Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT NẤM MEN GIÀU
KẼM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM BỔ SUNG

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62.42.02.01

Hà Nội, 2019


Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghiệp Thực phẩm

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Đức Mạnh
TS. Nguyễn Thị Minh Khanh
Viện Công nghiệp thực phẩm

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh
Phản biện 2: PGS.TS. Phan Thanh Tâm
Phản biện 3: TS. Phạm Hương Sơn

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại
Viện Công nghiệp thực phẩm, 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội
Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Viện Công nghiệp thực phẩm
- Trang web của Bộ GD&ĐT


MỞ ĐẦU
Kẽm có trong thành phần của ít nhất 160 loại enzyme khác
nhau, đặc biệt có trong hệ thống enzyme vận chuyển, thủy phân, đồng
hóa, xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử ADN... [81] Do
đó, các hệ cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da và niêm mạc, hệ
tiêu hóa, tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm. Ngày nay, tình
trạng thiếu kẽm vẫn đang là vấn đề khá phổ biến trong cộng đồng.
Chính vì vậy, việc bổ sung kẽm vào chế độ dinh dưỡng trong cộng
đồng là hết sức cần thiết.
Có rất nhiều phương pháp để tạo ra các hợp chất của kẽm như:
tổng hợp hóa học, chiết xuất từ tự nhiên, nhờ vi sinh vật… Tuy nhiên,
phương pháp tổng hợp hóa học có hạn chế như: dễ sinh ra các sản
phẩm phụ, khó kiểm soát, gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người.
Phương pháp chiết xuất hợp chất kẽm từ tự nhiên an toàn hơn nhưng
chi phí sản xuất cao. Vì vậy, hiện nay trên thế giới đang tập trung
nghiên cứu sử dụng nấm men là đối tượng nghiên cứu nhằm chuyển
hóa ion kim loại từ môi trường thành dạng hợp chất hữu cơ và tích lũy
trong nấm men. Các nghiên cứu so sánh khả năng hấp thu và chuyển
hóa giữa 2 dạng kẽm vô cơ và kẽm hữu cơ trên động vật đã chỉ ra rằng
động vật được bổ sung kẽm ở dạng hữu cơ có nồng độ kẽm huyết thanh
và hàm lượng kẽm dự trữ trong xương, thịt, các cơ quan nội tạng cao
hơn khi được bổ sung kẽm ở dạng vô cơ [56]. Việc nghiên cứu khoa
học để tạo ra quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm bột nấm men giàu

kẽm là cần thiết. Những căn cứ và nhu cầu thực tiễn nêu trên là cơ sở
để đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sảnxuất bột nấm men giàu kẽm
làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung” được thực hiện.
1


Mục tiêu nghiên cứu


Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm
hữu cơ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng.

Nội dung nghiên cứu


Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy
kẽm cao từ tự nhiên và Sưu tập giống VSVCN – Viện Công
nghiệp thực phẩm.



Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men tạo sinh khối nấm
men giàu kẽm.



Nghiên cứu nâng cao hiệu quả lên men bằng phương pháp lên
men bổ sung môi trường.



Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu
kẽm. Phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm.



Xây dựng quy trình công nghệ và triển khai sản xuất thử
nghiệm bột nấm men giàu kẽm tại Viện CNTP.

Những đóng góp mới của luận án


Phân lập mới được chủng nấm men S. cerevisiae A112 có khả
năng tích lũy kẽm hữu cơ cao.



Phân tích được tỉ lệ kẽm hữu cơ và một số dạng kẽm tồn tại
trong sinh khối nấm men.



Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men
giàu kẽm và triển khai sản xuất thử nghiệm tại Viện Công
nghiệp thực phẩm. Đây là công trình đầu tiên của Việt Nam
nghiên cứu một cách có hệ thống về sản xuất bột nấm men
giàu kẽm, từ việc nghiên cứu điều kiện sinh trưởng, tối ưu hóa
quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, đến việc
thu hồi dịch chiết, tạo chế phẩm nấm men giàu kẽm dạng bột.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu nguyên tố vi lượng kẽm
- Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm. Nhu cầu kẽm của cơ thể
- Tình hình thiếu kẽm trên thế giới và Việt Nam.
- Những dạng hợp chất phổ biến của kẽm và sự hấp thu vào cơ thể.
2. Đặc tính ưu việt của nấm men trong sản xuất công nghiệp
3. Khả năng hấp thụ kim loại và cơ chế tích lũy kẽm trong tế bào nấm men
- Khả năng hấp thụ kim loại của nấm men
- Cơ chế, vị trí tích lũy kẽm trong tế bào nấm men
- Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tích lũy kẽm của nấm men.
4. Các phương pháp lên men sử dụng trong sản xuất sinh khối nấm men giàu
kẽm
- Phương pháp lên men gián đoạn (batch fermentation)
- Phương pháp lên men gián đoạn bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation)
5. Các nghiên cứu về nấm men giàu kẽm
6. Các phương pháp phá tế bào nấm men
- Phương pháp cơ học
- Phương pháp phi cơ học
- Sử dụng kết hợp các phương pháp

7. Các sản phẩm chức năng giàu kẽm trên thế giới
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu
-

Nguồn phân lập nấm men: 56 mẫu gồm đất nhiễm kim loại nặng,
hoa quả chín, dịch lên men rượu gạo, nước thải… được thu thập
từ các địa phương ở Hà Nội, Thái Nguyên.

-

96 chủng S.cerevisiae được cung cấp từ Bộ Sưu tập giống VSV –
Viện Công nghiệp Thực phẩm.
3


-

Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng dòng Bal b/c, được cung
cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.

-

Môi trường phân lập Sabouraud, môi trường giữ giống maltglucose agar 4°Bx, môi trường hoạt hóa nấm men, môi trường lên
men.

2. Phương pháp nghiên cứu
-

Phương pháp phân tích hàm lượng kẽm tổng bằng AAS [139].

-

Phương pháp phân tích các phân đoạn kẽm được thực hiện theo
Liu và cộng sự (2015) [89, 104].

-

Phương pháp xác định nồng độ protein hoà tan theo phương pháp
Lowry [107].

-

Phương pháp xác định hoạt độ enzyme [69].

-

Phương pháp phân tích các tiêu chuẩn cơ sở về hàm lượng kim
loại nặng, chỉ tiêu vi sinh trong bột nấm men giàu kẽm theo AOAC
999.11, AOAC 971.21, TCVN 5667:1992.

-

Phương pháp sàng lọc các chủng nấm men có khả năng tích lũy
kẽm [10].

-

Phương pháp xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá
trình nhân giống S.cerevisiae A112

-

Nghiên cứu các điều kiện phù hợp cho quá trình lên men tạo sinh
khối nấm men giàu kẽm.

-

Phương pháp lên men bổ sung môi trường (fed-batch
fermentation) Phương pháp thu hồi dịch chiết nấm men giàu kẽm
và tạo sản phẩm nấm men giàu kẽm dạng bột

-

Nghiên cứu so sánh sự hấp thu, hoạt tính sinh học kẽm sulphat và
chiết xuất nấm men giàu kẽm trên chuột thí nghiệm [172].

-

Phương pháp xử lí số liệu
4


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng tích lũy
kẽm cao từ tự nhiên và Sưu tập VSVCN – Viện CNTP
Sàng lọc khả năng tích kẽm từ 96 chủng nấm men từ Sưu tập
VSVCN và 25 chủng nấm men từ nguồn phân lập mới. Kết quả có 44
chủng thể hiện khả năng tích kẽm thấp dưới 1 mg/g sinh khối khô
chiếm tỷ lệ 36,37 %; 54 chủng tích kẽm trong khoảng từ 1-3 mg/g sinh
khối chiếm tỷ lệ 44,63% và 23 chủng có khả năng tích lũy kẽm với
hàm lượng trên 3 mg/g sinh khối chiếm tỷ lệ 19,01 %. Trong đó, chủng
thể hiện khả năng tích luỹ kẽm cao nhất là chủng nấm men phân lập
A112 với hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối lên tới 10,95 mg/g,
lượng sinh khối đạt 1,02 g/100ml.
3.1.1. Nghiên cứu xác định dạng kẽm tồn tại trong sinh khối nấm
men giàu kẽm

12 chủng nấm men có khả năng tích kẽm với hàm lượng trên
5mg/g sinh khối được lựa chọn để phân tích định lượng kẽm hữu cơ
và dạng liên kết của kẽm trong sinh khối nấm men.

Hình 3.1. Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm chủng nấm men A112
5


Bảng 3.1. Hàm lượng kẽm hữu cơ tồn tại trong 12 chủng nấm men
S. cerevisiae

Sinh khối
(g/100ml)

Hàm lượng
kẽm (mg/g)

Tỉ lệ kẽm
hữu cơ (%)

CNTP 4007

0,93 ± 0,08

7,50 ± 0,21

80,43 ± 2,13

CNTP 4017

0,90 ± 0,09

5,23 ± 0,22

51,56 ± 1,53

CNTP 4059

0,89 ± 0,09

7,05 ± 0,19

78,64 ± 1,46

CNTP 4080

0,87 ± 0,08

7,65 ± 0,12

85,86 ± 1,24

CNTP 4087

0,94 ± 0,11

8,91 ± 0,21

86,86 ± 1,51

CNTP 4130

0,87 ± 0,09

5,47 ± 0,19

78,92 ± 2,16

CNTP 4131

0,95 ± 0,13

5,89 ± 0,3

62,65 ± 3,05

CNTP 4157

0,89 ± 0,09

7,19 ± 0,12

74,98 ± 1,34

CNTP 4158

0,91 ± 0,09

6,35 ± 0,19

71,12 ± 1,12

A112

1,02 ± 0,07

10,95 ± 0,13

0,83 ± 0,08

8,16 ± 0,18

0,71 ± 0,09

6,43 ± 0,17

CO8
A78

88,17 ± 1,27
86,05 ± 1,13
70,87 ± 2,16

Kẽm liên kết
protein (%)

Kẽm liên kết
polysacarit (%)

9,70 ± 0,19

12,16 ± 0,27

8,42 ± 0,17

11,18 ± 0,19

14,50 ± 0,21

19,21 ± 0,20

6,47 ± 0,09

16,61 ± 0,50

15,40 ± 0,18

20,52 ± 0,81

11,01 ± 0,26

14,84 ± 0,19

14,65 ± 0,18

17,90 ± 0,23

9,12 ± 0,23

11,86 ± 0,27

6,80 ± 0,85

12,40 ± 0,31

15,86 ± 0,25

28,25 ± 0,16

12,86 ± 0,25

18,25 ± 0,19

10,81 ± 0,11

15,01 ± 0,18

Như vậy, kẽm phân bố chủ yếu dưới dạng liên kết với hợp chất
hữu cơ, dao động từ 51,56 tới 88,17% so với lượng kẽm có trong dịch
chiết của các mẫu được phân tích. Kết quả này đã chứng minh khả
năng chuyển hóa nguồn kẽm vô cơ trong môi trường nuôi cấy, thành
dạng kẽm liên kết với hợp chất hữu cơ tích lũy trong tế bào của các
chủng nấm men. Kẽm dạng hữu cơ chiếm tỉ lệ cao nhất trong sinh khối
chủng nấm men phân lập A112 đạt giá trị 88,17%. Roepcke và cộng
sự (2011) khi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy thu nấm men
giàu kẽm trên chủng Pichia guilliermondii LBP 063 kết quả cho thấy
trên 91% kẽm liên kết với các dạng hợp chất hữu cơ [132]. Trong
6

nghiên cứu này, tỉ lệ kẽm hữu cơ cao nhất đạt 88,17% trên chủng
S.cerevisiae A112, giá trị này thấp hơn nghiên cứu của Roepcke và
cộng sự. Tuy nhiên, đây cũng là chủng có khả năng tích lũy kẽm hữu
cơ với hàm lượng cao trong sinh khối.
Ở mỗi chủng nấm men, dạng kẽm liên kết với phân đoạn
polysacarit đều lớn hơn dạng kẽm gắn với phân đoạn protein. Kẽm có
vai trò rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cơ thể. Kẽm liên
kết với hợp chất hữu cơ có thể được hấp thụ dễ dàng và ứng dụng trong
y học. Dạng kẽm liên kết với polysacarit đã được chứng minh có tác
dụng giải độc khi bị ngộ độc kim loại nặng [141]. Việc phân tích các
dạng tồn tại của kẽm có ý nghĩa trong việc làm sáng tỏ cơ chế tác dụng
của dịch chiết nấm men giàu kẽm.
3.1.2. Xác định đặc tính chủng nấm men tuyển chọn được
Khuẩn lạc chủng nấm men A112 có kích thước to nhỏ khác
nhau, khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, bề mặt trơn láng. Tế bào nấm men
khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét có hình tròn, ovan với kích
thước tế bào nằm trong khoảng 5 ÷ 7 × 7 ÷ 11µm. Những đặc điểm
hình thái tế bào và khuẩn lạc chủng nấm men A112 về cơ bản có sự
tương đồng với S.cerevisiae CNTP 4087 và một số loài thuộc chi
Saccharomyces [28]

Khuẩn lạc nấm men A112

Tế bào chủng nấm men A112

Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng nấm men A112
7


2 chủng nấm men có khả năng đồng hóa glucose, galactose,

sucrose, maltose và không có khả năng đồng hóa D-glucosamine, Dxylose, L-arabinose, D-sorbitol, Lactose, 2-keto-D-gluconate, Sắt
citrate. Đồng thời, các chủng này đều có khả năng lên men rượu, sinh
khí CO2, phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ 25oC - 33oC, pH từ 5-8. Đặc
biệt, chủng nấm men A112 có khả năng sinh trưởng được ở điều kiện
nhiệt độ lên tới 35oC đặc tính này vô cùng có ý nghĩa trong sản xuất
công nghiệp [101]…
3.1.3. Định tên chủng nấm men A112 bằng sinh học phân tử
Kết quả so sánh gen 26S rDNA của chủng A112 cho thấy,
chúng tương đồng 99,25% với chủng S. cerevisiae GITA551, trên cây
phát sinh chủng loại chủng A112 có quan hệ gần nhất với loài S.
cerevisiae. Như vậy, dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí sinh hóa và
sinh học phân tử cho thấy chủng nấm men A112 thuộc về loài S.
cerevisiae. Chủng nấm men S.cerevisiae A112 thể hiện đặc tính tốt
nhất về khả năng sinh trưởng và tích lũy kẽm trong sinh khối nên được
lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu các điều kiện phù hợp cho cho quá
trình lên men tích lũy kẽm.
3.2. Nghiên cứu các điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu
kẽm
3.2.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo
sinh khối nấm men giàu kẽm
a. Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm tới khả năng tích lũy kẽm trong
sinh khối nấm men S.cerevisiae A112

Muối kẽm nitorat, kẽm clorua và kẽm sunphat được
sử dụng để khảo sát lựa chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc
tạo sinh khối nấm men giàu kẽm. Tiến hành thí nghiệm như
8


đã trình bày ở phần phương pháp, kết quả được trình bày ở

bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm tới khả năng tích
lũy kẽm trong sinh khối nấm men
Nồng độ
kẽm (g/l)

Lượng sinh khối khô (g/100ml)

Hàm lượng kẽm (mg/g)

Zn(NO3)2

ZnSO4

ZnCl2

Zn(NO3)2

ZnSO4

ZnCl2

0

0,77 ± 0,11

0,76 ± 0,10

0,76 ± 0,11

0,34 ± 0,08

0,34 ± 0,11

0,34 ± 0,09

0,25

0,76 ± 0,10

0,76 ± 0,09

0,75 ± 0,11

2,08 ± 0,16

2,78 ± 0,19

2,45 ± 0,18

0,5

0,73 ± 0,11

0,75 ± 0,09

0,73 ± 0,08

4,71 ± 0,41

6,51 ± 0,35

5,44 ± 0,25

0,75

0,68 ± 0,11

0,72 ± 0,10

0,66 ± 0,10

5,29 ± 0,46

7,05 ± 0,39

6,71 ± 0,36

1

0,62 ± 0,12

0,70 ± 0,10

0,59 ± 0,09

9,15 ± 0,49

10,46 ± 0,45

9,73 ± 0,47

1,5

0,49 ± 0,08

0,61 ± 0,09

0,40 ± 0,07

11,13 ± 0,51

14,88 ± 0,58

12,52 ± 0,56

2

0,09 ± 0,03

0,08 ± 0,04

0,07 ± 0,04

15,03 ± 0,41

18,95 ± 0,62

17,71 ± 0,53

Kết quả về hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men
trên 3 loại muối kẽm nitorat cho thấy, khả năng chuyển hóa nguồn
muối kẽm vô cơ thành dạng hữu cơ tích lũy kẽm trong tế bào nấm men
S.cerevisiae A112 với mỗi loại muối kẽm khác nhau là khác nhau. Việc
sử dụng muối kẽm sunphat cho khả năng tích lũy và lượng sinh khối
khô thu được cao hơn hai muối còn lại. Chính vì vậy, chúng tôi chọn
muối kẽm sunphat làm nguồn muối bổ sung cho các nghiên cứu tiếp
sau.
Có thể nhận thấy, nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường
nuôi cấy có mối liên quan chặt chẽ với hàm lượng kẽm tích lũy trong
sinh khối. Nồng độ muối kẽm bổ sung càng cao thì hàm lượng kẽm
tích lũy trong sinh khối càng lớn. Tuy nhiên, tác động độc hại của kim
loại này lên sinh trưởng và phát triển của tế bào lại rất rõ rệt khi tăng
dần nồng độ muối kẽm.
9


b. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tích lũy kẽm và sự sinh
trưởng phát triển của chủng S. cerevisiae A112
Ảnh hưởng của glucose tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh
khối nấm men được trình bày ở hình 3.2.

2

10.58

10.21

1.6

10.2 10
1.28

1.06

1.2
0.8

10.21
1.24

8
6

0.71

4

0.4

2

0

Hàm lượng kẽm
(g/mg)

Khối lượng sinh khối
(g/100ml)

Khối lượng sinh khối sau nhân nuôi
Hàm lượng kẽm trong sinh khối

0
10g/l

50g/l
100g/l
150g/l
Nồng độ glucose (g/l)

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới quá trình tạo sinh
khối nấm men giàu kẽm
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy, glucose không ảnh hưởng tới khả
năng hấp thu kẽm trong sinh khối nhưng lại ảnh hưởng trực tiếp tới sự
sinh trưởng và phát triển của nấm men cũng như khối lượng sinh khối
sau lên men. Bởi lẽ, glucose là nguồn năng lượng chính cho nấm men
đồng hóa và xây dựng cấu trúc tế bào và gia tăng sinh khối. Xét về
hiệu quả kinh tế, hàm lượng đường glucose ở mức 100g/l là phù hợp
cho quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm.
c. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng tích lũy kẽm và sự sinh
trưởng phát triển của chủng S. cerevisiae A112
Kết quả trên cho thấy, nồng độ yeast extract bổ sung10g/l là
thích hợp nhất cho quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm.
10


Khi tăng nồng độ yeast extract từ 5g/l lên tới 10g/l chủng S. cerevisiae
A112 có chiều hướng gia tăng hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối
và khối lượng sinh khối sau lên men. Cụ thể, ở nồng độ yeast extract

là 10g/l khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối đạt tới 10,41 mg/g, với
lượng sinh khối tương ứng là 0,72 g/100ml. Tuy nhiên, điều đáng chú
ý là khi bổ sung nguồn dưỡng chất này ở nồng độ cao từ 15 lên tới 20
g/l lại có tác động bất lợi cho quá trình hấp thu kẽm. Brady và Ducan
(1994) cũng chỉ ra rằng, yeast extract có ảnh hưởng tích cực tới sự phát
triển của nấm men và sự hấp thu kẽm trong sinh khối ở nồng độ thích
hợp. Tuy nhiên, ở nồng độ cao chúng có thể liên kết trực tiếp với ion
kim loại trong môi trường nuôi cấy gây giảm hấp thu kẽm trong sinh
khối nấm men [33].
Khối lượng sinh khối sau nhân nuôi
Hàm lượng kẽm trong sinh khối
12
10.41

9.55

1.2

10

9.25

9.01
8

0.8

0.61

0.72

0.79

0.79
6
4

0.4

Hàm lượng kẽm
(mg/g)

Khối lượng sinh khối (g/100ml)

1.6

2
0

0
5g/l

10g/l

15g/l

20g/l

Yeast extract (g/l)

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ yeast extract tới hàm lượng kẽm
tích lũy và lượng sinh khối khô tới S. cerevisiae A112
11


3.2.2. Tối ưu hóa quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu
kẽm
Có thể nhận thấy, có mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ
kẽm bổ sung trong môi trường nuôi cấy với lượng kẽm trong sinh khối,
giữa nồng độ glucose với khối lượng sinh khối. Trong nghiên cứu này,
mục tiêu đặt ra của quá trình lên men là thu được hàm lượng kẽm trong
sinh khối khô đạt 15 mg/g sao cho lượng sinh khối nấm men thu được
càng cao càng tốt. Dữ liệu thực nghiệm được dùng làm đầu vào cho
quá trình phân tích điểm tối ưu, sử dụng phần mềm JMP trong tính
toán, kết quả thu được như sau: Nồng độ kẽm trong môi trường nuôi
cấy 1,5 g/l, nồng độ glucose 100 g/l và cao nấm men 5g/l

Hình 3.4. Điều kiện tối ưu và hiệu suất dự kiến bởi phần mềm JMP
3.2.3. Nghiên cứu động học của quá trình lên men tạo sinh khối
nấm men giàu kẽm theo phương pháp lên men gián đoạn
Nghiên cứu động học của quá trình tích lũy kẽm trong sinh
khối với các điều kiện tối ưu đã được lựa chọn. Kết quả được thể hiện
ở hình 3.5.
12


2.5

16
2

14
12

1.5

10

8

1

6
4

0.5

2
0

Lượng sinh khối (g/100ml)

Hàm lượng kẽm trong sinh khối (mg/g)
Nồng độ đường khử (g/100ml)

18

0
0h

3h

6h

9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h 36h

Thời gian (h)
Hàm lượng kẽm trong sinh khối (mg/g)

Nồng độ đường khử (g/100ml)

Lượng sinh khối khô (g/100ml)

Hình 3.5. Động học của quá trình tạo sinh khối nấm men giàu
kẽm theo phương pháp lên men gián đoạn
Như vậy, từ 0-3h sau khi tiếp giống, tế bào ở giai đoạn tiềm
tàng. Tuy nhiên, từ 3-21h tế bào nấm men chuyển sang pha logarit,
phát triển mạnh và gia tăng sinh khối tế bào. Từ 24-36 giờ, nguồn cơ
chất glucose cạn kiệt, tế bào ngừng sinh trưởng và đạt trạng thái cân
bằng. Sự hấp thu kẽm xảy ra mạnh mẽ ở thời điểm từ 9-18h và chậm
lại trong khoảng thời gian 21-36h. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu
của Walker (2004), tác giả cho rằng quá trình tích lũy kẽm diễn ra ngay
sau khi tiếp nguồn muối kẽm, ở pha sớm của quá trình lên men, khi
nguồn năng lượng ở mức cao nhất [158]. Đồng thời, khi lên men trên
thiết bị lên men tự động, sau 18h hàm lượng kẽm trung bình trong sinh
khối đạt 15,56 ± 0,71 mg/g với lượng sinh khối tương ứng là 1,51 ±
0,11 g/100ml. Lượng sinh khối thu được này tăng 121% so với lượng
sinh khối lên men trong điều kiện tối ưu trong bình tam giác (1,25 ±
0,11 g/100ml).
13

3.3. Nghiên cứu nâng cao hiệu quả lên men tạo sinh khối nấm men
giàu kẽm bằng phương pháp lên men bổ sung môi trường
Động học của quá trình phát triển và khả năng tích lũy kẽm của
Hàm lượng kẽm trong sinh khối (mg/g)
Nồng độ đường khử (g/100ml)
20

4
3.5

15

3
2.5

10

2
1.5

5

1

Lượng sinh khối khô (g/100ml)

Lượng kẽm trong sinh khối (mg/g)
Nồng độ đường khử (g/100ml)

nấm men được thể hiện ở hình 3.6.

0.5
0

0
0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h 36h
Thời gian (h)

Hình 3.6. Động học của quá trình lên men tạo sinh khối nấm men
giàu kẽm bằng phương pháp lên men bổ sung môi trường
Như vậy, so với phương pháp lên men theo mẻ thì phương pháp
lên men có bổ sung môi trường đã làm tăng cường hiệu quả lên men
tạo sinh khối nấm men giàu kẽm. Quá trình lên men theo mẻ cho hàm
lượng kẽm trung bình trong sinh khối đạt 15,56 ± 0,51 mg/g với lượng
sinh khối tương ứng là 1,51 ± 0,09 g/100ml. Trong khi đó, với phương
pháp lên men có bổ sung môi trường, hàm lượng kẽm trung bình trong
sinh khối đạt 17,32 ± 0,54 mg/g với lượng sinh khối lên tới 2,16 ± 0,10
g/100ml. Arakaki và cộng sự (2011) đã tiến hành đánh giá khả năng
thu hồi sinh khối nấm men giàu Cu bằng 2 phương pháp lên men gián
đoạn và lên men có bổ sung môi trường trên thiết bị lên men 10 l, tự
động điều chỉnh nồng độ oxi hòa tan ở mức 30%. Kết quả cho thấy,
lượng sinh khối sau lên men bằng có bổ sung cơ chất đường mía đã
tăng 48% so với lên men theo phương pháp gián đoạn. Đồng thời, tỉ lệ
14


tích lũy Cu tăng từ 91,98% lên tới 100% trong phương pháp lên men
có bổ sung môi trường [23]. Hình thái tế bào S. cerevisiae A112 trước

khi bổ sung muối kẽm sulphat và sau khi bổ sung kẽm sulphat nồng độ
1,5 g/l cũng được đánh giá (hình 3.7).

a. Hình ảnh tế bào trước khi

b. Hình ảnh tế bào sau khi bổ

bổ sung ZnSO4

sung ZnSO4 1,5 g/l

Hình 3.7. Hình ảnh S. cerevisiae trên kính hiển vi điện tử quét
Kết quả ở hình 3.25 cho thấy, kích thước tế bào nấm men trước
khi bổ sung muối kẽm sulphat vào khoảng 6,6 ± 0,8 µm và sau khi bổ
sung muối kẽm sulphat là 4,9 ± 0,9 µm. Như vậy, trong nghiên cứu
này tế bào nấm men S.cerevisiae A112 có sự sụt giảm kích thước khi
được nuôi trong môi trường có chứa kẽm. Kết quả này phù hợp với
nghiên cứu của Małgorzata và cộng sự (2006), nghiên cứu cho rằng,
khi được nuôi dưỡng trong môi trường ưu trương chứa nồng độ kẽm
cao hơn nồng độ kẽm trong nội bào, tế bào sinh vật có xu hướng co lại
và giảm thể tích của chúng. Do chênh lệch về áp suất thẩm thấu, chúng
có thể giảm tới 60% so với thể tích ban đầu [111].
3.4. Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu
kẽm
3.4.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp tự phân.
Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, thời gian tới quá trình tự phân
được thể hiện ở bảng 3.3.
15

Bảng 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả thu hồi kẽm
STT
Nhiệt
o

độ ( C)

pH

Thời
gian
(giờ)

Thông
số
40
45
50
55
60
3,5
4,5
5,5
6,5
8
16
24
32
40
48

Hàm lượng protein trong
dịch chiết (mg/ml)
2,27 ± 0,59
3,96 ± 0,98
4,85 ± 0,89
3,23 ± 1,03
1,08 ± 0,53
3,88 ± 0,99
4,34 ± 1,08
4,92 ± 0,99
2,03 ± 0,93
2,98 ± 0,37
4,11 ± 1,06
5,33 ± 0,79
5,57 ± 0,53
6,68 ± 1,18
6,28 ± 1,18

Hiệu quả thu hồi kẽm
hữu cơ (%)
18,83 ± 3,73
34,35 ± 2,54
39,14 ± 4,06
32,13 ± 3,58
7,36 ± 1,04
30,98 ± 5,73
36,63 ± 1,25
40,01 ± 4,58
17,93 ± 3,27

18,74 ± 1,93
40,65 ± 5,95
45,61 ± 5,38
45,86 ± 5,04
45,87 ± 3,57
45,90 ± 3,05

Như vậy, khi tăng nhiệt độ tự phân từ 40 đến 50oC, nồng độ
protein trong dịch tự phân cũng tăng dần và đạt giá trị cực đại là 4,85
mg/ml ở 50oC. Nhận thấy, ở 50oC khả năng tự phân của nấm men và
hiệu quả thu hồi kẽm đạt giá trị cao nhất nên mức nhiệt này được lựa
chọn cho quá trình tự phân nấm men. Giá trị pH tại 5,5 cho khả năng
tự phân tốt nhất thể hiện ở nồng độ protein giải phóng ra khỏi môi
trường và hiệu quả thu hồi kẽm đạt giá trị cao nhất. Vì vậy, giá trị pH
tại 5,5 được lựa chọn cho quá trình tự phân thu nhận dịch chiết nấm
men giàu kẽm. Giá trị pH này cũng nằm trong khoảng pH mà tác giả
Champane và cộng sự (2003) đưa ra khi thực hiện quá trình tự phân.
Tác giả cho rằng quá trình tự phân của nấm men diễn ra ở khoảng pH
từ 4-6 [39]. Đồng thời, để đảm bảo hiệu quả kinh tế cho sản xuất quá
trình tự phân được kết thúc ở thời điểm 24 giờ.
16


3.4.2. Phá tế bào kết hợp quá trình tự phân và thuỷ phân bằng
enzyme
Bổ sung enzyme protease vào quá trình phá vỡ tế bào sau khi tự
phân giúp tăng hiệu quả thu hồi kẽm so với mẫu đối chứng không bổ
sung chế phẩm. Việc bổ sung enzyme Flavourzyme ở nồng độ 0,4%
trong 2h cho khả năng phá vỡ tế bào cao, hiệu quả thu hồi kẽm tăng từ
45,26% lên tới 70,15%.

3.5. Phương pháp nâng cao chất lượng cảm quan, khử màu , khử
mùi dịch thủy phân nấm men
3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính
Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến quá trình khử màu,
mùi dịch thủy phân nấm men được thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến quá trình
khử màu, mùi
Nồng độ than
hoạt tính (%)
0 (đối chứng)
1
2
3
4
5

Tỉ lệ hao hụt
kẽm (%)
0
3,05 ± 0,14
3,62 ± 0,25
4,87 ± 0,38
6,34 ± 0,51
8,25 ± 0,55

OD (550nm)
1,18 ± 0,09
0,78± 0,04
0,31± 0,04
0,10 ± 0,03

0,09 ± 0,03
0,08 ± 0,02

Đánh giá cảm quan
Dịch đục, màu nâu, mùi
nấm men đặc trưng.
Dịch đục, màu nâu, mùi
nấm men đặc trưng.
Dịch hơi đục, màu nâu
nhạt, không mùi.
Dịch trong, không màu,
không mùi.
Dịch trong, không màu,
không mùi.
Dịch trong, không màu,
không mùi.

Kết quả cho thấy, nồng độ than hoạt tính càng cao thì khả năng khử
màu và mùi trong dịch chiết nấm men càng tốt. Tuy nhiên, hao hụt thể
tích dịch chiết nấm men và kẽm trong dịch chiết nấm men càng lớn, khó
khăn trong việc loại than, tăng chi phí sản xuất. Nhận thấy, ở nồng độ than
hoạt tính bổ sung là 3% cho dịch chiết sau lọc trong, không mùi với tỉ lệ
hao hụt kẽm ở mức vừa phải 4,87% nên nồng độ này đã được lựa chọn
cho quá trình xử lí màu và mùi của dịch chiết.
17


3.5.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến quá trình khử màu, mùi
dịch thủy phân nấm men
Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình khử màu dịch nấm men

bằng than hoạt tính được thể hiện ở bảng 3.31.
Bảng 3. 5. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình khử màu, mùi
dịch thủy phân
Thời gian
(phút)

OD
(550nm)

0 (ĐC)

1,17 ± 0,09

30

0,896 ± 0,09

60

0,437 ± 0,08

90

0,11 ± 0,03

120

0,095 ± 0,03

Hao hụt

kẽm %
0
3,25 ± 0,09
3,82 ± 0,11
4,58 ± 0,29
5,01 ± 0,36

Đánh giá cảm quan
Dịch đục, màu nâu, mùi dịch
chiết nấm men đặc trưng.
Dịch đục, màu nâu, có mùi
nồng.
Dịch hơi đục, có màu nâu
nhạt, mùi nồng giảm mạnh.
Dịch trong, không màu,
không mùi.
Dịch trong, không màu,
không mùi.

Có thể thấy, việc xác định thời gian xử lí là cần thiết cho quá
trình khử màu, khử mùi của dịch chiết. Kết quả trên cho thấy, khi tăng
thời gian xử lí than hoạt tính từ 30 đến 120 phút, tỉ lệ hao hụt kẽm tăng
từ 3,25 đến 5,01 %. Đồng thời, thời gian xử lí than hoạt tính là thông
số có ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu quả khử màu, khử mùi trong dịch
chiết nấm men. Thời gian xử lí than hoạt tính từ 30 tới 60 phút là chưa
đủ để khử màu và mùi trong dịch chiết, thể hiện ở giá trị OD (0,437)
vẫn ở ngưỡng cao. Khi tăng thời gian xử lí than lên 90-120 phút cho
giá trị quang OD thấp nhất và tương đương nhau, dịch chiết nấm men
trong, không màu, không mùi. Hơn nữa, khi xử lí than hoạt tính ở 90
phút, tỉ lệ hao hụt kẽm là 4,58 %, thấp hơn so với thời điểm120 phút.

Vì vậy, để rút ngắn thời gian cho quá trình xử lí dịch, thời gian 90 phút
được lựa chọn là thông số cho quá trình khử màu, khử mùi của dịch
chiết nấm men giàu kẽm.
18


3.6. Xây dựng quy trình công nghệ và sản xuất bột nấm men giàu
kẽm hữu cơ quy mô thực nghiệm
Chủng nấm men
S. cerevisiase A112

Hoạt hóa (YM, 30oC, 24h)

Nhân giống (YM glucose 50g/l, 30oC, 24h)

Chất phá bọt

Lên men (ZnSO4 1,5g/l,30oC, pH 6, 24h)

Muối kẽm
ZnSO4

Ly tâm thu, rửa sinh khối 3 lần (6000 vòng/phút)

Tự phân (50oC, pH 5,5, 24 giờ) + Thủy phân
(0,4% Flavourzyme 50oC, pH 5,5, 2 giờ)

Ly tâm thu dịch chiết (6000rpm)
Khử màu, mùi (than hoạt tính 3%, 80oC)

Loại
thành
tế bào

Cô đặc (nhiệt độ 75oC, 15oBx, 2 giờ)

Sấy phun (95oC, 5l/giờ, 15% Maltodextrin)

Bột nấm men giàu
kẽm

Hình 3.8. Quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm
quy mô thực nghiệm
19


Thuyết minh quy trình công nghệ
Chuẩn bị môi trường: Môi trường lên men được chuẩn bị theo
thành phần: 100 g/l glucose; 5 g/l yeast extract; MgSO4 0,5 g/l;
KH2PO4 2 g/l; Fe2(SO4)3 0,1 g/l; ZnSO4 1,5 g/l. Dùng NaOH 1M để
chỉnh pH về 6. Môi trường được tiệt trùng ở 121oC trong thời gian 15
phút. Muối kẽm sulphat được chuẩn bị và tiệt trùng trong bình riêng
với hàm lượng dịch 150g/l.
Nhân giống: Các chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm
cao được lưu trữ trong nitơ lỏng hoặc ống thạch nghiêng được hoạt hóa
trong môi trường YM lỏng. Sau đó, chủng giống được nhân nuôi trong
môi trường có chứa glucose 50g/l, cao nấm men 10g/l, pepton 5g/l,
malt extract 3g/l, pH 4,5 chế độ lắc 150 rpm, nhiệt độ 30oC trong
khoảng thời gian 24 giờ. Giống nên được sử dụng ngay sau khi kết
thúc 24 giờ nhân nuôi, mật độ giống cần đạt từ 109 CFU/ml.

Lên men: Chủng nấm men được bổ sung vào môi trường lên
men với tỉ lệ 8% (theo tỉ lệ thể tích với thể tích môi trường). Nấm men
được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 30oC, chế độ khuấy 200 vòng/phút.
Sau thời gian tiếp giống 9 giờ bổ sung dịch muối kẽm sulphat đã chuẩn
bị sao cho tỷ lệ muối kẽm đạt 1,5g/l so với thể tích môi trường. Sau 12
giờ, bổ sung môi trường dinh dưỡng với tốc độ tiếp dịch 20 l/giờ, duy
trì nồng độ oxi hòa tan ở mức 6 mg/l. Tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện
trên đến 24 giờ.
Ly tâm: Dịch lên men được làm lạnh xuống nhiệt độ 10oC, để
lắng. Dịch men sau lắng được mang đi ly tâm để thu sinh khối nấm
men ở điều kiện 9000g.
Rửa sinh khối: Sinh khối nấm men (dạng sệt) được hòa lại với
nước khử ion theo tỷ lệ khối lượng là: Sinh khối: nước = 1:5. Bật chế
20


độ khuấy sau đó để lắng trong 3 giờ. Sau đó cho ly tâm thu sinh khối
và loại nước. Lặp lại quá trình rửa sinh khối 3 lần.
Tự phân + thủy phân bằng enzyme: Sinh khối nấm men được
pha với dung dịch đệm acetat với tỉ lệ: 1 : 5 (v/v), chỉnh pH ở 5,5 bằng
HCl 1M, bổ sung 5% (w/v) NaCl và 5% (v/v) ethanol 95%, tự phân
trong 24 giờ ở nhiệt độ 50oC. Dịch sau tự phân được bổ sung thêm
0,4% enzyme Flavourzyme, thủy phân trong 2 giờ.
Ly tâm thu dịch chiết: Hỗn dịch sau thủy phân được ly tâm thu
dịch chiết, loại thành tế bào ở điều kiện 6000 vòng/phút trong thời gian
15 phút. Thành tế bào được rửa 2 lần bằng nước cất để thu hồi dịch
chiết chứa kẽm bám dính trên vỏ tế bào.
Khử màu, mùi: Dịch chiết được bổ sung thêm 3% than hoạt
tính, làm nóng tới 80oC, giữ trong thời gian 90 phút. Sau đó, than được
loại bằng cách lọc qua máy lọc khung bản đến khi dịch sau lọc trong,

không mùi, giá trị OD550 < 0,1.
Cô đặc: Dịch thu được sau khi khử màu, mùi được mang đi cô
đặc trên thiết bị cô quay chân không ở nhiệt độ 75oC, trong thời gian
120 phút đến khi dịch đạt 15oBx.
Sấy phun thu sản phẩm: Tiến hành sấy phun thu sản phẩm bột
chiết nấm men giàu kẽm ở chế độ nhiệt đầu ra 95oC, tốc độ bơm dịch
5 l/giờ, chất trợ sấy (maltodextrin) 15 % so với chất khô hòa tan.
3.7. Kết quả thử nghiệm kiểm tra độc tính và khả năng hấp thu
và sự phân bố kẽm trong cơ thể chuột thí nghiệm
Bột nấm men giàu kẽm (ZnY) đã được thử nghiệm các bước
tiền khảo sát về độc tính cấp trên chuột thí nghiệm dòng Bal b/c. Kết
quả cho thấy, chuột ăn uống, di chuyển bình thường và không có chuột
chết ở tất cả các lô được nghiên cứu. Theo phân loại chất độc theo
đường uống của tổ chức WHO (WorldHealth Organization, 1993),
21


Tổ chức Hợp tác và Phát triển kinh tế thế giới (Organization for
Economic Cooperation and Development - OECD), và GHS
(Globally Harmonized System of Classification and Labelling of
Chemicals) các mẫu thử nghiệm không gây độc ở liều tối đa, không
xác định được giá trị LD50 hoặc có giá trị LD50 > 5000 mg/kg thể trọng
theo đường uống thì được coi là không độc hoặc không phân loại
(unclassified). N h ư vậ y, bột chiết nấm men giàu kẽm (ZnY) trong
thí nghiệm này thuộc nhóm không gây độc theo đường uống.
Tiếp đó, khả năng hấp thu và sự phân bố kẽm trong cơ thể
chuột thí nghiệm của kẽm dạng hữu cơ - ZnY và kẽm dạng vô cơ
ZnSO4 cũng được nghiên cứu và đánh giá.
100

ZnY

Hàm lượng kẽm
(µg/ml)

4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

Hàm lượng kẽm
(µg/g)

ZnSO4

80

ZnY
ZnSO4

60
40

20

0
1h

3h

6h

12h

Xương Gan Thận Lách

24h

Thời gian (h)

Tim

Mô cơ thể

(A)
(B)
Hình 3.9. Nồng độ kẽm trong huyết thanh (A) và các mô (B) của
chuột thí nghiệm sau khi uống ZnY, ZnSO4 liều 4 mg/kgP
Kết quả cho thấy, hàm lượng kẽm trong huyết thanh đạt giá trị
cao nhất sau 3h uống bổ sung các nguồn kẽm. Tại thời điểm 3h, lô
chuột được bổ sung ZnY có nồng độ kẽm trong huyết thanh đạt 3,56 ±
0,37 µg/ml và lô chuột uống ZnSO4 nồng độ kẽm trong huyết thanh đạt
2,73 ± 0,31 µg/ml. Chuột uống ZnY có hàm lượng kẽm trong huyết
thanh cao và mô hơn so với bổ sung ZnSO4 (p < 0,05). Kết quả này

22


phù hợp với nghiên cứu của Salgueiro và cộng sự (2000) [134]. Zhang
và cộng sự (2018) khi nghiên cứu khả năng hấp thu, phân bố, bài tiết
và sinh khả dụng của kẽm sulphate, kẽm gluconate và ZnY trên chuột
thí nghiệm đã cho rằng ZnY có khả năng hấp thu và dự trữ trong cơ
thể tốt hơn hai dạng kẽm còn lại [172].
Có thể nhận thấy, hàm lượng kẽm tích lũy trong các mô xương,
gan, thận, lách, tim của chuột có bổ sung ZnY cao hơn so với ZnSO4.
Điều này cho thấy khả năng hấp thu Zn cũng như sinh khả dụng của
kẽm hữu cơ được chuyển hóa trong nấm men (ZnY) là cao hơn so với
muối kẽm vô cơ (ZnSO4). Khi đánh giá sinh khả dụng của 3 nguồn
muối kẽm từ nấm men, chelate và kẽm sulphat, Vinson và Bose (1981)
cho rằng ZnY là dạng tồn tại của kẽm có tính sinh khả dụng cao nhất.
Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ZnY là dạng tốt nhất để bổ
sung nguyên tố vi lượng cho cơ thể [156].
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu, luận án đã đạt được một số kết luận sau:
 Từ 121 chủng nấm đã tuyển chọn được 02 chủng nấm men có
khả năng tích lũy kẽm cao. Sau khi định tên bằng phương pháp sinh
học phân tử, đã xác định được tên loài của chủng tuyển chọn là
S.cerevisiae A112 và S.cerevisiae 4087.
 Dạng kẽm trong nấm men chủ yếu tồn tại ở dạng liên kết với
các hợp chất hữu cơ. Kẽm dạng hữu cơ chiếm tỉ lệ cao nhất trong sinh
khối chủng S.cerevisiae A112 đạt giá trị 88,17 %.
 Đã xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình
tạo sinh khối nấm men giàu kẽm với hàm lượng 15mg/g trong môi
23