Nghiên cứu tinh chế albumin trứng sử dụng trong dược phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

TRẦN THỊ THÚY

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ
ALBUMIN TRỨNG SỬ DỤNG
TRONG DƯỢC PHẨM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

TRẦN THỊ THÚY

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ
ALBUMIN TRỨNG SỬ DỤNG
TRONG DƯỢC PHẨM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2012.Y
Người hướng dẫn:
1.
2.

PGS.TS Nguyễn Thanh Hải
ThS Nguyễn Văn Khanh

Hà nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS.TS Nguyễn
Thanh Hải và Ths Nguyễn Văn Khanh, hai người thầy đã hết lòng hướng dẫn
và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên thuộc
bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi
trong quá trình học tập và thực nghiệm tại bộ môn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, phòng Đào
tạo, bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm, các bộ môn, ban phòng liên
quan trong nhà trường, các anh chị ở viện Dược liệu, viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị và hóa chất thí
nghiệm trong quá trình tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những
người đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập cũng như
hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Trần Thị Thúy

ABS
ACE
UF


BCA
BMBC

dd
EDTA
HPLC
NSX
OVA
PEG
SDS
SDS-PAGE
v/v
w/v
WHO

Bảng
Bảng 1.1

Bảng 1.2
Bảng 1.3

T

lò

T

tr

H


Bảng 2.1

C

Bảng 2.2

C

Bảng 3.1

Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4

Hình
Hình 1.1
Hình 2.1

Hình 2.2

Hình 2.3
Hình 2.4
Hình 2.5
Hình 3.1
Hình 3.2

K

tr

Ả

ov

K

H

qu


Hình 3.3
Hình 3.4

Hình 3.5


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………..………………… 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………... 2

1.1. Sơ lược về lòng trắng trứng……………………………………………. 2
1.1.1.
Thành phần……………………………………..………...…..…… 2
1.1.2.
Các protein chính trong lòng trắng trứng.….………….……….…. 3
1.1.3. Vai trò sinh học và giá trị của các thành phần lòng trắng trứng đối với
sức khỏe con người……………………………………..……...………… 5
1.2. Ovalbumin………………………………………………………………… 8
1.2.1.
Cấu trúc và một số tính chất đặc trưng của ovalbum…...………… 8

1.2.2. Một số đặc tính của ovalbumin có tiềm năng nghiên cứu sử dụng trong
Dược phẩm………..…….………….…………...…..…..…………...… 9
1.2.3.
Các phương pháp đánh giá ovalbumin…………………….…..… 10
1.2.4.
Các nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng..……..… 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………. 14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị……………………………………………….. 14
2.1.1.
Nguyên vật liệu………….………………………….…….……… 14
2.1.2.
Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu…………...………….………..…… 14
2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………... 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 15
2.3.1.
Phương pháp tinh chế albumin trứng………………….…….….…15
2.3.2.
Phương pháp đánh giá…………………….……………………... 20
2.3.3.
Phương pháp xử lí số liệu……………………………...………… 24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……..…………………………… 25
3.1.

Khảo sát các phương pháp tinh chế albumin trứng………………… 25

3.2. Tinh chế ovalbumin bằng cách loại từng bước các protein có trong lòng
trắng trứng và đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế
được…………………………………………………………………………… 27

3.2.1.
Định tính sản phẩm tinh chế………………..……………………. 27
3.2.2.
Hiệu suất tinh chế ovalbumin……………….…………………… 29
3.2.3.
Độ tinh khiết của ovalbumin…………..………………………… 30
3.3. Nâng cấp quy mô………...…………..………………………………… 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….. 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trứng từ lâu đã trở thành một phần thiết yếu trong chế độ ăn của con
người, là một trong số những thực phẩm được sử dụng phổ biến trên toàn thế
giới. Mặc dù chứa đến 74% là nước, trứng vẫn là nguồn nguyên liệu dồi dào
cung cấp protein, acid béo, sắt, phospho, khoáng chất và các vitamin quan trọng
cho cơ thể. Lòng trắng trứng chứa khoảng 9,7-11% protein, gồm các protein
chính như ovalbumin, ovotransferrin, lysozym và ovomucin. Ngoài ra, các
protein lòng trắng trứng còn chứa những đặc tính chức năng quan trọng như tạo
gel, tạo bọt, nhũ hóa, và đông tụ bởi nhiệt, khiến chúng trở thành một phụ gia
hữu ích đối với nền công nghiệp thực phẩm [2,18,21-24].
Là protein chính chiếm hơn một nửa lượng protein khô của lòng trắng
trứng, ovalbumin có hầu hết các tính chất và đặc tính chức năng của lòng trắng
trứng. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho thấy một vài hoạt tính sinh học có liên
quan đến albumin trứng như hoạt tính kháng vi sinh vật, điều hòa miễn dịch, và
tiềm năng ứng dụng như một chất mang thuốc, cho thấy sự cần thiết trong việc
phân lập và tinh chế ovalbumin từ phức hệ các protein của lòng trắng trứng
[18,23].
Albumin trứng (ovalbumin) được phân tách đầu tiên từ lòng trắng trứng

bằng phương pháp sử dụng amoni sulfat nồng độ cao. Trong nhiều thập kỉ qua,
nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để tinh chế ovalbumin như công
nghệ màng lọc UF, sắc kí trao đổi ion, sắc kí rây phân tử, hệ ABS… [2,28]. Các
phương pháp này yêu cầu các thiết bị kĩ thuật đắt tiền đồng thời một số phương
pháp phải được tiến hành qua nhiều giai đoạn phức tạp. Do vậy, chúng tôi thực
hiện đề tài “Tinh chế albumin trứng sử dụng trong dược phẩm” với 2 mục tiêu
chính:
-

Tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng.
Đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế được.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược về lòng trắng trứng
1.1.1. Thành phần
Trứng bao gồm khoảng 9,5% vỏ trứng (bao gồm màng vỏ), 63% albumen
(lòng trắng) và 27,5% lòng đỏ [21]. Thành phần chính của trứng là nước (75%),
protein (12%), lipid (12%), còn lại là carbohydrat, khoáng chất và một số
vitamin (A, E, K và B) [18,23].
Protein phân bố ở cả lòng đỏ và lòng trắng trứng, trong khi đó lipid phân
bố chủ yếu ở lòng đỏ. Một vài khoáng chất được tìm thấy trong vỏ trứng [22].
Carbohydrat và các thành phần thứ yếu khác phân bố khắp các bộ phận của quả
trứng, tồn tại ở cả dạng tự do và dạng liên hợp, liên kết với protein và lipid [23].
Lòng trắng trứng chiếm hơn một nửa (khoảng 60-63%) tổng khối lượng
quả trứng. Hai thành phần chính cấu tạo nên lòng trắng trứng bao gồm nước
(chiếm khoảng 88%) và protein (khoảng 9,7-11%). Carbohydrat chiếm khoảng
0,5-0,6%, lượng lipid có trong lòng trắng trứng chỉ chiếm khoảng 0,01%, không

đáng kể so với lượng lipid có trong lòng đỏ [21].
Protein là thành phần chính quyết định các đặc tính lý hóa và sinh học của
lòng trắng trứng. Trong nhiều thập kỉ qua, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để
nhận biết, phân tách và định lượng các protein có trong lòng trắng trứng. Protein
chiếm khối lượng lớn nhất trong tổng số protein lòng trắng trứng là ovalbumin
(54%). Cùng với ovalbumin, ovotransferrin (12%), ovomucoid (11%), ovomucin
(3,5%) và lysozym (3,4%) được xem là những protein chính của lòng trắng
trứng. Các protein khác cũng đã được nhận biết và định lượng bao gồm
ovoinhibitor, ovoglycoprotein, ovoflavoprotein, ovomacroglobulin (ovostatin),
cystatin, avidin… [18].

2


Bảng 1.1. Thành phần và tỷ lệ phần trăm khối lượng một số
protein lòng trắng trứng [18]
Protein
Ovalbumin
Ovotransferrin
Ovomucoid
Ovomucin
Lysozym
G2-globulin
G3-globulin

Như vậy, 70-80% protein lòng trắng trứng là ovalbumin, ovotransferrin và
ovomucoid. Do chứa một lượng lớn các protein trên, việc phát hiện và định
lượng các protein kích thước nhỏ và chiếm tỷ lệ ít trở nên khó khăn hơn [12].
Gần đây, nghiên cứu của Mann K. và Mann M. sử dụng công nghệ Orbitrap kết
hợp phân tích dữ liệu bằng phần mềm MaxQuant đã cho ra đời một danh sách

mới, toàn diện nhất về các thành phần cấu tạo nên lòng trắng trứng, bao gồm 158
loại protein khác nhau [20].
1.1.2. Các protein chính trong lòng trắng trứng
Lòng trắng trứng chứa từ 9,7-11% protein, được xem như một hệ thống
các protein hình cầu trong dung dịch thân nước. Các protein chiếm thành phần
nhiều nhất và tạo nên các tính chất đặc trưng của lòng trắng trứng bao gồm:
ovalbumin, ovotransferrin, ovomucoid, ovomucin và lysozym.
Ovalbumin là một mono phosphoglycoprotein hình cầu, khối lượng phân
tử 45 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,5, được cấu tạo từ 386 amino acid. Nghiên cứu
của Osuga và Feeney năm 1977 và Zabik năm 1992 cho thấy ovalbumin tồn tại ở


3


3 dạng A1, A2, A3 với tỷ lệ 85:12:3, chứa số nhóm phosphoryl tương ứng là 2, 1
và 0. Ovalbumin bị biến tính tại nhiệt độ 84oC [2,5].
Ovotransferrin là một mono glycoprotein cấu tạo từ 686 amino acid với
trọng lượng phân tử 77,7 kDa, điểm đẳng điện pI = 6,1 và biến tính ở nhiệt độ
61oC [21]. Ovotransferrin có chuỗi amino acid giống với glucoprotein vận
chuyển sắt trong huyết tương người và chiếm 12 % lượng protein của lòng trắng
trứng. Ovotransferrin tồn tại ở hai dạng cấu trúc chính: dạng apo- (không liên kết
với kim loại) và dạng holo- có khả năng liên kết với kim loại. Cấu trúc dạng
holo- của ovotransferrin bền hơn với các tác nhân vật lý và hóa học. Trước đây
protein này được gọi tên là conalbumin nhưng đã được đổi thành ovotransferrin
sau khi phát hiện thấy khả năng liên kết với sắt và tăng đề kháng với nhiệt, áp
suất cũng như enzym thủy phân protein và các tác nhân biến tính khác [2].
Ovomucoid là một glycoprotein có khối lượng phân tử 28 kDa, điểm đẳng
điện pI = 4,1. Ovomucoid chứa từ 20-25% carbohydrat và có khả năng chống
chịu cao với nhiệt độ (nhiệt độ biến tính là 77 oC) [21]. Ovomucoid có hoạt tính

ức chế trypsin và được xem như một chất gây dị ứng có trong thực phẩm. Tuy
nhiên nghiên cứu của Osuga và Feeny cho thấy ovomucoid trong trứng ức chế
trypsin bò nhưng không có hoạt tính ức chế đối với trypsin người [2,5].
Ovomucin là một glycoprotein, đây là protein đóng vai trò tạo nên đặc tính
nhớt của lòng trắng trứng. Khác với các protein khác, ovomucin có khối lượng
phân tử lớn, trong khoảng 5,5-8,8 x 10 3 kDa và chứa một lượng lớn cystin nối
với nhau bởi các liên kết liên phân tử. Ovomucin chiếm 1,5-3,5% lượng protein
lòng trắng trứng và có điểm đặng điện pI = 4,5-5,0 [5,21]. Ovomucin tồn tại ở 2
dạng: α-ovomucin và β-ovomucin trong đó α-ovomucin có số nhóm carbohydrat
ít hơn dạng β do đó có khả năng hòa tan tốt hơn. Ovomucin cũng chứa một
lượng lớn nhóm disulfid và chứa tới 33% carbohydrat [5].
Lysozym là một enzym cấu tạo từ 129 amino acid với khối lượng lượng
phân tử 14,2 kDa và điểm đẳng điện 10,7. Lysozym chứa 4 cầu nối disulfid dẫn
đến khả năng đề kháng tốt với nhiệt, lysozym biến tính ở 75oC [15,29].
4


Bảng 1.2. Thành phần và một số tính chất của các protein chính trong lòng
trắng trứng [21]

Protein

Ovalbumin
Ovotransferrin
Ovomucoid
Ovomucin
Lysozym
G2 Globulin
G3 Globulin
Avidin

1.1.3. Vai trò sinh học và giá trị của các thành phần lòng trắng trứng đối với
sức khỏe con người
Trứng từ lâu đã trở thành một phần quan trọng cung cấp các chất dinh
dưỡng cần thiết trong chế độ ăn của con người. Mặc dù chiếm đến 74% là nước,
trứng vẫn là nguồn cung cấp các protein, acid béo, chất khoáng và các vitamin
cần thiết cho cơ thể [34].
Quá trình chế biến, nấu chín thức ăn có liên quan đến đặc tính đông lại bởi
nhiệt của protein trứng. Các tính chất đặc trưng của các protein có trong lòng
trắng như tạo gel, tạo bọt khiến chúng trở thành một thành phần hữu ích trong
nhiều loại thực phẩm như mỳ phở, may-on-ne, các loại bánh, sản phẩm thịt chế
biến sẵn và mứt, kẹo. Đặc tính tạo gel khi đun nóng của các protein lòng trắng
trứng được ứng dụng trong chế biến nhiều loại sản phẩm như các món tráng
miệng, bánh pudding, thịt hộp, đậu phụ và surimi. Khả năng tạo bọt cũng được


5


ứng dụng trong bánh mỳ, bánh ngọt, bánh trứng, bánh quy, kem và nhiều loại sản
phẩm mứt, kẹo [18,21].
Nhiều protein trong lòng trắng trứng còn được sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm nhờ tác dụng ức chế sự phát triển của các loại vi sinh vật gây phân
hủy thức ăn. Lysozym là một trong những protein gây phân hủy vi khuẩn chính
được tìm thấy trong lòng trắng trứng, có tác dụng ức chế Listeria monocytogens
và Clostridium botulinum, hai nguồn bệnh gây ra các vấn đề chính trong công
nghiệp thực phẩm [29]. Ngoài ra, protein này có tác dụng kháng virus, kháng
viêm và có nhiều hiệu quả chữa bệnh [18]. WHO và nhiều quốc gia cho phép sử
dụng lysozym như một chất bảo quản trong các loại thực phẩm như giấm
kimuchi, sushi, pho mát và rượt vang. Ovotransferrin được biết đến với hoạt tính
kháng vi sinh vật mạnh, do đó có thể được sử dụng để tăng độ an toàn của thực

phẩm. Nghiên cứu của Babini và Livermore (2000) chỉ ra rằng ovotransferrin có
khả năng tăng cường hoạt động của pipercillintazobactam chống lại Escherichia
coli và Streptococcus mutans [6]. Ovomucin cho thấy hoạt tính ức chế tốt một số
vi

khuẩn như E. coli, Bacillus sp. và Pseudomonas sp. [33]. Do đó cũng được sử

dụng như một phụ gia bảo quản trong thực phẩm. Bên cạnh đó, nhờ có đặc tính
nhũ hóa và tạo bọt, ovomucin còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp làm
bánh [2].
Ngày nay, trứng là nguồn nguyên liệu được sử dụng trong rất nhiều lĩnh
vực bao gồm cung cấp thực phẩm, sản xuất Dược phẩm và ứng dụng trong Y
học. Nhiều hoạt tính sinh học đã được phát hiện có liên quan đến các thành phần
protein cấu tạo nên trứng, bao gồm khả năng kháng vi khuẩn và virus, khả năng
điều chỉnh miễn dịch, chống ung thư, hạ huyết áp [23].

6


Bảng 1.3. Hoạt tính sinh học của các protein lòng trắng trứng [18,23]
Protein

Ovalbumin

Ovotransferrin

Ovomucoid

Ovomucin

7


1.2. Ovalbumin
1.2.1. Cấu trúc và một số tính chất đặc trưng của ovalbumin
Ovalbumin là một mono phosphoglycoprotein có khối lượng phân tử 45
kDa, cấu tạo từ 386 amino acid, điểm đẳng điện pI = 4,5. Ovalbumin được tổng
hợp tại vòi trứng và cấu thành nên 54% tổng khối lượng khô của protein lòng
trắng trứng [2]. Đây là một protein dự trữ và là nguồn cung cấp acid amin chủ
yếu cho phôi trứng đang phát triển [24].
Ovalbumin chứa 3,5% carbohydrat, có 4 nhóm Sulfhydric tự do và một
cầu nối disulfid (Cys74-Cys121) [5]. Cấu trúc bậc 2 của ovalbumin gồm 41%
xoắn α, 34% phiến β và 12% nếp gấp β [26].
Cấu trúc 3-D của ovalbumin với một mạch xoắn ốc phản ứng α (màu
vàng) và các phiến βA (màu đỏ) được mô tả trong hình 1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc 3-D của ovalbumin [17]
Trong quá trình bảo quản, ovalbumin dần chuyển thành S-ovalbumin là
một dạng cấu trúc bền hơn với nhiệt và thường được xem là ovalbumin “bền”.
Sự có mặt của S-ovalbumin đã được chứng minh bởi sự khác nhau về nhiệt độ
8


biến tính của 2 dạng cấu trúc này (92,5 oC đối với S-ovalbumin và 84,5oC đối với
ovalbumin gốc). S-ovalbumin đồng thời cũng cho thấy tính kị nước bề mặt cao
hơn. Lượng S-ovalbumin trong trứng tăng dần theo thời gian bảo quản, từ 5% ở
trứng mới đẻ đến 81% sau 6 tháng bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2 oC. Cấu trúc tinh
thể của S-ovalbumin đã được xác định là không có sự khác biệt với cấu trúc bậc
2 của ovalbumin [5,15].

Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên sự
chuyển đổi cấu trúc ovalbumin sang dạng S-ovalbumin. Nghiên cứu của Alleoni
năm 1977 cho thấy phần trăm S-ovalbumin khi bảo quản ở 8 oC sau thời gian 7,
14 và 21 ngày lần lượt là 18, 26 và 24%; ở nhiệt độ bảo quản 25 oC, lượng Sovalbumin tương ứng sau 7 và 14 ngày là 56% và 60%. Smith và Back nghiên
cứu ảnh hưởng của pH lên sự chuyển đổi cấu trúc của ovalbumin và cho thấy
95% ovalbumin chuyển thành dạng S-ovalbumin ở pH 10, nhiệt độ 55 oC trong
20 giờ. Lượng S-ovalbumin chiếm tỷ lệ nhiều nhất ở pH 9,2 và ít nhất ở pH 7,9
[5].
1.2.2. Một số đặc tính của ovalbumin có tiềm năng nghiên cứu sử dụng trong
Dược phẩm
Lòng trắng trứng chứa một lượng lớn protein có hoạt tính kháng vi sinh
vật, đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên của trứng. Ovalbumin
và lysozym là hai protein chính tạo nên các đặc tính sinh học này của lòng trắng
trứng.
Các peptid tạo ra trong quá trình thủy phân ovalbumin nhờ các enzym tiêu
hóa được phát hiện là có hoạt tính chống lại Bacillus subtilus, E. coli, Bordetella
bronchiseptica, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens cũng như
Candida albicans [23].
Ovalbumin cũng có tiềm năng là một chất điều hòa miễn dịch, ovalbumin
cho thấy khả năng gây ra sự giải phóng yếu tố hoại tử u TNF-α trong nghiên cứu
in vitro, đồng thời các peptid có hoạt tính miễn dịch của ovalbumin được sử
dụng để tăng cường đáp ứng miễn dịch trong miễn dịch trị liệu ung thư. Hoạt
9


động thực bào của đại thực bào cũng được tăng cường khi thêm peptid OVA 7778 và OVA 126-134 [23].
Ovokinin, một peptid tách ra từ ovalbumin (OVA 358-365) và OV 359-364
cho thấy tác dụng làm giảm mạnh huyết áp tâm thu trong tăng huyết áp tự phát ở
chuột. Hai peptid ức chế enzym chuyển hóa angiotensin I (ACE) cũng được tìm
thấy trong ovalbumin là peptic (OVA 183-184) và tryptic (OVA 200218) [22,23]. Nghiên cứu của Fujita và cộng sự năm 2000 tiến hành thủy phân

ovalbumin với pepsin, trypsin và α-chymotrypsin cũng tạo ra 7 peptid ức chế
ACE bao gồm LKA, LKP, LAP, IKW, FQKPKR, FKGRYYP và IVGRRHQG,
trong đó một vài peptid đồng thời có tác dụng làm giảm nồng độ lipid trong máu
[2].
So với các polyme protein khác, ovalbumin được lựa chọn là một công cụ
dẫn truyền thuốc, đặc biệt trong kiểm soát phân bố thuốc nhờ tính chất dễ kiếm,
có nguồn gốc sinh học, giá thành rẻ, khả năng tạo gel, làm ổn định nhũ tương và
nhạy cảm với pH, nhiệt độ [31].
1.2.3. Các phương pháp đánh giá ovalbumin
Phương pháp định lượng: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ
ovalbumin trong dung dịch là đo độ hấp thụ quang của protein này tại bước sóng
hấp thụ cực đại. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp cũng thường
được sử dụng để định lượng ovalbumin nhờ hiệu quả và tính chính xác cao. Bên
cạnh đó, ovalbumin cũng được định lượng bằng các phương pháp định lượng
protein bao gồm: Phương pháp so màu (Biuret, Lowry, Bradford), phương pháp
dùng acid bicinchoninic (BCA), phương pháp phân tích amino acid sau khi thủy
phân protein, phương pháp định lượng nito Kjeldahl [32].
Phương pháp định tính: Để định tính ovalbumin, các phương pháp thường
được sử dụng là: HPLC, phương pháp điện di trên gel polyacrylamid, kĩ thuật
miễn dịch ELISA [3,10,11,13,28].

10


Phương pháp đánh giá độ tinh khiết: HPLC, điện di SDS-PAGE [34,10,13,28].
1.2.4. Các nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng
Ovalbumin là một trong những protein đầu tiên được tách ra từ lòng trắng
trứng. Nó được phân tách lần đầu tiên vào những năm 1900 bằng phương pháp
sử dụng dung dịch muối amoni sulfat nồng độ cao [8,14]. Mặc dù được phân lập
nhưng lượng muối sử dụng quá cao và độ tinh khiết của protein không được báo

cáo. Amoni sulfat bão hòa tiếp tục được sử dụng để tách ovalbumin bởi Warner
và Weber (1951) và Warner (1954) tuy nhiên độ tinh khiết của protein tách được
là thấp [28].
Năm 1940, Littlefield cùng cộng sự đã bào chế bột ovalbumin khô bằng
phương pháp dùng dung dịch acid clohydric acid hóa dung dịch lòng trắng trứng
về pH bằng điểm đẳng điện pI của ovalbumin. Kết tủa được tách khỏi dung dịch
bằng bộ lọc và sau đó được sấy khô [19].
Rhodes cùng cộng sự là những người đầu tiên sử dụng phương pháp sắc kí
cho mục đích phân tách ovalbumin từ trứng. Nhiều phép sắc kí khác nhau bao
gồm sắc kí trao đổi ion đã được tiến hành thử nghiệm để tinh chế ovalbumin từ
trứng. Geng F. cùng cộng sự đã phân lập được 4 protein của lòng trắng trứng gà
bao gồm lysozym, ovotransferrin, ovalbumin, ovoflavoprotein bằng chất kết tủa
polyethylen glycol, các protein này tiếp tục được tinh chế bằng sắc kí trao đổi
ion. Phương pháp HPLC được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của các protein
tinh chế được. Kết quả cho thấy độ tinh khiết của lysozym, ovotransferrin,
ovalbumin, ovoflavoprotein lần lượt là 91,84%, 94,55%, 96,45% và 88,16%
[13]. Tuy nhiên phương pháp này chỉ phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm,
khó để áp dụng trên quy mô lớn.
Năm 2009, Datta và cộng sự đã sử dụng công nghệ màng siêu lọc để tách
ovalbumin từ lòng trứng gà. Trong nghiên cứu này, hệ thống lọc 2 giai đoạn gồm
một màng lọc polyether sulfon (PES) 30 kDa và một màng lọc PES 50 kDa được
sử dụng, đồng thời dung dịch lòng trắng trứng được pha loãng bằng dung dịch
11


muối NaCl 200mM. Nghiên cứu cho thấy ovalbumin có độ tinh khiết cao
(98,7%) ở điều kiện áp suất màng 2,5 kgfcm-2, tốc độ khuấy 200 rpm, pH 2,5 và
tỷ lệ pha loãng dung dịch lòng trắng trứng 1:1 (v/v). Tuy nhiên nhược điểm của
phương pháp này liên quan đến đặc tính tạo bọt của protein lòng trắng trứng và
khó để thực hiện ở quy mô lớn. Việc kiểm soát áp suất, tốc độ khuấy, pH dung

dịch và pha loãng vật liệu trên màng cũng khó duy trì [10].
Trong vài thập kỉ gần đây, phương pháp sử dụng hệ hai pha thân nước
ABS (Aqueous Biphasic Systems) được nhiều nhà nghiên cứu thử nghiệm để
tinh chế protein. Saravan cùng cộng sự đã nghiên phân tách ovalbumin bằng hệ
ABS poly(ethylenglycol) (PEG)-poly(acrylic acid). Kết quả cho thấy có 87,4%
ovalbumin phân lập được [30]. Năm 2016, Pereira cùng các cộng sự đã nghiên
cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng sử dụng hệ ABS gồm một pha
polyme là polyethylen glycol và pha dung dịch đệm kali citrat/acid citric, thu hồi
65% ovalbumin từ pha polyme [28]. Nerli cùng cộng sự nghiên cứu nhiệt động
học liên quan đến sự phân tách của ovalbumin trên một vài hệ hai pha thân nước
khác nhau (được cấu tạo từ các PEG có khối lượng phân tử khác nhau và
dextran), chỉ ra rằng quá trình chuyển ovalbumin lên pha trên là quá trình tỏa
nhiệt, cho thấy có tương tác tĩnh điện giữa nhóm hydroxyl của PEG và chuỗi bên
thân nước của protein [25]. Hệ ABS gồm 16% (w/v) PEG 1000 và 17% (w/v)
kali phosphat cũng đã được Zhi cùng các cộng sự sử dụng để tinh chế
ovotransferrin, ovalbumin và lysozym từ lòng trắng trứng. Nghiên cứu cho kết
quả ovalbumin có độ tinh khiết cao (trên 95%) [35].
Abeyrathne cùng cộng sự đã tiến hành tách đồng thời ovalbumin,
ovotransferrin, ovomucin và lysozym bằng các phương pháp khác nhau.
Lysozym được tách trong bước đầu tiên nhờ sử dụng nhựa trao đổi ion FPC3500.
Phần dịch sau khi loại lysozym tiếp tục được điều chỉnh pH thích hợp để loại
ovomucin. Ovalbumin và ovotransferrin được tách khỏi dung dịch lòng trắng
trứng đã loại lysozym và ovomucin bằng cách thêm vào dung dịch amoni sulfat
và acid citric (nồng độ amoni sulfat và acid citric trong dung dịch tương ứng là
5% (w/v) và 2,5% (w/v)) để thu hồi kết tủa chứa ovotransferrin và phần dịch
12


lỏng chứa ovalbumin. Hiệu suất thu hồi ovalbumin và ovomucin là trên 98%, của
ovotransferrin và lysozym là trên 82%, độ tinh khiết của các protein đều trên

90%, ngoại trừ ovomucin (80%) [3].
Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng, phân tách và tinh chế ovalbumin từ một
phức hợp như lòng trắng trứng là một nghiên cứu khó khăn do sự xuất hiện của
rất nhiều protein khác nhau với các đặc tính tương tự nhau từ nguyên liệu thô.

13


CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu sử dụng
STT

Nguyên liệu
1

Amonium sulfat

2

Acid citric monohydrat

3

Acid chlohydric

4

Tris-hydrochloric

5

Sodium dodecyl sulfat

6

Dithiothreitol

7

Glycerol

8

Tris hydrochloric

9

Bromphenol blue

10

Gel polyacrylamid

11

EDTA

12

Coomassie brilliant blue

13

Trứng gà dưới 3 ngày tuổi

14

Nước cất

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Thiết bị nghiên cứu:
-

Máy ly tâm EBA 21 (HETTICH – Đức).