Xây dựng quy trình phân tích một số đa hình gen n acetyltransfarase 2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở người bệnh lao

ac
y,

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

an
d

Ph
a

rm

KIỀU HỒNG NHUNG

ed
ici
ne

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE 2
LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH Y ĐA KHOA

Co

py
rig

ht

@

Sc
ho

ol

of

M

Ở NGƯỜI BỆNH LAO

Hà Nội – Năm 2019


ac
y,

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

an
d

Ph
a

rm

KIỀU HỒNG NHUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

ed
ici
ne

MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE 2
LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID

of

M

Ở NGƯỜI BỆNH LAO

Sc
ho

ol

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH Y ĐA KHOA

: QH 2013.Y
: PSG.TS. Đinh Đoàn Long
ThS. Phạm Thị Hồng Nhung

Co

py
rig

ht

@

Khóa
Người hướng dẫn

Hà Nội – Năm 2019


LỜI CẢM ƠN

VN
U

Để hoàn thành quá trình nghiên cứu khóa luận này, lời đầu tiên tôi xin chân
thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Đoàn Long, ThS. Phạm Thị Hồng

Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người thầy đã
như kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

ac
y,

hướng dẫn trực tiếp, chỉ dạy nhiệt tình, tỉ mỉ và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức cũng
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS. Vũ Thị Thơm – Giảng viên Khoa Y

rm

Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội - cố vấn khoa học, người thầy đã luôn tận tâm giúp

Ph
a

đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi
có thể hoàn thành khóa luận này. Đồng thời, tôi xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thu Hà,
thành viên cùng nhóm nghiên cứu đã luôn tích cực giúp đỡ, chỉ dạy tôi rất nhiều trong

an
d

quá trình thực hiện các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.

Tôi xin cảm ơn Bộ Khoa học và công nghệ và Chương trình Newton Fund Việt

ed
ici
ne

Nam đã tài trợ kinh phí cho đề tài nghiên cứu KHCN cấp nhà nước (Mã số
HNQT/SPĐP/01.16) do PGS.TS Lê Thị Luyến chủ trì, mà đây là một nhánh đề tài
trong nghiên cứu đó.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Phổi
Hà Nội và Bệnh viện 74 Trung Ương đã cung cấp các mẫu phẩm phục vụ cho nghiên

M

cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô, các bạn thực tập tại Phòng thí
nghiệm – Bộ môn Y Dược học cơ sở đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện

of

nghiên cứu.

ol

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong

Sc
ho

Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong
quá trình học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và yêu thương tới gia đình và bạn
bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá

Co

py
rig

ht

@

trình thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2019
Tác giả

Kiều Hồng Nhung


VN
U

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Vi khuẩn kháng axit (Acid Fast Bacillus)

CYP2E1

Cytochrom P450 2E1

ddNTP

Dideoxynucleotide

DHPLC

Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance
liquid chromatography)

DILI

Tổn thương gan do thuốc (Drug-induced liver injury)

DNA

Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid)

EDTA

Chất chống đông Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

INH

Isoniazid

NAT1

Gen N-Acetyltransferase 1

NAT2

Gen N- Acetyltransferase 2

NAT2

Enzym N- Acetyltransferase 2

OD

Mật độ quang học (Optical Density)

PCR

Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase chain Reaction)

PGx

Dược di truyền học (Pharmacogenetics/-nomics)

RFLP

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment

M

ed
ici
ne

an
d

Ph

a

rm

ac
y,

AFB

Length Polymorphism)
Đa hình di truyền đơn nucleotit (Singles nucletotide

of

SNP

ol

polymorphisms)
Liều điều trị tiêu chuẩn (Standard Treatment Dose)

Sc
ho

STD

Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

Co

py
rig

ht

@

WHO


DANH MỤC CÁC BẢNG

VN
U

Trang

Bảng 1. 1. Ảnh hưởng của kiểu hình acetyl hóa tới chuyển hóa một số thuốc ...............4
Bảng 1. 2. Một số SNP phổ biến ở gen NAT2 .....................................................................7

ac
y,

Bảng 2. 1. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt ..................................................... 23
Bảng 3. 1. Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2............................. 27

Co

py
rig

ht

@

Sc
ho

ol

of

M

ed
ici
ne

an
d

Ph
a

rm

Bảng 3. 2. Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2 ............................... 30
Bảng 3. 3. Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam......... 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

VN
U

Trang

Hình 1. 1. Một số phản ứng chuyển hóa được xúc tác bởi NAT2 ....................................4
Hình 1. 2. Cấu trúc và vị trí gen NAT2 trên nhiễm sắc thể số 8 .........................................5

ac
y,

Hình 1. 3. Ảnh hưởng ở mức độ phân tử của các SNP NAT2 ............................................8
Hình 1. 4. Tỉ lệ mắc bệnh lao tại một số khu vực trên thế giới năm 2017 .......................9

rm

Hình 1. 5. Chuyển hóa isoniazid ở gan............................................................................... 12
Hình 1. 6. Số lượng người gặp tác dụng phụ của isoniazid từ 1997-2018 .................... 13

Ph
a

Hình 2. 1. Các bước tiến hành nghiên cứu ......................................................................... 20
Hình 2. 2. Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit ............................................................ 21
Hình 2. 3. Trình tự đoạn gen NAT2 được nhân dòng để xác định kiểu alen.................. 22

an
d

Hình 2. 4. Kết quả dự kiến cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7. ............................... 23
Hình 3. 1. Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2%. ......................................... 26
Hình 3. 2. Kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5%.. ... 27

ed
ici
ne

Hình 3. 3. Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu. .. 28
Hình 3. 4. Phân tích kiểu gen NAT2 dựa vào PCR - RFLP ............................................. 28
Hình 3. 5. Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9. ................ 30

M

Hình 4. 1. Các tần số phân bố của alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 tại một số vùng
và khu vực trên thế giới. ................................................................................... 34
Hình 4. 2. Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm trên 99 quần thể trên thế giới ......... 35

of

Hình 4. 3. Nồng độ INH sau 2 giờ của mỗi kiểu hình acetyl hóa ................................... 36

ol

Hình 4. 4. Tỷ lệ tổn thường gan do INH gây ra (INH-DILI) theo thời gian trong số 172

Co

py

rig

ht

@

Sc
ho

người bệnh. ......................................................................................................... 37


MỤC LỤC

VN
U

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................................... 1

ac
y,

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
1.1. Tổng quan về enzym N-Acetyltransferase 2 (NAT2) .................................................. 3

rm

1.2. Tổng quan về gen N-Acetyltransferase 2....................................................................... 5

1.2.1. Vị trí, cấu trúc và vai trò của gen NAT2 ............................................................... 5

Ph
a

1.2.2. Đa hình gen N-Acetyltransferase 2 ....................................................................... 6
1.3. Đặc điểm chung về bệnh lao và vai trò của isoniazid trong điều trị lao .................... 9

an
d

1.3.1. Đặc điểm chung về bệnh lao .................................................................................. 9
1.3.2. Điều trị và dự phòng lao ....................................................................................... 10

ed
ici
ne

1.3.3. Isoniazid trong điều trị lao.................................................................................... 11
1.3.3.1. Dược lý, chuyển hóa của isoniazid ............................................................ 11
1.3.3.2. Độc tính của INH với cơ thể ...................................................................... 12

M

1.3.4. Gen liên quan đến chuyển hóa isoniazid ở người.............................................. 14
1.4. Các nghiên cứu về đa hình di truyền NAT2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid

of

ở người bệnh lao. .................................................................................................................... 15

ol

1.5. Các phương pháp phân tích đa hình NAT2 .................................................................. 16

Sc
ho

CHƯƠNG 2. ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 19
2.1. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................................... 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 19

@

2.1.2. Hóa chất .................................................................................................................. 19

ht

2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................................... 19

py
rig

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 20
2.2.1. Thu mẫu sinh phẩm................................................................................................ 21

Co

2.2.2. Tách chiết DNA tổng số ....................................................................................... 21
2.2.3. Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR................................................................ 22

2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR...................................................................................... 23
2.2.5. Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP ........................................................ 23


2.2.6. Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp giải trình tự ................................ 24

VN
U

2.2.7. Xác định tần số của các SNP và dự đoán kiểu hình acetyl hóa ....................... 24
2.3. Đạo đức nghiên cứu........................................................................................................ 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................................ 26

ac
y,

3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................................ 26
3.2. Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR........................................................................ 26

rm

3.2.1. Tối ưu quy trình PCR ............................................................................................ 26

Ph
a

3.3.2. Nhân dòng gen NAT2 của 100 mẫu nghiên cứu ................................................ 27
3.3. Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP ................................................................. 28

an

d

3.4. Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình tự. ................................................................ 29
3.5. Kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2. .............................. 30
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN................................................................................................... 32

ed
ici
ne

4.1 Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2 ............................................. 32
4.1.1. Phương pháp PCR-RFLP ..................................................................................... 32
4.1.2. Phương pháp giải trình tự ..................................................................................... 32

M

4.2. Về đa hình di truyền NAT2 ............................................................................................ 33

of

4.2.1. Tần số alen và tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa............................................................ 33
4.2.2. Về mối liên quan giữa NAT2 và một số bệnh khác ........................................... 39

ol

KẾT LUẬN ............................................................................................................................ 40

Sc
ho

KIẾN NGHỊ........................................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Co

py
rig

ht

@

PHỤ LỤC


VN
U

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis là một trong các bệnh nhiễm

ac
y,

trùng mạn tính phổ biến nhất ở người. Bệnh gây nên các triệu chứng chủ yếu trên
đường hô hấp, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe và cuộc sống của người bệnh. Theo
công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam hiện đứng thứ 16/30 nước có
124.000 người trong đó 12.840 người tử vong do lao [40].

rm

gánh nặng bệnh lao cao nhất thế giới với số lượng người mới mắc năm 2017 là

Ph
a

Sau khi chẩn đoán mắc bệnh lao, người bệnh thường điều trị theo phác đồ của
Chương trình Chống lao Quốc gia [1]. Theo đó các thuốc chống lao hàng 1 gồm có 5
thuốc: Isoniazid (INH), Rifampicin, Ethambutol, Pyrazinamid, Streptomycin [1].

an
d

Trong đó, Isoniazid là thuốc then chốt trong điều trị và dự phòng lao do hiệu lực kìm
và diệt vi khuẩn lao cao. Đối với các người bệnh lao mới mắc và không đa kháng

ed
ici
ne

thuốc, hầu hết đều đáp ứng điều trị tốt với phác đồ hàng 1, tuy nhiên một tỷ lệ nào đó
gặp phải các tác dụng không mong muốn, một phần khác thất bại trong điều trị. Nhiều
trường hợp điều trị thất bại và gặp các tác dụng phụ đã được một số nghiên cứu trên
thế giới trước đây chỉ ra liên quan đến đột biến gen N- Acetyltransferase 2 (NAT2) gây
ra kiểu hình acetyl hóa chậm. Tùy vào vị trí đột biến mà làm biến đổi hoạt tính, cấu

M

trúc và độ bền enzym làm ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa isoniazid và các thuốc

of

chuyển hóa bởi NAT2 như hydralazin, procainamid, aminoglutethimid, sufasalazin,
nitrazepam, dapson [24]. Kiểu gen NAT2 quy định kiểu hình acetyl hóa với 3 kiểu

ol

hình acetyl hóa là acetyl hóa nhanh, acetyl hóa trung bình và acetyl hóa chậm [44].

Sc
ho

Một số nghiên cứu đã chứng minh, người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy
cơ tổn thương gan, gặp các tác dụng phụ và tỉ lệ thất bại khi điều trị với các thuốc
chuyển hóa bởi NAT2 cao hơn 2 kiểu hình còn lại [23, 46]. NAT2 ngoài liên quan đến
chuyển hóa một số thuốc nêu trên, nó còn đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa

@

một số hợp chất gây ung thư. Một số nghiên cứu chỉ ra sự liên quan giữa kiểu hình

ht

acetyl hóa và nguy cơ ung thư vú, ung thư bàng quang, ung thư đại trực tràng [10, 35].

py
rig

Trong các đột biến liên quan đến kiểu hình acetyl hóa, 6 alen NAT2*5

(c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11 (c.481C>T),
NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) được ghi nhận phổ biến và được nghiên

Co

cứu nhiều nhất ở một số quần thể trên thế giới [36, 37]. Việc xác định đột biến trên
gen NAT2 nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa biến đổi di truyền và đáp ứng thuốc có
thể giúp các bác sĩ lâm sàng cân nhắc điều chỉnh liều điều trị INH, hạn chế tác dụng
phụ của thuốc, qua đó nâng cao hiệu quả điều trị cho người bệnh. Đây chính là xu
1


hướng tối ưu hóa điều trị theo cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền trong phác đồ điều
trị đang được phát triển và mở rộng ứng dụng nhanh chóng trên thế giới. Tuy vậy, ở

VN
U

Việt Nam, việc nghiên cứu cũng như ứng dụng quy trình phân tích kiểu gen NAT2 vào

ac
y,

thực hành lâm sàng hầu như mới chỉ bắt đầu. Từ nhu cầu lâm sàng và tính cấp thiết
của việc tích hợp xét nghiệm gen NAT2 trong liệu trình chẩn đoán, điều trị người bệnh
mắc lao, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phân tích
một số đa hình gen N-acetyltransferase 2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở

rm

người bệnh lao” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:
Mục tiêu nghiên cứu:

Ph
a

- Xây dựng được quy trình phân tích một số đa hình di truyền gen NAT2 ở

an
d

người bệnh mắc lao tại Việt Nam.
- Áp dụng được quy trình đã tối ưu để bước đầu đánh giá mức độ đa hình di
truyền gen NAT2 trên 100 mẫu người bệnh lao ở Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu:

ed
ici
ne

- Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen mã hóa enzym NAT2.
- Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự.
- Khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen liên quan đến 6 đa hình SNP gồm
NAT2*5 (c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11

Co

py
rig

ht

@

Sc
ho

ol

of

tham gia nghiên cứu.

M

(c.481C>T), NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) ở nhóm người bệnh

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tổng quan về enzym N-Acetyltransferase 2 (NAT2)

VN
U

1.1.

Như chúng ta đã biết, hiệu lực của nhiều loại thuốc và các chất ngoại lai từ môi
trường tới cơ thể ngoài việc phụ thuộc vào các cơ chế truyền tin (cơ chế dược lực

ac
y,

học), còn phụ thuộc vào sự chuyển hóa và thải trừ thuốc của cơ thể (các cơ chế dược
động học). Trong các con đường chuyển hóa và thải trừ thuốc, sự acetyl hoá các thuốc

rm

bởi enzym N-Acetyltransferase (NAT, EC 2.3.1.5) [24, 62] là một cơ chế chuyển hoá
quan trọng giúp cơ thể tránh khỏi các phản ứng quá khích với thuốc và các chất độc

Ph
a

hại từ môi trường. Nhiều loại thuốc và hóa chất trong cơ thể có thể được NAT chuyển
thành các chất không độc và loại khỏi cơ thể, trong đó có cả các chất có khả năng gây
ung thư và gây độc cho cơ thể [14]. NAT là enzym xúc tác phản ứng acetyl hóa, qua

an
d

đó có xu hướng chuyển một chất gây độc cho cơ thể thành chất không hoặc ít độc.
NAT xúc tác phản ứng gồm N-Acetyl hóa, O-Acetyl hóa và N,O-Acetyl hóa, trong đó

ed
ici
ne

N-acetyl hóa (Hình 1.1) được chỉ ra là con đường hiệu quả nhất thực hiện biến đổi

sinh học các hợp chất amin thơm, hydralazin và một số chất gây ung thư [14]. NAT ở
người bao gồm 2 loại là N-Acetyltransferase 1 (NAT1) và N-Acetyltransferase 2
(NAT2). Enzym NAT1 có vai trò trong sự chuyển hóa các hợp chất folat, trong khi đó

M

NAT2 đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa một số hợp chất amin thơm và dị
vòng như isoniazid (một loại thuốc chống lao), hydralazin và endralazin (thuốc điều
trị tăng huyết áp), procainamid (thuốc điều trị loạn nhịp tim), aminoglutethimid ( một

of

chất ức chế tổng hợp hormon của tuyến thượng thận), nitrazepam (thuốc an thần) và

ol

dapson (thuốc điều trị bệnh phong) (Bảng 1.1) [24].

Sc
ho

NAT2 được phân bố chủ yếu ở gan, một phần ở ruột non và đại tràng trong khi
NAT1 có ở hầu hết các mô trong cơ thể [14]. Các gen mã hóa cả hai protein đều có
khung đọc mở dài 870 bp trên nhánh ngắn (vùng 22) của nhiễm sắc thể số 8 (vùng

@

8p22) [54]. Các biến thể di truyền trên gen NAT1 và NAT2 quyết định kiểu hình
acetyl hóa của mỗi cá thể ảnh hưởng đến đáp ứng với nhiều thuốc và các chất có nguy

ht

cơ gây ung thư. Tùy vào trình tự các nucleotid trên NAT2 của mỗi cá thể mà phân
chia ra ba nhóm kiểu hình là acetyl hóa là nhanh, trung bình và chậm [15]. Mối liên

py
rig

quan giữa kiểu hình acetyl hóa (được quyết định bởi NAT2) và nguy cơ mắc các bệnh
khác nhau đã được báo cáo từ nhiều năm nay. Năm 1960, lần đầu tiên các đa hình của
NAT2 được nghiên cứu liên quan đến chuyển hóa isoniazid, sau đó các nghiên cứu

Co

tiếp theo chứng minh sự liên quan đến các thuốc khác được đưa ra nhiều hơn, và ngày
càng chứng minh được tầm quan trọng của NAT đối với cơ chế giải độc của cơ thể
[12].
3


VN
U
ac
y,
rm
Ph
a
an
d

Hình 1. 1. Một số phản ứng chuyển hóa được xúc tác bởi NAT2 [14]

Kiểu hình
acetyl hóa
Chậm

Sulphamethoxazol

Chậm

Hydralazin

Chậm
Nhanh

ol
Chậm

Tăng mẫn cảm
Liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống
Giảm hiệu quả điều trị

Chậm

Tăng các phản ứng không mong muốn

Chậm

Gây độc với gan, gây buồn nôn, nôn

Procainamid

Chậm

Liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống

ht

Ảnh hưởng đến phenytoin và rifampicin

Phenelzin

Nhanh

Giảm đáp ứng điều trị

py
rig

Sc
ho

Isoniazid

Ảnh hưởng
Gây độc hệ thần kinh

of

Dapson

M

Tên thuốc

ed
ici
ne

Bảng 1. 1. Ảnh hưởng của kiểu hình acetyl hóa tới chuyển hóa một số thuốc [24]

p- Phenylenediamin

Chậm

Gây viêm da tiếp xúc

Ctrimoxazol

@

Sulphasalazin

Sự tiếp xúc với các chất độc hại từ thực phẩm hoặc từ môi trường làm việc

Co

(như khói thuốc lá, các hóa chất có chứa benzen..) sẽ làm con người dễ mắc một số
bệnh, đặc biệt là ung thư. Và kiểu hình acetyl hóa có thể làm tăng hoặc giảm nguy cơ
mắc ung thư đối với các cá thể có phơi nhiễm. Nguy cơ khác nhau giữa kiểu hình

4


acetyl hóa nhanh và chậm đã được nghiên cứu và chứng minh với một số bệnh như:
ung thư bàng quang, ung thư đại tràng, ung thư vú, bệnh lupus ban đỏ hệ thống [14],

VN
U

bệnh Parkinson và Alzheimer [11]. Đối với chuyển hóa thuốc, tính đa hình di truyền
của NAT2 được phát hiện lần đầu tiên ở những người bệnh lao điều trị bằng isoniazid
[47]. Các nghiên cứu sau đó đều chứng minh mối liên quan giữa kiểu hình acetyl hóa

ac
y,

và chuyển hóa isoniazid, từ đó đưa ra các phác đồ điều trị phù hợp cho mỗi kiểu hình
nhằm hạn chế tối đa ảnh hưởng không tốt của isoniazid lên cơ thể.
Tổng quan về gen N-Acetyltransferase 2

rm

1.2.

1.2.1. Vị trí, cấu trúc và vai trò của gen NAT2

Ph
a

Gen NAT2 trên vai ngắn nhiễm sắc thể số 8 (vùng 8p22) mã hóa enzym

an
d

arylamine N-Acetyltransferase 2. Gen NAT2 gồm hai exon, exon 1 (không mã hóa
protein) dài 100 bp nằm ở vị trí 8 kb ngược dòng của vị trí bắt đầu dịch mã, exon 2

@

Sc
ho

ol

of

M

ed
ici
ne

(mã hóa protein) là một khung đọc mở dài 870 bp như mô tả ở Hình 1.2 [54].

Hình 1. 2. Cấu trúc và vị trí gen NAT2 trên nhiễm sắc thể số 8[16]

ht

Việc xác định các đa hình NAT2 rất quan trọng trong việc thiết lập các khái

py
rig

niệm cơ bản trong dược lý học của các thuốc chuyển hóa bởi NAT2, trong đó
isoniazid là thuốc đầu tiên và điển hình. Enzym NAT2 có vai trò là trung tâm trong
chuyển hóa thuốc này, vì vậy sự biến đổi bất thường trên gen NAT2 gây ra nhiều ảnh

Co

hưởng khác nhau của cá thể với khả năng đáp ứng thuốc, tác dụng không mong muỗn
của thuốc và với sự gia tăng tỷ lệ một số bệnh khi đã tiếp xúc với yếu tố phơi nhiễm.

5


1.2.2. Đa hình gen N-Acetyltransferase 2

VN
U

Dự án giải trình tự hệ gen người hoàn thành vào năm 2004 và các nghiên cứu
sau này đã chứng minh rằng DNA hệ gen của phần lớn (hơn 7,5 tỷ người) chúng ta
đang sống khác biệt nhau chủ yếu là đa hình thay thế đơn nucleotit (Singles
nucletotide polymorphisms – SNP), một loại ʺđột biến điểmʺ có thể hoặc không dẫn

ac
y,

đến sự thay thế axit amin. SNP có ý nghĩa rất quan trọng vì nó là loại biến dị di truyền
phổ biến và ổn định. Sự biến đổi các SNP chung trong cả hệ gen được coi có ảnh

hưởng lớn đến phản ứng của mỗi người đối với bệnh tật, với các nhân tố môi trường

rm

(như vi khuẩn, vi rút, các độc tố và hóa chất), các thuốc và các liệu pháp điều trị khác

Ph
a

nhau. Sự tiến bộ trong các nghiên cứu di truyền học và dược lý học đã chứng tỏ bản
chất di truyền của sự khác biệt giữa các cá thể trong đáp ứng các yếu tố bất lợi của
môi trường (như các chất độc) và đáp ứng thuốc. SNP giải thích sự biến đổi trong hoạt

an
d

động của enzym với chuyển hóa thuốc làm tăng hoặc giảm độ thanh thải thuốc, qua đó
tác động đến đáp ứng điều trị [38]. Mặc dù tác động của từng SNP đến sự hình thành

ed
ici
ne

bệnh là tương đối yếu nhưng sự kết hợp của chúng có thể làm thay đổi đáng kể nguy
cơ gây bệnh. Cùng với đó là sự liên quan đến khả năng đáp ứng, khả năng hấp thụ và
chuyển hóa của nhiều thuốc. Do có cấu trúc đơn giản, chỉ thay đổi một nucleotit nên
các kĩ thuật sinh học phân tử có thể xác định nhanh kiểu gen và dự đoán hiệu quả của
kiểu gen lên đáp ứng thuốc của mỗi cá thể. Các nhà di truyền y học hy vọng trong

M

tương lai có thể hoàn thiện bản đồ các SNP có liên quan đến các bệnh lý, tiến đến việc
giải mã chức năng của các gen ở mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ mắc bệnh, từ

of

đó có lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng bệnh và điều trị của từng cá thể.

ol

Đa hình NAT2 cho thấy một quan điểm mới về lĩnh vực dược lý học, đây là một

Sc
ho

trong những đa hình về chuyển hóa thuốc đầu tiên được ghi nhận tương đối hệ thống
trong nhiều quần thể người [12]. Ngay từ năm 1953, các nghiên cứu bắt đầu chứng

@

minh được mối liên quan giữa đa hình NAT2 với hiệu quả lâm sàng, cụ thể là sự gia
tăng tần số và mức độ tác dụng phụ của thuốc chống lao isoniazid trên một số người
bệnh [42]. Năm 1960, kết quả về mối liên quan trên được công bố bởi Evan và cộng

ht

sự [12], đến năm 1965 danh pháp quốc tế về gen NAT đã được công bố lần đầu tiên và

py
rig

được áp dụng trên toàn thế giới vào các nghiên cứu sau đó [30]. Các nghiên cứu tiếp
theo về NAT2 đều chỉ ra rằng có 3 kiểu hình acetyl hóa là acetyl hóa nhanh (3 alen
nhanh), acetyl hóa trung bình (2 alen nhanh, 1 alen chậm) và acetyl hóa chậm (nhiều
hơn 1 alen chậm) [15]. Hiện nay, các nhà di truyền học đã xác định được alen kiểu dại

Co

hay còn gọi là kiểu alen không có đột biến, alen kiểu dại được qui ước là NAT2*4. Các
đột biến dưới dạng SNP có thể xuất hiện duy nhất trong đoạn gen hoặc xuất hiện đồng
thời với các đột biến khác được gọi là các halotype hay biến thể di truyền. Hiện nay,
6


trên thế giới đã tìm thấy tổng cộng 108 halotype, trong đó một số halotype được tìm ra
đã được chứng minh ảnh hưởng của nó đối với kiểu hình acetyl hóa [5]. Một ví dụ

VN
U

điển hình về halotype được tìm thấy là alen NAT2*5, một trong các alen gây ra kiểu
hình acetyl hóa chậm. Alen này được xác định khi có sự thay thế axit amin isoleucin
thành threonin ở vị trí c.341T>C , halotypee NAT2*5A được xác định khi có 2 vị trí

ac
y,

cùng xảy ra sự thay thế axit amin là c.341T>C và c.481C>T [5]. Bên cạnh alen kiểu
dại NAT2*4 là các halotype khác NAT2*12A-C, *13A, *18 liên quan đến kiểu hình
có liên quan đến kiểu hình acetyl hóa chậm (Phụ lục 1).

rm

acetyl hóa nhanh và các halotype NAT2*5A-J, *6A-E, *7, *12D, *14A-G, *17 và *19

Kiểu hình
acetyl hóa
Chậm

Ảnh hưởng chức
năng
Giảm hoạt tính
NAT2

Arg197Gln

Chậm

ed
ici
ne

Ph
a

Bảng 1. 2. Một số SNP phổ biến ở gen NAT2 [31, 38, 56]

Chậm

Giảm độ bền NAT2

Giảm hoạt tính
NAT2

Leu161Leu

Nhanh

Không gây biến đổi

Arg268Lys

Nhanh

Không gây biến đổi

Nhanh

Không gây biến đổi

Mã tra
cứu

Vị trí

Axit amin
thay thế

NAT2*5

rs1801280

341T>C

Ile114Thr

NAT2*6

rs1799930

590G>A

NAT2*7

rs1799931

857G>A

Gly286Glu

NAT2*11

rs1799929

481C>T

NAT2*12

rs1208

803A>G

NAT2*13

rs1041983

282C>T

M

an
d

Alen

Tyr94Tyr

of

Trong các đa hình gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm, 3 alen NAT2*5, *6, *7
được nghiên cứu nhiều nhất, bởi tỷ lệ đột biến trong 3 vị trí này được tìm thấy nhiều

ol

hơn hẳn các vị trí khác, đồng thời ảnh hưởng của 3 SNP trên cũng rõ ràng hơn [19].

Sc
ho

Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng 6 alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 được dùng
phổ biến hơn (Bảng 1.2) [5, 41], đặc biệt trong các nghiên cứu có sử dụng phương

pháp giải trình tự. Đối với kiểu hình dựa trên 3 SNP, các nhóm cá thể có kiểu hình

@

acetyl hóa nhanh có kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại ở cả 3 vị trí SNP (T341C, G590A,
G857A). Các cá thể có kiểu hình acetyl hóa trung bình có kiểu gen dị hợp tử về alen

ht

đột biến ở một trong 3 vị trí NAT2*5, *6 hoặc *7. Những người acetyl hóa chậm là

py
rig

những người có trên một alen đột biến trong 3 SNP trên. Tuy nhiên, các nghiên cứu tại
các vị trí địa lý khác nhau trên thế giới cho kết quả tỷ lệ các kiểu hình acetyl hóa có sự
khác biệt ở mỗi quốc gia và vùng địa lý. Đối với kiểu hình 6 SNP, xác định kiểu hình
Từ năm 2009 ứng dụng trên web là

Co

acetyl hóa được cho là chính xác hơn.

NAT2PRED (của tác giả Igor B. Kuznetsov) cho phép xác định kiểu hình acetyl hóa
thông qua kiểu gen ở 6 vị trí NAT2 *5, *6, *7, *11, *12, *13. Trên bài báo công bố về
web NAT2PRED có chỉ ra tỷ lệ khác biệt giữa kiểu hình dựa trên 3 SNP và 6 SNP, sự
7


khác biệt này là không lớn, nhưng việc xác định kiểu hình dựa trên 6 SNP được ưu

VN
U

tiên hơn [31, 65].
Một số vị trí đột biến thay thế gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm được biểu thi ở
Hình 1.3. Alen đột biến NAT2*5 (c.341T>C) làm thay thế isoleucin ở vị trí 114 thành
threonin gây giảm hoạt tính enzym, tuy nhiên đột biến này không thể xác định bằng

ac
y,

RFLP. Vì vậy, hầu hết các nghiên cứu đều phân tích alen c.481C>T (là một đột biến
câm liên kết với c.341) như là một biến thể đại diện của NAT2*5, vì khi xảy ra đột

M

ed
ici
ne

an
d

Ph
a

rm

biến ở vị trí c.481 thì cũng xảy ra đột biến ở NAT2*5 và ngược lại [38, 58].

of

Hình 1. 3. Ảnh hưởng ở mức độ phân tử của các SNP NAT2 [56]. Hình 3D của

ol

NAT2 và các SNP phổ biến xác định kiểu hình acetyl hóa gồm NAT2*5 (Ile114Thr,vị
trí số 2), NAT2*6 (Arg197Gln, vị trí số 7), NAT2*7 (Gly286Glu,vị trí số 10) và

Sc
ho

NAT2*12 (Arg268lys, vị trí số 8)

Đột biến ở alen NAT2*6 (c.590G>A) dẫn đến làm giảm độ bền của NAT2 do sự
thay thế axit amin Arginin bằng Glycin. Đột biến alen NAT2*7 (c.857G>A) làm biến

@

đổi cấu hình lập thể tại trung tâm xúc tác của enzym qua đó làm giảm hoạt tính của

ht

enzym. Các SNP tại 3 vị trí trên dẫn đến thay đổi hoạt độ, độ ổn định, ái lực của
enzym NAT2 với cơ chất, hậu quả là gây ra các biến đổi về nồng độ của các hợp chất

py
rig

không tốt trong cơ thể và gây ra các biểu hiện trên lâm sàng [50]. Các halotype
NAT2*11A, NAT2*12A và NAT2*13A gây ra kiểu hình acetyl hóa nhanh được cho là
không ảnh hưởng đến hoạt tính enzym NAT2, tuy nhiên sự xuất hiện của các alen

Co

nhanh nàycó thể liên quan đến sự tăng giảm một số chất chuyển hóa của thuốc khác.
Các nghiên cứu trước đây về đặc điểm chức năng của các đa hình NAT2 cho thấy các
cơ chế phân tử khác nhau của kiểu hình acetyl hóa chậm, cuối cùng đều gây giảm biểu
8


hiện protein mRNA và protein NAT2. Đặc biệt là khi có sự hiện diện của NAT2*5B,

1.3.

VN
U

NAT2*6D và NAT2*14G [8, 57] .
Đặc điểm chung về bệnh lao và vai trò của i soniazid trong điều trị lao

1.3.1 Đặc điểm chung về bệnh lao

ac
y,

Bệnh lao ở người do vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn kháng cồn kháng axit
(Acid fast bacilli, AFB) gây ra, trong đó chủ yếu là do vi khuẩn lao người
(Mycobacterium tuberculosis hominis). Đây là một trong những nguyên nhân hàng

HIV/AIDS

(Human

Immuno-deficiency

Virus/

rm

đầu gây tử vong trên toàn thế giới [2]. Thêm vào đó, sự xuất hiện của đại dịch
Acquired

Immuno

Deficiency

Ph
a

Syndrom, Vi rút gây Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người đã làm cho
bệnh lao bùng phát trở lại và đáng sợ hơn, đặc biệt là trong những năm cuối của thế kỉ

an
d

XX tỷ lệ người mắc và chết do lao đã gia tăng mạnh mẽ. Năm 1993, WHO đã tuyên
bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu về bệnh lao và mối hiểm họa kháng thuốc trong tương
lai. Trong công bố của WHO về dịch tễ lao, năm 2017 có 10 triệu người mắc bệnh lao

ed
ici
ne

với hơn 1,3 triệu người tử vong do lao, trong đó một số khu vực và vùng lãnh thổ có
tỷ lệ mắc khá cao, đặc biệt là khu vực Châu Phi như bản đồ phân bố ở Hình 1.4.
Trong số các ca tử vong năm 2017, có khoảng 1,3 triệu người âm tính với HIV và
300.000 người dương tính với HIV [40]. Năm 2017 Việt Nam có 124.000 người mắc

M

mới với 12.840 ca tử vong do lao. Hiện tại, Việt Nam hiện đang xếp thứ 16/30 nước

Sc
ho

ol

kháng thuốc [40].

of

có gánh nặng bệnh lao cao trên thế giới và thứ 13/30 nước có gánh nặng bệnh lao đa

ht

@

Việt Nam

Co

py
rig

Số ca mắc

Hình 1. 4. Tỉ lệ mắc bệnh lao tại một số khu vực trên thế giới năm 2017 [64]
9


Bệnh lao diễn biến qua 2 giai đoạn là nhiễm lao và lao bệnh. Vi khuẩn lao có
thể gây bệnh ở tất cả các bộ phận trên cơ thể người, trong đó phổ biến nhất là lao phổi.

VN
U

Giai đoạn nhiễm lao xảy ra khi vi khuẩn xâm nhập lần đầu tiên vào cơ thể chưa bao
giờ tiếp xúc với lao. Vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường hô hấp vào
tận phế nang gây tổn thương viêm phế nang, sau khoảng 3 tuần đến 3 tháng dưới tác

ac
y,

động của vi khuẩn lao, cơ thể có sự chuyển biến về mặt sinh học, hình thành dị ứng và
miễn dịch với vi khuẩn lao. Người bị lây ở tình trạng nhiễm lao, lúc này trong cơ thể
người bị nhiễm đã có kháng thể kháng lao và phản ứng Tuberculin có thể dương tính.

rm

Đa số người bị bệnh chỉ ở tình trạng nhiễm lao (khoảng 80% - 90%) không chuyển
sang giai đoạn lao bệnh. Khoảng 10% -20% người nhiễm lao sẽ chuyển sang giai đoạn

Ph
a

bệnh lao khi sức đề kháng của cơ thể giảm, số lượng và độc tính của vi khuẩn tăng.
bệnh mạn tính, các bệnh toàn thân khác [3].

an
d

Đặc biệt ở những người thuộc nhóm suy giảm miễn dịch như HIV/AIDS hoặc có các
Vi khuẩn lao ở cơ quan bộ phận nào thì sẽ gây nên các triệu chứng thuộc về

ed
ici
ne

mỗi cơ quan bộ phận đó. Do triệu chứng ở giai đoạn sớm thường khó phát hiện, vì vậy
bệnh chỉ được phát hiện khi đã có các biểu hiện rõ ràng. Các triệu chứng hay gặp nhất
là triệu chứng toàn thân và triệu chứng thuộc đường hô hấp như: da xanh xao, người
mệt mỏi, ăn kém, gầy sút cân, ho kéo dài, sốt nhẹ về chiều (37 o5 đến 38 o C) kèm ra mồ
hôi về ban đêm... Tuy nhiên, do các triệu chứng thường mơ hồ, khó xác định và dễ

M

nhầm với các triệu chứng thuộc các bệnh khác, vì vậy bệnh lao được chẩn đoán xác
định khi tìm thấy vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (đờm, dịch dạ dày, dịch phế quản).

of

Các kĩ thuật xác định vi khuẩn lao gồm 2 nhóm chính là kĩ thuật cổ điển và hiện đại.

ol

Các kĩ thuật cổ điển gồm: kĩ thuật nhuộm soi trực tiếp Ziehl - Neelsen (còn gọi là kĩ
thuật nhuộm AFB), phương pháp nuôi cấy, phương pháp tiêm truyền súc vật. Nhóm

Sc
ho

các kĩ thuật hiện đại gồm: phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain Reaction PCR), phương pháp khuếch đại trực tiếp (Amplified direct test), phản ứng miễn dịch
gắn men (Enzym Linked Immunosorbent Assay – ELISA), Xpert/MTB và nhiều kĩ

@

thuật khác [2, 3].

ht

1.3.2 Điều trị và dự phòng lao

py
rig

Điều trị lao: Mỗi nước trên thế giới đều có một phác đồ điều trị lao riêng,

nhưng đều có đặc điểm chung là đều dựa vào chiến lược chống lao do WHO khuyến
cáo là chiến lược DOTS (Directly Observed Treatment Short Course) điều trị hóa trị

liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp. Dựa trên DOTS, Chương trình Chống lao Quốc

Co

gia Việt Nam đã đưa ra phác đồ điều trị cho các loại bệnh lao. Trong đó lao mới mắc
sử dụng phác đồ I gồm các thuốc chống lao hàng 1 là isoniazid, rifampicin,
streptomycin, pyrazinamid, ethambutol. Phác đồ cụ thể là sử dụng 4 loại thuốc
10


streptomycin, isoniazid, rifampicin, pyrazinamid

đối với người lớn và rifampicin,

isoniazid, pyrazinamid với trẻ em hàng ngày trong 2 tháng đầu, 6 tháng tiếp theo dùng

VN
U

2 loại thuốc isoniazid, ethambutol cho người lớn và rifampicin, isoniazid cho trẻ em
hàng ngày. Người bệnh điều trị thuốc lao cần được theo dõi đánh giá đáp ứng lâm
sàng và các tác dụng phụ của thuốc để điều chỉnh kịp thời. Các người bệnh lao AFB

ac
y,

dương tính sẽ được xét nghiệm đờm vào tháng thứ 2, thứ 5 và thứ 7. Điều trị được coi
là thất bại nếu từ tháng thứ 5 xét nghiệm AFB vẫn dương tính [1].

Dự phòng lao: Vaccin BCG được sử dụng dự phòng trong trường hợp chưa

rm

nhiễm lao, các người bệnh nhiễm lao sẽ được dự phòng bằng uống INH trong vòng 6

an
d

1.3.3.1. Dược lý, chuyển hóa của isoniazid

Ph
a

tháng đến 1 năm để làm giảm tỷ lệ chuyển sang giai đoạn bệnh lao.
1.3.3 Isoniazid trong điều trị lao

Isoniazid (còn gọi là isonicotinylhydrazid, viết tắt là INH), là một thuốc chính
trong điều trị bệnh lao. Hóa chất này được tổng hợp ở Praha năm 1912 nhưng đến năm

ed
ici
ne

1952 mới biết được tác dụng của INH với vi khuẩn lao. INH kìm hãm sự sinh trưởng
và diệt vi khuẩn lao ở cả trong và ngoài tế bào. Cơ chế tác dụng của thuốc là thông
qua sự ức chế hình thành axit mycolic có ở thành trực khuẩn lao [3]. Sau khi uống,

M

INH hấp thu qua ruột vào máu: 40% ở dạng tự do, một phần kết hợp với axit amin

trong máu thành hydrazol; INH ở dạng tự do và hydrazol có tác dụng với vi khuẩn lao,
phần dư thừa còn lại được chuyển hóa ở gan tạo thành các hợp chất không có tác dụng

of

với vi khuẩn lao. Tại gan, 50% - 90% INH được acetyl hóa bởi enzym NAT2 như

ol

Hình 1.5 tạo thành acetyl isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị thủy phân tạo thành acetyl
hydrazin.

Sc
ho

Một con đường khác là INH có thể bị thủy phân trực tiếp tạo ra hydrazin [28].
Sau đó NAT2 xúc tác quá trình acetyl hóa của hydrazin tạo acetyl hydrazin và diacetyl
hydrazin. Acetyl hydrazin và hydrazin có thể bị oxi hóa bởi Cytochrom P450 2E1 tạo

@

thành các hợp chất trung gian gây độc cho cơ thể [53]. Hydrazin là một chất độc với
các tế bào gan do có khả năng gây hoại tử tế bào. Vì vậy, trong trường hợp hoạt tính

py
rig

ht

NAT2 thấp, hydrazin sẽ tăng nồng độ trong máu đồng thời chuyển hóa chủ yếu theo

con đường bởi CYP2E1, tạo ra các sản phẩm trung gian gây độc với gan. Các chất
chuyển hóa của INH được thải trừ ra khỏi cơ thể chủ yếu qua hệ tiết niệu (chiếm 80%)
[28]. Đặc tính dược động học của thuốc bị ảnh hưởng bởi các yếu tố cụ thể của từng

Co

người bệnh như tình trạng di truyền, tuổi, cân nặng, bệnh đi kèm và các thuốc dùng
đồng thời với INH.

11


VN
U
ac
y,
rm
Ph
a
an
d
ed
ici
ne

Hình 1. 5. Chuyển hóa isoniazid ở gan[61] (CYP2E1: Cytochrom P450 2E1;
NAT2: N-Acetyltransferase 2; GST: Glutathion S-transferase)

M

Nồng độ ức chế tối thiểu trong huyết thanh của INH với vi khuẩn lao là
0,04 µg/mL. Nồng độ của INH trong huyết thanh của mỗi người khác nhau phụ thuộc
vào kiểu hình acetyl hóa của cá thể. Khi uống INH liều 5 mg/kg sau 1-2 giờ sẽ đạt

of

nồng độ tối đa trong huyết tương trung bình là 3-5 µg/mL [3].
Liều chuẩn theo phác đồ của Bộ y tế là với INH là 5 mg (4-6 mg)/kg/ngày cho

ol

cả trẻ em và người lớn, liều hàng ngày tối đa là 300 mg, nên uống một lần lúc đói.

Sc
ho

Liều cách quãng 3 lần/tuần là 10 mg/kg thể trọng (8-12 mg), liều cách quãng 2
lần/tuần là 15 mg/kg thể trọng (13-17 mg) [1].
1.3.3.2. Độc tính của INH với cơ thể

@

Tương tác thuốc: Isoniazid ức chế chuyển hóa một số thuốc. Khi dùng kết hợp
isoniazid với các thuốc này có thể làm tăng nồng độ trong huyết thanh và làm tăng độc

ht

tính của thuốc phối hợp, nhất là các thuốc chữa động kinh. Các thuốc khi phối hợp với

py

rig

isoniazid phải điều chỉnh liều gồm có alfentanil, các chất chống đông máu dẫn chất
coumarin, dẫn chất

indandion, các

benzodiazepin, carbamazepin, theophylin,

phenytoin, enfluran, disulfiram và cycloserin [21]. Khi dùng đồng thời rifampicin,

Co

acetaminophen, rượu với isoniazid có thể làm tăng độc tính với gan, đặc biệt ở người
có tiền sử suy gan. Isoniazid làm giảm nồng độ ketoconazole (thuốc điều trị nấm)
trong huyết thanh, vì vậy làm giảm tác dụng điều trị nấm của thuốc này. Các corticoid
làm tăng thải trừ isoniazid, vì vậy làm giảm nồng độ và tác dụng của isoniazid, đặc
12


biệt ở những người bệnh chuyển hóa isoniazid nhanh. Các thuốc kháng axit, đặc biệt
muối nhôm làm giảm hấp thu isoniazid.

VN
U

Tác dụng phụ: Các tác dụng phụ của INH phổ biến nhất là tác dụng trên hệ thần
kinh và gan. Các chất chuyển hóa của INH gồm acetyl hydrazin và hydrazin có thể bị
oxy hóa bởi enzym CYP2E1 tạo thành các chất trung gian gây độc cho cơ thể, đặc biệt

ac
y,

là gây tổn thương gan. Theo Cục quản lý chất lượng thực phẩm và dược phẩm Hoa Kì
(US Food and Drug Administration, FDA) thống kê, giai đoạn 1997 – 2018 tỷ lệ gặp
tác dụng phụ của INH theo thời gian dùng thuốc được thể hiện trên biểu đồ Hình 1.6.

rm

Theo đó, các tác dụng phụ có tỷ lệ tặng dần từ năm 1997 đến năm 2018, có sự gia tăng
rõ vào các năm 2011, 2017 và 2018. Năm 2018 theo báo cáo của 30 tác giả gửi về, có

ed
ici
ne

an
d

Ph
a

1049 trường hợp gặp các tác dụng phụ điển hình khi dùng INH [67].

Hình 1. 6. Số lượng người gặp tác dụng phụ của isoniazid từ 1997-2018 [67].

M

Trên hệ thần kinh, bệnh lý thần kinh ngoại biên là tác dụng phụ phổ biến
nhất, do INH làm tăng quá trình đào thải vitamin B6 qua đường tiết niệu. Triệu

of

chứng khởi phát thường là dị cảm bàn tay và chân. Tỷ lệ gặp các triệu chứng này
cao hơn ở những người có kiểu hình acetyl hóa chậm. Các tác dụng trên hệ thần

ol

kinh ít gặp hơn là co giật, viêm dây thần kinh thị giác, rối loạn tâm thần [21].

Sc
ho

Tại gan, INH có thể gây viêm gan với các triệu chứng chán ăn, buồn nôn,
nôn, mệt mỏi. Người bệnh sử dụng INH có thể có nồng độ transaminase huyết
thanh (AST, ALT), bilirubin máu, bilirubin nước tiểu tăng trong đợt điều trị vào

@

bất kì thời điểm nào, nhưng thường tăng trong 1 đến 3 tháng đầu và sau đó trở lại
bình thường. Tuy nhiên vẫn có 20% người bệnh men gan tăng cao gấp 3-5 lần và 1-

ht

2% người bệnh bị nhiễm độc gan nặng do thuốc kháng lao [28]. Viêm gan do INH

py
rig

hay diễn ra ở người tuổi cao, nữ giới (đặc biệt đang trong thai kỳ), trọng lượng cơ

thể thấp hoặc suy dinh dưỡng, nghiện rượu, chức năng gan bất thường hoặc ghép
gan, nhiễm viêm gan B và C mãn tính, AIDS và một số bệnh suy giảm miễn dịch

Co

[28]. Các tác dụng phụ khác có thể gặp gồm: buồn nôn, nôn, đau thượng vị, viêm
tụy; thiếu máu, giảm hoặc mất bạch cầu hạt; thiếu hụt pyridoxine, tăng đường
huyết, toan chuyển hóa; lupus ban đỏ hệ thống, thấp khớp; sốt, viêm da…
13


1.3.4 Gen liên quan đến chuyển hóa isoniazid ở người

VN
U

Tổn thương gan do thuốc (drug-induced liver injury, DILI) chống lao gây ra
là một tác dụng phụ phổ biến và nghiêm trọng của thuốc chống lao, tuy nhiên đa
phần tác dụng gây tổn thương gan là do INH gây ra. Sự khác biệt về độc tính của
INH gây ra là do sự biến đồi về di truyền ở một số gen như N- acetyltransferase 2

ac
y,

(NAT2), Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1), glutathione S – transferase M1
(GSTM1), glutathione S – transferase T1 (GSTT1) [22], HLA DQA1/DQB1 [52].

rm

Đột biến gen NAT2 gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm làm ảnh hưởng đến

nồng độ và hoạt độ xúc tác của enzym như đã trình bày trong phần 1.2. Trong

Ph
a

trường hợp NAT2 thấp, con đường chuyển hóa của INH có thể chuyển sang
CYP2E1 gây tăng các sản phẩm trung gian gây độc cho gan, đồng thời làm tăng
nồng độ hydrazin làm gia tăng mức độ và tần số các tác dụng không mong muốn

an
d

[43, 59]. NAT2 đóng vai trò gián tiếp trong việc gây ra các tác dụng độc khác khi
INH phối hợp với rifampicin và một số thuốc chống lao khác. Khi phối hợp INH và

ed
ici
ne

rifampicin, rifampicin sẽ làm giảm hoạt độ NAT2 và hoạt động như một chất gây
cảm ứng mạnh với CYP2E1 gây ra tăng các chất độc. Một nghiên cứu khác cũng
chỉ ra INH và các chất chuyển hóa độc của có gây ra tăng độc tính của pyrazinamid
với tế bào gan [50].

M

CYP2E1 là gen mã hóa cho enzym CYP2E1 có tác dụng chuyển hóa thuốc ở
gan. CYP2E1 xúc tác quá trình oxy hóa acetyl hydrazin và Hydrazin tạo ra các chất

of

trung gian gây độc cho cơ thể. Hoạt tính của CYP2E1 cũng được quyết định bởi đa
hình tại một số vị trí trong gen, hoạt tính cao hơn của enzym này có thể làm tăng sự

ol

tổng hợp của các chất độc cho gan. Các nghiên cứu cho thấy người bệnh mang kiểu

Sc
ho

gen CYP2E1 kiểu dại (CYP2E1 *1A/*1A) có nguy cơ nhiễm độc gan cao hơn so
với CYP2E1 dạng đột biến. Nhiều nghiên cứu chứng minh DILI của người bệnh có

@

CYP2E1 kiểu dại tăng lên khi người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm [59].
Các enzym thuộc họ Glutathione S-Transferase (GST) có khả năng giải độc
cho cơ thể, chúng chuyển các chất trung gian gây độc hoặc các sản phẩm oxy hóa

ht

thành chất ít hoặc không gây độc và giúp cơ thể đào thải ra ngoài. GST tham gia

py
rig

quá trình chuyển hóa của thuốc điều trị lao thông qua các phản ứng liên hợp các
chất chuyển hóa trung gian gây độc ở dạng tiềm ẩn [28]. Sự thiếu hụt GST trong cơ
thể người mà cụ thể là GSTM1 (Glutathione S - Transferase M1) và GSTT1

Co

(Glutathione S - Transferase T1) đã được báo cáo là có liên quan đến độc tính gan.
Sự thiếu hụt hoạt tính GST do sự đồng hợp tử tại locus GSTM1 và GSTT1 có thể
ảnh hưởng đến tính nhạy cảm với độc tính gan do INH gây ra. Nguy cơ nhiễm độc
gan do INH ở người bệnh Ấn Độ có GSTM1 đồng hợp tử đột biến đã tăng so với
14


nhóm còn lại [20]. Một nghiên cứu ở Đài Loan cho thấy nhóm người bệnh có kiểu
gen GSTM1 đồng hợp tử đột biến có nguy cơ nhiễm độc gan do INH gây ra gấp

VN
U

đôi, điều này không xảy ra ở những người mang GSTT1 đồng hợp tử kiểu dại [20].
Việc xác định kiểu gen GSTM1 đồng hợp tử kiểu dại có thể giúp phòng ngừa và
quản lý tốt hơn khả năng gây độc gan do isoniazid.
Các nghiên cứu về đa hình di truyền NAT2 liên quan đến đáp ứng điều trị

ac
y,

1.4

isoniazid ở người bệnh lao.

INH được sử dụng để điều trị lao từ năm 1952, đến năm 1954 các nhà khoa học

rm

đã chứng minh kiểu hình acetyl hóa chậm liên quan đến sự gia tăng các tác dụng phụ

Ph
a

về thần kinh (cụ thể là bệnh lý thần kinh ngoại biên) ở người bệnh lao điều trị INH.
Sau đó sự liên quan của INH với các đa hình NAT2 được báo cáo lần đầu tiên bởi
Evans và cộng sự. Vào năm 1960, các tác giả đã xác định hai nhóm kiểu hình riêng

an
d

biệt: acetyl hóa nhanh và acetyl hóa chậm [12]. Đây là một trong các nghiên cứu sớm
nhất về dược động học của quá trình chuyển hóa thuốc. Tuy nhiên, lúc này các nhà di

ed
ici
ne

truyền học mới chỉ chứng minh sự nhiễm độc gan do INH gây ra, còn sự liên quan của
đa hình di truyền NAT2 đối với đáp ứng INH chưa rõ ràng. Mặc dù acetyl hoá chậm
được chứng minh là có nguy cơ tăng tác dụng phụ INH (cụ thể là độc với hệ thần
kinh), nhưng không cần thiết phải tiến hành các xét nghiệm di truyền để dự đoán tác
dụng phụ này bởi vấn đề này có thể được ngăn chặn bằng cách sử dụng

thêm

M

pyridoxine, một phương pháp khá rẻ và an toàn [17].
Năm 1985, Weber WW và Hein DW đưa ra các báo cáo đầy đủ và rõ ràng hơn

of

về dược động học quá trình acetyl hóa của isoniazid [55]. Năm 1991, gen NAT2 được

ol

nhân bản thành công đã cho phép xác định 2 alen đầu tiên có liên quan đến kiểu hình

Sc
ho

acetyl hóa chậm (đến năm 1995 theo danh pháp quốc tế về NAT2, 2 alen đó gọi là
NAT2*5 và NAT2*6) [17]. Đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu xác định tỷ lệ kiểu
hình acetyl hóa trong các quần thể người khác nhau cũng như mối liên quan giữa kiểu
hình acetyl hóa với các tác dụng phụ của INH.

@

Tại Việt Nam, nghiên cứu trên 100 người bệnh thu thập ngẫu nhiên từ một số

ht

bệnh viện tại Hà Nội sử dụng phương pháp PCR-RFLP cho kết quả tỷ lệ 3 alen
NAT2*5, *6, *7 lần lượt là 2%, 12,5% và 25% [34]. Một nghiên cứu khác của cùng

py

rig

tác giả sử dụng phương pháp realtime PCR cho kết quả tần số các alen đột biến
NAT2*5A, *6A, *7A lần lượt là 8%, 29% và 29% [33].
Năm 2005, Kinzig - Schipper đã công bố kết quả nghiên cứu về sự biến đổi

Co

dược động học của INH ở những người tình nguyện khỏe mạnh sau khi dùng liều
chuẩn và mối quan hệ của nó với các biến thể di truyền của NAT2, các đặc điểm nhân
khẩu học. Kết quả cho thấy rằng, nồng độ INH huyết tương tăng lên ở các cá thể có
15


kiểu hình acetyl hóa chậm do gây giảm hoạt tính NAT2 [36]. Trong một nghiên cứu
của Parkin và cộng sự, nồng độ trong huyết tương đã được đo trong khoảng thời gian

VN
U

ngắn sau khi uống INH ở người bệnh lao. Acetyl hóa chậm có nồng độ isoniazid trong
huyết thanh cao hơn acetyl hóa nhanh 4-6 lần trong khoảng thời gian từ 2 đến 6 giờ
sau khi uống, các tác giả đề xuất phác đồ liều isoniazid riêng cho mỗi kiểu hình [36,

ac
y,

51]. Như vậy, các nghiên cứu đều chỉ ra rằng việc xác định các đa hình di truyền
NAT2 có thể giúp các bác sĩ lâm sàng ngăn ngừa tình trạng nhiễm độc gan nặng
hơn thông qua thay đổi liều điều trị đối với mỗi cá thể riêng biệt, từ đó tăng hiệu

rm

quả điều trị, giảm các tác dụng không mong muốn.

Ngoài các nghiên cứu về vai trò NAT2 với INH, các nghiên cứu về mối liên

Ph
a

quan giữa kiểu hình acetyl hóa và các bệnh ung thư, bệnh Alzeimer, Parkinson, Lupus
ban đỏ hệ thống cũng đã được đưa ra. Bởi enzym NAT2 đóng vai trò quan trọng trong

an
d

chuyển hóa các hợp chất amin thơm, dị vòng, các chất gây ung thư do có khả năng
hoạt hóa sinh học, giải độc nhiều thuốc và các hóa chất độc hại. Các nghiên cứu trong

ed
ici
ne

hơn 50 năm trở lại đây đã chứng minh được tầm quan trọng của việc xác định kiểu
hình acetyl hóa ở các cá thể mắc lao hoặc một số cá thể phơi nhiễm với các tác nhân
ung thư. Việt Nam hiện đang đứng thứ 16/30 nước có gánh nặng bệnh lao cao nhất thế
giới, chính vì vậy việc xác định kiểu hình acetyl hóa có thể giúp các nhà lâm sàng

M

định hướng trong xác định liều isoniazid cho mỗi cá thể khi điều trị lao.
1.5
Các phương pháp phân tích đa hình NAT2
Hiện nay, có nhiều phương pháp phân tích SNP được sử dụng, một số phương

of

pháp điển hình được nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn gồm:

ol

1.5.1. Phương pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length
Polymorphism, RFLP).

Sc
ho

Phương pháp này được nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn sử dụng vì những ưu
điểm của nó như kết quả chính xác, giá thành rẻ, kết quả nhanh. PCR-RFLP được định
nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về

@

kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzym cắt giới hạn khi có
sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác. Nguyên tắc của

ht

kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzym cắt hạn chế (Restriction enzym) đối

py
rig

với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các
enzym cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một
mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt [64]. Sự khác

Co

biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau. Cùng với sự
phát triển kỹ thuật PCR, hiện nay kỹ thuật PCR-RFLP ngày càng trở nên đơn giản,
thuận tiện hơn. Một cặp mồi oligonucleotid có thể dùng khuếch đại một vùng DNA
16


cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các enzym cắt giới

VN
U

hạn, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc nitrat [64].
1.5.2. Phương pháp giải trình tự

Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu đột biến
điểm/SNP. Để khẳng định chính xác đột biến hay biến đổi người ta phải tiến hành giải

ac
y,

trình tự. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên

phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là phương pháp

rm

dideoxyribonuleotide (viết tắt là ddNTP). Tuy nhiên phương pháp cổ điển của Sanger
chỉ giải trình tự được các đoạn gen có kích thước nhỏ khoảng 300 bp, đồng thời yêu

Ph
a

cầu các thao tác kỹ thuật nhiều và chính xác. Phương pháp giải trình tự hiện nay phát
triển từ phương pháp cổ điển của Sanger giúp giải trình tự nhanh và chính xác các
đoạn gen lớn. Phương pháp này sử dụng các ddNTP được gắn chất phát quang,

an
d

ddNTP sẽ liên kết vào mạch DNA đang kéo dài và làm ngừng phản ứng sao chép. Cấu
trúc phần phát quang được thiết kế để phát ra ánh sáng có bước sóng khác nhau cho

ed
ici
ne

mỗi ddNTP. Một máy cảm biến tín hiệu kết hợp với máy tính xử lý, mã hóa và tự
động chuyển thành trình tự DNA. Phương pháp này có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, đặc
biệt với các đoạn DNA từ 30 bp đến 1000 bp. Một hạn chế nhỏ của phương pháp này
là không đọc được các trình tự quá ngắn (dưới 30 bp), sai số tăng khi giải trình tự các
đoạn DNA trên 1000bp. Đối với các đoạn quá ngắn cần xác định lại độ chính xác bằng

M

các phương pháp thủ công khác [5].

of

1.5.3. Phương pháp phản ứng nối chuỗi (Ligase Chain Reaction, viết tắt là LCR)

ol

Kỹ thuật cho phép phát hiện sự thay thế một đôi base với tính đăc hiệu và độ
tin cậy cao nhờ quá trình khuếch đại (với xúc tác của enzym ligase) để kết nối 2 đầu

Sc
ho

tận của 2 cặp mồi liền kề nhau. Enzym ligase nối hai chuỗi oligonucleotid khi chúng
liên kết bổ sung hoàn toàn (100%), vì vậy sự thay thế một đôi base sẽ cản trở hình
thành liên kết nối. Phương pháp LCR thường được sử dụng trong lĩnh vực pháp y [6].
1.5.4. Phương pháp Realtime PCR

@

Kĩ thuật sử dụng đoạn đầu dò oligonucleotid có khả năng lai với một vị trí nội

ht

phân tử của gen đích. Đầu dò này được gắn với chất phát màu huỳnh quang, số lượng
sản phẩm đặc hiệu sẽ tỷ lệ thuận với mức độ tín hiệu huỳnh quang. Các đột biến điểm

py
rig

của DNA khuôn sẽ làm giảm sự bền vững của liên kết giữa đầu dò và đoạn DNA đích.
Vì vậy khi có đột biến, tín hiệu huỳnh quang sẽ bị giảm đi nhanh chóng so với DNA
đích nguyên vẹn. Kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kì

Co

nhiệt của phản ứng, vì vậy người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí
nghiệm để đọc và phân tích kết quả xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không
(như PCR). Do khả năng phân tích kết quả sau mỗi chu kì phản ứng, Realtime – PCR
17