Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phần dưới mặt đất cây phong quỳ sa pa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ha
rm

ac
y

,V

NU

KHOA Y DƢỢC

an

dP

HOÀNG THỊ HUYỀN DIỆU

dic

ine

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC PHẦN DƢỚI MẶT ĐẤT
CÂY PHONG QUỲ SA PA

ol

of

Me

(Anemone chapaensis Gagnep.)

Sc

ho

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

ht
©

Khóa: QH.2013.Y

2. TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Co
py

rig

Người hướng dẫn: 1. ThS. HÀ THỊ THANH HƢƠNG

HÀ NỘI-2018


LỜI CẢM ƠN

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

dP

ha
rm

ac
y

,V

NU

Trong quá trình hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này, em nhận được sự
quan tâm, góp ý, chỉ bảo tận tình từ các thầy cô giá, các anh chị, gia đình và

bạn bè.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS.Hà Thị Thanh Hương, Giảng
viên Bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền và TS. Nguyễn Hữu Tùng, Giảng
viên Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, Đại học Quốc
gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa dược và Kiểm
nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tận tình
chỉ dẫn cho em thực hiện nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Phạm Giang Nam vì những chỉ bảo tận
tình, giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này.
Em xin cảm ơn tới các anh chị nghiên cứu viên phòng Hóa phân tíchTiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tạo điều kiện giúp đỡ em rất nhiều trong quá
trình nghiên cứu tại Viện.
Em gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Khoa Y Dược đã
dạy dỗ, trang bị kiến thức chuyên môn, tạo điều kiện cho em trong suốt quá
trình học tập tại trường.
Cuối cùng em xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè luôn quan tâm, động
viên, giúp đỡ cho em hoàn thiện khóa luận này.
Hà nội, tháng 4, năm 2018
Sinh viên

Co
py

rig

ht
©

Em xin chân thành cảm ơn!

Hoàng Thị Huyền Diệu


BuOH

n-butanol

13

Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

,V

C-NMR

NU

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

ESI-MS

Electrospray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc

Ethyl acetat

GF245

Gypsum fluorescent 254nm

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

dP

ha
rm

ac
y

DEPT

an

H-NMR

High Performance Liquid Chromatography

MeOH

Metanol

MS

Mass Spectroscopy

RP18

Reverse Phase C-18

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

UV

Ultra violet

Co
py

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

HPLC


MỤC LỤC

Me

dic

ine

an

dP

ha
rm

ac
y

,V

NU

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Tổng quan về chi Anemone ....................................................................... 2
1.1.1. Vị trí, phân loại ....................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 2
1.1.3. Số lượng và phân bố chi Anemone.......................................................... 2
1.2. Tổng quan về cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) ...... 5
1.2.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 5
1.2.2. Phân bố .................................................................................................... 6
1.3. Thành phần hóa học chi Anemone ............................................................ 6
1.3.1. Các saponin ............................................................................................. 6
1.3.2. Các flavonoid ........................................................................................ 10
1.3.3. Một số thành phần hóa học khác........................................................... 11
1.4. Tác dụng sinh học chi Anemone ............................................................. 14
1.4.1. Công dụng trong dân gian ..................................................................... 14
1.4.2. Công dụng sinh học được nghiên cứu .................................................. 15

Co
py

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ............................................................................................................... 16
2.1. Đối tương nghiên cứu ............................................................................. 16
2.2. Hóa chất trang thiết bị ............................................................................. 16
2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 16
2.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ .................................................................. 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 17
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất................................................... 17
2.3.2. Phương pháp phân lập, phân tách các hợp chất .................................... 18
2.3.3. Phương pháp xác định công thức hóa học ............................................ 18
2.3.4. Phương pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC)............................................................................................. 20
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 21
3.1. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ phần dưới mặt đất cây Phong
quỳ Sa Pa ......................................................................................................... 21
3.1.2. Phân lập chất từ rễ Phong quỳ Sa Pa .................................................... 21


,V

NU

3.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất thu được .................................................... 22
3.2. Phân tích định tính hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ................ 28
3.3. Bàn luận .................................................................................................. 29
KẾT LUẬN .................................................................................................... 30

KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 30

ac
y

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤC LỤC 1

Co
py

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

dP

ha
rm

PHỤC LỤC 2


DANH MỤC BẢNG

NU

Bảng 1: Phân bố 50 loài sử dụng làm thuốc. .................................................... 2

Co
py

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

dP

ha
rm

ac
y

,V

Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất PQRB .......................... 23


DANH MỤC HÌNH

Co
py

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

dP

ha
rm

ac
y

,V

NU

Hình 1.1. Tiêu bản thực vật Anemone chapaensis Gagnep.[28]...................... 6
Hình 1.2. Cấu trúc khung olean ........................................................................ 7
Hình 1.3. Các bộ khung olean cơ bản (nhóm A) phân lập từ chi Anemone. .... 7
Hình 1.4. Các hợp chất saponin phân lập tư Anemone raddeana Regel. ......... 8
Hình 1.5. Các bộ khung triterpen cơ bản khác (nhóm B,C,D) từ chi Anemone ..... 9
Hình 1.6. Một số flavonoid phân lập được từ chi Anemone. .......................... 11
Hình 2. Sơ đồ tách chiết dược liệu .................................................................. 18
Hình 3.1. Sơ đồ phân lập một số hợp chất từ phân đoạn BuOH của rễ cây
Phong quỳ Sa Pa.............................................................................................. 22
Hình 3.2. 6 tín hiệu methyl mũi đơn ............................................................... 25
Hình 3.3. Tín hiệu CH3 trên phổ DEPT .......................................................... 26
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR: Tín hiệu olefin và cacboxylic................................. 26
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR: 3 protons anomer hợp chất PQRB1 ........................ 27
Hình 3.6. Công thức cấu tạo hợp chất PQRB1 ............................................... 28
Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC của hợp chất PQRB1 ........................................... 29
Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC của cao phân đoạn n-butanol phần dưới mặt đất
cây Phong quỳ Sa Pa ....................................................................................... 29


ĐẶT VẤN ĐỀ

,V

NU

Hiện nay xu hướng sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ thiên
nhiên đang phát triển với ưu điểm chứa nhiều thành phần quý, điều trị hiệu
quả, ít có tác dụng phụ. Vì vậy chúng ta cần chú trọng vào việc tìm kiếm,
nghiên cứu khai thác nguồn tài nguyên này.

an

dP

ha
rm

ac
y

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, nguồn
dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật…) dùng làm thuốc vô cùng phong
phú. Từ xa xưa ông cha ta biết khai thác nguồn tài nguyên dược liệu này để
phòng bệnh và chữa bệnh, tuy nhiên việc điều trị chỉ dừng lại ở việc dùng trực
tiếp hoặc chế biến thành các nguyên liệu thô sơ, điều trị theo kinh nghệm của
bản thân hoặc địa phương, do đó chưa hiều được hết các tác dụng, công dụng
cũng như thành phần hóa học tạo ra tác dụng của dược liệu, hầu hết các loại
cây dùng làm thuốc chưa được nghiên cứu một các đầy đủ.

Me

dic

ine

Cây Phong quỳ Sa Pa, loại cây đặc hữu của địa phương đã được người
dân sử dụng rất nhiều trong điều trị các bệnh viêm họng, viêm amydal, viêm
túi mận, đau dạ dày… Song cho đến nay thì các nghiên cứu về thành phần
hóa học và tác dụng sinh học của cây Phong quỳ Sa Pa vẫn còn rất ít.

ol

of

Các nghiên cứu trước đã phân lập được 04 hợp chất từ cây Phong quỳ
Sa Pa là: Ethyl caffeat, blumenol A từ phân đoạn EtOAc phần trên mặt đất và
huzhangosid A, huzhangosid C từ phân đoạn BuOH phần dưới mặt đất.

ht
©

Sc

ho

Để cung cấp thêm các cơ sở cho việc sử dụng và bảo tồn loài cây đặc
hữu của Sa Pa làm thuốc ở Việt Nam, đề tài “Tiếp tục nghiên cứu thành phần
hóa học phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis
Gagnep.)” được thực hiện nhằm mục tiêu:

Co
py

rig

1. Phân lập thêm hợp chất tinh khiết từ phần dưới mặt đất của cây Phong quỳ
Sa Pa.
2. Xác định được cấu trúc của hợp chất phân lập.

1


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN

NU

1.1. Tổng quan về chi Anemone
1.1.1. Vị trí, phân loại

,V

Vị trí phân loại chi Anemone [1, 2]
Giới Thực vật (Plantae)

ac
y

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Bộ Hoàng Liên (Ranunculales)

ha
rm

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

dP

Họ Hoàng Liên (Ranunculaceae)

Chi Anemone

an

1.1.2. Đặc điểm thực vật

Me

dic

ine

Là loại cây thảo sống lâu năm, gốc thành rễ hoặc mọc thành bụi. Lá
mọc so le, bị cắt sâu nhiều hoặc ít. Hoa đều, đơn độc hay thường thành tán có
một bao chung bao gồm 3 lá chét. Đài dạng cánh có màu vàng, lam, trắng, đỏ,
5-10 phiến, không có tràng, nhị nhiều, lá noán có vòi nhụy. Quả bế, đơn hạt,
rời, tập hợp thành đầu.[1]

ol

of

1.1.3. Số lƣợng và phân bố chi Anemone

Bảng 1: Phân bố 50 loài sử dụng làm thuốc.

rig

ht
©

Sc

ho

Trên thế giới có khoảng 120-150 loài, phân bố rộng khắp các châu lục,
tập trung nhiều ở những nước ôn đới Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc, Hàn Quốc,
Nhật Bản, Việt Nam. Đặc biệt ở Trung Quốc tập trung tới 50 loài [3, 15, 22,
23]. Trong đó có 50 loài được sử dụng làm thuốc[6].

Co
py

STT

Loài

Phân bố

1

A.altaica

Châu Âu, Trung Quốc, Bắc Châu Á

2

A.amurensis

Đông nước Nga, bắc Hàn Quốc, Trung

Quốc

2


A.anhuiensis

Trung Quốc

4

A.baicalensis

Seberia, Hàn Quốc, Trung Quốc

5

A.biflora

núi Hymalaya

A.begoniifolia

Siberia, Hàn Quốc, Trung quốc

6

A.canadensis

Đông, Bắc Mỹ

7

A.cathayensis

Hàn Quốc, Trung Quốc

8

A.chosenicola var.
schantungensis

Sơn Đông (Trung Quốc)

9

A.cylindrica

Tây bắc Mỹ

10

A.davidii

Trung Quốc

11

A.delavayi

an

12

A.demissa

Trung Quốc, dãy Himalaya

13

A.demissa var.major

14

A.demissa var. villosissima

Himalayas, Trung Quốc

15

A.dichotoma

Bắc Châu Á, Châu Âu, Trung Quốc

16

A.drummondii

17

A.flaccida

18

A.flaccida var. hofengensis

ho

Trung Quốc (Trùng Khánh)

19

A.fulinggensis

Trung Quốc (Trùng Khánh)

,V

ac
y

ha
rm

dP

ine
dic

Me

of

ol

Nhật Bản, Trung Quốc, đông Nga,

Sc

Co
py

Trung Quốc

Tây bắc Mỹ

A.griffithii

Nepal, Bhutan, Sikkim-Ấn Độ

A.hupehensis

Trung Quốc (tỉnh Trùng Khánh, Cam
Túc, Chiết Giang, Thiểm Tây, Tứ
Xuyên…)

rig

21

Trung Quốc

ht
©

20

NU

3

22

A.hupehensis f. alba

Trùng Khánh-Trung Quốc

23

A.imdricata

Trung Quốc

3


A.multifida

Tây bắc và trung tâm nước Mỹ

25

A.narcissiflora

Châu Âu, châu Á, nam Mỹ

26

A.nemorosa

Anh, châu Âu, tây Á

27

A.nikoensis

Nhật Bản

28

A.obtusiloba

Himalaya, Trung Quốc

29

A.obtusiloba ssp. ovalifolia

Trung Quốc

30

A.parviflorab

Bắc Mỹ

31

A.parviflora (A.pulsatilla)

Châu Âu, Anh

32

A.quinquefolia

Đông nam Mỹ

34

A.raddenana

Trung Quốc, Hàn Quốc, đông nước
Nga

35

A.reflexa

36

A.rivularis

37

A.rivularis var. flore-minore Trùng Khánh-Trung Quốc

38

A.rockii var. pilocarpa

Trùng Khánh-Trung Quốc

39

A.rupicola

Bhutan, Nepal, bắc Ấn Độ, Trung
Quốc

40

A.silvestris

Châu Âu, Trung Quốc

41

A.stolonifera

Trung Quốc, Nhật Bản

A.taipaiensis

Thiểm Tây-Trung Quốc

an

dP

ha
rm

ac
y

,V

NU

24

ine
dic

Trung Quốc, Himalaya, Sri Lanka

Me

of

ol

ho
Sc

ht
©

42

Bắc Hàn Quốc, Siberia, Đông Âu,
Trung Quốc

Afghanistan, Kashmir (Ấn Độ), Tây
Tạng (Trung Quốc)

44

A.tibetica

Tây Tạng (Trung Quốc)

45

A.tomentosa

Trùng Khánh, Tứ Xuyên, Cam Túc,
Hà Nam, Thiểm Tây (Trung Quốc)

rig

A.tetrasepala

Co
py

43

4


Tây tạng (Trung Quốc)

47

A. trullifolia var. linearis

Trung Quốc

48

A.tuberosa

Tây nam Mỹ

49

A.virginiana

Trung và đông bắc Mỹ

50

A.vitifolia

Châu Âu, Himalaya

NU

A.trullifolia

ac
y

,V

46

dP

ha
rm

Ở Việt Nam đã phát hiện ra 5 loài là: A.japonica, A.chapaensis,
A.polilanei, A.rivularis, A.sumatrana trong đó có 2 loại được nghiên cứu
nhiều là A. japonica, A.rivularis [2, 6, 23, 27]. Chi Anemone tập trung ở các
tỉnh phía bắc Việt Nam: Yên Bái, Lai Châu, Hà Giang, Lào Cai…

an

1.2. Tổng quan về cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.)
Tên khoa học Anemone chapaensis Gagnep.
Tên thường gọi: Phong quỳ Sa Pa

ine

1.2.1. Đặc điểm thực vật

Co
py

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

Cây thảo sống lâu năm, mọc thành bụi, chiều cao trên mặt đất từ 10cm

đến 30cm. Thân mang lá chụm ở gốc, thân non màu tím, khi già chuyển sang
màu xanh lục, có nhiều lông, thân rễ hình trụ, màu nâu đen có đường kính từ
2-4cm. Lá hình tim, sẻ 3 thùy, mép có răng cưa, lá có nhiều lông màu trắng,
có 3 gân chính chia nhiều gân phụ hình hình chân vịt. Cuống lá dài từ 10cm
đến 15cm. Hoa nở vào tháng 6-9, cụm hoa hình sim, có màu trắng, hồng. Trục
mang hoa cao hơn 30cm, cuống mang hoa dài 6-7cm, có 6-7 lá đài dài 23,5cm, tràng 5, đầu tù hay lõm, có kích thước 2-4cm, nhiều nhị màu vàng. Ra
quả 8-10, quá bế, không cọng, không lông, có kích thước 4-5cm, khi chín
bung ra có nhiều hạt, hạt dài 2-3mm, mang nhiều lông màu trắng. Rễ hình trụ,
nhỏ, đường kính từ 1-2mm [3, 7, 27].

5


NU
,V
ac
y
ha
rm
dP
an
ine

dic

Hình 1.1. Tiêu bản thực vật Anemone chapaensis Gagnep.[28]

Me

1.2.2. Phân bố

ho

ol

of

Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) sinh trưởng và phát
triển tốt ở độ cao 1200-1500m, vùng ẩm, mát, ưa bóng, mọc rải rác miền Bắc
Việt nam. Cây Phong Quỳ nghiên cứu là loại đặc hữu ở Sa Pa, tỉnh Lào Cai.

Sc

1.3. Thành phần hóa học chi Anemone

ht
©

Thành phần hóa học chủ yếu có trong chi Anemone là các saponin,
flavonoid và một số ít các cumarin, acid béo, diterpaiensis glycoside, lacton,
tinh dầu…

rig

1.3.1. Các saponin

Co
py

Đến nay đã có hơn 200 saponin được phân lập từ chi Anemone. Bộ

khung aglycon triterpen là olean (nhóm A), ursan (nhóm B), lupan (nhóm C),
cycloartan tetracylic(nhóm D) [6].
 Bộ khung olean (nhóm A)

6


NU
,V
ac
y
ha
rm

dP

Hình 1.2. Cấu trúc khung olean

Co
py

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

Phần lớn các saponin trong tự nhiên được tìm thấy đều có bộ khung này,
phần aglycon thường có 5 mạch vòng. Một số saponin được phân lập từ chi
Anemone thuộc nhóm này.

Hình 1.3. Các bộ khung olean cơ bản (nhóm A) phân lập từ chi Anemone.

7


R1

R2

Rha-1-2[glc-1-4]ara

CH3

2

Rha-1-2-ara

CH3

3

Rha-1-2[glc-1-4]ara

4

Rha-1-2-ara

dic

ine

1

an

STT

dP

ha
rm

ac
y

,V

NU

Anemone raddeana Regel.[11, 17]

R3

Rha-1-4-glc-1-6glc
Rha-1-4-glc-1-6glc
H

CH2OH

Rha-1-4-glc-1-6glc

Me

CH2OH

of

Chữ viết tắt: Glc: β-D-Glucopyranosyl; Rha: α-L-Rhamnopyranosyl; Ara: α-LArabinopyranosyl

ho

ol

Hình 1.4. Các hợp chất saponin phân lập tư Anemone raddeana Regel.

Co
py

rig

ht
©

Sc

 Bộ khung ursan (nhóm B), lupan (nhóm C), và cycloartan tetracylic (nhóm
D)
Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự nhóm olean chỉ khác nhóm methyl
ở C-30 không gắn vào vị trí C-20 mà gắn vào vị trí C-19. Nhóm này thường ít
gặp hơn nhóm olean. Nhóm lupan (nhóm C) có các vòng A,B,C,D giống như
các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh.

8


NU
,V
ac
y
ha
rm
dP
an
ine

dic
Me
of
ol
ho

Co
py

rig

ht
©

Sc

Hình 1.5. Các bộ khung triterpen cơ bản khác (nhóm B,C,D) từ chi Anemone

9


ac
y

,V

NU

1.3.2. Các flavonoid

2. Kaempferol

Me

dic

ine

an

dP

ha
rm

1.Quercetin

4.Astragalin

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

3.Lutculin

Co
py

5.Quercetin-7-O-β-D-glucopyranosid

10


NU
,V
ac
y

6.Quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranosid

ha
rm

Hình 1.6. Một số flavonoid phân lập được từ chi Anemone.
1.3.3. Một số thành phần hóa học khác

dP

Các coumarin, lacton, lignin, steroid, phenolic và một số hợp chất khác
được phân lập từ chi Anemone.

an

Bảng 2. Các hợp chất phân lập từ chi Anemone

ine

Cấu trúc

Tên hợp chất

TLTK

ho

ol

of

Me

dic

STT

R1=R2=R3=R4=R5=H

Coumarin

[4]

2

R1=R2=R3=R5=H; R4=OCH2CH3

7-Ethyl-coumarin

[19]

ht
©

R1=R4=OCH3; R2=CH3; R3=R5=H 4,7-Dimethoxyl-5methylcoumarin

rig

3

Sc

1

Co
py

4

R1=R2=H; R3=R4=OCH3; R5=OH

Fraxidin

5

R1=R2=OCH3; R4=CH3; R3=R5=H 4,5-Dimethoxyl-7methylcoumarin

6

R1=R2=H; R3=R5=OCH3; R4=OH

11

Isofraxidin

[8,23]

[20]
[8,20]

[20]


R1=CH3; R2=CH3; R3=R4=O-CH2- 4-Methoxyl-5O; R5=H
methyl-6,7methylenedioxycoumarin

8

R1=R2=R5=H; R3=R4=OH

9

R1=R4=OCH3; R2=CH3; R3=OH; 4,7-Dimethoxyl-5R5=H

methyl-6hydroxycoumarin

[14]

10

R1=R4=OCH3; R2=CHO; R3=OH; 4,7-Dimethoxyl-5R5=H
formyl-6hydroxycoumarin

[14]

,V

[20]

dP

ha
rm

ac
y

Esculetin

[20]

NU

7

Acid mono-feruloyl
tartaric

[23]

Acid chlorogenic

[23]

Acid glucosyringic

[23]

Me

dic

ine

an

11

Sc

ho

ol

of

12

Co
py

rig

ht
©

13

12


Pelargonidin3[2΄(xylosyl)galactoid]

15

Anemonolid

[18]

[9]

ine

an

dP

ha
rm

ac
y

,V

NU

14

ho

ol

of

Me

dic

1718

R=H

18

R= Glc

ht
©

Co
py

rig

19

Sc

17

13

β-sitosterol

[29]

Daucosterol

[29]

Ergosterol peroxid

[20]

Carbonxyl methyl
isoferulat

21

,V

[29]

4΄-O-methyl
quisetum pyron

[26]

22

Phenyl ethyl alcohol

[25]

an

dP

ha
rm

ac

y

NU

20

dic

ine

23

Me

24

(E)-4-phenyl-3buten-2-on

[16]

7,9-

[25]

of

dimethylhexadecan

2,4-dodecadienal

[16]

Sc

ho

ol

25

ht
©

1.4. Tác dụng sinh học chi Anemone
1.4.1. Công dụng trong dân gian

Co
py

rig

Theo kinh nghiệm dân gian, rễ cây Phong quỳ được dùng phối hợp
cùng các vị thuốc khác để điều trị các bệnh về tim. Rễ có vị đắng, tính hàn, có
ít độc, có tác dụng khư phong thấp, thanh nhiệt giải độc. Người dân còn sử
dụng rễ làm thuốc chống viêm: như viêm họng, viêm gan, ngã sưng đau, điều
trị các bệnh đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn,
phong thấp đau nhức, giải độc ô đầu[1, 2].

14

1.4.2. Công dụng sinh học đƣợc nghiên cứu

Co
py

rig

ht
©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

dP

ha

rm

ac
y

,V

NU

Các saponin nhóm triterpenoid là thành phần chính trong rễ của chi
Anemone, chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng u, chống co giật[5, 24].
Phần cắn saponin triterpen thô từ loài A.flaccida (AFS) giảm sưng đỏ và phù
chân sau trong mô hình viêm khớp do collagen (CIA) trên chuột[10]. Nồng độ
các chất trung gian hóa học gây viêm như TNF-α và IL-6 trong huyết thanh
giảm đáng kể trên chuột được cho uống AFS với liều 200-400 mg/kg/ngày.
Trong rễ loài Anemone raddeana tìm thấy các chất raddeanoside R1, R2 có
khả năng úc chế các tế bào ung thu dạ dày BGC823 [13, 21]. Ngoài ra các
radeanosid còn có tác dụng giảm đau, chống viêm. Protoanemonin có tác
dụng an thần, chống co thắt phế quản, co thắt hồi tràng ở lơn bởi
histamin[19]. Loài Anemone demissa var. major được dùng điều trị kiết lỵ, hộ
trợ tiêu hóa, các bệnh khó tiêu.

15


,V

NU

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣơng nghiên cứu
Cây dược liệu được thu hái khi đang ra hoa, được thu hái ở đèo Hoàng
Liên (Ô Qui Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800m), thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai.

ha
rm

ac
y

Mẫu tiêu bản khô gồm có cành, lá, hoa số 01 thu hái ngày 11/9/2013 và
mẫu tiêu bản số 02 thu hái ngày 24/5/2015 tại đèo Hoàng Liên, huyện Sa Pa,
tỉnh Lào Cai được giám định bởi TS.Đỗ Thị Xuyến, được lưu giữ tại phòng
Bách thảo thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.

an

dP

Mẫu dược liệu được lưu giữ tại Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện
Dược liệu.

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

2.2. Hóa chất trang thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Các dung môi dùng trong chiết xuất phân lập: ethanol (EtOH) 96%,
methanol (MeOH), ethyl acetat (EtOAc), diclomethan, n-hexan…
- Các dung môi dùng trong HPLC (Methanol… ) của Merck, Đức.
- Pha tĩnh trong sắc ký cột là silica gel pha thường (cỡ hạt 60-200 µm,
Merck), silica gel pha đảo Rp-18 (cỡ hạt 30-50 µm, Merck).
- Bản mỏng tráng sẵn DC-Aulofolien 60 F245 (Merck), bản mỏng pha đảo RP18 F245s Merck. Dung môi hiện màu là acid sulfuric 10%/ethanol, đốt nóng
110oC.
2.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ

ht
©

 Hệ thống sắc ký hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity (Agilent
Technologies, Mỹ).

rig

 Hệ thống chiết hồi lưu với bình cầu có dung tích từ 10-2000ml

Co

py

 Máy đo phổ khối HP 5989B (Viện Hoá học, Viện Hàn Lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR ; 13C-NMR ;
DEPT (Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

16


 Dụng cụ chạy sắc ký: cột thủy tinh đường kính từ 1-10cm, dài 30100cm, bình cầu từ 50-2000ml, ống nghiệm, ống đựng mẫu, pipet…
 Dụng cụ trong chạy HPLC

,V

NU

 Các dụng cụ thí nghiệm thuộc Viện Dược liệu và bộ môn Hóa dược và
kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

an

dP

ha
rm

ac
y

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu và chiết xuất
Dược liệu là rễ cây Phong quỳ Sa Pa rửa sạch, phơi khô chiết bằng
phương pháp chiết nóng bằng dung dịch ethnol 96% ở 70oC, chiết 3 lần, sau
đó dịch chiết cất thu hồi dung môi ta thu được cắn.
Hòa tan cắn vào nước sau đó lắc với lần lượt các dung môi có độ phân
cực tăng dần (n-hexan, ethyl acetat, n-butanol). Mỗi dung môi chiết 3 lần, sau
đó các phân đoạn được cất thu hồi ta thu được cao từng phân đoạn.

ine

Dược liệu

dic

Chiết với EtOH 96%
Cô thu hồi dung môi

Lắc 3 lần với n-hexan
Cô thu hồi dung môi

Phân đoạn 1
Lắc 3 lần với EtOAc
Cô thu hồi dung môi

Phân đoạn 2

Cắn EtOAc

Co

py

rig

ht
©

Sc

Cắn n-hexan

ho

ol

of

Me

Cắn dược liệu

Lắc 3 lần với BuOH
Cô thu hồi dung môi

Cắn BuOH

17

Phân đoạn 3

2.3.2. Phƣơng pháp phân lập, phân tách các hợp chất

NU

Hình 2. Sơ đồ tách chiết dược liệu

ac
y

,V

Để phân tách, phân lập các phân chiết của dược liệu ta sử dụng phương
pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (TLC dùng để khảo sảt), sắc ký cột với chất hấp
thụ là silica gel pha thuận và pha đảo, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

dP

ha
rm

Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng có đế nhôm
Kieselgel 60 F254 (Merck), và bản mỏng pha đảo RP18 F245s (Merck, 0,25mm).
Hiện màu băng thuốc thử acid sufuric 10%/acetat đốt trên bếp điện ở 110oC.

dic

ine

an

Sắc ký cột (CC): sử dụng cột thủy tinh có đường kính từ 1-30cm, chiều
dài từ 30-100cm, sử dụng các chất hấp thụ là silica gel pha thường với cớ hạt
63-200 µm dùng cho các cột có đường kính to 10cm hoặc cỡ hạt 40-63 µm
dùng cho các cột có kích thước bé hơn (đường kính nhỏ hơn 5cm), silica gel
pha đảo với cỡ hạt 30-50µm.

Me

2.3.3. Phƣơng pháp xác định công thức hóa học

ht
©

Sc

ho

ol

of

Phương pháp phổ học ngày nay được sử dụng rất nhiều trong phân tích
và xác định các chất. Các loại phổ thường dùng trong phân tích dược liệu là:
phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lương (MS)
và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Ngoài ra, các loài phổ khác trong các
chừng mực nhất định cũng được sử dụng (phổ nhiễu xạ đơn tinh thể tia X,
phổ huỳnh quang, phổ cận hồng ngoại (near IR, NIR) và Raman, phổ lưỡng
cực vòng, và tán sắc quay…).

Co
py

rig

Ưu điểm của các phương pháp phổ là cho biết các đặc điểm cấu trúc
của các chất, giúp cho việc xác định cấu trúc của các chất chưa biết hay định
danh các chất đã biết bằng cách so sánh phổ với các chất chuẩn. Chúng cũng
được dùng trong xác định hàm lượng các chất khi so sánh độ hấp thụ/ cộng
hưởng của mẫu định lượng với độ hấp thu/cộng hưởng của mẫu chuẩn.
Phổ tử ngoại và khả kiến: sự hấp thụ năng lượng điển tử trong vùng
sóng ánh sáng tử ngoại gần (190-400nm) và khả kiến (400-780nm) của các

18