BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HÀNH
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:
TS. NGUYỄN MINH XUÂN HỒNG
ThS. TÔN BẢO LINH
NHÓM THỰC HIỆN:
VÕ ĐÌNH TÍN
LÊ BẠCH NGỌC TRÂN
HOÀNG QUANG BÌNH

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2017


MỤC LỤC
MỤC LỤC..............................................................................................................................................................1
DANH SÁCH BẢNG............................................................................................................................................2
DANH SÁCH HÌNH.............................................................................................................................................3
Chương 1 Mở đầu.................................................................................................................................................4
1.1.

Đặt vấn đề...............................................................................................................................................4

1.2.

Mục tiêu..................................................................................................................................................5

Chương 2 Tổng quan............................................................................................................................................5

2.1. Khái quát về Salmonella..............................................................................................................................5
2.2 Kỹ thuật PCR...............................................................................................................................................7
Chương 3 Vật liệu và phương pháp....................................................................................................................9
3.2.1. Phương pháp thực hiện.............................................................................................................................9
3.2.1. Tiền tăng sinh mẫu.............................................................................................................................9
3.2.2. Qui trình tách chiết DNA..................................................................................................................9
3.2.3. Thực hiện phản ứng PCR...................................................................................................................12
3.2.4. Điện di kiểm tra kết quả PCR.............................................................................................................13
3.2.2. Đọc kết quả............................................................................................................................................16
Chương 4 Kết luận.........................................................................................................................................17

1


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR...................................................................................................................12
Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của các phản ứng PCR....................................................................................................12

2


DANH SÁCH HÌNH
Hình 3.1: Dung dịch tiện tăng sinh........................................................................................................................9
Hình 3.2: Loại bỏ xác mẫu trong dung dịch tiện tăng sinh...................................................................................9
Hình 3.3: Thu kết tủa............................................................................................................................................10
Hình 3.4: Thu kết tủa lần 2...................................................................................................................................10
Hình 3.5: Làm lạnh dung dịch.............................................................................................................................11
Hình 3.6: Phản ứng PCR......................................................................................................................................11
Hình 3.7: Các bước chuẩn bị gel agarose 1%......................................................................................................14
Hình 3.8:Các bước thực hiện điện di trên gel agarose........................................................................................14

Hình 3.9: Chọn hiệu điện thế điện di...................................................................................................................14
Hình 3.10. Xem kết quả chạy điện di..................................................................................................................15
Hình 3.11. Xem kết quả chạy điện di dưới đèn UV............................................................................................15

3


Chương 1
Mở đầu
1. Đặt vấn đề
Cuộc sống ngày càng phát triển, nhiều thiết bị hiện đại được phát minh giúp cho
ngành công nghệ thực phẩm phát triển, đáp ứng được nhu cầu của con người về thực phẩm..
Bên cạnh đó, các phương pháp chế biến thực phẩm cũng được cải tiến hơn, nhiều phương
pháp nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm đã được đưa ra, giúp rút ngắn thời gian chế biến,
tăng cấu trúc, màu sắc và hương vị của sản phẩm.
Tuy nhiên, vấn đề được quan tâm nhất trong ngành thực phẩm đó là vấn đề vệ sinh
an toàn thực phẩm. Một trong những loài vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc cao và được
quan tâm nhiều nhất đó là Salmonella. Salmonella là tên chung của nhiều loại vi khuẩn.
Chúng có thể có mặt ở các loại thịt gia cầm và trứng, hay ở cả trái cây và rau nữa. Hầu hết
các loại Salmonella đều tác hại trực tiếp vào bao tử khiến người bệnh đau bụng, tiêu chảy
và nôn mửa trong vài ngày. Cũng có loại vào đường ruột, gây thương hàn khiến người bệnh
có thể tử vong. Do đó, việc phát hiện Salmonella có trong thực phẩm được đặt lên hàng đầu.
Phương pháp hiện đại gần đây được sử dụng nhiều là PCR (Polymerase Chain Reaction) là
một phương pháp khuếch đại DNA chuyên biệt bằng cách sử dụng mồi chuyên biệt. Trong
bài báo cáo này, nhóm xin trình bày phương pháp PCR được sử dụng để phát hiện
Salmonella trong thực phẩm.
2. Mục tiêu
-

Tiếp cận phương pháp PCR

-

Sử dụng phương pháp PCR phát hiện Salmonella trong mẫu vật.

4


Chương 2
Tổng quan
2.1. Khái quát về Salmonella
Salmonella

được

xếp

vào

giới

Bacteria,

ngành

Proteobacteria,

họ

Enterobacteriaceae, chi Salmonella. Giống Salmonella hiện nay được chia thành 2 loài:

Salmonella bongori (không gây bệnh) và Salmonella enterica (gây bệnh). Ðến nay, hơn
2.500 kiểu huyết thanh thuộc chi Salmonella.
S. enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S. enterica (S. enterica I), S.
salamae (S. enterica II), S. arizonae (S. enterica IIIa), S. diarizonae (S. enterica IIIb), S.
houtenae (S. enterica IV) và S. indica (S. enterica VI). Phần lớn, các serotype thuộc S.
enterica I là nguyên nhân gây hơn 99,9 % các bệnh nhiễm trùng ở người và động vật.
Trong đó, một số loài Salmonella có tầm quan trọng trong chẩn đoán bệnh ở ngườivà động
vật là:
-

S. typhi: chỉ gây bệnh cho người. Ở Việt Nam, bệnh thương hàn chủ yếu do vi khuẩn
này gây ra.

-

S. paratyphy A: chỉ gây bệnh thương hàn cho người. Ở Việt Nam, thường phát hiệnvi
khuẩn này sau vi khuẩnS. typhi.

-

S. paratyphy B: gây bện thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi có ở súc vật, thương
phát hiệnở các nước châu Âu.

-

S. paratyphy C: vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây bệnh
viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết, thường xuất hiệnở các nước Đông Nam Á.

-

S. typhimurium và S. enteritidis gây bệnh cho người và gia súc, là nguyên nhân chủ
yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do vi khuẩn Salmonella.

-

S. choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm trùng huyết do vi
khuẩn

5


Về hình thái, Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hình que, ngắn, hai đầu hơi tròn,
kích thước trung bình khoảng 0,4 – 0,6 x 1 – 3 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S.
gallimarum và S. pullorum, có khoảng 7 đến 12 tiên mao bao quanh thân; phát triển tốt ở
nhiệt độ 6 °C- 42 °C, thích hợp nhất ở 37 °C, pH thích hợp là 6,8 – 7,2.
Đặc điểm nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển được trên các
môi trường nuôi cấy thông thường, làmđục môi trường canh thang sau 18 h. Trên môi
trường thạch thường, khuẩn lạc Salmonella tròn, lồi, trắng xám, trong, bờ đều, đường kính
khoảng1 – 1,5 mm. Salmonella có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc
như HE (hektoen entericagar), XLD (xylose lysine deoxycholate). Trên môi trường HE,
khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm
đen, một số dòngSalmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.Còn
trên môi trường XLD, khẩn lạc đặc trưng của Salmonella có màu hồng trong suốt,có hay
không cótâm đen, một số dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết
khuẩn lạc, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ.
Đặc điểm sinh hóa. Phần lớn, các chủng Salmonella không lên men lactose, lên men
glucose và sinh hơi. Phản ứng oxidase âm tính, indol âm tính, VP âm tính, ure âm tính,
H2S dương tính.
2.2 Kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp được sử dụng trong sinh học phân tử

để khuếch đại một hay một vài bản sao của đoạn DNA bất kì của sinh vật, tạo thành hàng
triệu bảo sao từ một trình tự đặc trưng ban đầu. Phương pháp này được áp dụng phổ biến
để khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu và rất hữu ích trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh
di truyền, định danh sinh vật và nghiên cứu chức năng gen.
Phản ứng PCR gồm các thành phần: DNA khuôn, mồi xuôi và mồi ngược, các nucleodite
(dNTP), enzyme DNA polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm.
Thông qua các chu kì luân nhiệt, các đoạn DNA mục tiêu được tổng hợp nhờ enzyme
6


DNA polymerase.

Hình 2.1 Thành phần và một chu kì nhiệt của phản ứng PCR.

7


Chương 3
Vật liệu và phương pháp
3.1. Dụng cụ và thiết bị
3.1.1. Dụng cụ
Pipet 200-

Kéo

1000 µL

Bao tay

Pipet 20- 200 µL

Đầu hút pipet 200-1000 µL

Pipet 2.0- 20 µL

Đầu hút pipet 20- 200 µL

Pipet 1.0-10 µL
3.1.2. Thiết bị
Cân phân tích

Máy Vortex

Tủ hút

Máy PCR

Máy ly tâm tốc độ 6000 vòng,

Lò vi sóng

>11.000 vòng

Water bath (1000C)

Bộ điện di ngang
3.2. Phương pháp thực hiện
3.2.1. Tiền tăng sinh mẫu
Cân 25 g mẫu cho vào túi nylon vô trùng, bổ sung 100 mL môi trường BPW vào
túi. Ủ mẫu đã chuẩn bị trên ở 37 + 1 oC trong 18 ( + 2) giờ

3.2.2. Qui trình tách chiết DNA
 Lấy 2 mL dịch tiền tăng sinh mẫu vào ống eppendorf.

8


Hình 3.1: Dung dịch tiện tăng sinh
 Ly tâm 6000 vòng/10 giây để loại bớt xác mẫu, thu dịch nổi để ly trích DNA.

Hình 3.2: Loại bỏ xác mẫu trong dung dịch tiện tăng sinh
 Ly tâm 11.000 vòng/10 phút, đổ bỏ dịch nổi và thu kết tủa (sinh khối tế bào)

9


Hình 3.3: Thu kết tủa

 Huyền phù tủa trong 1 mL dung dịch PBS hoặc nước cất vô trùng.
 Ly tâm 11.000 vòng trong 10 phút, sau đó bỏ dịch nổi và thu phần tủa.

Hình 3.4: Thu kết tủa lần 2

 Huyền phù tủa trong 200 µL dung dịch đệm TE bằng cách vortex trong 10 giây.
 Đun các ống mẫu ở 100 oC trong 15 phút.
1
0


 Làm lạnh nhanh các ống này bằng cách đặt ống trong đá 15 phút.

Hình 3.5: Làm lạnh dung dịch
 Vortex trong 10 giây. Ly tâm ở 11000 vòng trong 10 phút ở 4 oC.
 Thu 50 – 100 µL phần dung dịch trên sang một tube mới.
 Tiến hành thực hiện phản ứng PCR hoặc bảo quản DNA ly trích ở -20 oC.

3.2.3. Thực hiện phản ứng PCR

Hình 3.6: Phản ứng PCR
Chuẩn bị phản ứng PCR với các thành phần như bảng 2.1.
1
1


Đặt các tube phản ứng vào máy PCR và cài đặt máy theo bảng 2.2
Trình tự mồi khuếch đại đoạn DNA kích thước 429 bp đặc hiệu cho S. typhimurium
ST11: 5’- GCC AAC CAT TGC TAA ATT GGC GCA -3’
ST15: 5’- GGT AGA AAT TCC CAG CGG GTA CTG G – 3’
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR
Nồng độ đầu

Nồng độ cuối

Thể tích hút (μL)

PCR master mix

1X

12,5

Mồi xuôi 10 μM

0,6 µM

1,5

Mồi ngược 10 μM

0,6 µM

1,5

DNA khuôn

5 μL

Nước (4,5µL)

Thêm vào cho đủ 25 μL

Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của các phản ứng PCR
Nhiệt độ (oC)

Thời gian

Số chu kỳ

95

5 phút

1

Biến tính

94

20 giây

Bắt cặp

60

30 giây

Kéo dài

72

30 giây

72

7 phút

Giai đoạn
Biến tính ban đầu

Khuếch đại

Kết thúc

1
2

35

1


3.2.4. Điện di kiểm tra kết quả PCR
Thể tích dung dịch agarose cần là 190ml nồng độ 1,5% => m agarose =2,85g. Làm tan
agarose cùng với dung dịch đệm TBE 0,5X
Thể tích dung dịch đệm TBE cần là: 500ml nồng độ 10X dùng cho vào bồn điện di +
190ml nồng độ 10X dùng pha agarose = 690ml
Pha 690ml dung dịch đệm TBE từ 10X cần dùng 34,5ml TBE 10X. Vậy để pha TBE
0.5X cần:
 Pha 500 ml cần 25 ml TBE 10X
 Pha 190 ml cần 9.5 ml TBE 10X
3.2.4.1. Chuẩn bi gel agarose 1%
+ Cân 2,85g agarose và cho vào bình tam giác
+ Bổ sung 190ml dung dịch đệm TBE 10X (vào bình tam giác và lắc nhẹ)
+ Làm tan agarose bằng lò vi sóng,
+ Đợi agarose nguội khoảng 650C và đổ vào khay gel
+ Gắn lược gel vào khay và đợi khoảng 15 phút cho gel nguội và đông lại
+ Nhẹ nhàng gở lược gel ra khỏi miếng agarose
3.2.4.2. Chuẩn bị bồn điện di
+ Cho 25 ml TBE vào bình 500 ml
+ Cho thêm nước cất, định lượng đến 500 ml.
+ Cho 500ml dung dịch đệm TBE 0,5X vào bồn điện di

+ Cho khay gel agarose vào bồn sao cho dung dịch đệm ngập gel 0,5cm.
Hình 3.7: Các bước chuẩn bị gel agarose 1%

3.2.4.3. Cho mẫu vào giếng
1
3


Đặt gel vào bồn điện di

Bơm mẫu vào giếng

Hình 3.8:Các bước thực hiện điện di trên gel agarose
Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.

Hình 3.9: Chọn hiệu điện thế điện di

1
4


3.2.2. Đọc kết quả.

Hình 3.10. Xem kết quả chạy điện di

Hình 3.11. Xem kết quả chạy điện di dưới đèn UV
15


Chương 4

Kết luận
Dựa vào khả năng tích điện của DNA, có thể biết được mẫu kiểm tra có chứa DNA vi
khuẩn hay không. Vạch số 18 và số 19 (hình 3.9) tương đương với đối chứng dương và đối
chứng âm của mẫu. Khi có dòng điện đi qua, các phân tử tích điện âm có xu hướng di chuyển
về cực dương của điện trường va ngược lại, phân tử tích điện dương lại có xu hướng di
chuyển về cực âm. Hình 3.9 cho thấy vệt đối chứng âm (vạch số 19) gần như không di
chuyển mà đứng yên, vệt đối chứng dương (vạch số 18) di chuyển xa vạch số 19 và đi về cực
âm của điên trường. Qua đó, có thể đọc kết quả kiểm tra rằng nếu vạch mẫu càng di chuyển
xa đối chứng dương và đi về cực âm thì đây chính là DNA của vi khuẩn. Để biết được độ dài
của vệt kết quả, so sánh giữa dãy vạch đối chứng số 9
Theo kết quả điện di hình 3.9, kết quả của nhóm ở vạch số 3 và số 4, trong đó, vạch số
3(số 3) là kết quả của thịt gà nạc ở 4oC (số 4) là thịt gà xay ở 0oC. Hai mẫu số 3 và số 4 đều
chứa DNA của Salmonella nên vệt di chuyển của mẫu khá xa so với vạch đối chứng âm.
Quan sát hình 3.9 cho thấy vệt chứa vi khuẩn di chuyển khá xa vạch đối chứng âm về cực
dương. Dựa vào kết quả có thể kết luận rằng thịt gà chứa nhiều Salmonella hơn thịt tôm
(vạch số 4 và 5), thịt heo (vạch số 6 và 7). Dù được bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông hay bảo
quản ở nhiệt độ mát thì vi khuẩn vẫn tồn tại trong thịt gà mà không bị tiêu diệt. Hơn nữa, vi
khuẩn có khả năng đề kháng tốt với nhiệt độ lạnh đông. Sản phẩm thịt gà xay hay thịt gà
nguyên thì vẫn nhiễm vi khuẩn với lượng như nhau. Vì vậy, cần có cách bảo quản thịt gà với
điều kiện khác tốt hơn để đảm bảo chất lượng thịt.