Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma lucidum kết hợp với enzyme và siêu âm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUY TRÌNH PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM
LINH CHI GANODERMA LUCIDUM KẾT HỢP VỚI
ENZYME VÀ SIÊU ÂM

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1411100465

: ĐẶNG THỊ KIM TUYỀN
Lớp: 14DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này hoàn toàn trung
thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các thông tin, tài liệu
trích dẫn trong đồ án này đều được ghi rõ nguồn gốc.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Kim Tuyền


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án, tôi đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ và giúp đỡ
từ phía nhà trường cũng như gia đình. Chính vì lí do đó, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến họ vì đã giúp tôi đạt được thành quả như hôm nay.
Lời đầu tiên tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Thành
phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để tôi được học tập thật tốt tại trường trong thời
gian qua và quý Thầy (Cô) của Viện Khoa học Ứng dụng lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự
hào vì đã được học tập tại đây. Bên cạnh đó, để hoàn thành được bài báo cáo này, tôi
xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương đã tận tình chỉ dạy tôi, cho tôi thêm
động lực mỗi khi gặp khó khăn, nhờ có cô tôi mới có thể hoàn thành tốt nhất đề tài của
mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm
Công nghệ Sinh học, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và các em
Nguyễn Bảo Trân, Nguyễn Ngọc Gia Bảo và Hồ Lí Hải Vân (15DSH) đã giúp đỡ tôi
và nhóm thực hiện đề tài nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Ngoài ra tôi cũng xin cảm ơn quý Thầy (Cô), các anh chị phụ trách phòng thí
nghiệm khoa Dược, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi
về thiết bị và dụng cụ để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè
tôi, đã luôn quan tâm, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành báo cáo.
Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót nhất định
mà tôi chưa thể khắc phục nên tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý Thầy (Cô) để
đề tài này được hoàn chỉnh hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Kim Tuyền


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................... v
DANH MỤC B ẢNG.................................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................................ ix
ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................................4
1.1.

Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ...............................................4

1.1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi .............................................................................................4
1.1.1.1.

Phân loại ......................................................................................................................5

1.1.1.2.

Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi........................................................................8

1.1.2. Bào tử nấm Linh chi ........................................................................................................9
1.2.

Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ....... 12

1.2.1. Các polysaccharide và peptidoglycan......................................................................... 15

1.2.2. Triterpenes ...................................................................................................................... 17
1.2.3. Saponin ........................................................................................................................... 22
1.2.4. Acid béo ........................................................................................................................... 23
1.2.5. Các thành phần khác.................................................................................................... 24
1.3.

Công dụng của nấm Linh chi và bào tử Nấm Linh chi........................................ 24

1.3.1. Phòng chống ung thư ................................................................................................... 26
1.3.2. Khả năng kháng oxi hóa .............................................................................................. 27
1.3.3. Điều trị bệnh đái tháo đường ...................................................................................... 28
1.3.4. Điều trị các bệnh về tim mạch..................................................................................... 28
1.3.5. Tăng cường hệ miễn dịch ............................................................................................ 29
1.4.

Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi ................. 29

1.4.1. Enzyme chitinase ........................................................................................................... 30
1.4.2. Giới thiệu về siêu âm phá tế bào ................................................................................. 33
1.4.2.1.

Khái niệm .................................................................................................................. 33

1.4.2.2.

Bản chất của sóng âm .............................................................................................. 34

1.4.2.3.

Nguyên lý tác động của sóng siêu âm.................................................................... 34

i


Đồ án tốt nghiệp

1.4.2.4.

Tác động của sóng siêu âm lên tế bào ................................................................... 36

1.4.2.5.

Ứng dụng của sóng siêu âm .................................................................................... 36

1.4.2.6.

Thiết bị phát sóng siêu âm ...................................................................................... 37

1.4.3. Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi ....................................................... 38
1.4.4. Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử ....................................................... 41
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 46
2.1.

Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 46

2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................................ 46
2.1.2. Nơi thực hiện ................................................................................................................. 46
2.1.3. Thời gian thực hiện ...................................................................................................... 46
2.1.4. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất..................................................................................... 46
2.1.4.1.

Thiết bị ....................................................................................................................... 46

2.1.4.2.

Dụng cụ...................................................................................................................... 47

2.1.4.3.

Hóa chất – Môi trường nuôi cấy ............................................................................ 48

2.2.

Phương pháp nghiên cứu............................................................................................ 52

2.2.1. Thu enzyme chitinase bằng lên men thể rắn ............................................................ 54
2.2.1.1.

Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 trên môi trường thạch
PDA ............................................................................................................................ 55

2.2.1.2.

Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 .......................................... 55

2.2.1.3.

Thu enzyme dịch trích ly bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn ... 55

2.2.1.4.

Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum
T2 tối ưu hóa để thu enzyme chitinase ................................................................. 55

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi ................. 56
2.2.2.1.

Phá vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng
enzyme thương mại Cellulase (EC), dịch tăng sinh nấm Trichoderma
harzianum T2 (DTL) và siêu âm............................................................................. 57

2.2.2.2.

Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ................. 57

2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lý bào tử .......................................................... 60

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học .................................................................................................................................... 61
2.2.4.1.

Quy trình trích ly hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi ................................. 63

2.2.4.2.

Định tính một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi .................................. 65

2.2.4.3.

Định lượng một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi sau khi bị phá vỡ 67

2.2.4.4.

Phương pháp kháng oxi hóa DPPH....................................................................... 69

2.2.4.5.

Phương pháp thử độc tính tế bào artemia ............................................................ 71

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 73
3.1.

Thu enzyme chitinase trên môi trường lên men thể rắn .................................... 73

3.2.

Ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi ........................... 74

3.3.

Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông..................................................... 78

3.4.

Định tính thành phần hóa học sau khi phá vỡ bào tử nấm Linh chi ................ 79

3.4.1. Định tính thành phần hóa học trong dịch phá vỡ bào tử ...................................... 80
3.4.1.1.

Định tính protein ...................................................................................................... 81

3.4.1.2.

Định tính saponin ..................................................................................................... 82

3.4.1.3.

Định tính polysaccharide ........................................................................................ 85

3.4.1.4.

Định tính triterpenoid .............................................................................................. 85

3.4.2. Định tính thành phần hóa học còn lại trong vỏ bào tử phá vỡ bằng enzyme
kết hợp siêu âm .............................................................................................................. 87
3.4.2.1.

Định tính protein ...................................................................................................... 87

3.4.2.2.

Định tính saponin ..................................................................................................... 87

3.4.2.3.

Định tính polysaccharide ........................................................................................ 88

3.4.2.4.

Định tính triterpenoid .............................................................................................. 88

3.5.

Định lượng các hoạt chất thu được từ dịch phá vỡ và bào tử bị phá vỡ ......... 90

3.5.1. Định lượng polysaccharide trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu
âm và mẫu siêu âm bằng phương pháp Phenol – Sulfuric.................................... 90
3.5.2. Định lượng lipid trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu
siêu âm bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb .............................................. 92
3.6.

Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa ............................................................................ 97

iii


Đồ án tốt nghiệp

3.7.

Thử độc tính tế bào trên Artemia nauplii .............................................................. 101

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 104
4.1.

Kết luận ........................................................................................................................ 104

4.2.

Kiến nghị ...................................................................................................................... 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 106
Tài liệu tiếng Việt ................................................................................................................... 106
Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................................... 106
PHỤ LỤC A ..................................................................................................................................1
PHỤ LỤC B ............................................................................................................................... 13

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
PDA: Potato Dextro Agar
EC: Enzyme Cellulase C20032
DTL: Dịch trích ly
A.nauplii: atermia nauplii
DPPH: 1,1 - Diphenyl - 2 - picryl – hydrazyl
Trolox: 6 – Hydroxy – 2, 5, 7, 8 - tetramethychroman - 2 – carboxylic
CMC: Sodium carboxymethyl cellulose
DNS: acid - 2 - hydroxyl - 3,5 – dinitrobenzoic
DMSO: Dimethyl sulfoxit
ĐC: Đối chứng
KSA: Không siêu âm
SA: Siêu âm

SA 75%: Siêu âm độ khuếch đại 75%
SA100%: Siêu âm độ khuếch đại 100%
PHC: Pha hữu cơ
PN: Pha nước
DI: Diethyl ether
HE: Hexane
BT: Bào tử

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác
nhau (Lê Xuân Thám, 1996) ..................................................................................................... 10
Bảng 1.2. Thành phần dược tính của nấm Linh chi ............................................................... 12
Bảng 1.3. Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li
JJ và cộng sự (2014)) ................................................................................................................. 15
Bảng 1.4. So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác
nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL) ....................................................................................... 27
Bảng 1.5. Những nghiên cứu về phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi trên Thế giới ............. 39
Bảng 1.6. Các phương pháp trích ly ........................................................................................ 41
Bảng 1.7. Các dung môi trong chiết xuất lipid của Ganoderma lucidum
(CN1099455C) ........................................................................................................................... 44
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính tế bào trên artemia nauplii.................................. 71
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của enzyme chitinase thu được từ hai môi
trường cơ chất (mm) .................................................................................................................. 73
Bảng 3.2. Bảng so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh
chi qua các ngày ủ enzyme........................................................................................................ 75

Bảng 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm
Linh chi qua các ngày ................................................................................................................ 76
Bảng 3.4. Kết quả so sánh ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông ........................ 78
Bảng 3.5. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly bằng hai dung
môi................................................................................................................................................ 81
Bảng 3.6. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định
tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng diethyl ether ........................ 82
Bảng 3.7. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định
tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng hexane ................................. 84
Bảng 3.8. Kết quả định tính saponin khi trích ly bằng hai dung môi .................................. 85
Bảng 3.9. Kết quả định tính polysaccharide khi trích ly bằng hai dung môi ...................... 85
Bảng 3.10. Kết quả định tính triterpenoid khi trích ly bằng hai dung môi ......................... 86

vi


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.11. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính thành phần hóa học trong dịch phá
vỡ bằng hai dung môi ................................................................................................................ 86
Bảng 3.12. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly vỏ bào tử ......... 87
Bảng 3.13. Kết quả định tính saponin theo thử nghiệm tạo bọt, Fontan - Kaudel khi
trích ly vỏ bào tử......................................................................................................................... 88
Bảng 3.14. Kết quả định tính polysaccharide theo thử nghiệm Molisch khi trích ly vỏ
bào tử ........................................................................................................................................... 87
Bảng 3.15. Kết quả định tính triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann-Burchard khi
trích ly vỏ bào tử......................................................................................................................... 88
Bảng 3.16. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính phần vỏ bào tử ................................... 88
Bảng 3.17. Bảng tổng kết các thử nghiệm tất cả các pha khi trích ly dịch phá vỡ bào tử
và vỏ bào tử ................................................................................................................................. 89

Bảng 3.18. Hàm lượng polysaccharide có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ
100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ....................... 91
Bảng 3.19. Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng
lỏng dịch phá vỡ bào tử bằng diethyl ether và hexane từ 100 g bào tử không siêu âm và
siêu âm ......................................................................................................................................... 92
Bảng 3.20. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử
phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ............................................. 92
Bảng 3.21. Giả sử hàm lượng polysaccharide tổng và lipid trong mẫu không siêu âm là
100% từ đó tính ra được% polysaccharide tổng và lipid của các mẫu còn lại nhằm so
sánh ảnh hưởng của siêu âm lên hàm lượng polysaccharide và lipid trong bào tử nấm
Linh Chi ....................................................................................................................................... 93
Bảng 3.22. Tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của đối chứng dương Trolox ............... 97
Bảng 3.23. Tỉ lệ phần trăm (%) quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử ................ 97
Bảng 3.24. Bảng giá trị IC50 (µg/ml) của các mẫu dầu bào tử ............................................ 98
Bảng 3.25. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất
trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của PHC SA (mg/ml) ...................................... 101

vii


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.26. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất
trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của BT SA (mg/ml) ......................................... 102

viii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A), nấm mọc trong tự nhiên (B) và
nấm trồng (C) .................................................................................................................................5
Hình 1.2. Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần ....................... 11
Hình 1.3. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum ......................... 11
Hình 1.4. Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi............................................... 12
Hình 1.5. Cấu trúc của Ganodermasides ................................................................................. 14
Hình 1.6. Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi ............................. 17
Hình 1.7. Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự,
1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48:
2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự,
1989).

................................................................................................................................... 19

Hình 1.8. Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi
(Bingji Ma và cộng sự, 2011) ................................................................................................... 20
Hình 1.9. Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự,
2011) ............................................................................................................................................ 21
Hình 1.10. Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ........................ 26
Hình 1.11. Cấu trúc chitin ......................................................................................................... 31
Hình 1.12. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ......................................................... 32
Hình 1.13. Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose ...................................... 33
Hình 1.14. Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí ............................................ 36
Hình 1.15. Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh ................................................................. 38
Hình 1.16. Máy phá mẫu, tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica Q500 ................................... 39
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 54
Hình 2.2 Sơ đồ thu enzyme chitinase bằng môi trường lên men thể rắn ............................ 54
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử
nấm Linh chi ............................................................................................................................... 57

Hình 2.4. Buồng đếm hồng cầu Neubauer .............................................................................. 58
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử................. 60

ix


Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học ....................................................................................................................... 62
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình trích ly bào t ử sau khi phá vỡ ........................ 64
Hình 2.8. Phương trình phản ứng định tính polysaccharide ................................................. 66
Hình 3.1. Đường kính vòng phân giải enzyme chitinase thu được từ hai môi trường cơ
chất (mm) ................................................................................................................................... 73
Hình 3.2. Khả năng phân giải chitin của enzyme thu được từ hai môi trường................... 74
Hình 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm
Linh chi qua các ngày ................................................................................................................ 76
Hình 3.4. Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi (X400)............................................... 76
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi . 77
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phá vỡ (%) bào tử nấm Linh chi qua các chế độ tiền xử
lí

................................................................................................................................... 79

Hình 3.7. Hai pha dịch trích ly lỏng lỏng bằng diethyl ether ............................................... 81
Hình 3.8. Biểu đồ polysaccharide tổng (%) có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ
100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ....................... 92
Hình 3.9. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá
vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm. ................................................... 93
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của siêu âm đến hàm lượng polysaccharide

tổng số và lipid có trong bào tử nấm Linh chi sau khi phá vỡ. ............................................ 94
Hình 3.11. Quy trình đề nghị phá vách bào tử nấm Linh chi kết hợp enzyme và siêu
âm

................................................................................................................................... 96

Hình 3.12. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào
tử

................................................................................................................................... 98

Hình 3.13 Đường chuẩn DPPH của mẫu pha hữu cơ không siêu âm và siêu âm .............. 99
Hình 3.14 Đường chuẩn DPPH của mẫu bào tử không siêu âm và siêu âm....................... 99
Hình 3.15. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 (g/ml) của các mẫu dầu bào tử........................ 100
Hình 3.16. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào
tử PHC SA (mg/ml) ................................................................................................................. 102

x


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.17. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào
tử BT SA (mg/ml) .................................................................................................................... 103

xi


Đồ án tốt nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tính cấp thiết của đề tài
Từ xưa đến nay, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được cho là một loại dược
liệu và đã có không ít người sử dụng làm thuốc. Theo các tài liệu nghiên cứu, nấm
Linh chi có nhiều công dụng trong việc hỗ trợ điều hòa huyết áp, tăng khả năng miễn
dịch cho cơ thể, hỗ trợ giải độc và cải thiện bệnh viêm gan mãn tính, xơ gan, thần kinh
suy nhược. Có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt
chất và xác định tác dụng dược lý của nấm Linh chi như: Germanium, acid ganoderic,
acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, adenosin, beta – D – glucan…
(đặc biệt trong nấm Linh chi có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 8 lần). Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố
vi lượng cần thiết cho sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium,
magnesium, natrium, calcium. Trong đó, triterpenoid và polysaccharide được xem là
thành phần chủ yếu có trong nấm được chú ý nhiều nhất. Chính vì lí do đó mà hiện
nay việc trồng và sử dụng nấm Linh chi đang trở nên rất phổ biến và được nhiều người
quan tâm.
Bên cạnh đó, phần bào tử do nấm Linh chi phóng thích ra cũng có nhiều công
dụng bổ ích nhưng lại ít được quan tâm nghiên cứu trích ly hoạt chất. Bào tử nấm Linh
chi được cho là tinh chất của nấm Linh chi chứa nhiều chất dinh dưỡng và các đặc tính
dược lý, là sản phẩm rất tốt cho sức khỏe. Tuy nhiên, cấu tạo bào tử nấm Linh chi gồm
2 lớp vỏ cứng, việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi để thu triệt để hoạt chất bên trong bào
tử là điều đáng được quan tâm.
Ngày nay đã có các phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng
cơ học kết hợp enzyme… Phương pháp phá vỡ sử dụng biện pháp cơ học vẫn chưa
mang lại hiệu quả tối ưu. Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại
học Vũ Hán, Trung Quốc (2007), vách bào tử nấm Linh chi chứa 57,64% là chitin,
việc sử dụng enzyme chitinase và cellulase trong việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi là
bước không thể thiếu. Nhóm sinh viên HUTECH đã phân lập nấm Trichoderma từ
nấm Linh chi phục vụ cho việc phá vách bào tử. Ngoài ra, việc kết hợp với enzyme

1

Đồ án tốt nghiệp

thương mại giúp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi, kết quả đã đạt được từ nghiên cứu
của sinh viên Nguyễn Thanh Liên Khương (khóa 13DSH) là 53.5%. Trong khi đó để
tăng hiệu suất phá vỡ thì việc ứng dụng siêu âm giúp tăng tỉ lệ phá vỡ đến 74.3%. Vì
muốn góp phần nâng cao tỉ lệ phá vỡ và chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào
tử nấm Linh chi, nên nhóm thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu các chế độ tiền xử và
áp dụng siêu âm trước và sau khi ủ bào tử với dịch enzyme. Kết quả được trình bày
trong đồ án tốt nghiệp “Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi
Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm”.
Mục đích: Thu hồi hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi.
Mục tiêu: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum
kết hợp enzyme và siêu âm.
Nội dung:
-

Chọn môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase từ Trichoderma
harzianum T2.

-

Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm và enzyme lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh
chi.

-

Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử.

-

Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học, hoạt tính sinh học
của bào tử nấm Linh chi.

Kết quả đạt được của đề tài:
-

Xác định môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase để phá vỡ bào tử
nấm Linh chi.

-

Thiết lập được chế độ tiền xử lý bào tử trước khi phá vỡ.

-

Thiết lập được quy trình phá vỡ bào tử kết hợp enzyme và siêu âm.

-

So sánh được thành phần polysaccharide tổng và lipid tổng của bào tử phá
vỡ bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.

-

So sánh được hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết từ bào tử phá vỡ bằng
enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.

2

Đồ án tốt nghiệp

-

Xác định được độc tính tế bào trên Artemia của cao chiết từ bào tử phá vỡ
bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.

Hạn chế của đề tài:
-

Chưa tối ưu hóa được thông số phản ứng enzyme như vận tốc khuấy đảo
quy mô Phòng thí nghiệm.

-

Chưa tối ưu hóa được thông số siêu âm do hạn chế về thiết bị.

-

Hạn chế về việc khảo sát triterpenoid và các thành phần hoá học, hoạt tính
sinh học khác của bào tử phá vỡ.

Phương pháp nghiên cứu
-

Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm.

-

Đề tài được xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals
Analysis Systems (SAS).

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi
1.1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi
Nấm Linh chi (tiếng Anh: Lingzhi mushroom) có tên khoa học là Ganoderma
lucidum, thuộc họ Nấm Lim (Ganodermataceae). Nấm Linh chi còn có những tên khác
như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung... được phân bố rộng rãi ở các nước Á
Đông và thường mọc trên các thân cây khô hoặc đã chết. Ở một số nước Châu Á như
Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan… nấm Linh chi được sử dụng như một loại dược
thảo thiên nhiên giúp cải thiện sức khỏe, tăng cường khả năng kháng tế bào ung thư...
Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ.
Trong tiếng Latin thì lucidus có nghĩa là “sáng bóng” hay “rực rỡ” và điều này cũng
tương thích với hình dáng bên ngoài của nấm Linh chi. Ở mỗi nơi nấm Linh chi được
gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji
(Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn
niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo 2 cuốn sách rất nổi tiếng mô
tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing – Thần Nông Bản
Thảo Kinh” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán), tác phẩm chuyên
tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật từ đời Hán trở về trước và “Ben Cao
Gang Mil – Bản Thảo Cương Mục” của “Li Shi Zhen – Lí Thởi Trân” (1590 trước
Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm
lúc bấy giờ. Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập. Tuy nhiên, trong các

văn bản cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ.

4


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1: Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A),
nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C)
1.1.1.1. Phân loại
Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010)
Giới: Nấm – Mycota hay Fungi
Ngành: Nấm thật – Eumycota
Ngành phụ: Basidiomycotina
Lớp: Hymenomycetes
Lớp phụ: Hymenomycetidae
Bộ: Ganodermatales
Họ: Ganodermataceae
Chi: Ganoderma

5


Đồ án tốt nghiệp

Loài: Ganoderma lucidum
Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đã
tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấm
Linh chi. Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rất
nhiều loại khác nhau dựa vào thể quả cũng như hình dáng bên ngoài của nấm.

Ở phương Tây, theo trình định danh có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này.
Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học
Phần Lan xác định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst đã mất
đến 100 năm (1881). Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu cho
chủng loại nấm này. Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh chi đã được thay đổi
bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano và Steyaert, ... sau khi họ đã
tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như các bào tử của nấm Linh chi có hình
quả trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp
trong của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ. Cũng từ đó, nấm
Linh chi không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa.
Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y
Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu
sắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi.
- Xích Chi - Nấm Linh chi đỏ: còn được gọi là Đơn chi, Hồng chi có vị đắng,
thường được tìm thấy ở trên núi Huo. Ganoderma lucidum là đại diện chính cho loài
nấm này. Những đặc điểm của nấm Linh chi đỏ chính là nắp nấm có hình dạng giống
như quả thận hoặc hình bán nguyệt, màu nâu đỏ. Thân nấm có dạng giống như một
thân cây, cùng màu hoặc đậm hơn so với nắp nấm. Nấm Linh chi đỏ giúp ích tâm khí,
chủ vị, tăng trí tuệ. Sử dụng Linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh
các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực.
- Tử chi - Nấm Linh chi tím: còn được biết đến với tên gọi là Linh chi gỗ, màu tím
có vị ngọt. Đặc điểm của loại nấm này là nắp nấm có màu nâu hoặc nâu tím. Thể quả
có màu nâu, bào tử của chúng lớn hơn nấm Linh chi đỏ. Ganoderma sinense là đại

6


Đồ án tốt nghiệp

diện của loài nấm này. Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi

đẹp.
- Hoàng chi - Linh chi vàng: còn gọi là Kim chi, loại nấm này có màu vàng tím, có
vị ngọt. Một cây nấm lớn có thể nặng khoảng 5 kg hoặc hơn, còn cây nấm non thì
nặng khoảng 1,5 đến 2 kg. Laetiporus sulphureus là đại diện của loài nấm này. Khi
tươi thì nấm này sẽ chứa rất nhiều nước, có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần.
- Bạch chi - Linh chi trắng: còn gọi là nấm Linh chi ngọc bích, có màu trắng. Theo
như Bao Puzi mô tả thì đây là loại nấm không có chất béo, Fomitopsis officinalis là đại
diện cho loài nấm này. Loại nấm này có thể quả màu trắng, hình dáng giống như một
cái móng ngựa. Một cây nấm lớn có thể nặng đến nhiều kilogram. Loại nấm này
thường mọc trên cây thông và một số loại cây lá kim khác. Bạch chi có vị cay, tính
bình, không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi.
- Hắc chi - Linh chi đen: còn gọi là nấm Linh chi xuân hay Huyền chi có màu đen
và vị mặn. Loại nấm này thường mọc ở trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài có
màu đen bên trong có màu đỏ, thường mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng.
Amauroderma rugosum và Polyporus melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này.
Cả cuống và nắp của 2 loại nấm này đều có màu đen. Hắc chi có tác dụng ích thận khí,
khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường.
- Thanh chi – Linh chi xanh: còn gọi là nấm Linh chi rồng. Theo Bao Puzi miêu tả
thì nấm Linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá.
Coriolus versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này. Đặc điểm của loài này là
mũ nấm cứng và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn. Thanh chi giúp cho
sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng
và thoải mái.
Trong mỗi loài nấm Linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau. Ví dụ như
nấm Linh chi đỏ thì có Ganoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết đến nhiều
nhất. Đối với Linh chi tím thì có Ganoderma neojaponicum và Ganoderma sinense.
Tuy nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa, người ta chỉ tập trung nghiên
cứu 2 loại đó là Linh chi đỏ và Linh chi tím.

7

Đồ án tốt nghiệp

Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật
Bản chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác
loại mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau. Nếu thay đổi điều kiện người ta
có thể có được sáu loại từ cùng một giống.
Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại Linh
chi theo các đặc điểm như:


Vị trí nấm mọc trên cơ chất chủ.
 Nhóm mọc cao: tai nấm mọc từ gốc lên đến ngọn cây.
 Nhóm mọc gần đất : nấm mọc từ gốc cây chủ.
 Nhóm mọc từ đất : tai nấm mọc từ rễ cây hoặc xác mùn.



Nhiệt độ ra nấm.
 Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 20 0C – 23 0C.
 Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 240 C – 260 C.
 Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 27 0C – 30 0C.

Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa
dạng về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N. 189). Linh chi
thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là
Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là
Ganoderma lucidum có tới 45 loại.
Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công

trong phòng thí nghiệm năm 1978. Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ
đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào
nuôi trồng chủ động.
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi
Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác:
- Cuống nấm: dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống
nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc. Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen,
bóng, không có lông phủ trên mặt tán nấm.

8


Đồ án tốt nghiệp

- Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt. Mũ nấm dạng thận – gần tròn,
đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có
tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu
đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có
đầu sợi dày thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 – 10 μm. Chính những tế bào
vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm. Lớp vỏ láng phủ suốt
theo cuống. Kích thước tán biến động từ 2 – 30 cm, dày 0,8 – 2,5 cm, cuống dài từ 2,5
- 3,5 cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2 cm). phần đính cuống hoặc gồ
lên hoặc lõm như lõm rốn. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8 cm màu vàng kem – nâu nhạt –
trắng. Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ. Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận
cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ
trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong
cồn. Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa,
nắng. Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào .
- Thụ tầng: Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ
0,2 – 1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5

ống/mm. Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không
màu, dài 16 - 22μm. Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpore) phồng căng
hay lõm thụt vào mà thành.
1.1.2. Bào tử nấm Linh chi
Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử,
tức là hạt giống hữu ích cho đời sau. Bào tử thường được mô tả có dạng trứng cụt. Đôi
khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn - nhọn. Thực ra đó là do chụp
phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành. Mỗi bào tử được
bao phủ với hai lớp vách rất khó phá vỡ gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng
mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích
thước bào tử rất nhỏ dao động khoảng từ 6,5 x 8,0 µm đến 9,6 x 12,6 µm. Vách bào tử
gồm hai lớp liên kết giữa exosporium và endosporium, có độ dày 0,8 x 1,0 µm và 11 x
14 µm, có cấu trúc phức tạp. Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vách rất cứng, khó nảy

9


Đồ án tốt nghiệp

mầm (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016). Một số nghiên cứu về kích thước bào
tử nấm Linh chi được trình bày trong bảng dưới đây (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác
nhau (Lê Xuân Thám, 1996)
Kích thước bào thử (μm)

Vùng thu mẫu

10 – 12 x 6 – 8

Đông Dương

1939, Imazeki

9,5 – 11 x 5,5 – 7

Nhật Bản

1964, Teng

8,5 - 11,5 x 5 – 6,5

Trung Quốc

8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5

Indonesia, Úc châu

1973, Pegler và cộng sự

9 – 13 x 6 – 8

Anh Quốc

1976, Ryvarden

7 – 12 x 6 – 8

Bắc Âu, Phi châu

7 – 12 x 6 – 8

Đông Phi châu

7,5 – 10 x 5 – 6,5

Bắc Việt Nam

9 – 13 x 5 – 7

Argentine

8,2 – 11,5 – 13,5 x 6,5 – 7,5 – 8,1

Bồ Đào Nha

9 – 12 x 5,5 – 8

Bắc Mỹ

10 – 11,8 x 6,8 – 7,8

Bắc Mỹ

1987, Peterson

7 – 8 x 6 – 7,8

Bắc Âu

1989, Zhao

9 – 11 x 6 – 7

Trung Quốc

1990, Hseu

8,5 – 11,5 x 5 – 7

Đài Loan

1994, Thu

9 – 12 x 5 – 7

Hà Bắc, Việt Nam

8 – 10,5 x 5 x 7

Lạng Sơn, Việt Nam

7,5 – 11,5 x 5,5 – 7

Đà Lạt, Việt Nam

Nguồn
1889, Patouuillard

1972, Steyaert

1980, Ryvarden và cộng
sự
1981, Kiet
1982, Bazzalo và cộng sự
1986,Melo
1986, Gibertson và cộng
sự
1986, Adaskaveg và cộng
sự

1994, Tham và cộng sự
1996, Tham

Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử
bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất mịn.
10


Đồ án tốt nghiệp

Tuy vậy số lượng bào tử Linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ thu
được 1 kg bào tử.
Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu
tạo tinh vi của bào tử thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung
Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt.

a)

b)

Hình 1.2. Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần
a) Bào tử nấm Linh chi chưa bị phá vỡ
b) Bào tử nấm Linh chi bị phá vỡ vách

Hình 1.3. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum

11