Nghiên cứu đa dạng hệ vi sinh trong ruột tôm thẻ chân trắng tại tỉnh sóc trăng bằng kỹ thuật metagenomics

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI SINH
TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG
BẰNG KY THUẬT METAGENOMICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI SINH
TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG
BẰNG KY THUẬT METAGENOMICS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8.42.01.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Chu Hoàng Hà

Hà Nội – 2018

i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới
sự hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà và TS. Nguyễn Trung Nam. Các nội
dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công
bố dưới bất kỳ hình thức nào.
Luận văn sử dụng thông tin, số liệu và hình ảnh từ các bài báo và nguồn tài
liệu của các tác giả khác đều được chú thích và trích dẫn đầy đủ.
Nếu có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung
luận văn.

Hà Nội, tháng 11 năm 2018
Học viên

Nguyễn Hồng Nhung


ii

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà và TS.
Nguyễn Trung Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn Ths. Lê Hoàng Đức, cùng tập thể cán bộ, nghiên cứu
sinh, học viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng và Phòng Công nghệ tế bào thực
vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực
hiện luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và Ban đào tạo Viện Sinh
thái và Tài nguyên sinh vật đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt
thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến bạn bè và gia đình đã giúp đỡ và chia sẻ, động
viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn.
Hà Nội, tháng 11 năm 2018
Học viên

Nguyễn Hồng Nhung


3

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT..............................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... viii
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
1. Giới thiệu.................................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2
NỘI DUNG .................................................................................................................3
Chương 1. Tổng quan tài liệu......................................................................................3
1.1. Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng..............................................................3
1.1.1. Hệ thống phân loại, đặc điểm hình thái cấu tạo của tôm thẻ chân trắng .....3
1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái và tập tính của tôm thẻ chân trắng; phân
bố tự nhiên của tôm thẻ chân trắng ...................................................................................4
1.2. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam.....................6

1.2.1. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam .................6
1.2.2. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi và các biện pháp phòng trừ bệnh trên
thế giới và Việt Nam
.............................................................................................................8

1.3. Công nghệ metagenomics và hướng tiếp cận mới trong nuôi trồng và phòng
trừ bệnh hại trên tôm nuôi......................................................................................10
1.3.1. Giới thiệu về công nghệ metagenomics .............................................................10
1.3.2. Các nghiên cứu và thành tựu của công nghệ metagenomics trong lĩnh vực
thủy sản ...................................................................................................................................13
1.3.3. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next generation sequencing –
NGS) và hệ thống giải trình gen thế hệ mới Illumina ................................................19
1.3.3.1. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới ..........................................................19
1.3.3.2. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina ............................20


4

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ......................................................24
2.1. Vật liệu............................................................................................................24
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................................24
2.1.2. Hóa chất phục vụ nghiên cứu................................................................................24
2.1.3. Thiết bị phục vụ nghiên cứu ..................................................................................24
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................24
2.2.1. Phương pháp thu mẫu .............................................................................................25
2.2.2. Các phương pháp phân tích mẫu nước ...............................................................25
2.2.3. Phương pháp tách ADN .........................................................................................25
2.2.4. Đánh giá chất lượng ADN tách chiết ..................................................................33
2.2.5. Các phương pháp giải trình tự ..............................................................................33
2.2.6. Xử lý số liệu giải trình tự gen ADN 16S rARN ..............................................33

Chương 3. Kết quả và thảo luận................................................................................35
3.1. Kết quả thu mẫu và đánh giá các chỉ tiêu môi trường ....................................35
3.2. Kết quả tách ADN tổng số của các mẫu ruột, nước .......................................37
3.2.1. Kết quả tách ADN mẫu ruột ..................................................................................38
3.2.2. Kết quả tách ADN mẫu nước ................................................................................41
3.3. Kết quả xác định trình tự metagenome ADN .................................................46
3.3.1. Xác định trình tự ADN metagenome ..................................................................46
3.3.2. Kết quả phân tích đa dạng vi sinh vật mẫu ruột và nước ..............................48
3.3.3. Thành phần vi khuẩn trong mẫu tôm thẻ khỏe mạnh và bệnh .....................50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................56
1. Kết luận..............................................................................................................56
2. Đề nghị...............................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................57


5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Acut
Ch
A
e
ng
H
Heph
P
BsinhBhóa
O i
D5 o
C c C Nhu

ng
O
h o
E
Ea H
r chết
M
y
Tổ
S
M
ort c
Na
tio
cLi
G
eên
A
mi
A
Global
H
G
Ou ộ
O
f i
A
sả
n
G

G
e
O
Bệnh
n
L
d
Baculovir
g
O O Đơn
T p loài
Us e
ương
r
P
a p
r
t

e

-

a

P To l Tổng
T
tal a
A
am

nghị
N m
on b
Total
Tổ
T
Dis
ng
D
lved
ch
Sất
S
rắ


6

TSS

Turbidity and suspendid solids

Tổng chất rắn lơ lửng


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Thông tin các vị trí thu mẫu .....................................................................35
Bảng 3.2. Kết quả phân tích các chỉ tiêu môi trường ao nuôi thu mẫu ....................36

Bảng 3.3. Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp .........39
Bảng 3.4. Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp .........42
Bảng 3.5. Bảng mô tả bộ dữ liệu giải trình tự gen trên máy Illumina......................48
Bảng 3.6. Các thông số giải trình tự và các chỉ số đa dạng phân tích ở các mẫu
nước, ruột của tôm thẻ bị bệnh và khỏe mạnh ..........................................................49


8

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình thái tôm thẻ chân trắng ......................................................................3
Hình 1.2. Quy trình sản xuất tôm thẻ chân trắng (Nguồn: FAO) ...............................6
Hình 1.3. Sản lượng tôm trên thế giới giai đoạn 1995-2017, dự báo đến năm 2019 .7
Hình 1.4. Tổng sản lượng tôm đánh bắt và nuôi trồng (Nguồn: FAO) ......................7
Hình 1.5. Số liệu sản xuất ngành tôm năm 2017........................................................8
Hình 1.6. Xây dựng và sàng lọc thư viện metagenomics. ........................................12
Hình 2.1. Hình ảnh quá trình lọc nước qua các màng lọc có kích thước 8 µm, 0,8
µm và 0,22 µm. .........................................................................................................29
Hình 3.1. Hình ảnh ao nuôi tôm thu mẫu (A); và mẫu tôm khỏe (hình B, phải) và
mẫu tôm bệnh (hình B, trái) ......................................................................................35
Hình 3.2. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm sử dụng ba phương
pháp khác nhau..........................................................................................................39
Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu ruột tôm phục vụ
giải trình tự gen thế hệ mới .......................................................................................41
Hình 3.4. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm sử dụng ba phương
pháp khác nhau..........................................................................................................43
Hình 3.5. Hình ảnh điện đi metagenomic ADN của mẫu với nhiệt độ ly giải 95 và
70 độ..........................................................................................................................44
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu nước phục vụ giải
trình tự gen thế hệ mới ..............................................................................................46

Hình 3.7. Sơ đồ quy trình giải trình tự ADN metagenome ......................................47
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra thư viện ADN được gắn adapter của các mẫu bằng
Bioanalyzer................................................................................................................47
Hình 3.9. Sơ đồ quá trình phân tích dữ liệu 16S rARN ...........................................48
Hình 3.10. Đường cong biểu diễn mối tương quan giữa số lượng trình tự và số
lượng OTU ở các mẫu...............................................................................................50


9

Hình 3.11. Thành phần 10 ngành chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh
và khỏe mạnh ............................................................................................................51
Hình 3.12. Thành phần 10 lớp chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và
khỏe mạnh .................................................................................................................52
Hình 3.13. Thành phần 10 lớp chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và
khỏe mạnh .................................................................................................................52
Hình 3.14. Thành phần 10 chi chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và
khỏe mạnh .................................................................................................................53
Hình 3.15. Kết quả phân tích thành phần chính (PcoA) ở các mẫu nước và ruột tôm
thẻ ..............................................................................................................................5
4


1

MỞ ĐẦU
1. Giới thiệu
Theo dự báo của GOAL 2018, đến năm 2020 Việt Nam sẽ vượt qua hai quốc
gia xuất khẩu tôm lớn ở châu Á là Ấn Độ và Indonexia để trở thành quốc gia xuất
khẩu tôm lớn thứ hai châu Á, sau Trung Quốc. Theo VASEP, sản lượng tôm ước

tính của Việt Nam vào năm 2019 có thể đạt 700.000 tấn. Diện tích nuôi trồng và sản
lượng liên tục tăng là dấu hiệu đáng mừng đối với ngành nuôi trồng thủy sản. Tuy
nhiên, sự tăng trưởng này cũng đi kèm với sự gia tăng nhiều yếu tố rủi ro, trong đó,
nan giải nhất vẫn là vấn đề dịch bệnh trên tôm nuôi với diễn biến phức tạp qua các
năm. Các bệnh phổ biến trên tôm nuôi có thể kể đến là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính
(AHPND) (hay bệnh chết sớm – EMS) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra,
hội chứng đốm trắng (Bacterial White Spot Syndrome – BWSS) do vi khuẩn thuộc
họ Bacillaceae, bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) do White spot
syndrome virus (WSSV) gây ra,…. Hiện nay kháng sinh được sử dụng phổ biến để
kiểm soát dịch bệnh. Tuy nhiên, từ việc phụ thuộc vào kháng sinh trước khi sử
dụng các biện pháp phòng trị bệnh khác đến việc sử dụng kháng sinh mất kiểm soát
đã dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh (ABR - antibiotic resistance). Cùng với đó,
chính sách kiểm duyệt vệ sinh an toàn thực phẩm đối với dư lượng chất kháng sinh
trong sản phẩm thủy sản của các thị trường nhập khẩu và tiêu thụ lớn như Mỹ, EU,
… ngày càng chặt chẽ và gắt gao đã đặt ra thách thức không nhỏ đối với ngành Nuôi
trồng thủy sản Việt Nam trong việc quản lý sử dụng và nghiên cứu đưa ra các biện
pháp thay thế kháng sinh trong phòng ngừa và điều trị các bệnh thủy sản. Một trong
những hướng đi mới và hiệu quả đã được nhiều quốc gia trên thế giới hướng tới là
sử dụng các chế phẩm probiotics. Tuy nhiên, sử dụng probiotics trong nuôi trồng
thủy sản hầu hết đều dựa vào kinh nghiệm thực hành [91]; hơn nữa, việc nuôi cấy,
phân lập và tìm hiểu các cơ chế tương tác giữa các vi sinh vật trong môi trường nuôi
tôm còn gặp nhiều khó khăn, từ đó dẫn đến việc các chế phẩm probiotics chưa thực
sự phát huy được tiềm năng hiệu quả của chúng.
Sự phát triển vượt bậc của Công nghệ gen trong những năm gần đây đã cho
ra đời nhiều công cụ kỹ thuật hữu ích. Trong đó, công nghệ metagenomics được
xem là


2

sự tổng hợp sức mạnh và các thành tựu mới nhất của các công nghệ genomics, sinh
tin học, sinh học hệ thống. Công nghệ này cho phép tiếp cận và phân tích toàn bộ hệ
gen của quần xã sinh vật trong sinh cảnh nhất định và tìm hiểu mối quan hệ tương
tác giữa các thành phần vi sinh vật trong quần xã đó. Từ đó cho phép phát hiện sớm
các chủng vi sinh vật gây bệnh cũng như tìm được các chủng vi sinh vật hoặc các
gen có ích trong phòng ngừa và điều trị các bệnh thủy sản.
Xuất phát từ thực tiễn này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu
đa dang hệ vi sinh trong ruột tôm thẻ chân trắng tai tỉnh Sóc Trăng bằng ky
thuật metagenomics”.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài nhằm:
- Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA metagenome phục vụ cho quá trình
giải trình tự gen hệ vi sinh vật đất và ruột tôm thẻ chân trắng.
- Đánh giá cấu trúc và đa dạng hệ vi sinh vật trong nước và ruột tôm thẻ chân
trắng thông qua phân tích cơ sở dữ liệu 16S rRNA metagenome.
- Xác định mối tương quan giữa hệ vi sinh vật trong nước nuôi tôm thẻ và hệ
vi sinh vật trong ruột tôm thẻ.


3

NỘI DUNG
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng
1.1.1. Hệ thống phân loại, đặc điểm hình thái cấu tạo của tôm thẻ chân trắng
Tôm thẻ chân trắng có tên khoa học là Litopenaeus vannamei (Boone, 1931),
tên tiếng anh là Pacific white shrimp, thuộc giống Litopenaeus, họ Penaeidae, bộ
Decapoda, lớp Malacostraca, ngành Arthropoda.
Tôm thẻ chân trắng có vỏ màu xanh lam, khi vỏ mỏng có màu trắng đục,
chân bò có màu trắng ngà (Hình 1.1.). Chùy là phần kéo dài tiếp với bụng. Dưới

chùy có
2 – 4 răng cưa, đôi khi có tới 5 - 6 răng cưa ở phía bụng, các răng cưa này kéo dài,
đôi khi tới đốt thứ hai. Vỏ đầu ngực của tôm thẻ chân trắng có những gai gân và gai
râu rất rõ, không có gai mắt và gai đuôi (gai telssm), không có rãnh sau mắt, đường
gờ sau chuỳ khá dài đôi khi từ mép sau vỏ đầu ngực. Gờ bên chuỳ ngắn, chỉ kéo dài
tới gai thượng vị. Phần bụng của tôm có 6 đốt bụng, ở đốt mang trứng, rãnh bụng rất
hẹp hoặc không có. Telsson (gai đuôi) không phân nhánh. Râu không có gai phụ và
chiều dài râu ngắn hơn nhiều so với vỏ giáp. Xúc biện của hàm dưới thứ nhất thon
dài và thường có 3 - 4 hàng, phần cuối của xúc biện có hình roi. Gai gốc (basial) và
gai ischial nằm ở đốt thứ nhất chân ngực [3].

Hình 1.1. Hình thái tôm thẻ chân trắng (Nguồn: wikipedia)


4

1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái và tập tính của tôm thẻ chân trắng; phân bố
tự nhiên của tôm thẻ chân trắng
Đặc điểm sinh trưởng
Vòng đời của tôm thẻ chân trắng được chia làm 6 thời kỳ:
Thời kỳ phôi: bắt đầu từ khi trứng được thụ tinh đến khi trứng nở, bao gồm
nhiều giai đoạn đến khi phát triển thành phôi Nauplius.
Thời kỳ ấu trùng: bao gồm nhiều giai đoạn để ấu trùng tôm lột xác và biến
thái hoàn toàn:
Giai đoạn Nauplius (N): gồm 6 giai đoạn phụ tương ứng với 6 lần lột xác của
ấu trùng Nauplius, diễn ra trong khoảng 36-51 giờ, trong đó các Nauplius bơi từng
đoạn ngắn rồi nghỉ, lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàng,
không cần cho ăn.
Giai đoạn Zoea (Z): gồm 3 giai đoạn phụ, diễn ra trong khoảng 105- 120 giờ,
trong đó các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ hai lần, mỗi lần khoảng 36 giờ.

Ở giai đoạn này, ấu trùng Zoea bơi lội liên tục có định hướng, thẳng về phía trước
và ăn thực vật nổi bằng hình thức lọc.
Giai đoạn Mysis (M): gồm 3 giai đoạn, diễn ra trong 72 giờ, trong đó các
Mysis có đặc tính treo mình trong nước, đầu chúc xuống dưới, và ăn các động vật
nổi hoặc tảo silic bằng hình thức bắt mồi chủ động.
Giai đoạn Post-larvae (PL) (giai đoạn hậu ấu trùng): tôm thẻ đã có hình dạng
loài nhưng chưa hoàn thiện sắc tố, các Post-larvae hoạt động nhanh nhẹn, bắt mồi
chủ động với thức ăn chủ yếu là động vật nổi. Ở cuối giai đoạn này, các Post-larvae
chuyển sang sống đáy.
Thời kỳ ấu niên: ở thời kỳ này, hệ thống mang của tôm đã hoàn chỉnh, tôm
chuyển sang sống đáy hoàn toàn, bắt đầu bò bằng chân và bơi bằng chân bơi. Thời
kỳ này tương ứng với cuối giai đoạn tôm bột và đầu tôm giống trong sản xuất [3].
Thời kỳ thiếu niên: tôm bắt đầu ổn định tỷ lệ thân. Giai đoạn này tương
đương
với giai đoạn ươm giống và nuôi thịt trong sản xuất.


5

Thời kỳ sắp trưởng thành: thời kỳ này tôm trưởng thành về mặt sinh dục và
thể hiện sự sinh trưởng không đồng đều một cách rõ rệt giữa hai giới tính, trong đó
con cái lớn nhanh hơn con đực.
Thời kỳ trưởng thành: tôm có khả năng tham gia sinh sản. Lúc này, tôm
trưởng thành sống ở vùng xa bờ nơi có độ trong cao và độ mặn ổn định [1].
Phân bố và tập tính
Trong tự nhiên, tôm thẻ chân trắng phân bố ở vùng ven bờ phía đông Thái
Bình Dương, từ biển Bắc peru đến nam Mexico và Equador. Ở vùng biển tự nhiên,
tôm chân trắng thích nghi sống nơi đáy là bùn, độ sâu khoảng 72 m, có thể sống ở
độ mặn trong phạm vi 5 - 50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển 28 - 34‰, pH = 7,7 8,3, nhiệt độ thích hợp 25 - 32oC, tuy nhiên chúng có thể sống được ở nhiệt độ 12 28oC.
Tôm chân trắng là loài ăn tạp giống như những loài tôm khác. Song không

đòi hỏi thức ăn có hàm lượng đạm cao như tôm sú.
Tôm chân trắng có tốc độ sinh trưởng nhanh, chúng lớn nhanh hơn tôm sú ở
tuổi thành niên. Trong điều kiện tự nhiên từ tôm bột đến tôm cỡ 40 g/con mất
khoảng thời gian 180 ngày hoặc từ 0,1 g có thể lớn tới 15 g trong giai đoạn 90 - 120
ngày.
Sinh sản
Tôm chân trắng thành thục sớm, con cái có khối lượng từ 30 - 45 g/con là có
thể tham gia sinh sản. Ở khu vực tự nhiên có tôm chân trắng phân bố thì quanh năm
đều bắt được tôm chân trắng. Song mùa sinh sản của tôm chân trắng ở vùng biển lại
có sự khác nhau ví dụ: ở ven biển phía Bắc Equađo tôm đẻ tử tháng 12 đến tháng 4.
Lượng trứng của mỗi vụ đẻ phụ thuộc vào cỡ tôm mẹ: Nếu tôm mẹ từ 30 - 45g thì
lượng trứng từ 100.000 - 250.000 trứng, đường kính trứng 0,22 mm.
Sau mỗi lần đẻ hết trứng, buồng trứng tôm lại phát triển tiếp. Thời gian giữa
2 lần đẻ cách nhau 2 - 3 ngày. Con đẻ nhiều nhất tới 10 lần/năm. Thường sau 3 - 4
lần đẻ liên tục thì có lần lột vỏ. Sau khi đẻ 14 - 16 giờ trứng nở ra ấu trùng Nauplius.
ấu trùng Nauplius trải qua 6 giai đoạn: Zoea qua 3 giai đoạn, Mysis qua 3 giai đoạn
thành Postlarvae. Chiều dài của Postlarvae tôm P.Vannamei khoảng 0,88 - 3mm.


6

Hình 1.2. Quy trình sản xuất tôm thẻ chân trắng (Nguồn: FAO)
1.2. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam
1.2.1. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam
Tôm thẻ chân trắng bắt đầu được đánh bắt tự nhiên từ năm 1981 với sản
lượng khiêm tốn. Đến năm 1995 chúng mới bắt đầu được nuôi trồng và cho đến nay,
đây là loài tôm được nuôi phổ biến nhất. Theo thống kê của FAO (2018) và GOAL
(2017), tổng sản lượng tôm thẻ chân trắng đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng liên tục
tăng qua các năm, và tăng mạnh từ những năm 2000 đến nay (Hình 1.3) [22]. Đặc
biệt, đối với sản lượng tôm thẻ chân trắng nuôi trồng, có thể dễ dàng thấy được sự

tăng trưởng mạnh và đều qua các năm, và được dự doán là tiếp tục tăng trong năm
2019 (Hình
1.3). Trong báo cáo của FAO năm 2018, tính đến năm 2015, sản lượng tôm thẻ chân


7

trắng tự nhiên và nuôi trồng chiếm 47% tổng sản lượng tôm trên thế giới (2015)
(Hình
1.4).

Hình 1.3. Sản lượng tôm trên thế giới giai đoạn 1995-2017, dự báo đến năm 2019

Hình 1.4. Tổng sản lượng tôm đánh bắt và nuôi trồng (Nguồn: FAO)
Các quốc gia dẫn đầu trong nuôi trồng và xuất khẩu tôm thẻ chân trắng có thể
kể đến là Trung Quốc, Ấn Độ, Ecuador, Việt Nam và Indonexia [22]. Theo thống kê
của FAO Fishery Stastistics, bắt đầu từ năm 2006, Việt Nam là một trong những
nước sản xuất tôm thẻ chân trắng chính trên toàn thế giới. Báo cáo của FAO (2018)
chỉ ra rằng trong suốt chín tháng (từ tháng 1 đến tháng 9) năm 2017, xuất khẩu tôm
thẻ chân


8

trắng của Việt Nam đạt 390 000 tấn, tăng 11% so với cùng kỳ năm 2016. Thị trường
chính của tôm Việt Nam xuất khẩu là Trung Quốc (chiểm 50-60% tổng lượng tôm
xuất khẩu), tiếp đến là Mỹ, EU28, Nhật Bản, và Hàn Quốc.
Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổng cục thủy sản, diện tích nuôi tôm nước
lợ trong năm 2017 cả nước đạt 721,1 nghìn ha; tăng 3,8% so với năm 2016 trong đó
diện tích tôm chân trắng là 98,7 nghìn ha; tăng 4,7% so với năm 2016; và sản lượng

tôm nước lợ năm 2017 đạt 683,4 nghìn tấn, tăng 4% so với năm 2016 trong đó sản
lượng tôm chân trắng 427 nghìn tấn, tăng 8,5% so với năm 2016 (Hình 1.5.). Và
theo thống kê sơ bộ mới nhất của Tổng cục thủy sản, trong chín tháng đầu năm
2018, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 701.302 ha (tăng 0,7% so với cùng kỳ năm
2017), sản lượng nuôi
kỳ

năm

đạt

509.400

tấn

(tăng

8,0%

so

với

cùng

2017).

Hình 1.5. Số liệu sản xuất ngành tôm năm 2017
(Nguồn: Tổng cục Thủy sản Việt Nam - 2017)
1.2.2. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi và các biện pháp phòng trừ bệnh trên thế

giới và Việt Nam


9

Theo đánh giá của GAA qua các năm, vấn đề bệnh và dịch bệnh trên tôm
luôn là vấn đề thách thức đối với sự phát triển bền vững của sản xuất tôm nuôi. Năm
1987 và 1988 sự bùng phát của bệnh gan tụy (MBV) tại Đài Loan gây thiệt hại
nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm sú [14]. Tại Trung Quốc, sự bùng phát của dịch
bệnh đốm trắng vào năm 1992 làm sụt giảm nghiêm trọng sản lượng tôm sú nuôi
trồng, và kéo dài đến năm 2000. Bệnh này cũng gây thiệt hại tới năng suất tôm nuôi
ở Thái Lan và Ấn Độ trong giai đoạn 1995-2003 [37]. Sự phục hồi sản lượng tôm
nuôi trồng được thu nhận từ năm 2003 với sự xuất hiện của tôm thẻ chân trắng. Tuy
nhiên, theo khảo sát của GOAL, sản lượng trong năm 2012 giảm xuống còn 3,4
triệu tấn (giảm 5% so với năm 2011) do tác động của hội chứng tôm chết sớm
(EMS) hay là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính ở Trung Quốc, Thái Lan, Việt
Nam và Malaysia. Gần đây nhất, trong Chuỗi Hội nghị Bàn tròn Nuôi trồng thủy
sản gần đây (TARS) ở Chang Mai, Thái Lan, bệnh SHIV - căn bệnh do virus gây ra,
lần đầu tiên được phát hiện và xác định trong mẫu tôm tôm thẻ chân trắng
Litopenaeus vannamei được thu thập từ một trang trại ở tỉnh Chiết Giang, Trung
Quốc, vào tháng 12 năm 2014, đã được báo cáo là “sát thủ” đối với tôm đã xuất hiện
và hoành hành ở Trung Quốc, và cũng xuất hiện ở một số quốc gia khác có sản
lượng tôm thẻ chân trắng nuôi trồng lớn như Ấn Độ, Việt Nam; và các thông tin liên
quan đến tác nhân gây bệnh – SHIV mới chỉ được nghiên cứu ở mức độ xác định
đặc điểm [56], [57], phát hiện và định lượng bằng rt- PCR hoặc bằng hệ thống SHIV
RT-PCR/POCKITTM system và giải trình tự toàn bộ hệ gen của loại virus này [55].
Tại Việt Nam, Theo báo cáo về tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi của Tổng
cục Thủy sản, trong 6 tháng đầu năm 2017 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt
hại là 11.430 ha, chiếm 1,89% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước. Trong đó, tổng
diện tích tôm nuôi bị bệnh là 4.165,78 ha, chiếm 36.4% (các bệnh trên tôm nuôi:

bệnh đốm trắng 14%, bệnh hoại tử gan tụy cấp 14%, bệnh đỏ thân, còi, phân trắng...
chiếm
8%) tổng diện tích bị thiệt hại; không xác định nguyên nhân 4.745 ha, chiếm 41,6%;
do biến đổi môi trường, thời tiết là 2.519 ha, chiếm 22,0 %.
Thống kê hàng năm của GAA đều chỉ ra rằng, bệnh trên tôm luôn là thách
thức lớn đối với ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản nói chung và ngành công
nghiệp


10

nuôi tôm nói riêng. Và các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh trên tôm để nhằm
giảm thiểu đến mức thấp nhất thiệt hại trên tôm nuôi trồng đã được đưa ra. Trong số
đó, kháng sinh được sử dụng như là một loại thuốc quan trọng trong điều trị các
bệnh nhiễm khuẩn, xử lý, cải tạo môi trường. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh
với mức độ cao trong nuôi tôm đã làm gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh của vi
khuẩn. Theo Phuong và cs (2006); Dang và cs (2007), kết quả điều tra thực địa đã
chỉ ra enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, oxolinic acid và flumequin,
sulfamethoxazole và oxytetracycline là các loại kháng sinh đang được sử dụng phổ
biến trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam [18], [54]. Cùng với đó, yêu cầu ngày
càng cao trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đối với các sản phẩm thủy sản về
dư lượng kháng sinh, hóa chất của các nước nhập khẩu đã đặt ra thách thức cho các
nước nuôi trồng thủy sản, trong đó có Việt Nam. Theo Nguyễn Quốc Ân (2009),
chloramphenicol hoặc các kháng sinh khác như oxytetracycline, sulfamethazone,
enrofloxacine, ciprofloxacin, flofenicol, trimethoprim… đã được phát hiện trong
một số lô hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam [2]. Vì vậy, trong những năm gần
đây, các biện pháp nuôi trồng sử dụng các chế phẩm sinh học đang được khuyển
cáo và khuyến khích sử dụng. Các nghiên cứu của Moriarty (1999), Farzanfar
(2006) đã đề xuất bổ sung các chủng khuẩn Bacillus spp., Lactobacillus spp. vào
các chế phẩm sinh học để kiểm soát và cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh [23], [50].

Nghiên cứu của Balcázar (2007) và Liu (2010) đã đề cập đến vai trò của chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis trong việc chống lại các chủng vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh
chết sớm (EMS) hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) trên tôm thẻ chân
trắng giống [6], [43].
1.3. Công nghệ metagenomics và hướng tiếp cận mới trong nuôi trồng và phòng
trừ bệnh hại trên tôm nuôi
1.3.1. Giới thiệu về công nghệ metagenomics
Công nghệ metagenomics được xem là sự tổng hợp sức mạnh và các thành
tựu mới nhất của các công nghệ genomics, tin sinh học, sinh học hệ thống. Công cụ
genomics cho phép nghiên cứu hệ gen trong từng cá thể đơn lẻ, tuy nhiên khi áp
dụng trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật sẽ gặp phải những hạn chế sau: (i) Hầu hết
các vi sinh vật là không nuôi cấy được. Vi sinh vật trên hành tinh ước tính có 1030
loại, trong


11

đó số lượng sinh vật có thể nuôi cấy được chỉ chiếm 0,1-1% tùy theo từng môi
trường sinh thái); (ii) tính đa dạng của sinh vật trong hệ sinh thái và khả năng biến
dị di truyền xảy ra không ngừng để thích nghi nhanh chóng với những thay đổi của
môi trường sinh thái để đảm bảo cân bằng sinh thái bền vững.
Trong khi đó, công nghệ metagenomics là một bước tiến xa hơn trong nghiên
cứu hệ gen, cho phép phân tích hệ gen của cả quần xã sinh vật trong một khu hệ sinh
thái để con người có thể hiểu được bức tranh tổng thể về: (i) Mức độ phức tạp của
các sinh vật trong một khu hệ sinh thái nhất định như quần xã sinh vật có mặt trong
đường hô hấp, trong hệ tiêu hóa, tiết niệu của các nhóm người mắc các nhóm bệnh
khác nhau; sinh vật trong nước biển, trong các môi trường khắc nghiệt, cực đoan,…;
(ii) mối tương tác giữa các sinh vật trong một môi trường để đảm bảo tính bền vững
của hệ sinh thái, mối tương tác giữa các sinh vật để con người chống lại bệnh tật, tái
tạo lại môi trường xanh, sạch; (iii) và từ những hiểu biết tổng thể về đặc điểm di

truyền của quần xã sinh vật, cùng với metabolomics, metaproteomics và công cụ tin
sinh học, con người có thể học tập được các qui trình trao đổi chất, qui trình chuyển
hóa đảm bảo cân bằng sinh thái, môi trường và khai thác được nhiều nguồn gen mã
hóa cho các tính trạng quí, hiếm, phục vụ đắc lực cho đảm bảo sức khỏe cộng đồng,
nâng cao chất lượng cuộc sống, đảm bảo an ninh quốc gia, năng lượng và giữ được
trái đất xanh sạch chống lại biến đổi khí hậu toàn cầu đang đe dọa đến toàn nhân
loại.
Về cơ bản, công nghệ Metagenomics bao gồm hai hướng chính: (i) Sàng lọc
thư viện metagenome dựa vào hoạt tính sinh học; (ii) Sàng lọc thư viện metagenome
dựa vào xác định trình tự nucleotid.
Cả hai hướng nghiên cứu này đều phải tiến hành tách chiết các phân tử di
truyền từ mẫu môi trường. Tùy theo mục đích mà Metagenomic ADN hay
Metagenomic ARN được tách chiết. Để khảo sát quần thể virus xâm nhiễm ở đường
mũi họng hoặc trong hệ tiêu hóa, Metagenomic ARN sẽ được tách chiết còn để khảo
sát vi sinh vật và đa dạng vi sinh vật thì Metagenomic ADN sẽ được tách chiết.
Metagenomic ADN sẽ được giải trình tự trực tiếp để có được bức tranh tổng thể về
quần xã sinh vật, toàn bộ các gen có trong đó và đây là bước định hướng cho các
nhà nghiên cứu đi khai thác các nguồn gen khác nhau hoặc khai thác con đường
chuyển


12

hóa sinh học. Ngoài ra, từ nguồn metagenome đã tách được, các nhà khoa học có thể
tạo thư viện metagenome và thư viện này được chuyển vào các vật chủ tương thích
để sàng lọc các dòng có được hoạt tính sinh học mong muốn như sàng lọc các
enzyme mới, các chất kháng sinh mới, con đường chuyển hóa các chất độc hại hoặc
nhận biết các chất có khả năng dùng làm thuốc. Toàn bộ kỹ thuật có liên quan đến
công nghệ metagenomics được mô tả ở Hình 1.6.

Hình 1.6. Xây dựng và sàng lọc thư viện metagenomics.
Mặc dù các công cụ giải trình tự metagnome mới phát triển mạnh mẽ trong
vài năm gần đây nhưng các nhà khoa học đã nhen nhóm, ấp ủ các nghiên cứu về
metagenomics trong vòng 20 năm qua. Theo thống kê của GOLD, các nhà khoa học
đã nhận biết được có tới 7338 glycosyl hydrolase giả định. Gene mã hóa cho
enzyme này chiếm tới 1,5 % trong tổng số gene tương đồng thu được từ các
dự án metagenomics ở đối tượng VSV của mối, người và đường ruột của chuột.
Trong đó


13

13 họ glycosyl hydrolase tương đồng là gene chiếm ưu thế trong các hệ
metagenome. Các chất xúc tác sinh học mới được phát hiện với số lượng lớn nhờ
các công cụ giải trình tự metatranscriptomics [79]. Và theo GOLD, tính đến tháng
10/2018, trên thế giới có 33.475 dự án phân tích metagenome đã và đang được thực
hiện.
Hiện tại, công nghệ Metagenomics đã và đang được sử dụng như một công
cụ hữu hiệu vào các lĩnh vực chủ yếu sau: (1) tái tạo môi trường; (2) sàng lọc các
sản phẩm cho công nghiệp; (3) sàng lọc các phân tử dùng làm thuốc; (4) ứng dụng
trong lĩnh vực y tế; (5) tìm ra mối tương tác giữa vi sinh vật và cây trồng, bảo vệ
thực vật như tìm ra mối tương tác giữa các sinh vật, quần xã sinh vật để đảm bảo cơ
thể khỏe mạnh, chống lại vi khuẩn, virus gây bệnh; (6) phát triển hệ sinh thái bền
vững, chống lại biến đổi khí hậu toàn cầu.
1.3.2. Các nghiên cứu và thành tựu của công nghệ metagenomics trong lĩnh vực
thủy sản
Chúng ta phải chấp nhận một thực tế là 99% vi sinh vật trong hệ sinh thái vi
sinh vẫn chưa được nuôi cấy và đây là một hạn chế chủ yếu trong việc tìm kiếm các
gene, enzyme và các chất có hoạt tính sinh học mới cũng như nghiên cứu sinh lý,
khả năng trao đổi chất và vai trò của chúng trong môi trường [7], [59], [62]. Cuối

những năm 1980, các phân tích trực tiếp từ trình tự rARN đã chỉ ra phần lớn vi sinh
vật có mặt trong môi trường chưa được phân lập bằng phương pháp nuôi cấy [30].
Phát hiện này cùng với những tiến bộ trong phương pháp tách chiết, tinh sạch ADN
từ môi trường và công nghệ xác định trình tự ADN đã đẩy nhanh tốc độ phát triển
của các nghiên cứu di truyền quần thể vi sinh vật hỗn hợp [29], [44]. 16S ribosomal
DNA/RNA (rADN/rARN) đã được sử dụng rộng rãi trong việc phân loại vi sinh vật
chưa được phân lập (nuôi cấy) trong môi trường [76]. Những nghiên cứu dựa trên
chỉ số này thực sự đã định nghĩa lại và mở rộng tầm hiểu biết của chúng ta về đa
dạng sinh học, sinh thái vi sinh và tiến hóa [45]. Một tính toán đơn giản về đa dạng
sinh học của vi sinh vật đất giao động từ 3.000 đến 11.000 genome trên một gam
đất, nhưng chỉ với 1% trong số đó đã được nuôi cấy [17], [69], [70]. Phân tích vi
sinh vật đất được nuôi cấy đã phát hiện ra một nguồn dồi dào các hợp chất có ý
nghĩa trong y tế như chất kháng sinh, nhân tố kháng ung thư, chất ức chế miễn
dịch [53] và rất


14

nhiều các sản phẩm có ý nghĩa công nghệ sinh học khác [34], [58], [65], [71]. Tuy
nhiên, phương pháp tiếp cận phụ thuộc vào vi sinh vật nuôi cấy bị giới hạn vì đa số
vi sinh vật đất không thể nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy thông thường trong
phòng thí nghiệm. Một khối lượng khổng lồ thông tin di truyền vẫn còn nằm trong
vi sinh vật chưa được nuôi cấy và metagenomics là công nghệ chìa khóa để xâm
nhập vào nguồn tài nguyên quý giá và giàu tiềm năng này [30], [52]. Phương pháp
tiếp cận này cho phép nghiên cứu sự đa dạng di truyền phổ rộng của mỗi gene đơn
và các sản phẩm của nó cũng như là phân tích toàn bộ operon mã hóa cho các con
đường sinh tổng hợp hoặc phân giải. Metagenomics cho phép chúng ta trả lời các
câu hỏi chìa khóa về hệ sinh thái vi sinh nhờ việc kết nối chức năng tiềm tàng tới
các vi sinh vật đặc biệt trong các quần thể vi sinh vật đất đa loài.
Trong số các phương pháp được thiết kế để thâm nhập ở mức độ di truyền

của vi sinh vật chưa được nuôi cấy, thì metagenomics nổi lên như một công cụ hữu
hiệu nhất. Thuận lợi của phương pháp này là phân tích dựa trên trình tự và chức
năng trong các mẫu nghiên cứu từ nước, đất và vật chủ eukaryotes. Ý tưởng cloning
trực tiếp ADN từ mẫu môi trường lần đầu tiên được đề xuất bởi Schmidt (1991) và
tiếp theo là việc xây dựng các thư viện metagenomics ADN từ hỗn hợp vi sinh vật
được làm giàu từ cỏ khô trong phòng thí nghiệm. Sau đó là các thư viện
prokaryotes từ nước biển [63]. Một clone có kích thước 40 kb được xác định từ thư
viện này có chứa gene
16S rARN có nguồn gốc từ vi khuẩn cổ chưa được nuôi cấy trước đây [30]. Các kết
quả nghiên cứu metagenomics hệ vi sinh vật từ bọt biển đã chỉ ra rằng chúng mang
các gene và nhóm gene đặc biệt cho việc tổng hợp các chất tự nhiên có hoạt tính
sinh học [38]. Một số lipase mới cũng được phát hiện và phân tích từ việc sàng lọc
thư viện metagenomics [31], [44]. Năm 2007, Martin-Cuadrado và cộng sự đã xây
dựng thư viện metagenomic của fosmid từ các sinh vật phù du sâu 3000 m ở biển
Mediterranean. Kết quả phân tích 16S rARN cho thấy cấu trúc quần thể này tương
đồng với quần thể được tìm thấy trong đới thiếu ánh sáng của Thái Bình Dương.
Gene liên quan đến trao đổi chất, vận chuyển, phân giải các hợp chất hữu cơ phức
tạp cũng có sự tương đồng với hệ sinh vật dị dưỡng ở các vùng biển sâu. Gilbert và
cộng sự (2010) đã phân tích dữ liệu metagenomics và metatranscriptomics ở nước
bề mặt ở