Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi sinh vật gây bội nhiễm mụn trứng cá do sử dụng sản phẩm chứa corticoid tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mãngành: 9420107

DƯƠNG THỊ BÍCH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT
GÂY BỘI NHIỄM MỤN TRỨNG CÁ DO SỬ
DỤNG SẢN PHẨM CHỨA CORTICOID

Cần Thơ, 2018


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Văn Bá
Người hướng dẫn phụ: PGS.TS. Huỳnh Văn Bá

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến
sĩ cấp trường
Họp tại: Phòng Bảo Vệ Luận Án Tiến Sĩ, Lầu 2 – Nhà Điều
Hành, Trường Đại Học Cần Thơ.
Vào lúc 14 giờ 00 ngày 12 tháng 7 năm 2018

Phản biện 1: TS. Mai Nguyệt Thu Hồng
Phản biện 2: PGS.TS. Dương Xuân Chữ

Cóthể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.
Thư viện Quốc gia Việt Nam.


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TRÊN TẠP CHÍ
1. Dương Thị Bích, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2014.
Khảo sát tần suất xuất hiện của vi khuẩn Propionibacterium
acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
ở bệnh nhân trứng cácó bôi corticoid. Tạp chí Y dược lâm
sàng 108, 9 (5): 65-70.
2. Dương Thị Bích, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2015.
Phân lập vàtuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế
Propionibacterium
acnes,
Staphylococcus
aureus,
Staphylococcus epidermidis ở bệnh nhân trứng cá có bôi
corticoid. Y học Việt Nam, 427 (1): 41-45.
3. Dương Thị Bích, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2016.
Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh trứng cácủa vi khuẩn
lactic phân lập từ da. Y học Việt Nam, 448 (1): 23-27.
4. Nguyen Kim Đong, Duong Thi Bich, Nguyen Chi Toan,
2017. The Estimation method of S-acid lactic the
fermentation products Aloe vera gel by High-Performance
Liquid Chromatography. Jounal of Natrura Science, 126
(1B/2017).

Chương 1. GIỚI THIỆU
Tí
nh cấp thiết của đề tài
Mụn trứng cá(MTC) làbệnh viêm nang lông tuyến
bãphổ biến ở da, đặc trưng bởi các vùng da tăng tiết bã
nhờn như mặt, lưng và ngực. Theo nhiều nghiên cứu thì
nguyên nhân gây mụn liên quan đến bốn yếu tố chí
nh gồm:
sự tăng sản xuất chất nhờn, sự tắc nghẽn lỗ chân lông, sự
phát triển quámức của vi khuẩn Propionibacterium acnes
(P. acnes) vàsự hiện diện các yếu tố viêm. Bên cạnh đó,
vấn đề sử dụng mỹ phẩm không phù hợp, đặc biệt làmỹ
phẩm chứa corticoid đã để lại nhiều ảnh hưởng như làm
trầm trọng MTC, teo da, suy giảm collagen vàgia tăng sự
bội nhiễm của vi sinh vật. Hiện nay, vấn đề điều trị MTC
được áp dụng nhiều phương pháp như sử dụng kháng sinh,
nội tiết vàretinoid hay liệu pháp ánh sáng xanh. Tuy nhiên,
các biện pháp trên còn những hạn chế như gia tăng sự
kháng thuốc ở vi sinh vật gây bội nhiễm MTC hoặc để lại
nhiều tác dụng phụ cho người sử dụng. Từ đó, yêu cầu về
biện pháp mới có thể ức chế sự bùng phát của vi sinh vật
gây bội nhiễm là rất cần thiết trong quản lý và điều trị
MTC.
Mục tiêu của đề tài
Tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic (LAB) cókhả năng
ức chế vi sinh vật gây bội nhiễm phổ biến ở MTC có sử
dụng sản phẩm bôi chứa corticoid, định hướng đưa ra
phương pháp chăm sóc da MTC theo hướng cạnh tranh
sinh học.

Nội dung nghiên cứu
(1) Khảo sát tần suất xuất hiện của vi sinh vật bội
nhiễm phổ biến (P. acnes, Staphyloccocus aureus
(S.aureus), Staphyloccus epidermidis (S. epidermidis),
1


Demodex) trên da MTC có sử dụng sản phẩm bôi chứa
corticoid (gọi tắt là corticoid bôi); (2) Khảo sát sự đề
kháng kháng sinh của nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến
ở MTC dùng sản phẩm bôi chứa corticoid vàtuyển chọn
vi khuẩn chỉ thị (VKCT); (3) Phân lập và tuyển chọn
những dòng LAB cókhả năng ức chế VKCT; (4) Khảo sát
một số hoạt tính sinh học có khả năng ứng dụng trong
chăm sóc da của dòng LAB đã chọn; (5) Lên men gel Nha
đam làm chế phẩm chăm sóc da.
Những đóng góp mới của đề tài
- Xác định nhóm vi khuẩn gây bội nhiễm phổ biến ở
MTC sử dụng corticoid bôi và đánh giáthực trạng kháng
thuốc kháng sinh.
- Tìm được dòng LAB có khả năng ức chế nhóm vi
khuẩn bội nhiễm phổ biến ở MTC dùng corticoid bôi,
đồng thời có khả năng chăm sóc da bằng cách sản sinh
hợp chất chống oxy hóa vàgiữ ẩm.
- Bước đầu xây dựng được công thức lên men chế
phẩm LAB chăm sóc da MTC từ gel Nha đam.
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về mụn trứng cá
MTC làbệnh viêm da mãn tính, phổ biến ở lứa tuổi
thanh thiếu niên với các biểu hiện lâm sàng: mụn đầu

trắng, đầu đen, mụn mủ, nốt, nang (Bộ Y tế, 2015). Sinh
bệnh học của MTC thường liên quan đến các yếu tố nội
sinh, ngoại sinh nhưng rõ nhất là liên quan đến bốn yếu tố:
Tăng sản xuất chất nhờn, tắc nghẽn lỗ chân lông, phát
triển quá mức của P. acnes và phản ứng viêm (Tahir,
2010).

2


2.2. Vi sinh vật gây bội nhiễm MTC
Theo nhiều nghiên cứu về nhóm vi sinh vật gây bội
nhiễm ở MTC cho thấy, tỷ lệ P. acnes ở MTC chiếm 32%,
S. aureus là45%, S. epidermidis là49% vàtỷ lệ nhiễm ký
sinh trùng Demodex đối với những trường hợp MTC lạm
dụng corticoid bôi tăng lên 75,5% (Dolenc-Voljc et al.,
2005; Dhillon and Varshney, 2013).
Vi khuẩn P. acnes là một trong những vi khuẩn
thuộc hệ vi sinh vật tự nhiên của da, chiếm khoảng 105106 tế bào/cm2 ở những vùng có nhiều bãnhờn như mặt,
lưng, ngực vàkhoảng 102 tế bào/cm2 ở các vùng khác trên
cơ thể. P. acnes cókhả năng sản xuất các enzym liên quan
đến sự pháhủy tế bào ký chủ như: hyaluronan, sialidase,
neuraminidase, lipase vàcókhả năng thu hút đại thực bào
và tế bào đuôi gai kích thích mạnh mẽ phản ứng viêm
(Bru¨ggemann, 2010).
Vi khuẩn S. aureus là nhóm vi khuẩn da và niêm
mạc, phát triển nhiều ở tay, ngực, bụng và mũi. Khoảng
10-35% người khỏe mạnh mang S. aureus thường xuyên,
20-75% nhiễm không liên tục. S. aureus gây bệnh bằng
sản xuất enzym staphylokinase vàprotein A làm vô hiệu

hóa vị tríhoạt động C3b, C1q của IgG vàcókhả năng bất
hoạt một số bổ thể và tránh sự truy bắt của bạch cầu. S.
aureus gây bệnh với các biểu hiện lâm sàng dạng mụn mủ,
áp se, bong vảy da.
S. epidermidis làthành viên của hệ vi sinh vật da có
khả năng ức chế phản ứng viêm thông qua hoạt động của
acid lipoteichoic (LTA). Trên MTC, S. epidermidis được
xem lànhân tố nhiễm trùng cơ hội, hiện diện với tỷ lệ từ
6,8-49% đứng sau P. acnes là 52,7-91,6% (Dhillon and
Varshney, 2013). Cơ chế gây bệnh của S. epidermidis nhờ
khả năng tạo exopolysaccharid hình thành màng sinh học
ức chế sự tấn công của đại thực bào vàcác yếu tố chống
3


nhiễm khuẩn của ký chủ, giảm tốc độ tăng trưởng và đột
biến gen kháng lại thuốc kháng sinh, sản xuất chất ngoại
bào acid poly-γ-glutamic, PNAG/PIA vàPSMs bảo vệ tế
bào vi khuẩn khỏi cơ chế miễn dịch bẩm sinh của kýchủ.
Ký sinh trùng Demodex là một loại ve ký sinh có
kích thước nhỏ nhất trong nhóm động vật chân đốt, ký
sinh chủ yếu ở nang lông ở các vị trígần mũi, lông mày,
đầu, mímắt là những nơi tập trung nhiều tuyến nhờn và
gây bệnh khi hiện diện với mật số cao. Cơ chế gây bệnh
của Demodex là làm tổn thương nang lông, tắc nghẽn lỗ
chân lông gây viêm và tạo cơ hội cho yếu tố gây bệnh
khác xâm nhập như P. acnes và S. aureus (Tchernev,
2011). Một số biểu hiện lâm sàng do Demodex như khô
nang lông, ngứa, đỏ, da sần sùi, mụn mủ.
2.3. Ảnh hưởng corticoid đối với MTC

Corticoid cótên đầy đủ corticosteroid làhợp chất có
hoạt tí
nh sinh học giống như hormon steroid tiết ra từ vỏ
thượng thận có tác dụng chống viêm, chống dị ứng. Tuy
nhiên, việc lạm dụng corticoid đặc biệt làdạng bôi ngoài da
cũng mang lại nhiều tác dụng phụ như: teo da, mỏng da,
ửng đỏ hoặc rạn da, giãn mạch, suy yếu collagen, teo da,
mất sắc tố, làm trầm trọng MTC, da dễ tổn thương và tạo
cơ hội cho nhiều vi sinh vật bội nhiễm như S. aureus, P.
acnes vàkýsinh trùng Demodex (Klein et al., 2001).
2.4. Sơ lược về vi khuẩn lactic vànhững ứng dụng
trong chăm sóc da
Thuật ngữ vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria –
LAB) dùng để chỉ nhóm vi khuẩn có khả năng lên men
chất bột đường tạo thành acid lactic. LAB có các đặc điểm
chung như: Gram dương; không sinh bào tử; kỵ khítùy
tiện hay vi hiếu khí; tế bào cóhình que hoặc cầu; âm tí
nh
với catalase, oxidase vàgelatinase.
LAB thường kết hợp với môi trường sống giàu chất
dinh dưỡng, chẳng hạn như phát triển trên nhiều loại thực
4


phẩm (sữa, thịt, rau), và một số là thành viên của hệ vi
sinh vật trong miệng, ruột và âm đạo của động vật có vú.
Trong quátrình trao đổi chất, LAB cókhả năng ức chế vi
sinh vật khác bằng con đường cạnh tranh dinh dưỡng và
sản sinh các sản phẩm như: acid lactic; acid acetic;
peroxid hydrogen; carbon dioxid; bacteriocin; diacetyl;...

LAB được xem là vi khuẩn có lợi và đã được ứng
dụng phổ biến trong các lĩnh vực như chăn nuôi, thủy sản,
chế biến thực phẩm qua nhiều thời kỳ của lịch sử. Thời
gian gần đây, LAB được ứng dụng rộng rãi trong y học
như: phòng chống tiêu chảy, cải thiện sự dung nạp lactose,
kí
ch thí
ch miễn dịch, phòng chống dị ứng, giảm tỷ lệ mắc
ung thư ruột kết, cải thiện những bệnh có liên quan đến
tim mạch,….
Ngoài các ứng dụng trên, LAB có thể ứng dụng để
chăm sóc và bảo vệ da thông qua các đặc tí
nh kí
ch thí
ch
miễn dịch, ức chế vi khuẩn gây bội nhiễm trên da, giảm
hì
nh thành melanin, chống lão hóa da, tăng tính đàn hồi và
giữ ẩm cho da (Chen et al., 2006; Tsai et al., 2013).
2.5. Sơ lược về Nha đam và những ứng dụng
trong mỹ phẩm
Nha đam là cây lâu năm phát triển khắp các vùng
ôn đới vànhiệt đới. Gel từ thịt láNha đam cóchứa 99% là
nước và các hợp chất hữu cơ khác gồm: phenolic như:
emodin aloe, aloin, aloesin; các acid hữu cơ như: saponin
và terpenoid; các polysaccharid như: arabinan, acid
glucuronic, galactan,....và nhiều khoáng, acid amin,
vitamin. Với những thành phần này, gel Nha đam được
dùng giữ ẩm, làm chậm quátrình lão hóa da, làm mát và
kháng khuẩn, chống nấm nên có thể điều trị các bệnh

nhiễm trùng da ở thể nhẹ như: mụn nhọt, u nang da lành
tí
nh, giảm viêm (Nandal and Bhardway, 2012; Sanghi,
2015) Vìthế, Nha đam được ứng dụng phổ biến trong
ngành công nghiệp mỹ phẩm.
5


Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Khảo sát tần suất xuất hiện của P. acnes, S.
aureus, S. epidermidis, Demodex trên da MTC có sử
dụng sản phẩm bôi chứa corticoid
Mục đích là xác định tác nhân bội nhiễm phổ biến ở
MTC có sử dụng corticoid phục vụ nội dung nghiên cứu
tiếp theo.
Thời gian khảo sát từ tháng 3/2013 đến 10/2014.
Thông qua phỏng vấn thu thập thông tin các bệnh nhân
mụn trứng cá vàlấy mẫu bệnh phẩm xét nghiệm vi sinh
vật (phân lập vi khuẩn và soi tươi Demodex).
Kiểm tra corticoid trong sản phẩm bôi da bằng
phương pháp sắc ký bản mỏng với chất chuẩn
dexamethason acetat và phương pháp hóa học.
3.2. Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của nhóm
vi khuẩn gây bội nhiễm phổ biến ở MTC dùng sản
phẩm bôi chứa corticoid và tuyển chọn vi khuẩn làm
chỉ thị
Thực hiện kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuếch tán
trên đĩa thạch Kirby-Bauer với các loại kháng sinh gồm:
trimethoprim/sulfamethoxazol, climdamycin, doxycyclin,
erythromycin, oxacillin vàtetracyclin vàchọn đại diện các

dòng vi khuẩn đại diện để làm VKCT.
3.3. Phân lập và tuyển chọn những dòng LAB có
khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị
a) Phân lập LAB
Các mẫu nước vo gạo, nước bột, nước tàu hũ thu về
để lên men 1-2 ngày và mẫu vi sinh vật từ da, phân lập
trên môi trường MRS bổ sung 1% CaCO3. Các dòng phân
lập được kiểm tra hình thái và sinh hóa bằng các thử
nghiệm nhuộm Gram, thử nghiệm catalase, oxydase,
gelatinase chuẩn bị thínghiệm sau.

6


b) Khảo sát khả năng ức chế VKCT
1) Phương pháp khuếch tán giếng thạch cócải tiến
Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (well
diffusion agar) có cải tiến là thay dịch ly tâm loại bỏ vi
khuẩn bằng huyền phù vi khuẩn. Khả năng ức chế VKCT
được xác định bằng cách đo khoảng cách vùng vô khuẩn,
không tính đường kính của giếng.
2) Phương pháp chủng LAB đã chọn vào dịch nuôi
cóVKCT.
Chủng 1 mL dòng LAB với mật số 2-2,5x105
CFU/mL vào 20 mL môi trường TSB bổ sung dịch trí
ch
5
tim cóVKCT với mật số tế bào là2-2,5x10 CFU/mL. Kết
quả xác định bằng đếm mật số vi khuẩn ở các thời điểm 2,
6, 12, 24, 30 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo

công thức.

Trong đó:
N = Số lượng vi khuẩn cótrong 1 mL dịch nuôi
C = Tổng số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa
ni = Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ i
di = Hệ số pha loãng thứ i
3.4. Khảo sát một số đặc tính sinh học ứng dụng
trong chăm sóc da của dòng LAB đã chọn
a. Kiểm tra khả năng sinh bacteriocin
Sử dụng phương pháp nhỏ giọt với VKCT: Bacillus
coagulans JCM 2257T; Micrococcus leteus NBRC 12708;
S. aureus ATCC 12600T; Pediococus pentosacus JCM
5885.

7


b. Khảo sát khả năng sinh hoạt chất chống oxy
hóa
Dịch nuôi LAB trong môi trường MRS 24 giờ ly tâm
loại bỏ tế bào (DN-Lp), pha loãng các nồng độ 30%, 50%,
70% và100% vàthử hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) với
DPPH (2,2–Diphenyl–1–picrylhydrazyl), vitamin C làm
đối chứng. Hỗn hợp sau phản ứng được đo độ hấp thu
bằng máy quang phổ Genesys 10S UV- Vis ở bước sóng
517 nm. HTCO (%) (trung bình của 3 lần đo) được tí
nh
theo công thức:
HTCO (%) 

( ODc  ODt )

 100

ODc

Trong đó:
ODc: Mật độ quang của DPPH vàethanol.
ODt: Mật độ quang của DPPH vàLAB.
c. Khảo sát khả năng giữ ẩm
Dịch nuôi LAB sau khi lọc loại tế bào được pha
loãng các nồng độ 10%, 50% và100%, bổ sung 1 mL vào
các týp nhựa 2 mL ủ ở nhiệt độ 50 oC, ẩm độ 60%, thời
gian theo dõi là96 giờ. Mỗi nồng độ thử nghiệm lập lại 3
lần, đối chứng làglyceril 5%, 10% và nước làmẫu trắng.
Kết quả được tính theo công thức sau:

Trong đó:
Rr (%): % giữ ẩm
W0LAB: trọng lượng dịch LAB ở 0 giờ
WtLAB: trọng lượng dịch LAB ở 96 giờ
W0C: trọng lượng mẫu nước trước ở 0 giờ
WtC: trọng lượng mẫu nước ở 96 giờ
d. Khảo sát khả năng sản sinh acid lactic
Dịch nuôi LAB trong môi trường MRS được ly tâm
loại tế bào, đo lượng acid lactic sinh ra bằng sắc ký lỏng
8

hiệu năng cao (HPLC) (trên máy US HPLC-1210 và cột
RSpak SH-1011) ở nhiệt độ 75 oC, HClO4 3 mM làm pha
động, tốc độ dòng chảy 0,6 mL/phút vàthể tích mẫu tiêm
vào là 2 mL. Lượng acid lactic được xác định bằng bộ
cảm ứng BF-5 biosensor (Japan).
e. Khảo sát khả năng đề kháng với kháng sinh
dùng trong điều trị mụn
Thực hiện kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuếch tán
trên đĩa thạch Kirby-Bauer với các loại kháng sinh gồm:
trimethoprim/sulfamethoxazol, erythromycin, tetracyclin,
clindamycin, doxycyclin.
3.5. Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm
sóc da
3.5.1. Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi sinh
khối LAB
Mục đích của thínghiệm là tìm môi trường cải tiến
giá thành rẻ để nuôi sinh khối LAB cung cấp cho thí
nghiệm lên men Nha đam làm chế phẩm, gồm các thí
nghiệm.
a. Khảo sát thời gian tăng trưởng: Vi khuẩn được
nuôi trong môi trường MRS lỏng, đếm mật số vi khuẩn
sau 2, 6, 12, 24, 30 giờ.
b. Khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon:
LAB được cấy trên môi trường TSA có bổ sung 20% các
loại đường: glucose, lactose, saccarose, tinh bột. Quan sát
sự phát triển của vi khuẩn sau 24 giờ.
c. Khảo sát thành phần môi trường và điều kiện
nuôi sinh khối
1) Khảo sát khả năng sử dụng đường
Thínghiệm được thiết kế theo Bảng 3-1

9


Bảng 3.1: Thành phần môi trường (MT) nuôi LAB
Thành phần
Nước tàu hũ (%)
Glucose (%)
Sacarose (%)
Lactose (%)
KH2PO4 (%)
(NH4)SO4 (%)

MT 1
100
20
0
0
2
2

MT 2
100
0
20
0
2
2

MT 3

100
0
0
20
2
2

Thínghiệm bố trígồm 3 nghiệm thức, 1 nhân tố và3
lần lặp lại, đối chứng là môi trường nuôi MRS. Chỉ tiêu
khảo sát làsinh khối vi khuẩn sau 24 giờ.
2) Khảo sát tỷ lệ các thành phần của môi trường
Thiết kế thínghiệm theo Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tỷ lệ thành phần môi trường nuôi LAB
Thành phần
Nước tàu hũ (%)
Carbohydrat (%)
KH2PO4 (%)
(NH4)SO4 (%)

Mức 1

Mức 2

Mức 3

100
15
1,5
1,5

100
20
2
2

100
25
2,5
2,5

Biến
thiên
0
5
0,5
0,5

Thínghiệm bố trígồm 3 nhân tố, 3 mức độ và2 lần
lặp lại. Chỉ tiêu khảo sát làsinh khối vi khuẩn sau 24 giờ.
3) Thínghiệm khảo sát điều kiện nuôi
Thiết kế thínghiệm gồm 2 nhân tố: nhiệt độ vàpH,
khảo sát ở 3 mức độ với 3 lần lặp lại (Bảng 3.3). Chỉ tiêu
khảo sát: sinh khối vi khuẩn sau 24 giờ.
Bảng 3.3: Điều kiện nuôi LAB
Nhiệt độ (oC)
30
37
45

pH

6,5
3
3
3

5,5
3
3
3

10

7
3
3
3


3.5.2. Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm
sóc da
a. Khảo sát tỷ lệ các thành phần nguyên liệu
Thành phần lên men gồm: gel Nha đam của FOB,
sữa đặc có đường của vinamilk vàLAB. Thínghiệm khảo
sát gồm 3 nhân tố, 3 mức độ, 2 lần lặp lại, bố tríở nhiệt
phòng (25-30 oC) (Bảng 3.4). Chỉ tiêu theo dõi: pH, mật
số LAB, độ nhiễm khuẩn và cảm quan (mùi, màu sắc,
trạng thái sản phẩm).
Bảng 3.4: Tỷ lệ các thành phần trong chế phẩm
Thành phần
Nước bổ sung (%)

Gel Nha đam (%)
Sữa đặc (%)
Vi khuẩn LAB (%
pH

Mức 1
25
50
1
1
6±0,5

Mức 2
50
30
2
2
6±0,5

Mức 3
75
20
3
3
6±0,5

b. Khảo sát thời gian vànhiệt độ tồn trữ
Khảo sát điều kiện tồn trữ gồm nhiệt độ vàthời gian.
Nhiệt độ được khảo sát ở 3 mức độ là15 oC, 25 oC và30
o

C, 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi: pH, mật số LAB, độ
nhiễm khuẩn, cảm quan.
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát tần suất xuất hiện của P. acnes, S. aureus,
S. epidermidis, Demodex trên da MTC dùng corticoid
bôi
Qua thời gian khảo sát từ tháng 3/2013 đến tháng
10/2014 tại Bệnh viện Da Liễu Cần Thơ, với tổng số bệnh
nhân tì
nh nguyện tham gia là148 người. Kết quả cho thấy
bệnh phổ biến ở lứa tuổi từ 19-25 chiếm 45,9%. MTC
dùng corticoid bôi chiếm tỷ lệ cao hơn các sản phẩm khác
(corticoid bôi là 53,4%, sản phẩm khác là 39,9%) và sử
dụng với mục đích trị mụn, làm trắng da có hiệu quả
nhanh.
Tỷ lệ nhiễm P. acnes trên MTC dùng corticoid bôi là
56,8%, S. epidermidis là89,9%, S. aureus là60,8% vàtỷ
11


lệ Demodex thấp chỉ chiếm 8,9%. Nhóm vi khuẩn bội
nhiễm phổ biến ở MTC dùng corticoid bôi gồm vi khuẩn S.
epidermidis, P. acnes và S. aureus chiếm tỷ lệ cao nhất
45,6% (P<0,001) (Hình 4.1).

Hình 4.1: Tỷ lệ đồng nhiễm các nhóm vi khuẩn MTC
(SE: S. epidermidis; SA: S. aureus; PA: P. acnes; DE: Demodex)

Từ kế quả cho thấy, việc lạm dụng corticoid đã tạo
cơ hội cho nhiều vi sinh vật xâm nhiễm, làm cho mụn trở

nên nặng hơn.
4.2. Khảo sát khả năng đề kháng kháng sinh của
vi khuẩn bội nhiễm ở MTC dùng corticoid bôi vàchọn
VKCT
Tổng số 79 trường hợp MTC có sử dụng corticoid
bôi đã phân lập được 63 dòng P. acnes, 70 dòng S.
epidermidis và 44 dòng S. aureus. Kết quả cho thấy vi
khuẩn P. acnes, S. aureus, S. pidermidis cótỷ lệ đề kháng
cao với kháng sinh kiểm tra từ 55,6% đến 95,4%. Sự
kháng thuốc của nhóm vi khuẩn gây bội nhiễm ở MTC đã
được nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước công bố.
Qua kết quả kháng sinh đồ đã chọn dòng 10Sa,
09Se vàdòng 46Pa giải trình tự cho thấy dòng 10Sa xác
định làS. aureus, dòng 09Se xác định làS. epidermidis và
dòng 46Pa làP. acnes. Các dòng này được chọn làVKCT
cho các khảo sát tiếp sau.
12


4.3. Phân lập và tuyển chọn LAB có khả năng
ức chế VKCT
4.3.1. Phân lập LAB
Tổng số 41 mẫu phân lập LAB gồm: nước vo gạo,
sữa tươi, nước bột làm bún vàmẫu vi sinh vật từ da mặt
của người đã phân lập được 82 dòng LAB có đặc điểm thể
hiện ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Đặc điểm của 82 dòng LAB phân lập
Đặc điểm

Màu sắc

Khuẩn
lạc

Hình dạng
Dạng bìa
Kích thước
Gram

Hình dạng
Tế bào
và
đặc
điểm sinh
Catalase
hóa
Oxydase
CaCO3

trắng đục
trắng
trong
trắng ngà
Tròn
Nguyên
< 0,5
0,5–1
>1
Dương
cầu
que ngắn

que dài
âm tính
âm tính
Dương

Số dòng
vi khuẩn
55
22

Tỷ lệ (%)

5
82
75
15
53
14
82
25
18
39
82
82
82

6,1
100
91,14
18,29

64,63
17,08
100
30,48
21,95
47,56
100
100
100

67,0
26,9

Bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch khảo sát
khả năng ức chế VKCT của 82 dòng LAB phân lập, có25
dòng thể hiện khả năng ức chế ít nhất một VKCT (Bảng
4.2.).
Bảng 4.2: Tỷ lệ dòng LAB ức chế VKCT
Vi khuẩn lactic
VKCT
n
Tỷ lệ (%)
P. acnes 46Pa
25
44,64
S.aureus 10Sa
12
21,48
S. epidermidis 09Se
8

14,28
13


Qua khảo sát đãchọn được dòng 05SL3 phân lập từ
da người không bị MTC thể hiện khả năng ức chế cả 3
dòng VKCT với khoảng vôkhuẩn 8 cm đối với S. aureus
10Sa, S. epidermidis 09Se và 18 cm đối với P. acnes 46Pa
(Hì
nh 4.2)

a

b

c

Hình 4.2: Khả năng ức chế VKCT của dòng LAB 05SL3

(a: ức chế S. aureus 10Sa; b: ức chế S. epidermidis 09Se; c. ức chế P. acnes 46Pa)

Khảo sát khẳng định khả năng ức chế vi khuẩn tham
gia sinh mụn của LAB 05SL3 bằng phương pháp chủng
LAB 05SL3 vào dịch nuôi VKCT. Kết quả thấy rằng L.
plantarum 05SL3 đã làm giảm 48,6% mật số S. aureus
10Sa, 47,3% mật số S. epidermidis 09Se và60,2% mật số
P. acnes 46Pa so với đối chứng ở tại thời điểm 30 giờ sau
khi chủng (P<0,001) (Hình 4.4; 4.5; 4.6). Sự ức chế
VKCT của LAB phân lập có thể do khả năng sản sinh
bacteriocin hoặc các chất có khả năng ức chế vi khuẩn

khác như: acid lactic, acid acetic, peroxide hydrogen,
carbon dioxide,..... Từ kết quả thể hiện khả năng ức vi
khuẩn bội nhiễm ở MTC tốt hơn các dòng khác nên LAB
05SL3 được chọn xác định và khảo sát một số đặc điểm
sinh học cóthể ứng dụng chăm sóc da.

14


Hì
nh 4.4: Biểu đồ ức chế S. aureus 10Sa của L. plantarum 05SL3

Hình 4.5: Biểu độ ức chế S. epidermidis 09Se của L. plantarum 05SL3

Hì
nh 3.1: Biểu đồ ức chế P. acnes 46Pa của L. plantarum 05SL3

Dòng LAB 05SL3 được xác định là L. plantarum
bằng phương pháp sinh học phân tử. Tế bào vi khuẩn
hình que, kích thước 2,26x0,61 µm, Gram dương (Hình
4.3).

15


Hình 4.3: Hình tế bào vi khuẩn L. plantarum 05SL3
(a. chụp ở độ phóng đại 5.500 lần; b. Gram +)

Khảo sát một số đặc tính sinh học ứng dụng trong
chăm sóc da của L. plantarum 05SL3

a. Khả năng sinh bacteriocin bằng phương pháp nhỏ
giọt
Kết quả cho thấy L. plantarum 05SL3 không sản
xuất bacteriocin (Hình 4.7). Từ đó, khả năng ức chế
VKCT của L. plantarum 05SL3 có thể là do acid lactic
hoặc hoạt chất khác do vi khuẩn sinh ra trong quá trình
phát triển.
4.4.

Hình 4.7: Khả năng sinh baceriocin của L. plantarum 05SL3
(A.VKCT Pediococus pentosacus JCM 5885; B. Vi khuẩn chị thị Bacillus coagulans
JCM 2257T)

b. Khả năng sinh acid lactic
Kết quả cho thấy L. plantarum 05SL3 sinh acid
lactic cao nhất ở 37 oC là14,23 g/L với hiệu suất chuyển
hóa glucose là84%. (Hình 4.8).

16


80000

05ｓｌ
3-37 - CH2

5 Lactate

Intensity [µV]

60000

40000

3 Glucose

20000

1 Unknown
2 Unknown

6 Acetate
4 Unknown

7 Unknown
8 Unknown

0
0.0

2.0

4.0

6.0

8.0
10.0
Retention Time [min]

12.0

14.0

16.0

18.0

Hình 4.8: Phổ HPLC trên cột Rspak SH-1011 của DN-Lp

c. Khả năng sinh hoạt chất chống oxy hóa
Kết quả thử HTCO của DN-Lp ở nồng độ 100% là
86,06%. Giá trị IC50 là 31,85% thấp hơn vitamin C 1,75
lần (IC50 của vitamin C là18,19 µg/mL). HTCO của DNLp cao hơn 1,2 lần so với dịch nuôi của L. rhamnosus
trong MRS (HTCO=71,7%) trong nghiên cứu của Tsai et
al. (2013) (Hình 4.9; 4.10).

Hì
nh 4.9: Hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH của DN-Lp

Hì
nh 4.10: Biểu đồ thể hiện giátrị IC50 của viatmin C vàDN-Lp

17


d. Khả năng giữ ẩm
Khả năng giữ ẩm của DN-Lp ở nồng độ 100% là
7,61±0,0% tương đương với glycerin 5% (Rr=7,75%). So
với glycerin 10%, DN-Lp nồng 100% thấp hơn 1,68 lần,

thấp hơn 1,37 lần so với dịch nuôi của L. rhamnosus
trong MRS (Rr=10,5%) trong nghiên cứu của Tsai et al.
(2013) (Hình 4.11).

Hì
nh 4.11: Khả năng giữ ẩm của DN-Lp so với glycerin và nước

d. Khả năng kháng kháng sinh
Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch KirbyBauer, kết quả dòng L. plantarum 05SL3 kháng tất cả các
kháng sinh sử dụng trong điều trị MTC. Điều đó có nghĩa
làvi khuẩn không bị tiêu diệt bởi kháng sinh khi sử dụng
chăm sóc da MTC (Hình 4.12).

Hình 4.12: Kết quả kháng sinh đồ của L. plantarum 05SL3

Qua khảo sát một số đặc tính sinh học, cho thấy vi
khuẩn L. plantarum 05SL3 có khả năng ức chế vi khuẩn
bội nhiễm ở MTC, chống oxy hóa, giữ ẩm, sinh acid
lacitic cao và đề kháng với nhiều loại kháng sinh dùng
18


trong điều trị mụn. Đây là những đặc tí
nh tốt, cần cótrong
sản phẩm chăm sóc da mà L. plantarum 05SL3 có được.
Vìthế, việc nghiên cứu chế phẩm từ dòng L. plantarum
05SL3 để chăm sóc da là cần thiết, nhằm đưa dòng vi
khuẩn cólợi để cải thiện hệ vi sinh vật da.

4.5. Lên men gel Nha đam làm chế phẩm

chăm da
a. Thiết kế môi trường và điều kiện nuôi sinh khối
L. plantarum 05SL3
Qua khảo thời gian tăng trưởng, khả năng sử dụng
nguồn carbohydrate cho thấy tốc độ tăng trưởng của L.
plantarum 05SL3 bắt đầu giảm ở 24 giờ nuôi trong môi
trường MRS (Hình 4.13), có khả năng sử dụng tốt đường
saccarose, không sử dụng tinh bột. Phát triển tạo sinh khối
cao ở môi trường cải tiến gồm: 100% nước tàu hũ, 20%
saccarose, 2% kali và 2% nitơ ở pH là6,5 vànhiệt độ là
37 oC cho sinh khối vi khuẩn gần với đối chứng hơn tất cả
các nghiệm thức còn lại (2,7±0,2 g/L, đối chứng MRS là
3,9 ± 0,1 g/L (p<0,001)). Đây là môi trường cải tiến, tận
dụng được nguồn nguyên liệu sẵn cóvàrẻ tiền. Giáthành
của môi trường cải tiến để sản xuất sinh khối vi khuẩn L.
plantarum 05SL3 thấp hơn MRS 3,3 lần (Hì
nh 4.13; 4.14).

Hình 4.13: Biểu đồ tăng trưởng của L. plantarum 05SL3

19


Hình 3.2: Sinh khối L. plantarum 05SL3 sau 24 giờ

a. Lên men làm chế phẩm chăm sóc da
Nha đam là nguồn nguyên liệu có thành phần dinh
dưỡng cao và đặc tính dược liệu tốt, vừa cókhả năng ứng
dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, vừa cókhả năng
lên men bởi vi khuẩn lactic. Vìthế, Nha đam được chọn

làm nguyên liệu chín để lên men. L. plantarum 05SL3 có
thể với 30% Nha đam, 2% sữa đặc và mật số vi khuẩn
chủng vào là1% vàtồn trữ ở nhiệt 25 oC trong thời gian
40 ngày thìsản phẩm vẫn đảm bảo mật số vi khuẩn là
4,7x108 CFU/mL (p<0,001).

Hình 4.15: Chế phẩm trữ ở nhiệt độ 25 oC sau 60 ngày

Sản phẩm gel Nha đam lên men bởi L. plantarum
05SL3 (Lp. Gel) gây kích ứng da không đáng kể và pH
đạt 3,5 (Bảng 4.3).

20


Bảng 4.3: Kết quả kiểm nghiệm chế phẩm Lp. Gel
Chỉ tiêu
pH
Chì
Cadimi
Thủy ngân
S. aureus
Candida
albicans
Pseudomonas
aeruginosa
Kích ứng da
Mật số
L.plantarum

Kết quả
3,5
0,01 ppm
0,002 ppm
không
Không
Không

Tài liệu áp dụng

Không

TCVN 6972-2001

SOP/AA/5.4/02/01.00
SOP/AA/5.4/02/01.00
SOP/AA/5.4/02/01.00
TCVN 6972-2001
TCVN 6972-2001

kích ứng
TCVN 6972-2001
không đáng kể
6

3,77x10 cfu/g

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Qua khảo sát tình trạng bội nhiễm vi sinh vật trên

MTC từ tháng 3/2013 đến 10/2014 tại Bệnh viện Da Liễu
Cần Thơ, đã có 148 bệnh nhân MTC tì
nh nguyện tham gia
nghiên cứu. Kết quả, cho thấy MTC xuất hiện phổ biến ở
lứa tuổi từ 19-25 chiếm 45,9%. Tỷ lệ MTC có dùng
cortcoid bôi chiếm 53,4%. Tỷ lệ nhiễm P. acnes trên MTC
sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid là 56,8%, S.
epidermidis là 89,9%, S. aureus là 60,8%, nhiễm
Demodex là8,9% vànhóm vi khuẩn bội nhiễm phố biến
gồm P. acnes, S. epidermidis; S. aureus với tỷ lệ 45,6%.
Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập từ MTC dùng
corticoid bôi đều kháng với các kháng sinh dùng trong
điều trị mụn gồm: erythromycin, clindamycin, doxycyclin
và tetracyclin, oxacillin, Trimethoprim/sulfamethoxazol
với mức kháng từ 55,6% đến 95,4%.
Tổng số 82 dòng LAB phân lập từ 41 mẫu nước vo
gạo, nước tàu hũ, nước bột, nước sữa lên men vàmẫu vi
21


sinh vật từ da người, đã tuyển chọn được dòng L.
plantarum 05SL3 có nguồn gốc từ da người không MTC
cókhả năng ức chế nhóm vi khuẩn P. acnes,
S.
epidermidis, S. aureus cao hơn các dòng khác với khoảng
vô khuẩn tương ứng 18 mm, 8 mm và 8 mm. Khả năng
làm giảm mật số VKCT sau 30 giờ: S. aureus 10Sa là
48,6%, S. epidermidis 09Se là47,3% vàP. acnes 46Pa là
60,2% so với đối chứng. Vi khuẩn L. plantarum 05SL3 có
các đặc tính: Gram dương, hình que có kích thước

2,26x0,61 µm, sắp xếp đơn hoặc chuỗi ngắn, oxidase và
catalase âm tí
nh, có khả năng phát triển ở nhiệt độ 50 oC,
có thể sử dụng đường glucose, saccarose, lactose, không
sử dụng tinh bột, sản xuất acid lactic đạt 14,23 g/L với
hiệu suất chuyển hóa glucose là 84% ở nhiệt độ 37 oC,
không sinh bacteriocin, chống oxy hóa với IC50 31,18%
thấp hơn vitamin C 1,75 lần, giữ ẩm tương đương với
glycerin 5%, đề kháng với các kháng sinh như: tetracyclin,
oxacillin, erythromycin, doxycyclin, climdamycin,
trimethoprim/ sulfamethoxazol.
Dòng L. plantarum 05SL3 có thể nuôi sinh khối
trong môi trường với các thành phần gồm nước tàu hũ
(100), đường saccarose (20%), KH2PO4 (2%) và
(NH4)2SO4 (2%) ở điều kiện pH là6,5 vànhiệt độ 37 oC.
Sinh khối thu được dùng lên men gel Nha đam 24 giờ làm
chế phẩm chăm sóc da với các thành phần gồm: 30% gel
Nha đam, 2% sữa đặc có đường, 1% L. plantarum 05SL3
vàtồn trữ ở nhiệt 25 oC trong thời gian 40 ngày sản phẩm
vẫn đảm bảo mật số vi khuẩn là4,7 x 108 CFU/mL.

5.2. Đề nghị
- Khảo sát tính an toàn của L. plantarum 05SL3 đối
với người vàthử nghiệm chăm sóc da MTC.
- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu và xây dựng qui
trì
nh sản xuất chế phẩm chăm sóc da từ vi khuẩn L.
plantarum 05SL3 hiệu quả hơn.
22