Xác định đa hình nucleotide đơn (SNP) có khả năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở cá tra pangasianodon hypophthalmus

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***************

NGUYỄN THỊ HOA

XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN (SNP) CÓ
KHẢ NĂNG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG
TRƯỞNG Ở CÁ TRA PANGASIANODON
HYPOPHTHALMUS.

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội – 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***************

NGUYỄN THỊ HOA

XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN (SNP) CÓ
KHẢ NĂNG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG
TRƯỞNG Ở CÁ TRA PANGASIANODON
HYPOPHTHALMUS.

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. KIM THỊ PHƯƠNG OANH

Hà Nội – 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh
vật đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến TS. Kim Thị Phương Oanh,
trưởng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên cứu hệ Gen - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận
tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ
Phòng Hệ gen học môi trường – Viện Nghiên cứu hệ Gen tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và tập thể lớp Cao học K20 đã luôn
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Hà Nội, ngày ..... tháng ...... năm 2018
Học viên

Nguyễn Thị Hoa


ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được trình bày dựa trên kết quả
nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn chuyên môn của TS. Kim Thị
Phương Oanh, trưởng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên cứu hệ Gen,
cùng với sự giúp đỡ kỹ thuật của các cán bộ trong phòng Hệ gen học môi trường.
Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày, trong luận văn này là trung thực,
không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ
rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội
đồng.
Hà Nội, ngày… tháng… năm 2018
Học viên

Nguyễn Thị Hoa


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT................................................................................ v
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3
1.1.

Đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cá tra...............................................................................3

1.1.1.

Đặc điểm sinh học ..................................................................................................................3

1.1.2.

Giá trị kinh tế của cá tra .........................................................................................................4

1.2.

Tình hình nghiên cứu về SNP marker trong thủy sản trên thế giới ................................................5

1.3.

Tình hình nghiên cứu về cá tra ở Việt Nam ...................................................................................7

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 10
2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................................................................10
2.1.1. Thu thập mẫu cá tra ....................................................................................................................10
2.1.2. Các cặp mồi nhân các vùng trình tự có chứa SNP marker .........................................................10
2.1.3. Hóa chất thí nghiệm ...................................................................................................................11
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ......................................................................................................12
2.2. Phương pháp......................................................................................................................................12
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số .............................................................................................................12
2.2.2. Khuếch đại các vùng trình tự bằng phương pháp PCR ..............................................................13
2.2.3. Xác định SNP bằng phương pháp Single Base Extension (SNapShot Multiplex Kit). ..............14
2.2.4. Thiết kế mồi SBE (Single Base Extension)................................................................................16
2.2.5. Thu thập dữ liệu và đánh giá ......................................................................................................22
2.2.6. Phân tích số liệu trên quần thể....................................................................................................23
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số........................................................................................................25
3.2. Kết quả khuếch đại các đoạn trình tự chứa SNP ...............................................................................26
3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR ......................................................................................................26
3.4. Kết quả điện di mao quản bộ mẫu chuẩn ..........................................................................................27
3.5. Thiết lập 11 Binset cho 11 nhóm mẫu ...............................................................................................29

3.6. Kết quả chạy Binset cho các sản phẩm SNapShot của 11 nhóm.......................................................33
3.7. Kết quả thống kê và tính xác suất theo thành phần kiểu gen và tần số alen tại các vị trí SNP cần
kiểm nghiệm trên hai nhóm cá tra sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm ............................................35


iv

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 41
4.1. Kết luận .............................................................................................................................................41
4.2. Kiến nghị ...........................................................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................. 42
PHỤ LỤC 1: Danh sách 96 mẫu cá tra (gồm 48 mẫu STN và 48 mẫu STC) ................................... 1
PHỤ LỤC 2: Danh sách các cặp mồi nhân đoạn trình tự DNA chứa SNP. ..................................... 3
PHỤ LỤC 3: Kết quả tách chiết DNA tổng số của 96 mẫu cá tra (gồm 48 mẫu sinh trưởng nhanh và
48 mẫu sinh trưởng chậm ..................................................................................................................... 9
PHỤ LỤC 4: Kết quả đo nồng độ DNA tổng số 96 mẫu cá tra sinh trưởng nhanh và chậm ....... 10
PHỤ LỤC 5: Kết quả PCR khuếch đại các vùng trình tự có chứa SNP ........................................ 12
PHỤ LỤC 6: Danh sách 11 nhóm mồi SBE ...................................................................................... 14
PHỤ LỤC 7: Kết quả chạy điện di mao quản của 11 nhóm .......................................................... 100
PHỤ LỤC 8: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của 11 nhóm mẫu .............................................. 107
PHỤ LỤC 9 ........................................................................................................................................ 100
Các chỉ số về thành phần kiểu gen và tần số alen của 84 SNP (thuộc 11 nhóm) của nhóm cá tra sinh
trưởng nhanh và nhóm cá tra sinh trưởng chậm (NN:kí hiệu cho kiểu gen chưa được xác định rõ do
kỹ thuật) ............................................................................................................................................. 100
phụ ...................................................................................................................................................... 103


v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
AFLP
BLAST
cDNA
DNA
EBV
FAO

FET
NGS
PCR
RAPD
SAP
SBE
SNP
UTR

Từ đầy đủ
Amplified Fragment Length Polymorphism
Basic Local Alignment Search Tool
Complementary DNA
Deoxy Ribonucleic Acid
Estimates of breeding value – Giá trị chọn giống của
tính trạng
Food and Agriculture Organization of the United
Nations – Tổ chức lương thực và nông nghiệp
Liên Hợp Quốc
Fisher Exact Test
Next Generation Sequencing

Polymer Chain Reaction
Random – Amplified Polymorphic DNA
Shrimp Alkaline Phosphatase
Single Base Extension
Single Nucleotide Polymorphism
Unified Genotyper


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Sơ đồ tổng quát các bước tiến hành thí nghiệm ............................................................... 12
Hình 2: Sơ đồ minh họa chu trình nhiệt ........................................................................................ 14
Hình 3: Hình ảnh minh họa quá trình thực hiện thí nghiệm SBE sử dụng SNapShot [38] ........... 16
Hình 4: Sơ đồ quy trình xử lý thiết kế mồi SBE ........................................................................... 17
Hình 5: Sơ đồ minh họa chu trình nhiệt trong phản ứng SNapShot .............................................. 20
Hình 6: Kết quả điện di mẫu DNA tổng số trên gel agarose 0,8% một số mẫu đại diện .............. 25
Hình 7: Kết quả điện di sản phẩm PCR của một mồi đại diện trên gel agarose 0.8% .................. 26
Hình 8: Kết quả điện di tinh sạch của đại diện một nhóm mẫu trên gel Agarose 0.8% ................ 27
Hình 9: Kết quả điện di mao quản bộ mẫu chuẩn 6 sản phẩm trên hệ thống phân tích ABI 3500 28
Hình 10: Kết quả điện di mao quản của một nhóm mẫu đại diện G1 ........................................... 34
Hình 11: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G2 của 9 mồi SBE (S024, S089,
SV14, S037, S125, S013, S105, S079 và S006) từ một mẫu cá tra sinh trưởng nhanh: kích thước
sản phẩm thực tế lần lượt là 75, 70, 65, 53, 48, 42, 36, 30 và 24 nucleotide .............................. 100
Hình 12: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G3 của 9 mồi SBE (SV12, S004,
S067, S127, S097, S082, S017, S030, S038) từ một mẫu cá tra sinh trưởng nhanh: kích thước sản
phẩm thực tế lần lượt là 78,72, 61, 55, 50, 44, 38, 31 và 24 nucleotide...................................... 101
Hình 13: Binset G4 gồm 10 mồi SBE (S048, S122, S113, S056, S077, S039, S012, S047, S076
và S046) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 76, 71, 66,
61, 55, 49, 43, 37, 31 và 24 nucleotide. ....................................................................................... 101

Hình 14: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G5 của 10 mồi SBE (S005, S034,
SV06, SV03, S114, S109, SV08, SV04, S078 và S098) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích
thước sản phẩm thực tế lần lượt là 77,71, 65, 59, 53, 47, 41, 36, 30 và 24 ................................. 102
Hình 15: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G6 của 8 mồi SBE (S081, S008,
SV15, S058, SV13, S011, S063 và S124) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản
phẩm thực tế lần lượt là 64, 58, 53, 47, 42, 37, 30 và 24 nucleotide. .......................................... 103
Hình 16: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G7 của 6 mồi SBE (S100, S095,
S020, S086, S001 và S042) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần
lượt là 53, 47, 42, 237, 31 và 24 nucleotide ................................................................................ 103


vii

Hình 17: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G8 của 7 mồi SBE (S090_4109,
S033_1077, S090_3990, S060, S033_992, S044 và S036) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm:
kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 59, 54, 48, 42, 36, 30 và 24 nucleotide ........................ 104
Hình 18: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G9 của 7 mồi SBE (S085, SV07,
S126, S053, S118, S019 và S071) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực
tế lần lượt là 58, 52, 47, 42, 37, 31 và 24 nucleotide................................................................... 105
Hình 19: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G10 của 7 mồi SBE (SV02, S066,
SV05, S121, S066, SV10 và SV16) từ một mẫu cá tra sinh trưởng nhanh: kích thước sản phẩm
thực tế lần lượt là 69, 62, 55, 48, 41, 33 và 25 nucleotide .......................................................... 105
Hình 20: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G11 của 6 mồi SBE (S029, S028,
S070, S080, S099 và S096) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần
lượt là 54, 48, 43, 38, 31 và 24 nucleotide .................................................................................. 106

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Thông số kỹ thuật cài đặt mặc định cho kỹ thuật SNapShot trên hệ thống ABI 3500 ... 21
Bảng 2: Danh sách 6 mồi SBE trong bộ mồi chuẩn ...................................................................... 22
Bảng 3: Bảng kết quả đo nồng độ DNA tổng số của một số mẫu đại diện ................................... 25

Bảng 4: Kết quả điện di mao quản đối với bộ sản phẩm chuẩn trên hệ thống phân tích ABI 3500
....................................................................................................................................................... 28
Bảng 5: Danh sách 11 bộ Binset cho 11 nhóm sản phẩm SNapShot ............................................ 29
Bảng 6: Các SNP được lựa chọn với điều kiện xác suất (FET<0.01, FST ≥ 0.05) ....................... 38
Bảng 7: Chú giải chức năng transcript chứa 4 chỉ thị SNP và dự đoán ảnh hưởng của SNP ....... 40


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus), thuộc họ cá tra (Pangasiidae),
bộ cá da trơn hay cá nheo (Siluriformes). Cá tra nuôi là một trong những loài cá đặc
hữu của vùng lưu vực sông Mê Kông (Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia), có
giá trị kinh tế lớn và được nuôi phổ biến ở vùng này và một số nước khác thuộc
khu vực miền nam châu Á. Theo thống kê của FAO, Việt Nam là nước có sản
lượng cá tra nuôi Pangasianodon hypophthalmus lớn nhất thế giới và xuất khẩu
sang hơn 140 nước trên thế giới. Mặc dù xuất khẩu ra hàng trăm thị trường nhưng
sản phẩm cá tra Việt Nam vẫn chưa có chỗ đứng bền vững. Một phần do chất lượng
cá giống đầu vào chưa cao, tình hình dịch bệnh, thời tiết thất thường… dẫn đến
hiệu quả sản xuất thấp, giá cả không ổn định, mặt khác, ngành hàng cá tra Việt
Nam còn chịu sự cạnh tranh gay gắt khi mà một số nước khác đã và đang đẩy mạnh
sản xuất loại thủy sản này. Do đó việc tìm ra giải pháp đột phá để nâng cao giá trị
ngành hàng cá tra là yêu cầu cấp bách hiện nay. Việc phát triển và ứng dụng rộng
rãi Công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản đang là hướng đi mà chính phủ,
lãnh đạo các cấp các ngành liên quan cũng như các doanh nghiệp thủy sản đặc biệt
quan tâm. Một trong những vấn đề cấp thiết và có ý nghĩa cực kỳ quan trọng đối
với công tác giống là thông tin về đặc điểm cấu trúc phân tử của bộ gen (genome)
của cá tra. Nghiên cứu genome sẽ cung cấp những thông tin chính xác nhất cho
việc xác định các tính trạng quan trọng như tính kháng bệnh, tính chống chịu đối

với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến năng suất, chất lượng sản
phẩm cá tra. Để tạo tiền đề cho các nghiên cứu về hệ gen cá tra, góp phần cho công
tác nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ sinh học trong thủy sản, Viện Nghiên cứu
hệ gen đã xây dựng và thực hiện đề tài nghiên cứu cấp nhà nước: “Phân tích hệ gen
biểu hiện (exome + transcriptome) của cá tra nhằm phát triển chỉ thị phân tử phục
vụ chọn giống cá tra theo hướng tăng trưởng” thuộc Chương trình phát triển và ứng
dụng công nghệ sinh học trong thủy sản của Bộ nông nghiệp và Phát triển nông
thôn, do TS. Kim Thị Phương Oanh làm chủ nhiệm (thời gian thực hiện đề tài
8/2014 đến 4/2018). Dựa trên dữ liệu toàn bộ hệ gen (genome) và hệ gen biểu hiện


2

(transcriptome) cá tra, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định đa hình
nucleotide đơn (SNP) có khả năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở cá
tra Pangasianodon hypophthalmus” nhằm xác định chính xác các chỉ thị SNP
tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng đã được sàng lọc và dự đoán bằng
phương pháp tin sinh học trên quần thể cá tra. Kết quả của đề tài đóng góp về mặt
khoa học cho hướng nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử trên đối tượng cá tra nuôi
Việt Nam.
2. Mục tiêu của đề tài
Kiểm nghiệm lại các chỉ thị SNP tiềm năng đã được sàng lọc dựa trên dữ liệu
hệ gen biểu hiện (transcriptome) trong quần thể cá tra.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Mẫu vây cá tra (100 cá thể) được lấy từ Trung tâm Quốc gia Giống thủy sản
nước ngọt Nam Bộ, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II, được chia thành hai
nhóm:
- Nhóm mẫu sinh trưởng nhanh: Phân tích và kiểm nghiệm trên 50 cá thể thuộc
gia đình có EBV cao nhất.
- Nhóm mẫu sinh trưởng chậm: Phân tích và kiểm nghiệm trên 50 cá thể thuộc

gia đình có EBV thấp nhất.
4. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô vây của các cá thể cá tra
thuộc quần thể kiểm nghiệm.
Nội dung 2: Thiết kế mồi dựa trên dữ liệu transcriptome đã phân tích và sàng
lọc SNP bằng phương pháp tin sinh.
Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR phân lập đoạn trình tự DNA có chứa
SNP.
Nội dung 4: Xác định các SNP bằng phương pháp Single-Base Extension/
SNaPshot Multiplex System
Nội dung 5: Phân tích dữ liệu SNP


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cá tra
1.1.1. Đặc điểm sinh học
Cá tra có tên khoa học là Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth sử
dụng lần đầu vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được nhiều tác
giả khác sử dụng phổ biến cho đến nay. Cá tra nuôi là một trong những loại cá đặc
hữu của vùng lưu vực sông Mê Kông (Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia),
thuộc họ cá tra (Pagasiidae), bộ cá da trơn hay cá nheo (Siluriformes), có giá trị
kinh tế lớn và được nuôi phổ biến ở vùng này và một số nước khác thuộc khu vực
miền Nam Châu Á.
Về đặc điểm sinh học, cá tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lưng xám
đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to. Vây lưng cao,
có một gai cứng có răng cưa. Vây ngực có ngạch, bụng có 8 tia phân nhánh [10].
Cá tra dễ nuôi, có thể sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ,
có hàm lượng oxy hòa tan và độ pH thấp. Người ta có thể nuôi loại cá này với mật

độ rất cao và có thể sống được ở vùng nước lợ (nồng độ muối 7-10‰). Một ao nuôi
có thể chứa 50 con/ m2, còn nuôi bè thì khoảng 90 – 120 con/ m2.
Cá tra là loài cá ăn tạp. Chúng có thể ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và
chúng vẫn tiếp tục ăn nhau nếu cá ương không được cho ăn đầy đủ. Trong quá trình
ương thành cá giống trong ao, chúng ăn các loại động vật phù du có kích thước nhỏ
và thức ăn nhân tạo. Khi cá lớn thể hiện tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về
động vật. Trong điều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc
khác như mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả và thức ăn có nguồn gốc động
vật như tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá. Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích
nghi với nhiều loại loại thức ăn khác nhau như: thức ăn tự chế, thức ăn công
nghiệp, cám, tấm, rau muống… Thức ăn có nguồn gốc động vật giúp cá lớn nhanh
hơn [7].
Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, lúc còn nhỏ cá tăng nhanh về
chiều dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng đạt chiều dài từ 10-12 cm (14 – 15 gam).
Từ khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với chiều dài cơ thể.
Cá nuôi trong ao 1 năm đạt 1 đến 1,5 kg/con (năm đầu), những năm về sau cá tăng


4

trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 đến 6 kg/năm tuỳ thuộc môi trường sống và sự
cung cấp thức ăn cũng như loại thức ăn có hàm lượng đạm nhiều hay ít.
Cá tra không sinh sản trong ao nuôi, cá có tập tính di cư sinh sản trên những
khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp. Trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên
sông ở địa phận của Campuchia và Thái Lan. Ở Việt Nam cá tra cũng không có bãi
sinh sản tự nhiên. Cá sinh sản ở Campuchia, cá bột theo dòng nước về Việt Nam
[7]. Tuổi thành thục của cá tra trên sông Mekong 3 – 4 năm tuổi. Cá tra có tập tính
di cư ngược dòng. Mùa vụ sinh sản của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 đến
tháng 7 âm lịch hàng năm. Trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 đến 3 kg [7].
Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ, nếu chỉ nhìn hình dáng bên ngoài thì khó

phân biệt được cá đực và cá cái. Bắt đầu phân biệt được cá đực cái từ giai đoạn II,
các giai đoạn sau, buồng trứng tăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có
hình dạng phân nhánh, màu hồng chuyển dần sang màu trắng sữa. Hệ số thành thục
của cá tra khảo sát được trong tự nhiên từ 1,76 đến 12,94 (cá cái) và từ 0,83 đến 2,1
(cá đực) cỡ cá từ 8 đến 11 kg. Trong ao nuôi vỗ, hệ số thành thục cá tra cái có thể
đạt 19,5%. Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá gọi là sức sinh sản
tuyệt đối, sức sinh sản tuyệt đối của cá tra từ 200.000 đến vài triệu trứng. Sức sinh
sản tương đối có thể là 135.000 trứng/kg cá cái. Kích thước của trứng cá tra tương
đối nhỏ và có tính dính. Trứng sắp đẻ có đường kính trung bình 1mm, khi đẻ ra
trứng trương nước thì đường kính trứng có thể là 1,5 – 1,6 mm. Trong sinh sản
nhân tạo, ta có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (từ tháng
3 dương lịch hàng năm), cá tra có thể tái phát dục 1 – 3 lần trong một năm [3].
1.1.2. Giá trị kinh tế của cá tra
Ở Việt Nam, đồng bằng Nam Bộ đã có truyền thống nuôi cá tra trong ao và
bè. Năng suất nuôi cá tra rất cao, trung bình khoảng 300 tấn/ha. Cá tra đã và đang
trở thành một đối tượng nuôi có giá trị xuất khẩu lớn. Tính đến hết năm 2017, diện
tích nuôi cá tra cả nước là 5.230 ha (tăng 3,5% so cùng kỳ). Trong đó, vùng đồng
bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với 5 tỉnh: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh
Long và Bến Tre chiếm đến 95% diện tích. Kim ngạch xuất khẩu cá tra năm 2017
đạt khoảng 1,78 tỷ USD, tăng 4,3% so với năm 2016, đạt 1,79 tỉ USD, đóng góp
21,45% vào giá trị xuất khẩu của ngành thủy sản [4]. Song song với việc sản lượng


5

thủy sản xuất khẩu tăng là sự cạnh tranh gay gắt ở cả thị trường trong nước cũng
như thị trường nước ngoài. Rất nhiều doanh nghiệp cạnh tranh không lành mạnh,
lạm dụng kháng sinh, chất tăng trọng làm mất uy tín chất lượng cá tra xuất khẩu
Việt Nam. Bên cạnh đó, giá cá tra nguyên liệu tăng dẫn đến tình trạng các hộ dân ồ
ạt mở rộng diện tích nuôi trồng mà không có sự kiểm soát làm nguồn cung vượt

cầu, rủi ro cao. Một khó khăn gây trở ngại cho việc xuất khẩu cá tra nữa là hiện nay
các nước khác cũng gia tăng sản lượng nuôi và xuất khẩu cá tra, chẳng hạn như Ấn
Độ có sản lượng hơn 650.000 tấn, Bangladesh gần 500.000 tấn, indonesia 110.000
tấn … Riêng thị trường Trung Quốc, vốn là nhà nhập khẩu cá tra lớn nhất, các
doanh nghiệp nội địa cũng đang tích cực nuôi với sản lượng khoảng 10.000 tấn [5].
Không chỉ bị cạnh tranh về thị trường với các đối thủ mới, cá tra Việt Nam cũng
đang gặp nhiều trở ngại tại thị trường nước ngoài từ chính các thay đổi về chính
sách. Chính vì vậy, ngành thủy sản cần phải đổi mới phương pháp nuôi trồng để
nâng cao năng suất, cải tiến cách thức quản lý để kiểm soát và nâng cao chất lượng
sản phẩm cá tra để đáp ứng được yêu cầu thị trường và bảo vệ thương hiệu cá tra
Việt Nam trên thị trường quốc tế. Nền tảng cho chiến lược phát triển này là công
tác chọn giống, tập trung ứng dụng khoa học kỹ thuật nhằm nâng cao chất lượng di
truyền của loài cá có giá trị kinh tế cao này.
1.2. Tình hình nghiên cứu về SNP marker trong thủy sản trên thế giới
Với sự phát triển của khoa học công nghệ trong những năm gần đây, việc áp
dụng nghiên cứu genome trong nuôi trồng thủy sản và bảo vệ nguồn đa dạng sinh
học đã trở nên dễ dàng tiếp cận hơn [33], [11], [32]. Giải mã gen hay đọc trình tự
DNA bằng phương pháp Sanger [42] cùng với các thế hệ máy giải trình tự tự động
đã tạo nên một cuộc cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen (genomics) [24].
Với công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS)
hiện nay đã và đang phát hiện được thêm nhiều đa hình nucleotide đơn (Single
Nucleotide Polymorphism – SNP) cho nhiều đối tượng khác nhau. Đã có nhiều các
nghiên cứu và bài báo được công bố liên quan đến chỉ thị phân tử DNA và phạm vi
ứng dụng của chúng, bao gồm trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Phân tích đa hình
nucleotide đã nổi lên như công nghệ genotyping với các ứng dụng rộng rãi trong
nuôi trồng thủy sản như xây dựng bản đồ liên kết di truyền, tìm kiếm các gen quy


6

định tính trạng hữu ích trong nuôi trồng thủy sản [35], [55] như tính kháng bệnh,
tính chống chịu với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến năng suất,
chất lượng sản phẩm, màu sắc thịt, độ tuổi thành thục. Các SNP liên kết với các
tính trạng mong muốn có thể được xác định bằng cách sử dụng công nghệ NGS
như RNA-seq, Genotyping by sequencing (GBS) [18], multiplexed shotgun
genotyping [14] và Restriction-site associated DNA sequencing (RAD-seq), tạo ra
một khối lượng dữ liệu khổng lồ với giá thành rẻ hơn rất nhiều. Sử dụng GBS đã
giúp xác định được 4275 loci SNP của cá nheo lục Ictalurus furcatus, trong đó 64
SNP multiplex đã được sử dụng cho genotyping [29]. Nhờ kĩ thuật NGS, đã xác
định được tổng cộng 5243 SNP marker chất lượng cao ở loài ngọc trai môi đen
Pinctada margaritifera từ quần đảo Fiji [28]. Một bản đồ liên kết di truyền mật độ
cao được tích hợp cùng bản đồ vật lý được tạo ra ở cá nheo Mỹ (Ictalurus
punctatus) với hơn 50000 SNP, độ bao phủ 90% Mb của hệ gen cá da trơn, kích
thước di truyền ước tính 3505,4 cM [31]; [30]. Bản đồ tích hợp tạo điều kiện cho
việc lắp ráp bộ gen cá da trơn, lập bản đồ QTL và phân lập các gen mang các đặc
điểm hữu ích về mặt kinh tế. Một bản đồ di truyền cho cá chép (Cyprinus carpio)
cũng được xây dựng dựa trên 8487 SNP marker với 50 nhóm liên kết với tổng
khoảng cách 3762,88 cM [27]; [54]. Ngoài ra, bản đồ liên kết di truyền còn được
xây dựng ở một số loài khác quan trọng đối với nuôi trồng thủy sản như cá tráp đầu
vàng (Sparus aurata) [50]; cá chẽm Châu Á (Lates calcarifer) [52]; cá quế mõm
hếch (Siniperca chuatsi) [45]; cá bơn Nhật (Paralichthys oilivaceus) [15]; [43]...
Tăng trưởng là đặc điểm kinh tế quan trọng nhất trong nhiều chương trình
chọn giống trong nuôi trồng thủy sản, do đó đã có nhiều nghiên cứu về chủ đề này.
Sự liên quan giữa tính trạng sinh trưởng và đa hình ở các gen thích hợp đã được
nghiên cứu ở một số loài cá. Ở cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvelinus alalpinus),
nghiên cứu đa hình nucleotide đơn (SNP) của các gen liên quan đến sinh trưởng
cho thấy trên gen GHRH/PACAP2 có SNP liên quan rõ ràng tỷ lệ sinh trưởng và
được coi như một marker tiềm năng có thể ứng dụng cho chọn giống dòng sinh
trưởng nhanh [47]. Gần đây, công nghệ RNA-seq cũng đã được sử dụng để xác
định SNP marker cho tính trạng tăng trưởng ở cá hồi cầu vồng. Nghiên cứu này đã

xác định được 22 SNP có liên kết với tính trạng tăng trưởng ở 778 cá thể đại diện


7

cho 40 gia đình [40]. Ở cá hồi Đại tây dương (Salmo salar L.), nghiên cứu SNP
trên gen IGF1 cho thấy, có hai vị trí (ở vùng promoter g.5763G>T và ở intron 3
g.4671A>C) có liên quan chặt chẽ với trọng lượng cơ thể và đây cũng là những
marker tiềm năng có thể ứng dụng cho chọn giống [49]. Ở cá chép (Cyprinus
carpio), SNP nằm trên intron 2 của gen IGF-1 (g.7627T>A) có liên quan chặt chẽ
với trọng lượng và chiều dài cơ thể. Cá chép có kiểu gen AA có trọng lượng trung
bình cao hơn cá có kiểu gen TT 5,9%. Cá có kiểu gen TT tương ứng có trọng lượng
trung bình thấp nhất. Đây cũng là marker tiềm năng có thể ứng dụng cho chọn
giống [20]. Ở cá rô phi (Oreochromis niloticus), nghiên cứu SNP trên các gen liên
quan đến sinh trưởng (bao gồm: GH, IGF-1 và MyoG) đã tìm ra các SNP mới trên
gen GH và MyoG có tiềm năng ứng dụng làm marker chọn giống [16]. Như vậy,
nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen liên quan đến tính trạng sinh trưởng là
một phương pháp khá hiệu quả nhằm tìm ra marker phân tử để chọn lọc tính trạng
này.
1.3. Tình hình nghiên cứu về cá tra ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, ở nước ta đã bước đầu chú ý đến các nghiên cứu
nhằm nâng cao chất lượng di truyền và kiểm soát dịch bệnh ở một số giống thủy
sản. Các nghiên cứu đã và đang tiến hành trên cá tra đã đặt cơ sở khoa học cho
công tác chọn giống và nghiên cứu đa dạng sinh học của giống thủy sản có giá trị
kinh tế cao này. Các tác giả Phạm Anh Tuấn và Nguyễn Hữu Ninh đã sử dụng 4
microsatellite tìm kiếm mối tương quan giữa marker phân tử với màu sắc thịt của
cá tra [9]. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng các marker phân tử như
RAPD và AFLP đã được nghiên cứu trên trên cá tra [2]; [6]. Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thủy sản II đã thực hiện chương trình chọn giống cá tra thông qua tính trạng
tốc độ tăng trưởng bằng phương pháp chọn lọc cá thể (quần đàn 2001-2002) và tỷ

lệ phi lê bằng phương pháp chọn lọc kết hợp (quần đàn 2003) dưới sự hỗ trợ kinh
phí của SUFA (2001-2005). Quần đàn 2001, 2002 và 2003 được thành lập trên cơ
sở chọn lọc đàn con của 75, 79 và 101 gia đình được sản xuất từ cá bố mẹ thuộc 34 trại sản xuất giống khác nhau và có nguồn gốc từ tự nhiên ở đồng bằng sông Cửu
Long. Chương trình chọn giống được tiếp tục bằng đề tài cấp Bộ “Chọn giống cá
tra nhằm tăng tỷ lệ philê bằng chọn lọc gia đình, 2006-2008” trên quần đàn G1-


8

2001, G1-2002 và G1-2003 và đề tài trong giai đoạn “Đánh giá hiệu quả chọn
giống cá tra nâng cao tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ philê, 2010-2012” trên quần đàn
G2-2001, G2-2002 và G2-2003. Kết quả đề tài 03 giai đoạn này cho thấy hệ số di
truyền ước tính của tính trạng tỷ lệ phi lê thấp (h2=0,05-0,12), trọng lượng cơ thể
cao (h2=0,22-0,54) và kháng bệnh gan thận mủ thấp (h2=0,04-0,20). Hiệu quả
chọn lọc tương ứng được mong đợi cho những tính trạng này. Nguyễn Văn Sáng và
ctv (2009) đã tìm thấy tương quan di truyền thuận thấp giữa tỷ lệ philê và trọng
lượng cơ thể (r=0,35). Kết quả này cho phép kết luận rằng chọn lọc tính trạng trọng
lượng cơ thể có thể mang lại hiệu quả cho tỷ lệ philê nhưng không cao. Hiệu quả
chọn lọc thực tế tính trạng tăng trưởng tương đối khả quan ở mức trung bình và cao
5,4-18,2% mỗi thế hệ và cho tính trạng tỷ lệ philê ở mức 0,51-1,2%. Hệ số di
truyền thực tế cho tính trạng tăng trưởng cũng ở mức trung bình và cao như hệ số
ước tính, 0,24-0,38 và cho tính trạng tỷ lệ phi lê tương đối cao, 0,27 (trong khi hệ
số di truyền ước tính tương đối thấp). Quần đàn chọn giống thế hệ thứ 3 được hình
thành trong các năm 2010-2012 cho chọn giống tiếp theo bao gồm 1800 con chọn
lọc có giá trị chọn giống EBV cao và 250 con đối chứng (chọn ngẫu nhiên). Kết
quả đánh giá đa dạng các quần đàn chọn giống bằng chỉ thị microsatellite cho thấy
không có sự khác biệt về cấu trúc alen giữa các đàn cá thiết lập vật liệu chọn giống
có nguồn gốc từ các trại giống khác nhau, 2001, 2002 và 2003 và giữa chúng với
đàn con G1-2001, G1-2002 và G1-2003 trên 6 chỉ thị khảo sát [8]; [1]. Kết quả
nghiên cứu chuyên đề trong đề tài giai đoạn 2010- 2012 cho thấy, các quần đàn bố

mẹ G1-2001, G1-2002, G1-2003 và đàn tự nhiên có số lượng alen, độ phong phú
alen, chỉ số thông tin đa hình, giá trị dị hợp tử mong đợi và thực tế gần tương
đương nhau bằng phân tích trên 10 cặp microsatellite. Trong đó, quần đàn G1-2001
có khác biệt di truyền so với các đàn còn lại và đàn G1-2002 có chỉ số cận huyết
thấp hơn các đàn còn lại. Như vậy, cho đến nay chúng ta chưa tìm ra chỉ thị phân tử
nào có thể ứng dụng cho chọn giống cá tra. Do việc nghiên cứu xác định các chỉ thị
phân tử DNA có độ tin cậy cao, có ý nghĩa thực tế lớn, ứng dụng trong chọn giống
và kiểm soát sạch bệnh nên ngày càng được các nhà khoa học và các nhà quản lý
quan tâm, xác định đó là nền tảng cho các nghiên cứu ứng dụng sau này.
Ở nước ta, với giá trị kinh tế cao của cá tra và yêu cầu cấp thiết nâng cao chất


9

lượng di truyền, kiểm soát dịch bệnh và quản lý nghề nuôi cá này, phân tích hệ gen
cá tra là một trong những vấn đề rất cần nghiên cứu và có ý nghĩa quan trọng. Để
tạo tiền đề cho các nghiên cứu về hệ gen cá tra, góp phần cho công tác nghiên cứu
và ứng dụng công nghệ sinh học trong thủy sản, từ năm 2014 – 2018 viện Nghiên
cứu hệ gen đã thực hiện đề tài cấp nhà nước: “Phân tích hệ gen biểu hiện (exome +
transcriptome) của cá tra nhằm phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống cá tra
theo hướng tăng trưởng”, do TS. Kim Thị Phương Oanh làm chủ nhiệm. Đề tài đã
sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) giải mã được toàn bộ hệ gen
(genome) của một cá thể cá tra đực độ bao phủ khoảng 127X. Kích thước bộ gen cá
tra ước tính 700 Mb, lắp ráp thành 568 scaffolds, với giá trị N50 đạt 14,29 Mbp.
Toàn bộ hệ gen của cá tra đã được chú giải và ước tính có khoảng 28.600 gen mã
hoá protein. Đây là phác thảo bộ gen cá tra đầu tiên có thể được sử dụng làm hệ
gen tham chiếu cho cá tra [26]. Đề tài cũng đã giải mã hệ gen biểu hiện
(transcriptome) của mô cơ từ hai nhóm mẫu: cá tra sinh trưởng nhanh (10 cá thể) và
cá tra sinh trưởng chậm (10 cá thể). Bằng cách sử dụng các công cụ và phần mềm
tin sinh học, nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân tích hai bộ dữ liệu transcriptome

của hai nhóm cá tra sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm; sàng lọc được 369 đa
hình nucleotide đơn (SNP) có sự khác biệt giữa hai nhóm mẫu. Dựa trên những
phân tích dự đoán bằng phương pháp tin sinh học, 99 chỉ thị SNP tiềm năng có sự
khác biệt giữa các nhóm sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm, có khả năng liên
quan đến tính trạng tăng trưởng được sàng lọc. Tuy nhiên, những phân tích dựa trên
phương pháp tin sinh học này cần được kiểm nghiệm lại bằng thực nghiệm trên
quần thể lớn hơn.


10

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Thu thập mẫu cá tra
a. Địa điểm thu thập mẫu
Cá tra thuộc nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm được thu
thập từ Trung tâm Quốc gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ, Viện nghiên cứu
nuôi trồng Thủy sản II, ấp 2, xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang.
b. Quá trình thu mẫu
Tất cả mẫu cá tra đã được phân loại thành hai nhóm sinh trưởng nhanh và
sinh trưởng chậm theo kết quả đề tài trước đó của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản II. Để phân loại nhóm sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm người ta
căn cứ vào chỉ số giá trị giống ước tính (Estimated Breeding Value – EBV) được
tính toán cho từng cá thể. Dựa vào bảng xếp hạng EBV của toàn bộ quần đàn cá tra
nuôi mẫu, chúng tôi tiến hành thu mẫu vây của 50 cá thể có EBV cao nhất (nhóm
sinh trưởng nhanh) và 50 cá thể có EBV thấp nhất (nhóm sinh trưởng chậm). Mẫu
vây được thu cắt từ vây bụng của cá, sau khi cắt rời khỏi cơ thể cá được bảo quản
ngay trong cồn tuyệt đối. Mẫu vây sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Trong
quá trình thao tác cắt mẫu vây dụng cụ cắt được rửa sạch bằng cồn trước khi thực
hiện cắt mẫu tiếp theo. Trong quá trình bảo quản mẫu vây thường xuyên thay cồn

trong ống đảm bảo mẫu không bị biến đổi.
Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi chỉ tiến hành trên 96 mẫu cá tra
gồm 48 mẫu sinh trưởng nhanh và 48 mẫu sinh trưởng chậm để phù hợp với việc
sử dụng khay 96 giếng.
Danh sách 96 mẫu cá tra được liệt kê ở PHỤ LỤC 1.
2.1.2. Các cặp mồi nhân các vùng trình tự có chứa SNP marker
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng 90 cặp mồi nhân vùng trình tự có chứa chỉ
thị SNP được thiết kế dựa vào danh sách 99 SNP tiềm năng có sự khác biệt giữa hai
nhóm cá tra sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm đã qua sàng lọc bằng các phần
mềm tin sinh học, dựa trên kết quả nghiên cứu trước đó (kết quả của nhóm nghiên
cứu đề tài “Phân tích hệ gen biểu hiện (exome + transcriptome) của cá tra nhằm
phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống cá tra theo hướng sinh trưởng”. Từ 99


11

SNP tiềm năng chỉ thiết kế 90 cặp mồi là do có một số trường hợp có 2 SNP trở lên
ở cùng một transcript, do vậy sẽ có những cặp mồi nhân lên được đoạn trình tự có
chứa nhiều SNP.
Danh sách 90 cặp mồi nhân đoạn trình tự genome chứa SNP cùng kích thước
sản phẩm PCR dự tính được liệt kê ở PHỤ LỤC 2
2.1.3. Hóa chất thí nghiệm
STT

1

Thí nghiệm

Tên hóa chất

Hỗn hợp dung dịch solution 1: Tris HCl 10
mM, EDTA 100 mM, SDS 2%
Tách chiết và Dung dịch amonium axetat 7,5M (solution
tinh sạch DNA 2)
tổng số
Proteinase K (20 mg/ml)
Ethanol 100%
Ethanol 70%

Điện di

Agarose
TAE
Bromophenol blue 0,25%
Ethidium bromide 0,1 µg/ ml

PCR

Taq 2X Master Mix
Primer
H2O

4

SNP
Genotyping

ABI PRISMSNaPshotTM Multiplex Kit gồm:
SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix
SNaPshot Multiplex Control Primer Mix

SNaPshot Multiplex Control template

5

Tinh sạch DNA Shrimp Alkaline phosphatase (SAP)

2

3


12

2.1.4. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Sử dụng trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm thuộc phòng thí nghiệm của Viện
Nghiên cứu hệ Gen gồm máy ly tâm Eppendorf 5415C (Biofuge, Sorvall), máy
PCR veriti 96 well Thermal Cycler (ABI, Mỹ), tủ lạnh nhiệt độ 40C, -200C (Sanyo,
Nhật bản)…
2.2. Phương pháp
Toàn bộ quá trình thực hiện thí nghiệm được minh họa theo sơ đồ sau:

Hình 1: Sơ đồ tổng quát các bước tiến hành thí nghiệm

2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
48 mẫu vây cá tra sinh trưởng nhanh và 48 mẫu sinh trưởng chậm được tách
chiết DNA tổng số dựa theo phương pháp của Sambrook và Russell có sửa đổi.
Các bước thực hiện:
- Lấy mẫu mô vây cá tra ra, rửa sạch cồn bằng H2O 1X khử trùng, thấm khô
trên giấy thấm, cắt nhỏ mẫu trên đĩa peptri sạch.
- Cho 1000 µl solution 1 vào ống Eppendorf có chứa mẫu.

13

- Bổ sung thêm vào 5 µl proteinase K (20 mg/ml), lắc đều và để mẫu trong bể
ổn nhiệt ở 55oC cho đến khi mẫu tan hoàn toàn. Chú ý: trong quá trình ủ lắc mẫu 2
– 3 lần
- Thêm vào mỗi ống 240 µl solution 2 (amonium axetat), sau đó để lạnh ở 4oC
trong 60 phút (để kết tủa protein).
- Lấy mẫu đem ly tâm 15 phút/ 14000 rpm/ 4oC. Hút dịch pha trên sang ống
mới, loại bỏ cặn protein
- Bổ sung một thể tích phenol – chloroform. Vortex và ly tâm 15 phút/ 14000
rpm/ 4oC. Hút dịch pha trên
- Lặp lại bước 6.
- Chiết lại dung dịch một lần nữa với chloroform. Vortex và ly tâm 15 phút/
14000 rpm/4oC. Hút dịch pha trên.
- Bổ sung 1/10 thể tích muối sodium acetate 3M và 2,5 thể tích ethanol 100%.
Ủ -20oC qua đêm hoặc ở -70oC trong 3h.
- Ly tâm 15 phút/ 14000 rpm/4oC. Loại bỏ dịch và thu tủa DNA
- Rửa tủa thu được bằng 500 µl ethanol 70% (2 lần).
- Để khô tủa DNA, sau đó hòa tan trong H2O tinh khiết (thể tích tùy lượng tủa
DNA thu được) và bảo quản ở - 20oC
- Kiểm tra chất lượng và nồng độ mẫu DNA bằng máy Nanodrop (kiểm tra
nồng độ và độ tinh sạch). Chạy điện di trên gel 0,8% trong đệm TAE/ 30 phút/ 110
V (kiểm tra chất lượng, mức độ đứt gãy DNA hoặc DNA có bị lẫn RNA).
2.2.2. Khuếch đại các vùng trình tự bằng phương pháp PCR
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để khuếch đại các vùng trình tự chứa SNP
marker với 90 cặp mồi đã thiết kế, sử dụng DNA tách chiết từ 96 cá thể, nhiệt độ
Tm tương ứng với từng cặp mồi được hiệu chỉnh dựa trên Tm tham khảo của nhà
sản xuất (IDT, Singapore). Nồng độ DNA template dùng cho phản ứng vào khoảng

100 – 120 ng/µL.
Thành phần phản ứng cho mỗi phản ứng, đơn vị µL
Dung dịch đệm PCR 10X
2,5
dNTPs 10 mM
0,5
Dream taq polymerase (U/µl)
0,2


14

Mồi F (10 µM)
Mồi R (10 µM)
DNA (100 ng/µl)
H2O

1
1
1
18,8
25 (µL)

Chu trình nhiệt được thiết lập trên máy Eppendorf MasterCycler ProS
(Chu trình chạy có thể thay đổi phụ thuộc kích thước sản phẩm và nhiệt độ gắn
mồi)

Hình 2: Sơ đồ minh họa chu trình nhiệt



Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% - 1,5% (tùy thuộc
kích thước sản phẩm PCR) khoảng 30-35 phút, điện thế 100V. Gel sau khi điện di
được nhuộm 2 - 5 phút trong dung dịch ethydium bromide loãng, soi UV và chụp
ảnh trên máy chụp ảnh gel dùng phần mềm VisionWorks® LS Analysis.
2.2.3. Xác định SNP bằng phương pháp Single Base Extension (SNapShot
Multiplex Kit).
Phương pháp Single Base Extension (SBE) còn được biết đến như
minisequencing [46], cho phép phát hiện đồng thời đến hơn 30 điểm SNP nằm rải
rác trong bộ gen của cơ thể [37]. Ưu điểm của phương pháp này là khả năng phát
hiện tetra – allelic SNPs, nhanh nhạy, có tính đặc hiệu và khả năng giải trình tự
động. SBE đã được áp dụng trong một vài ứng dụng khác như phân tích tế bào đơn


15

dòng cho chẩn đoán di truyền trước khi cấy ghép, chẩn đoán phân tử trước và sau
sinh [21], phân tích và giám định DNA ti thể trên mẫu đã bị phân hủy [34], và sàng
lọc SNP hiệu năng cao trong nghiên cứu quần thể [51]. Trong nghiên cứu này của
chúng tôi, với mục đích muốn kiểm nghiệm lại các SNP marker tiềm năng liên
quan đến tính trạng tăng trưởng của cá tra nuôi P. hypophthalmus đã được dự đoán
và lựa chọn dựa trên dữ liệu transcriptome đã được phân tích bằng các phương
pháp tin sinh học trước đó, chúng tôi sử dụng bộ kit thương mại SNapShot
Multiplex Kit của hãng Applied Biosystems, Mỹ. Bộ kit ứng dụng phương pháp
SBE và phát hiện sản phẩm đã được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang nhờ
điện di mao quản (capillary electrophoresis). Một primer không đánh dấu được
thiết kế để bắt cặp với trình tự chứa điểm SNP theo chiều 5’- 3’ với đầu 3’ nằm
ngay sát vị trí SNP và được kéo dài một dideoxynucleotide (ddNTP) đã được đánh
dấu huỳnh quang. Bộ kit SnapShot gồm dung dịch đệm phản ứng, Taq polymerase
và các ddNTP có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang. Mỗi một ddNTP được gắn với
một loại thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau (ddATP phát tín ra tín hiệu màu

xanh lá, ddTTP phát tín hiệu màu đỏ, ddGTP phát tín hiệu màu da trời và ddCTP
phát tín hiệu màu đen). Trong suốt quá trình gia nhiệt, mồi SBE sẽ gắn với các sản
phẩm PCR (amplicon) và ddNTP thích hợp sẽ được gắn vào vị trí SNP tương ứng
(Hình 3). Tiếp theo, mẫu sẽ được tinh sạch để loại bỏ ddNTP dư thừa gây ảnh
hưởng đến việc phân tích dữ liệu khi cho vào máy điện di mao quản. Với mục đích
xác định được nhiều điểm SNP trên cùng một phản ứng (multiplex), chúng tôi có
gắn thêm vào đầu phía 5’ của mồi SBE một đoạn trình tự có chiều dài khác nhau,
sao cho mỗi mồi SBE có kích thước cách nhau 5 đến 7 nucleotided. Đó có thể là
một đoạn trình tự poly-T, poly-C hoặc poly-AGCT. Mỗi mồi SBE sẽ có tổng chiều
dài từ 25 đến 75 nucleotide. Sản phẩm của phản ứng sau đó sẽ được phân tách bằng
điện di trên hệ thống máy giải trình tự mao quản tự động [41].


16

Hình 3: Hình ảnh minh họa quá trình thực hiện thí nghiệm SBE sử dụng SNapShot [38]

2.2.4. Thiết kế mồi SBE (Single Base Extension)
Quy trình xử lý thiết kế mồi SBE được biểu diễn qua sơ đồ hình dưới đây: