Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn methylobacterium sp từ lá dương xỉ (marattiaceae)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM
SP. TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE)

Đà Nẵng – Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM
SP. TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE)

Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn : TS. PHẠM THỊ MỸ

Đà Nẵng – Năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Đà Nẵng, tháng 4 năm 2018
Tác giả luận văn

ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS. Phạm Thị Mỹ người đã trực tiếp
truyền đạt kinh nghiệm quý báu và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa
luận.
Xin cảm ơn thầy ThS. Vũ Đức Hoàng đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Sinh - Môi trường - Đại học Sư Phạm
- Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong 4 năm
học.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ động
viên em trong suốt thời gian làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Mỹ Triều


MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1

1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài............................................................................................2
3. Ý nghĩa của đề tài.......................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP. .....................3
1.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại VK Methylobacterium sp. ..............3
1.1.2. Đặc điểm phân bố ............................................................................4
1.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí................................................4
1.1.4. Phương pháp phân lập và định danh................................................6
1.1.5. Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium ...............................6
1.1.6. Một số ứng dụng của chi Methylobacterium ...................................7
1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP.
TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI ...........................................................10
1.2.1. Một số nghiên cứu trên thế giới .....................................................10
1.2.2. Một số nghiên cứu trong nước .......................................................12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.......................................................................................................................... 15
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU......................................15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................15
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................15
2.1.3. Nội dung nghiên cứu .....................................................................15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................16
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ..................................................................16
2.2.2. Phương pháp thu mẫu ....................................................................17
2.2.3. Phương pháp phân lập ...................................................................17
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào và các test sinh
hóa của các chủng VK được tuyển chọn .................................................18
2.2.5. Phương pháp định danh các chủng VK bằng kỹ thuật sinh học phân
tử ..............................................................................................................20
2.2.6. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh

trưởng của các chủng VK tuyển chọn được ............................................22


2.2.7. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng VK
tuyển chọn được.......................................................................................23
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..................................................... 25
3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ MẪU LÁ DƯƠNG XỈ ..........................25
3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO VÀ CÁC TEST
SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VK ĐƯỢC TUYỂN CHỌN .......................27
3.3. ĐỊNH DANH 2 CHỦNG VK T6, T12 BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ .........................................................................................................32
3.3.1. Tách chiết và khuếch đại gen ........................................................32
3.3.2. Giải trình tự đoạn gen 16S – rRNA và định danh loài ..................33
3.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VK T6 VÀ T12.........................................36
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ methanol.....................................36
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ..............................................37
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ......................................................38
3.5. NGHIÊN CỨU ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VK
T6 VÀ T12 .......................................................................................................38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 40
1. KẾT LUẬN ..............................................................................................40
2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 41


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CTAB

Cetyltrimethyl-ammonium bromide

CMS:

Môi trường MS bổ sung Caseine Hydrolase

CFU:

Colony Forming Unit

IAA:

Indole-3-acetic acid

MMS:

Methanol minerat salts

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PHB:

Poly-β-hydroxybutyrate

PPFM:

Pinkpigmented facultatively methylotrophic

PTN

Phòng thí nghiệm

VK:

Vi khuẩn

UV:

Ultraviolet

VSV:

Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Kí hiệu bảng
1.1

Tên bảng

Trang

Danh mục các loài Methylobacterium sp. đã được

đặt tên (Lựa chọn dựa trên công bố của các tạp chí

7

trong ngân hàng NCBI)
2.1

Trình tự cặp mồi được sử dụng để khuếch đại vùng
gen 16S rRNA

3.1

Hình thái khuẩn lạc 32 chủng VK phân lập được

3.2

Tổng hợp các đặc tính sinh hóa của 2 chủng VK
(T6, T12)

22
25,26
31


DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Số hiệu

Tên hình ảnh

Trang

2.1

Lá dương xỉ

15

2.2

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

16

2.3

Phương pháp test Gram (–)/(+) nhanh với KOH

18

2.4

Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại PCR

22

3.1

Hình thái khuẩn lạc của 34 chủng VK phân lập được từ mẫu
lá dương xỉ

25

3.2

Hình thái khuẩn lạc của các chủng VK có sắc tố hồng

27

3.3

Tế bào dưới kính hiển vi của 15 chủng VK (T1, T2, T4, T5,
T6, T7, T8, T10, T12, T13, T16, T18, T25, T27, T31)

29

3.4

Thử nghiệm catalase 2 chủng VK T6, T12

30

3.5

Test Urease của 2 chủng VK T6, T12

31

3.6

Sinh khối của 2 chủng VK T6, T12

32

3.7

Sản phẩm PCR 2 chủng VK T6, T12

33

3.8

Tìm kiếm trình tự tương đồng chủng VK T6

34

3.9

Tìm kiếm trình tự tương đồng chủng VK T12

35

Ảnh hưởng của nồng độ methanol lên sự sinh trưởng
3.10
3.11
3.12
3.13

của 2 chủng VK T6 và T12
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của 2 chủng VK
T6 và T12

Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của 2 chủng VK T6 và
T12
Đường cong sinh trưởng của 2 chủng VK T6 và T12 sau
120h nuôi cấy

36
37
38
39


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh
dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM). Chúng cư
ngụ chủ yếu ở vùng lá, nhưng đôi khi vẫn tìm thấy ở trong đất và trong nước. Chúng
sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu đồng thời sinh tổng hợp các
chất điều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, salicylic acid), vitamine (B12)
và các enzyme (urease, ACC deaminase) để tác động ngược trở lại đối với thực vật,
là nhóm VK có ích nên chúng đã được sử dụng để tăng năng suất lúa [35], kích thích
sự sinh trưởng của mía, bông vải hay gia tăng tính kháng bệnh ở đậu phộng [9], [23],
[36].
Bên cạnh đó, Methylobacterium sp. có khả năng sử dụng đa dạng các hợp chất
hữu cơ khác nhau, từ các chất không độc cho tới các chất độc đối với sinh vật hay các
chất gây ô nhiễm môi trường (methyl bromine, methyl chloride, methane,
trinitrotoluent, Hg, Ni, Cd...) do vậy chúng có nhiều tiềm năng để ứng dụng trong xử
lý ô nhiễm môi trường [46]. M. radiotolerans, M. extorquens, M. fujisawaense còn
có khả năng kháng mạnh với các chất phóng xạ, chúng vẫn tồn tại ở liều chiếu xạ

20kGy. Vì thế, nhóm VK này được sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị cho khả năng vô
trùng của các vật dụng dùng trong ngành công nghiệp thực phẩm, y tế được xử lý vô
trùng bằng công nghệ chiếu xạ [45].
Do sử dụng các hợp chất một carbon làm nguồn năng lượng nên VK
Methylobacterium sp. đang là một VK kiểu mẫu đầy tiềm năng trong việc sử dụng
nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị chẳng hạn như: βcarotene, vitamine B12, Q10, các amino acid…[23], [46]. Ngày nay, nhiều công trình
tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế các hệ thống vector tái tổ hợp nhằm biểu hiện
các protein ngoại lai trong tế bào vi khuẩn Methylobacterium sp., trong đó hai công
trình nổi bật trong hướng nghiên cứu này là biểu hiện bacteriocin và tinh thể độc tố
diệt sâu [23].
Đặc biệt, một hướng tiếp cận mới hiện nay đang được nhiều nhà khoa học trên
thế giới quan tâm đó là hướng sử dụng protein đơn bào từ vi sinh vật làm nguồn


2

protein thay thế trong thức ăn nuôi trồng thủy sản. Trong một nghiên cứu mới nhất
vào đầu năm 2017 tại một công ty công nghệ sinh học có trụ sở tại Massachusetts
KnipBio, Tổ chức New England Aquarium, Đại học Massachusetts, Đại học Roger
Williams và Cơ quan Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông nghiệp Mỹ USDA đã
chỉ ra rằng chế độ ăn có chứa từ 30% đến 100% VK dạng viên Methylobacterium
extorquens đóng vai trò như một chất thay thế protein nông nghiệp có chất lượng cao
trong thức ăn cho thủy sản (tôm, cá) [22].
Từ những nghiên cứu trên đây nhận thấy rằng VK Methylobacterium sp. đã và
sẽ trở thành vi khuẩn đầy tiềm năng trong việc tạo ra các sản phẩm có giá trị cao,
phục vụ nông nghiệp và đời sống.
Xuất phát từ những lí luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng VK Methylobacterium sp. từ
lá dương xỉ (Marattiaceae)”.

2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu là phân lập và tuyển chọn được các chủng
vi khuẩn Methylobacterium sp. từ lá dương xỉ. Từ đó tạo dữ liệu khoa học về các
chủng phập lập được, ứng dụng vào thực tiễn tại địa phương.

3. Ý nghĩa của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
Phân lập và lưu giữ được một số chủng VK Methylobacterium sp. Đây là nguồn
gen cung cấp cho các hướng nghiên cứu chuyên sâu hơn về sinh lý, sinh hóa, di
truyền...
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Các chủng VK phân lập được sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu các đặc tính và
ứng dụng sản xuất protein đơn bào, nhựa sinh học tự phân hủy PHB, các chất điều
hòa sinh trưởng thực vật…


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP.
1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại VK Methylobacterium sp.
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh
dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM). Chúng có
khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon như fomate,
formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn
cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng [23].
Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau: Giới:
Bacteria, ngành: Proteobacterium, lớp: Alphaproteobacteria, bộ: Rhizobiales, họ:
Methylobacteriaceae.
Mặc dù, VK Methylobacterium sp. hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các

sinh vật nhưng trong một thời gian dài nhóm vi khuẩn này không được nghiên cứu
nhiều. Những năm 1960-1970 khi các nghiên cứu tập trung vào con đường đồng hóa
các hợp chất một carbon thì nhóm vi khuẩn dinh dưỡng methyl được phân lập, nghiên
cứu, trong đó tập trung vào các phương thức biến dưỡng năng lượng và những ứng
dụng. Trong đó, loài Methylobacterium sp. được Bassalik phân lập lần đầu tiên vào
năm 1913 từ giun đất và được đặt tên lúc đầu là Bacillus extorquens [20], [23].
Trong giai đoạn trước năm 1960, một số loài VK thuộc chi Methylobacterium
đã được phân lập nhưng do không có đầy đủ thông tin nên các loài này được phân
loại vào các chi VK khác nhau chẳng hạn như: Pseudomonas, Flavobacterium,
Protaminobacter, Arthrobacter, Corynebacterium, Vibrio… [20], [23], [36].
Năm 1976, Patt và cộng sự phân lập được loài Methylobacterium sp. đầu tiên
có khả năng sử dụng methane. Loài này sắp xếp vào một chi mới là Methylobacterium
với tên loài là Methylobacterium organophilum (loài chuẩn cho Chi) [41]. Năm 1982,
Green và Bousfield nhận thấy chủng M. organophilum có nhiều đặc điểm rất giống
với các loài VK Methylobacterium sp. đã được công bố trước đây (không có khả năng
sử dụng methane) và căn cứ trên sự tương đồng trên 70% của 140 đặc điểm sinh lý,
sinh hóa và hình thái của 149 chủng với loài M. organophilum, Green và Bousfield


4

đã đề nghị sắp xếp các loài VK Methylobacterium sp. vào chi Methylobacterium [20],
[23].
Từ năm 1992 đến nay, dựa sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử,
hơn 50 loài Methylobacterium sp. mới được công bố trên hệ thống NCBI [21], [25],
[26], [51].

1.1.2 Đặc điểm phân bố
VK Methylobacterium sp. phân bố rộng trong tự nhiên, hiện diện ở nhiều môi
trường khác nhau: môi trường đất, nước, không khí, băng ở hai cực, sần rễ thực vật

và tập trung chủ yếu ở vùng lá thực vật [21], [23].
VK Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi
khuẩn này có thể được phân lập môi trường nước sạch nào có chứa oxy hòa tan. Ngoài
ra, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện
diện trong nước sạch dùng để sinh hoạt [24], [27].
VK Methylobacterium sp. được phân lập trên bề mặt lá, thân, rễ của thực vật
nhưng mật độ ở mỗi cơ quan thì khác nhau [29]. Chúng có mặt chủ yếu trên vùng lá
của hơn 100 loài thực vật và có mối quan hệ mật thiết với thực vật [18], [38], [40].
Thông qua phương pháp sử dụng carbon phóng xạ (C14) Green đã làm sáng tỏ khả
năng sử dụng các hợp chất methanol từ thực vật của VK Methylobacterium sp., điều
này giải thích nguyên nhân sự hiện diện của chi VK Methylobacterium sp. trên thực
vật [23], [28], [39].
VK Methylobacterium sp. thường lan truyền qua không khí, có khả năng sử
dụng các hợp chất có tính độc với sinh vật làm nguồn cung cấp carbon và nitơ:
tetrachloromethane, trimethylamine. Chính vì vậy, các VK Methylobacterium sp. còn
đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon trong tự nhiên [23], [48], ứng dụng
trong xử lý ô nhiễm môi trường [49]. Tuy nhiên, vai trò của chúng trong hệ sinh thái
vẫn chưa được sáng tỏ [38].

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí
Hầu hết các loài Methylobacterium sp. thường có hình que kích thước 0,8 - 1 x
1- 8µm và là VK gram âm, thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa
hồng (rosettes) [22], [23]. Hầu hết các chủng Methylobacterium sp. đều có khả năng


5

di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực và chúng cho phản ứng dương tính với
catalase [23]. Chúng thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng hay đỏ cam, một
vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar. Sắc tố hồng của VK

Methylobacterium sp. không tan trong nước và là hợp chất carotenoid, không phát
ánh sáng huỳnh quang, hấp thu bước sóng cực đại ở 473, 499 và 532nm [21]. Ở môi
trường lỏng nuôi cấy tĩnh VK Methylobacterium tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt,
điều này cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc [23].
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium
dao động từ 250C đến 300C. Một vài loài vẫn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 370C hay
510C. Mặc dù đa số các loài đều tăng trưởng ở khoảng pH trung tính nhưng cũng có
một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH cực đoan (pH=4; pH=10). Tất
cả các loài đều không đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng và không có khả năng phân giải
các hợp chất như: casein, tinh bột, gelatin, cellulose, lecithin và DNA. Khả năng phân
giải các hợp chất lipid chỉ có ở một số loài. Tất cả các loài đều không tạo ra các
enzyme: β-galactosidase, L-ornithine decarboxylase, L-lysine decarboxylase, Larginine dihydrolase (ngoại trừ Urease lại hiện diện ở tất cả các loài) [21], [23], [24].
VK Methylobacterium sp. có tính kháng cao với chất khử, nhiệt độ lạnh, Cl-, tia
UV phóng xạ ion, nhiệt độ cao. Phần lớn các loài trong Methylobacterium sp. đều
nhạy cảm với kháng sinh như: kanamycine, albamycine T, streptomycine, framycine
và tetracyline. Trong đó, tetracyline có ức chế mạnh đối với VK Methylobacterium
sp [23].
Phương thức chuyển hóa các hợp chất một cacbon ở tất cả các loài VK
Methylobacterium sp. đều theo chu trình serine. Trong đó có sự gắn kết giữa chu trình
serine và chu trình tricarboxylic (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho
VK sử dụng. Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình PHB để tạo ra các
sản phẩm dự trữ cho VK (poly-β-hydroxybutyrate). Một số chủng có khả năng tổng
hợp hormone thực vật (phytohormone) trong môi trường nuôi cấy, một số loài có khả
năng tổng hợp vitamine B12 và một số khác [39].
Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ cung cấp cung cấp nguồn cacbon và
năng lượng của chủng VK Methylobacterium sp. thuộc chi Methylobacterium sp. rất


6

đặc trưng. Hầu hết các chủng có khả năng sử dụng betaine, trimethylanine,
serbactae,... Trong khi một số loài khác có khả năng sử dụng cyanate, thiocianate,
formaldehyde, TNT (2,4,6-trinitrotoluene), HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro1,3,5,7-tetrazicine hay high-melting-point explosive), RDX (hexahydro-trinitro1,3,5-triazine hay royal explosive),... Do vậy, có thể phân biệt các loài VK
Methylobacterium sp. nhờ căn cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của các
chủng này [21], [23], [24].

1.1.4 Phương pháp phân lập và định danh
Methylobacterium sp. là những vi khuẩn có khả năng sử dụng methanol làm
nguồn cung cấp carbon và năng lượng, vì thế môi trường methanol mineral salts
(MMS) là môi trường thích hợp để phân lập vi khuẩn Methylobacterium sp. Ngoài
ra, VK Methylobacterium sp. có sắc tố hồng đặc trưng nên rất dễ nhận diện trên môi
trường phân lập [23].
Khoảng nhiệt độ thường được sử dụng để phân lập Methylobacterium sp. là 25300C. Vi khuẩn có tốc độ tăng trưởng tương đối chậm, trên môi trường MMS sau 2
đến 3 ngày mới hình thành khuẩn lạc, khuẩn lạc đạt đường kính tối đa 1-3 mm sau 7
ngày nuôi cấy. Đôi khi vi khuẩn mọc nhanh, có màu đậm hơn trên môi trường
Glycerol-Peptone Agar và môi trường này thường được sử dụng trong giữ giống các
chủng VK Methylobacterium sp. [23].
Ngoài việc sử dụng methanol làm tác nhân chọn lọc thì việc sử dụng
cycloheximide cũng giúp cho quá trình phân lập được thuận lợi hơn. Khi sử dụng môi
trường MMS làm môi trường phân lập thì những khuẩn lạc màu hồng có đường kính
khoảng 1 mm thường là vi khuẩn Methylobacterium sp., trong môi trường này nhóm
nấm men hay nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng không phải là phổ biến [23], [36].

1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium
Theo thống kê của ngân hàng dữ liệu NCBI [51] thì đã có tổng cộng 52 loài tính
đến tháng 4. 2018 (bảng 1.1).


7

Bảng 1.1 Danh mục các loài Methylobacterium sp. đã được đặt tên.

1

M. adhaesivum

19

M. hispanicum

37

M. pseudosasae

2

M. aerolatum

20

M. indicum

38

M. pseudosasicola

3

M. aminovorans

21

M. iners

39

M. radiotolerans

4

M. aquaticum

22

M. isbiliense

40

M. rhodesianum

5

M. brachiatum

23

M. jeotgali

41

M. rhodinum

6

M. brachythecii

24

M. komagatae

42

M. salsuginis

7

M. bullatum

25

M. longum

43

M. soli

8

M. cerastii

26

M. marchantiae

44

M. specialis

9

M. dankookense

27

M. mesophilicum

45

M. suomiense

10 M. endosymbiont

28

M. nodulans

46

M. tardum

11 M. extorquens

29

M. organophilum

47

M. tarhaniae

12 M. frigidaeris

30

M. oryzae

48

M. thiocyanatum

13 M. fujisawaense

31

M. oxalidis

49

M. thuringiense

14 M. gnaphalii

32

M. persicinum

50

M. trifolii

15 M. goesingense

33

M. phyllosphaerae

51

M. variabile

16 M. gossipiicola

34

M. phyllostachyos

52

M. zatmanii

17 M. gregans

35

M. platani

18 M. haplocladii

36

M. populi

TÊN LOÀI

STT

TÊN LOÀI

STT

STT

(Lựa chọn dựa trên công bố của các tạp chí trong ngân hàng NCBI [51])
TÊN LOÀI

1.1.6 Một số ứng dụng của chi Methylobacterium
a.Tác động lên thực vật
Khả năng tương tác với thực vật cùng với việc hấp thu các chất tiết ra từ thực
vật thì VK Methylobacterium sp. có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi
cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chủng Methylobacterium được

Basile và cộng sự (1969) phát triển kích thích sinh trưởng ở cây rêu (Scapania
nemorosa) trong điều kiện in vitro. Trong những nghiên cứu ban đầu, họ mô tả VK
này có thể kích thích sự tăng trưởng và tái sinh của rêu nuôi cấy mô. Sau đó, họ chỉ


8

ra rằng VK Methylobacterium sp. sản xuất vitamine B12 (cyanocobalamine) và sự bổ
sung vitamine này khi trồng rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata có
thể kích thích sự tăng trưởng và phát triển của cây. VK Methylobacterium sp. có tác
động đối với một số lượng lớn các loài cây trồng có giá trị như: thuốc lá, bông, dâu
tây, lúa, bông vải, mía, cà chua, hướng dương, đậu phụng [9], [35], [36]. Tuy nhiên,
hiệu quả cho từng loại cây trồng không phải do một loài mà là do sự tác động tổng
hợp của nhiều loài VK Methylobacterium sp. tạo ra [23].
Ngoài khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của một số loài cây trồng,
VK Methylobacterium sp. còn có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên
thực vật chẳng hạn như: Xanthomonas camprestris, Pseudomonas syringae, Erwinia
carotovora, Clavibacter michiganense và Agrobacterium tumefaciens, Fusarium
solani (gây bệnh trên cây tiêu), Guignardia citricarpa hay Xylella fastidiosa (gây
bệnh nghiêm trọng trên các loài cây có múi). Madhaiyan ghi nhận khả năng kháng
bệnh ở cây lúa và cây đậu phộng có liên quan tới sự thay đổi hệ enzyme polyphenol
trong cây [35]. Penalvera và Poonguzhali ghi nhận khả năng sinh tổng hợp các phân
tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone, điều này giúp VK Methylobacterium sp. cạnh
tranh với các loài VK gây bệnh khác trong quá trình cư trú trên thực vật [42]. Các
nghiên cứu này ghi nhận khả năng giúp cây trồng kháng lại với các tác nhân gây bệnh
nhưng chưa làm sáng tỏ các cơ chế. Tuy nhiên, những ghi nhận này cũng cho thấy
tiềm năng sử dụng VK Methylobacterium sp. để kiểm soát dịch bệnh trên thực vật
[18], [40].
b. Sản xuất nhựa sinh học PHB
PHB (Poly-β-hydroxybutyrate) là một loại nhựa polymer chịu nhiệt, là nguồn

carbon dự trữ ở vi sinh vật. Do vậy, quá trình sinh tổng hợp hay phân giải hợp chất
PHB sẽ do các enzyme có trong sinh vật đảm nhiệm. Do đó, PHB được coi như là
một loại nhựa sạch, không gây ô nhiễm môi trường, được áp dụng trong lĩnh vực y
dược, nông nghiệp hay công nghiệp thực phẩm. PHB được điều chế thành các sản
phẩm có giá trị cao như chỉ khâu dùng trong phẫu thuật, vật liệu gắn kết xương bị
gãy, nhựa chịu nhiệt…[37]


9

Đa số các loài VK trong chi Methylobacterium đều có khả năng sinh tổng hợp
PHB nhưng lượng PHB tạo ra ở mỗi loài Methylobacterium sp. khác nhau và phụ
thuộc vào môi trường nuôi cấy. Ở Methylobacterium extorquens AM1 trên môi trường
có nguồn carbon là succinate thì lượng PHB tạo thành chiếm 15-20% trọng lượng
sinh khối khô, trong môi trường có methanol lượng PHB tạo ra chiếm tới 80% trọng
lượng khô và Methylobacterium fujisawaense trên môi trường glucose chỉ sinh tổng
hợp được lượng PHB chiếm khoảng 12,4% [37].
Trong tế bào VK, PHB được dự trữ trong túi bên trong tế bào. PHB bắt màu đặc
hiệu với thuốc nhuộm Nile blue, phát ánh sáng đỏ khi được xem dưới kính hiển vi
huỳnh quang với bước sóng 235nm. Một số loài VK thuộc chi Methylobacterium đã
được sử dụng để tách chiết PHB bao gồm: M. extorquens, M. fujisawaense, M.
organophilum, M. mesophilicum, M. rhodium, M. rhodesianum, M. zatmanii, M.
radiotolerans [17], [31].
c. Xử lý môi trường
VK Methylobacterium sp. có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ khác nhau
gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho chính VK
cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của Van Aken và
cộng tác viên (2004), chứng minh rằng VK Methylobacterium sp. cộng sinh được
phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng
VK thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất

25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO2 [45],
[46]. Methylobacterium sp. đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái do chúng có
khả năng sử dụng methan một loại khí gây hiệu ứng nhà kính. Ngoài ra, VK
Mehtylobacterium sp. cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm
khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, dichloromethane,
methul tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa ethylated sulfur,
cyanate và thiocyanate [23], [40].
d. Ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm
Ngoài khả năng sinh tổng hợp PHB, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng
sinh tổng hợp một số hợp chất khác có giá trị kinh tế chẳng hạn như: exopolysaccharid


10

được sử dụng để tạo ra các màng sinh học, methylan được sử dụng để tạo ra các
polysaccharid ion dương nhằm thay thế cholestyramine dùng trong điều trị bệnh cao
huyết áp [47].
Trong lĩnh vực thực phẩm VK Methylobacterium sp. cũng có thể góp phần quan
trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn nguyên liệu
rẻ tiền vừa có thể tạo các sản phẩm có giá trị như protein đơn bào, β-carotene,
vitamine B12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [23], [44].
Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng VK Methylobacterium sp. có nhiều
tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường,
thực phẩm.

1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM
SP. TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
1.2.1 Một số nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới việc nghiên cứu về Methylobacterium sp. khá phong phú và đa
dạng.

Năm 1976, Patt và cộng sự phân lập được loài VK Methylobacterium sp. đầu
tiên có khả năng sử dụng methane. Loài này sắp xếp vào một chi mới là với tên loài
là Methylobacterium organophilum (loài chuẩn cho Chi) [41]. Năm 1982, Green và
Bousfield nhận thấy chủng M. organophilum có nhiều đặc điểm rất giống với các loài
VK Methylobacterium sp. đã được công bố trước đây (không có khả năng sử dụng
methane) và căn cứ trên sự tương đồng trên 70% của 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa
và hình thái của 149 chủng VK Methylobacterium sp. với loài M. organophilum,
Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các loài VK Methylobacterium sp. vào chi
Methylobacterium [20], [23].
VK Methylobacterium tập trung nhiều trên lá của hơn 100 loài thực vật và chúng
có mối quan hệ mật thiết với thực vật. Koenig và cộng sự (2002), nghiên cứu về mối
liên hệ giữa Methylobacterium sp. và thực vật ở mức phân tử [30]. Họ chứng minh
bốn loài Methylobacterium sp. phân lập từ lá và loài M. extorquens đều tạo ra
cytokinin là trans-zeatin ở mức rất thấp và tiết vào môi trường nuôi cấy [41]. Thông
qua phương pháp sử dụng carbon phóng xạ (C14) Green đã làm sáng tỏ khả năng sử


11

dụng các hợp chất methanol từ thực vật của VK Methylobacterium sp., điều này giải
thích nguyên nhân sự hiện diện của VK Methylobacterium sp. trên thực vật… [21],
[22], [23], [24].
Một số công trình nghiên cứu chứng minh tác dụng của VK Methylobacterium
sp. trên thực vật có khả năng tăng năng suất cây trồng. Nghiên cứu của Maliti (2000)
chỉ ra một số chủng Methylobacterium sp. có khả năng gia tăng callus từ phôi hạt lúa,
trong khi một số khác có tác dụng kích thích sinh trưởng và phát triển trên thân, lá,
rễ lúa [36]. Trong nghiên cứu của Madhaiyan (2005), đã chỉ ra tất cả chủng VK
Methylobacterium sp. có khả năng kích thích nảy mầm hạt lúa, kích thích sinh trưởng
và tăng khả năng kháng bệnh, góp phần tăng năng suất trên cây lúa [34], [35]. Một
số công trình nghiên cứu khác cũng chứng minh được Methylobacterium sp. góp phần

tăng năng suất trên cây mía, bông, đậu phộng [23].
Sự tổng hợp một số hợp chất thứ cấp của Methylobacterium sp. cũng được ghi
nhận. Năm 2001, trong nghiên cứu của Ivanova chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria là
M. mesophilicum, A. aminovorans, M. mays, P. Kondratievae có thể tạo IAA. Năm
2002, Koenig và cộng sự kiểm tra được lượng cytokynin được tổng hợp bởi PPFM
[41]. Năm 2004, nghiên cứu của Omer và cộng sự chứng minh rằng Methylobacteria
hiếu khí có thể tổng hợp auxin (chủ yếu là IAA) từ L- tryptophan ngoại bào [39],
[40].
Bên cạnh khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng sinh trưởng
của thực vật, Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB.
Trong nghiên cứu của Ackermann và cộng sự (1994), chứng minh rằng PHB được
tích lũy trong tế bào ở điều kiện bị giới hạn dinh dưỡng. Tùy thuộc vào yếu tố giới
hạn (nitrogen hoặc phosphate) mà tổng tích lũy PHB biến thiên trong khoảng 2%
trọng lượng thô của sinh khối [35], [37].
Ngoài ra, VK Methylobacterium sp. được Van Aken (2004) đánh giá là có tiềm
năng ứng dụng trong xử lí ô nhiễm môi trường bởi chúng có khả năng phân giải các
hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác như methyl chloride, methyl bromide, methyl
iodide, methyl tert-butyl ether, dichloromethane, những hợp chất chứa ethylated
sunfur, cyanate, thiocyanate [45], [46].


12

Vì sử dụng các hợp chất một carbon làm nguồn năng lượng nên VK
Methylobacterium sp. đang là một VK kiểu mẫu đầy tiềm năng trong việc sử dụng
nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị chẳng hạn như:
protein đơn bào, β-carotene, vitamine B12, Q10, các amino acid…[23], [46]. Ngày
nay, nhiều công trình tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế các hệ thống vector tái
tổ hợp nhằm biểu hiện các protein ngoại lai trong tế bào VK Methylobacterium sp.,
trong đó hai công trình nổi bật trong hướng nghiên cứu này là biểu hiện bacteriocin

và tinh thể độc tố diệt sâu [23].
Đặc biệt, một hướng tiếp cận mới hiện nay đang được nhiều nhà khoa học trên
thế giới quan tâm đó là hướng sử dụng protein đơn bào từ vi sinh vật làm nguồn
protein thay thế trong thức ăn nuôi trồng thủy sản. Trong một nghiên cứu mới nhất
vào đầu năm 2017 tại một công ty công nghệ sinh học có trụ sở tại Massachusetts
KnipBio, Tổ chức New England Aquarium, Đại học Massachusetts, Đại học Roger
Williams và Cơ quan Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông nghiệp Mỹ USDA đã
chỉ ra rằng chế độ ăn có chứa từ 30% đến 100% VK dạng viên Methylobacterium
extorquens đóng vai trò như một chất thay thế protein nông nghiệp có chất lượng cao
trong thức ăn cho thủy sản (tôm, cá) [22].
Từ những nghiên cứu này, VK Methylobacterium sp. sẽ trở thành VK có lợi
trong việc tạo ra các sản phẩm có giá trị cao, phục vụ nông nghiệp và đời sống.

1.2.2 Một số nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam trong những năm gần đây các công trình nghiên cứu chủ yếu tập
trung khảo sát hệ VK Methylobacrium sp. trên thực vật và một số ít công trình nghiên
cứu về thu nhận PHB.
Kiều Phương Nam và cộng sự [8] đã phân lập thành công các chủng M.
radiotorelans H2T, M. oryzae 1021b, M. radiotolerans 1019 từ lá lúa. Trong các
nghiên cứu của mình họ chỉ ra được chủng VK Methylobacterium radiotolerans 1019
có ảnh hưởng tới sự phát sinh cơ quan ở thực vật: gia tăng sự hình thành chồi, rễ ở
cây thuốc lá, cây hoa cúc và cây hồng, ức chế sự tạo mô sẹo ở thuốc lá, sự hình thành
chồi ở cây cà chua và tăng cường sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo của cây cúc.
Hiệu quả và chiều hướng tác động của VK phụ thuộc vào bản chất loại mô và loại


13

thực vật. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chứng minh được 2 chủng VK
Methylobacterium sp. (M. radiotolerans H2T, M. oryzae 1021b) có khả năng sinh

tổng hợp auxin, cytokinin và gibberellin [9].
Trong nghiên cứu về poly-beta-hydroxybutyrate (PHB, nhựa phân hủy sinh
học), Lê Lý Thùy Trâm (2006) chứng minh chủng Methylobacterium sp. (kí hiệu
Mcd) phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây chanh dây tạp nhiễm VK màu hồng,
có thể phát triển trên môi trường khoáng cơ bản với methanol 1% là nguồn C và lượng
PHB tạo ra chiếm 31.37 % tổng lượng sinh khối khô sau 4 ngày nuôi cấy [14].
Năm 2010, Kiều Phương Nam và cộng sự nghiên cứu sâu về sự tích lũy nhựa
phân hủy sinh học PHB, ở chủng VK Methylobacterium radiotolerans H2T được xác
định thông qua quan sát sự phát màu màu cam sáng của tế bào VK đã được nhuộm
với Nile Blue A 1% trên kính hiển vi huỳnh quang và phân tích sản phẩm PHB thu
nhận từ sinh khối VK bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS). Khảo
sát các điều kiện nuôi cấy để gia tăng khả năng tích lũy PHB ở này cho thấy: môi
trường khoáng Med3 có 1% methanol thích hợp hơn môi trường MMS và khoáng K.
Khi bổ sung thêm nguồn carbon (methanol 1,5% ) ở thời điểm 24 giờ sau khi bắt đầu
nuôi cấy đã kích thích sự tích lũy PHB lên tới 50,55% (khối lượng PHB/khối lượng
sinh khối tế bào). Hiệu suất này cao hơn hoặc ngang bằng với hiệu suất tích lũy PHB
ở một số chủng Methylobacterium sp. khác đã được nghiên cứu trong nước cũng như
trên thế giới. Kết quả này cho thấy tiềm năng sản xuất PHB theo con đường sinh học
từ nguồn Carbon rẻ tiền (methanol) đang mở ra một hướng nghiên cứu và ứng dụng
mới đầy triển vọng ở nước ta hiện nay [10].
Ngoài ra các nhà khoa học trên đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng VK
Methylobacterium sp. trong tạo chế phẩm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống cây
trồng. Kết quả cho thấy ở VK Methylobacterium sp. có tính đặc hiệu chủng. Mỗi
chủng tác động mạnh nhất đối với một loại hạt nhất định. Tuy nhiên, vẫn có một vài
chủng có phổ hoạt tính rộng, điển hình là chủng 1021b. Các chủng Methylobacterium
sp. không chỉ làm tăng tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của hạt mà còn tăng kích thước
và chiều cao của cây con [9].


14

Từ những công trình khoa học trên đây cho thấy, các nghiên cứu trong nước về
chủng VK Methylobacterium sp. chủ yếu quan tâm đến khả năng sinh tổng hợp một
số hợp chất kích thích tăng trưởng ở thực vật hoặc các chất nhựa tổng hợp phân lập
chủ yếu ở vùng Đông Nam Bộ mà chưa có công trình nghiên cứu, phân lập VK
Methylobacterium sp. ở miền trung nói chung và Đà Nẵng nói riêng.


15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- 10 mẫu lá dương xỉ thu nhận ở khu vực
huyện Hòa Vang và quận Liên Chiểu,
thành phố Đà Nẵng.
- Các chủng VK có sắc tố hồng phân lập
được từ 10 mẫu lá trên.
Hình 2.1. Lá dương xỉ

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa bao gồm:
+ Xã Hòa Nhơn, xã Hòa Liên, xã Hòa Phong thuộc huyện Hòa Vang, quận Cẩm
Lệ, thành phố Đà Nẵng.
+ Phường Hòa Khánh Nam, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng.
Địa điểm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm:
+ Phòng thí nghiệm (PTN) Vi sinh - sinh lý thực vật - hóa sinh, PTN Công nghệ
sinh học, PTN Sinh học phân tử thuộc khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư
Phạm, Đại học Đà Nẵng.

2.1.3 Nội dung nghiên cứu
Đề tài tập trung vào các nội dung sau:
- Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng VK có sắc tố hồng có khả năng
sinh trưởng trên môi trường MMS có bổ sung 1% methanol.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy và đặc tính lý hóa của các chủng
VK được tuyển chọn.
- Định danh chủng VK tuyển chọn bằng bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và xây dựng đường cong sinh trưởng của
các chủng VK Methylobacterium sp. được định danh.


16

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm nghiên cứu được bố trí theo sơ đồ sau đây:

Mẫu lá dương xỉ
Phân lập
Các chủng vi khuẩn
Làm thuần
Các chủng vi khuẩn
thuần
Khảo sát đặc điểm hình
thái, nuôi cấy, sinh lý
hóa
Tuyển chọn
Chủng VK
Methylobacterium sp.

được tuyển chọn
Định danh bằng kỹ thuật
sinh học phân tử
Các loài VK thuộc chi
Methylobacterium
Nghiên cứu các yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình
sinh trưởng của VK

Xây dựng đường cong
sinh trưởng của loài
VK

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm