Nghiên cứu nhân giống cây chuối đỏ dacca (musa acuminata) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ NGỌC THƯƠNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY
CHUỐI ĐỎ DACCA (MUSA ACUMINATA)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Đà Nẵng – Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ NGỌC THƯƠNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY
CHUỐI ĐỎ DACCA (MUSA ACUMINATA)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Ngành: Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn: TS. Võ Châu Tuấn

Đà Nẵng – Năm 2018


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kì công trình nào khác.
Tác giả

Nguyễn Thị Ngọc Thương


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp này, tôi xin chân
thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh – Môi
trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Châu Tuấn – thầy giáo đã
tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Vũ Đức Hoàng, người
đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc trau dồi kiến thức và kĩ năng thực hành thí
nghiệm. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Sinh - Môi trường
đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài khoá luận của
mình.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn
động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt được kết quả
tốt nhất.
Đà Nẵng, tháng 5 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Thương


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề: ..............................................................................................................1
2. Mục tiêu...................................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...........................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................ 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................ 2
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở THỰC VẬT .......3
1.1.1. Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro ở thực vật ...................................... 3
1.1.2. Cơ sở khoa học ............................................................................................. 3
1.1.3. Các bước nhân giống in vitro ....................................................................... 4
1.1.4. Ưu, nhược điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 6
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro ............................................ 7
1.2. NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC LOÀI CHUỐI BẰNG KỸ THUẬT
NHÂN GIỐNG IN VITRO ........................................................................................ 12
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 12
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước ......................................................................... 14
3.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA .................................................17
3.1.1. Đặc điểm sinh học....................................................................................... 17
3.1.2. Giá trị sử dụng ............................................................................................ 17
3.1.3. Các nghiên cứu trên đối tượng nghiên cứu ................................................. 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................19
2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN .........................................................................19
2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu vật và tái sinh chồi ...................................... 20

2.3.2. Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro .................................................. 20
2.3.3. Phương pháp tạo rễ in vitro – tạo cây hoàn chỉnh ................................... 21
2.3.4. Phương pháp xử lí thống kê ...................................................................... 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 22
3.1. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU VẬT VÀ TÁI SINH CHỒI IN
VITRO .....................................................................................................................22
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐHST ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI
IN VITRO CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA .....................................................................24
3.2.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây chuối đỏ
Dacca ......................................................................................................................... 25
3.2.2. Ảnh hưởng của BA, IBA phối hợp đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
cây chuối đỏ Dacca ................................................................................................... 27
3.2.3. Ảnh hưởng của BA, NAA phối hợp đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
cây chuối đỏ Dacca ................................................................................................... 29
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐHST IBA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH
RỄ IN VITRO CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA ...............................................................32
3.4. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CHUỐI ĐỎ DACCA 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 37
* Kết luận .................................................................................................................37
* Đề nghị ..................................................................................................................37
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 38
*Tiếng Việt ................................................................................................................ 38
*Tiếng Anh................................................................................................................ 39
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: Diclorophenoxyacetic acid

AC

: Active carbon (than hoạt tính)

BA

: 6-benzyl adenine

BAP

: 6-benzylaminopurine

B5

: Gamborg (1968)

Cs

: Cộng sự

CW

: Coconut water (nước dừa)

ĐHST : Điều hòa sinh trưởng
IAA

: Indole 3-acetic acid

IBA

: Indole 3-butyric acid

KIN

: Kinetin

L

: Lít

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: α-naphthalen acetic acid

SH

: Schenk và Hildebrandt (1972)

TDZ

: Thidiazuron

DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu
bảng
3.1.

3.2.

Tên bảng
Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng
cây chuối đỏ Dacca 1 tháng tuổi sau 4 tuần nuôi cấy
Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng
cây chuối đỏ Dacca 3 tháng tuổi sau 8 tuần nuôi cấy

Trang
22

23

Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi in vitro
3.3.

cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy

25

Ảnh
ấ hưởng của BA và IBA kết hợp đến khả năng nhân
3.4.
3.5.

3.6.

chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy
uối ố
uần
ấ
Ảnh hưởng của BA và NAA kết hợp đến khả năng
uối ố
uần
ấ
nhân chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi
cấy hưởng của IBA đến khả năng nhân nhanh rễ in
Ảnh
vitro cây chuối đỏ Dacca sau 20 ngày nuôi cấy sóc
ố ố
ần
ấ

28
29
32


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu
hình

Tên hình

Trang

2.1.

Cây chuối đỏ Dacca ngoài tự nhiên

20

2.2.

Sơ đồ thí nghiệm

23

Chồi chuối đỏ Dacca 1 tháng tuổi sau hiệu quả khử
3.1.

trùng bằng cồn 70o sau 4 tuần nuôi cấy

22

3.2.

Chồi chuối đỏ Dacca 3 tháng tuổi sau hiệu quả khử
uối ố
uần
ấ
o
trùng bằng cồn 70 sau 8 tuần nuôi cấy

23

3.3.

Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy cấy

26

Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh
3.4.

chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy

29

cấy
3.5.
3.6.

Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro cây chuối đỏ Dacca sau 4 tuần nuôi cấy

30

Ảnh hưởng của IBA đến khả năng nhân nhanh rễ in
vitro chuối đỏ Dacca

33

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay chuối là cây ăn quả được trồng phổ biến nhất, hay gặp trong
các vườn gia đình. Chuối cung cấp cho hàng triệu người khắp các vùng nhiệt đới và
cận nhiệt cùng với các thực phẩm chủ yếu và được cho là một loại trái cây xuất
khẩu rộng lớn trên thế giới. Hiện nay chuối được trồng trong 150 quốc gia trên thế
giới trên khu vực 4.84 triệu ha, cung cấp 95.6 triệu tấn [50]. Chuối chiếm xấp xỉ
44% sản lượng trái cây tươi và là cây ăn trái quan trọng thứ hai trên thế giới, ở
Châu Phi chiếm khoảng 35% sản lượng trên thế giới [53]. Ở nước ta, tại khu vực
miền Nam Việt Nam, nơi có điều kiện trồng chuối thuận lợi, sản lượng chuối có thể
đạt 1 triệu tấn mỗi năm, diện tích trên 5 vạn ha trong số 8 vạn ha của cả nước [14].
Mặt khác, các bộ phận của chuối đều có thể sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau
mang lại những lợi ích thiết thực cho con người, đặc biệt có thể làm thuốc chữa các
bệnh khác nhau như nõn chuối có tác dụng cầm máu nhanh [37]. Quả chuối có giá
trị dinh dưỡng khá cao và được chế biến ra nhiều sản phẩm khác nhau như chuối
sấy, mứt chuối, bánh chuối, kem chuối… đa dạng phục vụ cho giá trị dinh dưỡng
cũng như tín ngưỡng của người Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung.
Cây chuối đỏ Dacca có tên khoa học là Musa acuminata ‘Red Dacca’ thuộc
chi Musa được tìm thấy ở Úc và Trung, Nam Mỹ [53], [39] (đề tài nghiên cứu về
giống chuối đỏ Dacca nguồn gốc từ Úc). Chúng nhỏ hơn và có vỏ dày so với các
loại thông thường, thịt chuối có màu trắng kem cho đến màu hồng với hương vị
chuối thường đặc trưng hòa lẫn vị mâm xôi. Đây là món ăn yêu thích của vùng
Trung Mỹ với hơn 6,4 tỉ đô la tiêu thụ mỗi năm. Chuối đỏ cũng rất tốt cho sức khỏe
với hàm lượng 100 calo trên 10gr, đáp ứng 16% chất xơ (4gr), giàu Kali, vitamin
B6 và vitamin C. Ngoài ra chuối đỏ còn có thể giảm nguy cơ mắc bệnh tim, tiểu
đường type 2 [51].
Trong tự nhiên, chuối nói chung được nhân giống theo phương pháp nhân

giống sinh dưỡng, nghĩa là bằng cách dùng cây chuối con vốn phát triển từ các chồi
bên có nguồn gốc từ thân hành với một hay nhiều chồi được sử dụng [32].
Cây chuối được nhân giống theo phương pháp nhân giống sinh dưỡng có mức
nhân giống thấp, thường sinh trưởng kém, phát triển chậm, cây không đồng đều,


2
lâu cho thu hoạch, thu hoạch không tập trung. Phương pháp này thường làm cây
con mắc bệnh virus rất nguy hiểm dẫn đến tình trạng thoái hóa giống cao [54].
Vì vậy, vấn đề làm sao để tạo ra giống chuối đỏ sạch bệnh với năng suất và
chất lượng tốt đang là vấn đề cấp thiết được các nhà khoa học đặt ra.
Hiện nay kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô là phương pháp nhân giống
mới, hiện đại tạo ra số lượng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh mà không có
phương pháp nào có thể thay thế được. Tính đồng nhất của giống chuối nuôi cấy
mô giúp chúng ta có thể điều khiển được thời gian thu hoạch, tăng năng suất và
chất lượng trái [33].
Tại học viện Nông nghiệp Hà Nội đã nhập khẩu giống chuối đỏ Dacca từ Úc
và tiến hành nuôi cấy mô cây giống thành công, tuy nhiên chưa có một quy trình
nhân giống cụ thể được công bố.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
nhân giống cây chuối đỏ Dacca (Musa acuminata) bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro”.
2. Mục tiêu
Xây dựng quy trình nhân giống cây chuối đỏ Dacca bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro với hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp những dẫn liệu khoa học về nhân giống vô tính cây chuối đỏ Dacca
bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu
về kỹ thuật nhân giống cây chuối đỏ Dacca.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu là cơ sở để chủ động sản xuất nhanh, liên tục với chất
lượng cây giống tốt, giá thành rẻ, đáp ứng nhu cầu cây giống cũng như sản xuất
thương phẩm chuối đỏ Dacca trên quy mô lớn.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở THỰC VẬT
1.1.1. Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro ở thực vật
Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy khử
trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô
dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng),
sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản
các nguồn gen quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ
sinh học [7].
Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân
giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật
nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của
thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện khử trùng trong các ống nghiệm
hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác [7].
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân
giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống
thực vật trong điều kiện khử trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (in
vitro culture) [19].
Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực
vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy khử trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong
quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân
giống khác là cutting (cành giâm), layer (cành chiết), scion (cành ghép) hoặc seed

(hạt) [19].
1.1.2. Cơ sở khoa học
1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Haberlant (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào. Theo ông mỗi một tế bào
bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tang để phát triển thành
một cá thể hoàn chỉnh [11]. Như vậy, mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều
chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật và nếu gặp điều kiện
thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh [11].
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) được thực hiện dựa trên tính toàn năng của tế


4
bào, được thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào riêng biệt, trong môi trường thích
hợp thì có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh, đặc trưng cho loài và có thể
phát triển bình thường. Do trong nhân tế bào có chứa bộ DNA hoàn chỉnh chứa toàn
bộ thông tin di truyền cho một chu kì sống hoàn chỉnh.
1.1.2.2. Tính phân hóa và phân phân hóa của tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào in vitro là kết quả của
quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào [11]. Trong đó: Tính phân hóa của tế
bào là sự biển đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa
đảm nhận các chức năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô
khác nhau đảm nhận các chức năng khác nhau (mô giậu, mô dẫn, mô bì, mô
khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn
phân hóa để hình thành các mô riêng biệt [11].
Tính phản phân hóa của tế bào: tế bào khi đã được phân hóa thành các mô có
chức năng riêng biệt, nhưng trong những điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay
lại trạng thái phôi sinh và phân chia tế bào mạnh mẽ [11]. Trên thực tế đã chứng
minh khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách

nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây
[11]. Trong kĩ thuật nuôi cấy cơ quan dinh dưỡng của cây như thân, rễ, lá… thì giai
đoạn tạo mô sẹo (callus) chính là những tế bào đã quay trở lại trạng thái phôi sinh
có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của cơ quan sinh dưỡng [53].
Tùy vào từng tế bào, từng mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù
hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát
triển của cơ thể (cơ chế điều hòa hoạt động của gen) [53].
Về bản chất của sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen. Do
thông tin về vị trí của tế bào, tương quan dinh dưỡng và tương quan hormone quy
định. Trong đó quan trọng nhất là thông tin về vị trí của tế bào, khi nằm trong một
cơ thể các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, khi được tách rời và trong điều kiện nhất
định thì các gen được hoạt hóa dễ dàng hơn. Đó là cơ sở nền tảng cho việc nuôi cấy
mô, tế bào [11].
1.1.3. Các bước nhân giống in vitro
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ


5
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và
ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường
thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ
làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro
[19].
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm
bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc
vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần
chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn,

đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử
trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp
khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt
được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 510 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch
Br…
Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White
(1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962); Chất hữu cơ: đường sarcaroza;
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit; Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…),
Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) [19].
Bước 3: nhân nhanh
Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng
nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông
qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ
sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều
chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề
là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả
cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ


6
ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân
hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế
độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân
phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối… [19].
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn
nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi
trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi

trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra
rễ là thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi
chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất
điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường
không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp
thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh [19].
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,
số rễ, chiều cao cây…)
- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để
thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây
ngoài điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi…
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat
nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như
có chế độ dinh dưỡng thích hợp [19].
1.1.4. Ưu, nhược điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế
bào
1.1.4.1. Ưu điểm
Theo E.F. Gerge (1993) cho biết ưu điểm của nhân giống in vitro [9].
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành một số lượng lớn
cây giống từ một mô, cơ quan với kích thước nhỏ 0,1 -10 mm.


7
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sạch
bệnh
- Sử dụng vật liệu sạch virus có khả năng nhân được các giống sạch bệnh
- Có khả năng điều chỉnh các tác nhân ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây

như thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, các chất điều hòa sinh trưởng … theo ý
muốn.
- Hệ số nhân giống khá cao, có khả năng sản xuất lượng lớn cây giống trong
một thời gian ngắn.
- Có thể tiến hành quanh năm, không chịu sự chi phối của các nhân tố môi
trường.
- Có thể bảo quản cây giống in vitro trong thời gian dài nếu chưa sử dụng [7].
1.1.4.2. Nhược điểm
Vì cây giống được cung cấp nguồn dinh dưỡng nhân tạo nên khả năng tự tổng
hợp các chất hữu cơ kém. Cây giống được nuôi trong bình thủy tinh có độ ẩm bão
hòa, nên khi trồng dễ mất cân bằng nước, gây ra hiện tượng héo rũ. Vì vậy, cây
giống in vitro đưa ra trồng tự nhiên cần qua giai đoạn thích nghi để quen dần với
điều kiện tự nhiên [16].
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
1.1.5.1. Môi trường nuôi cấy
Chất dinh dưỡng được cung cấp cho tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro lấy
từ môi trường nuôi cấy. Thành phần cấu tạo nên môi trường nuôi cấy được chia
thành 4 nhóm: nước cất (95%), môi trường cơ bản bao gồm nguồn cacbon và chất
khoáng, chất điều hoà sinh trưởng và các chất khác như agar, agarose .Vì vậy, vấn
đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng
giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng.
Sự sinh trưởng và phân chia của tế bào thực vật bị tác động mạnh mẽ bởi sự
điều chỉnh của nguồn Cacbon, nồng độ photphat, nguồn cung cấp nitơ và các chất
điều hoà sinh trưởng [41].
+ Nguồn Cacbon: các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên
chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất cacbon
nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991). Thông
thường, saccharose (2-5%) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô thực vật.

8
Saccharose sẽ được enzyme ngoại bào thuỷ phần tạo ra các đường đơn là glucose và
fructose trong quá trình nuôi cấy. Các nguồn cacbon có thể sử dụng là saccharose,
glucose, fructose và sorbitol [41].
+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển
mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4+ và
NO3- (nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả
hơn so với NH4+. Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì
vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả hai nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng
rộng rãi nhất.
+ Các nguyên tố đa lượng: bao gồm sáu nguyên tố: nitơ (N), phốt pho(P), kali
(K), canxi (Ca), magiê (Mg) và lưu huỳnh (S), tồn tại dưới dạng muối khoáng, là
thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau, được sử dụng ở nồng độ trên
30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate
và potassium. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng
trong khoảng 1-3 mmol/L [19].
Các môi trường khoáng khác nhau có hàm lượng và thành phần các chất khoáng
khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop
khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5. Việc lựa chọn thành phần
và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm công
tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh
dưỡng khoáng.
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất
quan trọng cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng
trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với
các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây
[15].
+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được vitamin,
nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu
một số vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo

từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các vitamin inositol, B1 (thiamin) và B6
(pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy
với nồng độ thấp khoảng 0,1-1 mg/L Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin


9
B1 là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào và rất quan trọng đối với
nuôi cấy mô sau khi nghiên cứu kĩ lưỡng sự có mặt của nó trong môi trường MS
[15].
+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết
nấm men,... được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô
sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1994.
Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA.
Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô
như: myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxine, các gluxid của cytokinin [15].
+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại polysacharid của
tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có
ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong
khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy [15].
Các chất điều hoà sinh trưởng: Các phytohormon là những chất có tác dụng
điều hoà sinh trưởng ở thực vật. Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm:
Auxine, cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid. Sự phối hợp hay lựa chọn nồng
độ các chất kích thích sinh trưởng sẽ là yếu tố quyết định đến sự thành công của quá
trình nuôi cấy.
1.1.5.2. Điều kiện nuôi cấy
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó
là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
+ Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu
sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Với đa số các loài cây, thời gian
chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày. Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình

phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của
mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung,
cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin,
1974). Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng
cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm
tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức
chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo.


10
Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh
quang với cường độ 2000 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá
trình trao đổi chất của mô nuôi cấy. Nhiệt độ cho phép tế bào thực vật có thể sinh
trưởng và phát triển trong điều kiện in vitro là từ 23°C đến 29°C (Endress 1994;
Fowler 1988).
+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên ta
không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô [7].
1.1.5.3. Điều kiện vô trùng
Bất kì hình thức nuôi cấy in vitro nào cũng đều cần có điều kiện vô trùng. Nếu
điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm
nấm hoặc vi khuẩn, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị
ngừng lại. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp vào mẫu và các
thao tác đúng quy cách, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng, bàn nuôi và dụng
cụ nuôi cấy phải vô trùng [7].
1.1.5.4. Các chất điều hòa sinh trưởng
Ở thực vật, các chất điều hòa sinh trưởng còn được gọi là các phytohormon,
có thể chia các chất phytohormon ra thành 5 nhóm: auxin, cytokinin, giberillin,
ethylen, abscisic acid. Các chất ĐHST được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp, nồng
độ sử dụng cao hay thấp là yếu tố quyết định đến sự thành công của nghiên cứu.

Auxin và cytokinin là 2 nhóm chính thường được sử dụng trong nuôi cấy mô
thực vật. Nhóm auxin gồm các chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D. Trong đó, IAA ít
được sử dụng do kém bền vững với nhiệt và ánh sáng, IBA, NAA, 2,4-D thường
được sử dụng ở nồng độ thấp 0,1 – 2 mg/L, còn IAA thường được sử dụng ở
nồng độ khá cao từ 1 - 30 mg/L [13]. Auxin thường được sử dụng để kích thích
sự phân chia tế bào, hình thành rễ, hình thành mô sẹo, phân chia rễ phụ… [15].
Cytokinin được bổ sung để kích thích sự phân chia tế bào, quyết định sự phân
hóa chồi bất định từ mô sẹo vào cơ quan, làm tăng số chồi. Các chất cytokinin
thường được sử dụng là BA, KIN, zeatin, …
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, đối với mỗi loài thực vật, mỗi giai đoạn
nuôi cấy các chất ĐHST và nồng độ được sử dụng không giống nhau.Trong
nghiên cứu của Đặng Ngọc Phúc và cs (2011) nghiên cứu nhân giống cây sa


11
nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu), môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L
BA hoặc 1,0 mg/L KIN cho hiệu quả tái sinh chồi tốt nhất, nhưng nồng độ 1,5
mg/L BA có kết hợp với 0,25 mg/L NAA lại thích hợp nhất cho việc nhân nhanh
chồi loài cây này [1].
+ Auxine: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA, IAA, NAA, 2,4-D trong
nuôi cấy mô thực vật auxine thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế
bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ
[15]. Lấy ví dụ cụ thể, 2,4-D được bổ sung với nồng độ cao nhằm thúc đẩy sự tăng
sinh của callus [41].
+ Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia
tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp chất
thường sử dụng là: KIN, BAP, Zip, Zeatin… Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi
cấy mà cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10-7- 106

M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích

thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy mô để kích thích sự nhân nhanh người ta
thường xử dụng cytokinin với nồng độ 10-6- 10-4 [15].
+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan
trọng nhất là GA3. GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau,
kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các
phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973). Ngoài
ra, nó còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng
rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây.
+ Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được
dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi cấy,
khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ
[6]. ABA được sử dụng để gây phôi soma trong hệ thống nuôi cấy mô thực vật và
trong nghiên cứu giống cây tổng hợp. Chống thoát hơi nước, tăng thời gian thích
ứng với điều kiện khí hậu của cây nuôi cấy mô và làm giảm sự mất nước của lá
[44]. Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở giai
đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một số
trường hợp, ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường hợp
nó lại kìm hãm quá trình này [15].


12

1.2. NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC LOÀI CHUỐI BẰNG KỸ THUẬT
NHÂN GIỐNG IN VITRO
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Chuối là loại cây ăn quả rất gần gũi và có giá trị, đã góp một phần đáng kể
phục vụ ngành sản xuất chuối xuất khẩu. Vì vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nhân
giống chối đã được nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu tại nhiều nước trên thế giới.
Rahman và cs (2004) nghiên cứu trên ảnh hưởng của chất ĐHST BAP và

NAA trên giống chuối BARI-I ở nồng độ BA (0,1,2,3,4,5 và 6 mg/L) riêng rẽ và kết
hợp BA (0, 4 và 5 mg/L), NAA (0; 0,5; 1; 1,5 và 2 mg/L). Số lượng chồi tái tạo đạt
cao nhất (4,52 chồi) với chiều cao thân cao nhất đạt 3,62 cm ở môi trường MS cơ
bản bổ sung 4 mg/L BAP + 1,5 mg/L NAA [43].
Năm 2006, Akbar và cs nghiên cứu trên Musa sapientum L., sự hình thành rễ
sau 2 tuần nuôi cấy khi chúng được tách riêng lẻ và nuôi cấy ở môi trường MS bán
lỏng, bổ sung 1,0 mg/L IBA, nhưng tỷ lệ rễ phát sinh và phát triển ở môi trường
lỏng cao hơn so với môi trường thạch bổ sung thạch agar [23].
Theo kết quả nghiên cứu tái sinh cây chuối mốc của Ghanem và cs (2008)
ghi nhận khả năng tạo rễ tốt nhất trên môi trường bổ sung 0,5 mg/L NAA (11,6
rễ/chồi) sau 5 tuần nuôi cấy [42].
Buah và cs (2010) nghiên cứu ảnh hưởng khác nhau của nồng độ các
cytokinin trong nhân chồi in vitro giống Plantain (Musa sp.) cho thấy môi trường
MS cơ bản bổ sung 4,5 mg/L BAP cho số lượng chồi cao nhất sau 8 tuần nuôi cấy.
BAP cho hệ số nhân chồi cao nhất đối cả các giống nghiên cứu so với sử dụng
Kinetin và 2-ip [25].
Năm 2010, Siamak và cs nghiên cứu ảnh hưởng của cytokinin bao gồm BAP,
kinetin, TDZ đến sự phát triển chồi in vitro của các giống chuối khác nhau (Musa
spp.) nhóm AAA và AAB cho thấy BAP ở mức 22,2 µM là tối ưu cho sự phát triển
cũng như kéo dài chồi của các giống chuối [49].
Năm 2010, Olivia Saha Roy và cs nhân giống và sản xuất giống chuối Musa
paradisiaca ‘Malbhog’ nhóm AAB cho thấy môi trường MS cơ bản bổ sung 1 mg/L
IBA cho số rễ in vitro cao nhất (6 rễ/ chồi) sau 2 tuần nuôi cấy, huấn luyện trong
điều kiện nhà kính và trồng thực nghiệm, kết quả theo dõi cho thấy khả năng sống
sót đạt 95% sau 5 tháng [46].


13
Năm 2011, Jafari và cs nghiên cứu ảnh hưởng của BAP lên sự nhân chồi in
vitro của chuối Musa acuminata cv. Berangen cho thấy môi trường MS bổ sung

BAP ảnh hưởng đến sự hình thành chồi của Musa acuminata cv. Berangen trong
giai đoạn tăng trưởng với nồng độ sử dụng (11, 22 và 33 μM). Tuy nhiên, nồng độ
cao nhất của BAP (33 μM) tạo các chồi bất thường. Môi trường bổ sung IAA cũng
cho sự gia tăng chồi nhưng không làm giảm chồi ngẫu nhiên bất thường [35].
Năm 2013, Ngomuo và cs nghiên cứu ảnh hưởng của auxin và cytokinin đến
sự sinh trưởng và phát triển trên giống chuối ‘Yangambi’ bằng kĩ thuật nuôi cấy
mô. Kết quả cho thấy môi trường MS cơ bản bổ sung 6,0 mg/L BAP cho sự tăng
trưởng số lượng chồi cao nhất và sự tương tác khi kết hợp 6 mg/L BAP + 0,35 mg/L
IAA cho thấy sự sinh trưởng khỏe của chồi. Ở giai đoạn ra rễ, 2,0 mg/L IBA tác
động mạnh mẽ nhất đến số lượng và chiều dài của rễ so với các nồng độ khác [38].
Năm 2013, Iqbal và cs nghiên cứu nhân giống in vitro trên đối tượng Musa
saientum L.. Sau khi nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung các chất ĐHST
cho thấy môi trường MS bổ sung BAP + IAA (5,0 + 1,0 mg/L) + 10% CW cho hiệu
quả nhân chồi cao nhất, môi trường MS bổ sung 2mg/L IAA cho hiệu quả ra rễ cao
nhất [34].
Năm 2013, Demissie nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và NAA đối với việc tái
tạo và nhân giống chuối (Musa spp.) cv. Matoke. Callus được hình thành sau 28
ngày, sau đó phát triển thành cây con. Trong số các nồng độ khác nhau, 5 mg/L
BAP + 1,0 mg/L NAA cho thấy sự sinh trưởng cao nhất là 1,00; 1,67; 1,75 và 3,08
chồi trên mỗi cụm lần lượt sau 10, 20, 30 và 60 ngày. Số lượng chồi tốt đạt được ở
mức 5 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA ở sau 60 ngày là 3,08. Chồi dài nhất được sản
xuất ở nồng độ 5 mg/L BAP + 1.0 mg/L NAA (0,43, 2,42, 2,63 và 3,42 chồi trên
mỗi cây con) lần lượt sau 10, 20, 30 và 60 ngày. Số lượng lá tối đa sau 10, 20, 30 và
60 ngày được sản xuất trên môi trường được bổ sung với 5,0 mg/L BAP và 0,50
mg/L NAA là 1,67, 2,67, 3,67 và 4,33 cho mỗi lần cấy. Số lượng lá thấp nhất thu
được từ đối chứng. Lá dài nhất được tạo ra bởi nồng độ 5,0 mg/L BAP + 1,0 mg/L
NAA (1,52, 2,27, 2,70 và 3,13 cm) ở lần lượt sau 10, 20, 30 và 60 ngày [29].
Năm 2014, Ahmed và cs nghiên cứu nhân giống chuối (Musa sp.) cv. Grand
Naine bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Sử dụng HgCl2 (0,1%) trong 6 phút cho tỷ lệ
nhiễm ít nhất với khả năng sống sót cao nhất. Môi trường MS bổ sung BAP

14
4.00mg/L và IAA 2.00 mg/L cho tỷ lệ cảm ứng mẫu cao nhất với thời gian ít nhất.
Môi trường MS bổ sung BAP 4.00 mg/L và IAA 2.00 mg/L cho tỷ lệ ra chồi cao
nhất. Tỷ lệ ra rễ cao nhất khi nuối cấy trên môi trường ½ MS bổ sung IBA 1.00
mg/L và 200mg/L AC [22].
Năm 2015, Lohidas và Sujin đánh giá hiệu quả khử trùng lên giống chuối
Matti bằng các chất khử trùng khác nhau như cồn 95%, NaOCl 1%, HgCl 0,1%. Kết
quả cho thấy hiệu quả tối đa là 90,33% khi khử trùng bằng cồn 95% trong 30s kết
hợp với NaOCl trong 10 phút và 250 ppm streptomycin sulfate. Khi chỉ khử trùng
với cồn 95%, tỷ lệ mẫu sống sót chỉ còn 54,33% [36].
Năm 2017, Safarpour và cs nghiên cứu kĩ thuật mới của vi nhân giống Musa
acuminata Colla ‘Grand Naine’ (AAA) thông qua việc cắt ngang mặt cắt của đỉnh
chồi. Nghiên cứu cho thấy các chồi khi nuôi cấy ở môi trường MS bổ sung 0; 10; 20
và 30 μM BAP kết hợp với 1.0 μM NAA duy trì trong 6 tháng. Sự nhân chồi tối đa
23,65 chồi trên môi trường bổ sung 20 μM BAP. Để gia tăng tốc độ nhân chồi, các
chồi riêng lẻ được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 10 μM BAP được chia
thành 3 mặt cắt ngang và phần giữa tạo ra số lường chồi nhiều nhất (7,22). Các
chồi này khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 20 μM BAP phát sinh 8 chồi so
với môi trường bổ sung BAP ở 10 hoặc 30 μM cho số chồi lần lượt là 6,18 và 7,94
chồi/mẫu. Từ chỉ một mặt cắt ngang, 32,77 chồi được tạo ra so với 11,79 chồi
thông qua phát tạo trực tiếp từ đỉnh chồi. MS bổ sung với 6 μM IBA tạo rễ mạnh
trong 4 tuần nuôi cấy. Huấn luyện trong điều kiện nhà kính tỷ lệ sống sót cao nhất
đạt 88,63%. Sự phân tích DNA đa hình (RAPD) ngẫu nhiên cho thấy các cây
trồng từ các đỉnh chồi có 23,46% sự đa hình, trong khi những cây con từ các mặt
cắt ngang cho thấy không có biến thể di truyền khi so sánh với cây mẹ [47].
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước
Kỹ thuật nhân giống vô tính chuối bằng phương pháp in vitro ở nước ta cũng
thu được một số kết quả:

Trần Thanh Hương và cs (2009) nghiên cứu vai trò của các chất điều hòa tăng
trưởng thực vật trong sự hình thành rễ bất định từ các khúc cắt mang chồi ở một vài
giống chuối (Musa sp.) kết luận quá hình thành rễ bất định ở chuối bao gồm 4 giai
đoạn: tạo tế bào hoạt hóa, hình thành vùng tế bào mô phân sinh, hình thành sơ khởi
rễ và kéo dài rễ. Quá trình này chịu ảnh hưởng phần nào bởi kiểu gen, bản chất và


15
nồng độ auxin được áp dụng. Ở chuối cau mẫn, 0,1 mg/L 2,4-D kích thích sự hoạt
hóa tế bào để tạo mô phân sinh rễ trong khi 0,4 mg/L NAA kích thích sự tăng
trưởng của các tế bào mô phân sinh để hình thành rễ thật sự [18].
Năm 2014, Hà Minh Tuân và cs, Đại học nông Lâm- Đại học Thái Nguyên
xác định kỹ thuật vào mẫu in vitro hiệu quả cho giống chuối Tây bản địa Bắc Kạn
(Musa x Paradisiaca). Bốn thí nghiệm trong phòng được triển khai nhằm đánh giá
ảnh hưởng của mẫu cây con từ các vườn cây mẹ có tuổi khác nhau, vị trí lấy mẫu và
các nồng độ của chất khử trùng H2O2, HgCl2 đến tỷ lệ sống và tỷ lệ tái sinh chồi.
Kết quả cho thấy, dùng chồi đỉnh của vườn cây mẹ 03 tháng tuổi để vào mẫu đem
lại hiệu quả cao nhất. Việc sử dụng hóa chất khử trùng H2O2 và HgCl2 không cải
thiện tỷ lệ tái sinh chồi, trong khi nồng độ hóa chất cao có thể giảm tỷ lệ tái sinh
chồi của giống chuối nghiên cứu [3].
Năm 2015, Huỳnh Thị Bích Vân, đại học sư phạm Đà Nẵng đã nghiên cứu
thành công nhân giống cây chuốc mốc (Musa paradisiaca L.) bằng kĩ thuật nuôi
cấy in vitro. Khử trùng mẫu bằng cồn 70o trong 3 phút cho hiệu quả khử trùng tốt
nhất với tỉ lệ sống sót đạt 100%, sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường MS có 3%
sucrose, 0,8% agar bổ sung 5 mg/L BA và 0,01 NAA là môi trường nhân nhanh
chồi in vitro tốt nhất từ chồi đỉnh chuối mốc, với hệ số nhân chồi cao đạt 7,8
chồi/mẫu, chiều cao đạt 4 cm, số lá đạt 3,7 lá/chồi sau 4 tuần nuôi cấy. Môi
trường MS có 3% sucrose, 0,8% agar bổ sung 0,5 NAA thích hợp để tạo rễ in vitro.
Sau 2 tuần nuôi cấy, đạt 7,9 rễ/chồi, chiều dài rễ là 9,8 cm, cây con phát triển
tốt. Cây chuối mốc in vitro có tỉ lệ sống sót rất cao (đạt 100%) khi trồng ngoài

nhà lưới trên cả 3 giá thể cát + xơ dừa + phân chuồng hoai mục + trấu hun
(1:1:1:1), cát + xơ dừa + phân chuồng hoai mục (1:1:1) và cát + phân chuồng
hoai mục + trấu hun (1:1:1). Cây chuối mốc sinh trưởng tốt trên giá thể cát + xơ
dừa + phân chuồng hoai mục + trấu hun (1:1:1:1) sau 4 tuần trồng [4].
Năm 2017, Giảng viên Mai Hương Trà, đến từ Khoa Kỹ thuật hóa học và Môi
trường (Trường đại học Lạc Hồng) đã thực hiện khảo sát thành công ảnh hưởng của
Nano bạc lên cây chuối già lùn và tìm ra giải pháp mới nhân giống nhanh, hiệu quả.
Tiến hành khảo sát 5 mức nồng độ Nano bạc 0,1 ppm, 3 ppm, 5 ppm, 7 ppm bổ
sung vào môi trường MS trong điều kiện hấp khử trùng 121oC, trong thời gian 5, 10
và 15 phút. Nhóm tác giả giải pháp xác định được thời gian và nồng độ Nano bạc


16
thích hợp cho khả năng kháng khuẩn ở môi trường MS là 10 phút và 7 ppm. Nano
bạc ở nồng độ 1 ppm là thích hợp nhất so với các nồng độ còn lại 0 ppm, 3 ppm, 5
ppm, 7 ppm khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhân chồi in vitro cây chuối già
lùn. Cũng khảo sát ở mức các nồng độ như vậy thì môi trường tốt nhất để nuôi cấy
cây chuối già lùn ở giai đoạn cây in vitro là môi trường MS có bổ sung 3 ppm Nano
bạc. Sau khi đưa cây con chuối già lùn ra trồng trên giá thể xơ dừa ngoài vườn ươm
thì nhóm tác giả xác định được nồng độ Nano bạc dùng để tưới cho cây chuối già
lùn con tốt nhất là 5 ppm [8].
Thời gian gần đây, quy trình nhân giống chuối bằng phương pháp nhân giống
in vitro đã được chuyển giao đến nhiều cơ sở sản xuất, áp dụng rộng rãi trên cả
nước, tuy nhiên ở từng địa phương thì có những mặt hạn chế khác nhau và công tác
nghiên cứu chuyển sang một hướng mới là khắc phục hạn chế của quy trình nhân
giống ở mỗi địa phương.