Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh tại đà nẵng bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN TẤN PHÁT

ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO
XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÀ NẴNG, NĂM 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN TẤN PHÁT

ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO
XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

Ngành : Công nghệ sinh học

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN MINH LÝ

ĐÀ NẴNG, NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả

Nguyễn Tấn Phát


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các quý thầy, cô khoa Sinh – Môi Trƣờng,
trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Đại Học Đà Nẵng đã hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Minh Lý
ngƣời thầy tâm huyết đã tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian
trao đổi và định hƣớng cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên tinh
thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành khóa luận.


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU.......................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài............................................................................................................2

3. Ý nghĩa khoa học của đề tài.......................................................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................4
1.1. Tổng quan về vi khuẩn............................................................................................4
1.1.1. Phân loại vi khuẩn.............................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn Ralstonia solanacearum . 6

a. Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R. solanacearum......................................6
b. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum................................................7
c. Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum.....7
d. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo
xanh vi khuẩn hại lạc...............................................................................................8
e. Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn và phân lập vi khuẩn gây bệnh..................9
1.1.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum............................... 10
a. Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum..................................................... 10
b. Chủng................................................................................................................ 11
c. Loài phức........................................................................................................... 12
d. Kiểu gây bệnh.................................................................................................... 12
e. Kiểu quan hệ phả hệ.......................................................................................... 12
1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam và trên Thế giới.................13
a. Nghiên cứu bệnh héo xanh trên thế giới............................................................ 13


b. Nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam.............................................................. 13
1.2. Tổng quan về kỹ thuật RAPD................................................................................ 14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........17
2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................... 17
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 18
2.3. Địa điểm, thời gian và phạm vi nghiên cứu........................................................... 18
2.3.1. Địa điểm nghiên cứu....................................................................................... 18
2.3.2. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04/2017 đến 04/2018..................................... 18

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................................... 18
2.4.1. Phƣơng pháp thu mẫu..................................................................................... 18
2.4.2. Phƣơng pháp phân lập.................................................................................... 18
a. Mẫu đất.............................................................................................................. 18
b. Mẫu cây bệnh..................................................................................................... 19
2.4.3. Phƣơng pháp xác định biovar của dòng vi khuẩn phân lập............................. 19
2.4.4. Phƣơng pháp phân tích DNA.......................................................................... 21
a. Phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn.......................................................... 21
2.4.5. Kỹ thuật PCR:................................................................................................. 21
2.4.6. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose............................................................. 21
2.4.7. Nghiên cứu đa dạng di truyền một số chủng vi khuẩn R. solanacearum bằng
phân tích DNA.......................................................................................................... 22
2.4.8. Phƣơng pháp bảo quản giống vi sinh vật........................................................ 22
Bảo quản trên môi trường thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền......................22
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................. 24
3.1. Phân lập vi khuẩn héo xanh tại địa bàn Đà Nẵng............................................... 24
3.2. Xác định biovar của các chủng vi khuẩn R. solanacearum................................ 27
3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền một số chủng vi khuẩn R. solanacearum bằng
phân tích DNA.......................................................................................................... 29
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA vi khuẩn R. solanacearum..................................... 29


3.3.2. Kết quả phân tích các chủng vi khuẩn với các mồi RAPD...........................29
3.3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các chủng VKHX................30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................... 34
1. Kết luận............................................................................................................. 34
2. Kiến nghị........................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 35
Tiếng việt............................................................................................................... 35
Tiếng Anh.............................................................................................................. 36

DANH MỤC CH Ữ VIẾT TẮT
F
A
O
H
X
V
K
T
Z
C
S
P
A
P
C
R
b
p
D
N
A
µ
g
µ
L
A
P

P
C
R
D
A
F

RAPD
TAE
Kb
mg
mL
mM
cs
CTAB
EDTA


Food
and
Agric
ulture
Organi
zation
of the
United
Nation
s
Héo
xanh

vi
khuẩn
Tetraz
olium
chlori
de
Sucros
e
pepton
e agar

Polymerase chain reaction
Base pair
Deoxyribonucleic acid
Microgram
Microliter
Arbitrary primed polymerase chain
reaction
DNA amplification fingerprinting
Randomly amplified polymorphic
DNA
Tris-Acetic acid-EDTA
Kilobase
Milligram
Millilite
Millimol
Cộng sự
cetyltrimethyl-ammonium bromide
ethylene diamine tetraacetic acid

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số hiệu
bảng

Tên

Bảng 2.1

Tọa

Bảng 2.2

Danh

Bảng 2.3

Phản

Bảng 3.1

Các

Bảng 3.2

Bảng 3.3

Bảng 3.4

Bảng 3.5

Đƣờ
48h

Kết q

solan

Mức
tích

Hệ s
héo


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu hình
Hình 1.1

Hình 3.1

Hình 3.2

Hình 3.3

Hình 3.4


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây ra bệnh héo xanh, và có nguồn gốc
trong đất, đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên các cây thuộc họ Cà ở Mỹ vào n m 1896.
Cho đến nay bệnh phổ biến rất rộng ở hầu hết các nƣớc châu Á, Phi, Mỹ, Úc. Bệnh bắt
đầu xuất hiện ở Châu Âu nhƣng gây hại nghiêm trọng chủ yếu ở các nƣớc vùng nhiệt
đới, cận nhiệt đới có khí hậu nóng, ẩm.
Bệnh này đƣợc coi là một trong n m loại bệnh cây trồng thuộc đối tƣợng quan
tâm nhất của chƣơng trình phòng trừ sâu bệnh tổng hợp của FAO (1992) và chịu sự
kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch Quốc tế, nhất là các nƣớc thuộc cộng đồng châu Âu
[5]. Đây là loại vi khuẩn có khả n ng gây hại trên 200 loài cây cỏ, đặc biệt gây hại nặng
trên cây họ cà nhƣ cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và các cây khác họ nhƣ đậu
phụng, gừng chuối, chúng có khả n ng sống rất lâu trong đất và lây lan rất nhanh, di
chuyển từ nơi này sang nơi khác. Vi khuẩn gây thiệt hại kinh tế lớn đối với các cây
trồng có ý nghĩa kinh tế nhƣ lạc, cà chua, khoai tây, và có thể làm giảm đáng kể đến
n ng suất và chất lƣợng của nông sản từ 5-100% tùy theo loài cây, giống cây, vùng địa

lý
Việt nam là một nƣớc có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuộc vùng phân bố chính
của loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum , bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) đƣợc coi
là bệnh hại phổ biến ở nhiều tỉnh trong cả nƣớc nhƣ: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình,
Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh... [15, 16]. Bệnh gây hại nghiêm
trọng ở một số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động
trong khoảng 15% đến 35% và ở tỉnh Long An và Tây Ninh là từ 20% đến 30%.
Đặc biệt, trên địa bàn thành phố Đà Nẵng do sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh
héo xanh, nên quá trình sản xuất các loại cây họ cà gặp rất nhiều khó kh n. Trong đó, cà
chua và lạc cho n ng suất thấp và hầu nhƣ không thể trồng đƣợc trên các cánh đồng
(đối với cà chua).
Trong thực tế sản xuất, phòng chống bệnh HXVK là vấn đề rất khó kh n, đã có
nhiều nghiên cứu về canh tác và chọn giống cây trồng, sử dụng thuốc hóa học cũng
nhƣ các chế phẩm sinh học có khả n ng ức chế và làm giảm tính độc của R.
solanacearum[17]. Tuy nhiên, các biện pháp đó còn nhiều hạn chế, bệnh HXVK vẫn

luôn hiện diện, gây hại và luôn là mối lo ngại đối với ngƣời sản xuất.
1


Chọn tạo giống mang gen kháng bệnh đƣợc xem là biện pháp ƣu việt và hiệu
quả nhất[13]. Nhƣng tính kháng của giống phụ thuộc rất nhiều vào độc tính của các
chủng vi khuẩn [1, 14]. Và để tạo ra đƣợc giống kháng bền vững phải hiểu đƣợc đặc
điểm di truyền cũng nhƣ độ độc tính của các chủng vi khuẩn ở các vùng sinh thái khác
nhau.
Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã đề xuất thực hiện đề tài “Đánh giá tính
đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh
héo xanh tại Đà Nẵng bằng chỉ thị phân tử”.
2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và đánh giá đƣợc tính đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp sinh học
phân tử các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh tại các vùng
sản xuất nông nghiệp của thành phố Đà Nẵng, .

2


3. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Cung cấp dẫn liệu khoa học về sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn
Ralstonia solacearum đƣợc phân lập tại Đà Nẵng.
Cung cấp các chủng phục vụ trong việc đánh giá tính kháng bệnh bằng phƣơng
pháp gây bệnh nhân tạo.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về vi khuẩn
1.1.1. Phân loại vi khuẩn
Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) đƣợc gây ra bởi vi khuẩn Ralstonia
solanacearum , mà trƣớc đây đƣợc gọi là Pseudomonas solanacearum do E.F.Smith
nghiên cứu n m 1896, đƣợc cho là đã gây bệnh ở khoai tây gây tổn hại nhất, đứng thứ
hai sau bệnh bạc lá ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (CGIAR 2005). Chúng gây
bệnh cho khoảng 30 loài cây trồng cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm (Smith et al.,
2003), trong đó cây dễ bị nhất là khoai tây, cà chua, ớt, cà tím, và lạc. Nghiên cứu đã
chỉ ra rằng có 5 chủng và 5 biovars của Ralstonia [13].

Hình 1.1: Hình thái vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith dưới kính hiển vi[18]
Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi khuẩn đƣợc Smith đặt tên là
Bacillus solanacearum. Tiếp theo, vi khuẩn đƣợc đổi tên là Pseudomonas
solanacearum (Smith, 1896). Các nghiên cứu phân loại gần đây về các vi khuẩn
Pseudomonas không tạo sắc tố huỳnh quang đã tạo ra một chi mới là Burkholderia. Vi
khuẩn P. solanacearum đã đƣợc phân loại lại thành Burkholderia solanacearum
(Yabuuchi et al., 1992). Các nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng B.
solanacearum khác hoàn toàn các vi khuẩn Burkholderia khác và thuộc một chi mới là
Ralstonia. Dựa trên các nghiên cứu phân loại mới này, B. solanacearum đã đƣợc đổi
4


tên lại là R. solanacearum(Yabuuchi et al., 1995). Sau Hội nghị Quốc tế lần thứ 2 về vi
khuẩn n m 1997, đa số các tác giả gọi vi khuẩn là Ralstonia solanacearum . Hiện nay
phân loại chính thức của vi khuẩn héo xanh là:
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Phylum): Proteobacteria
Lớp (Class): Beta Proteobacteria
Bộ (Order): Burkholderiales
Họ (Family): Ralstoniaceae

Chi (Genus): Ralstonia
Loài: Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et
al., 1996; Tahat và Sijam, 2010).
Ngoài ra, vi khuẩn còn có các tên đồng nghĩa khác là Pseudomonas ricini
(Archibald) (Robbs, 1954); Pseudomonas batatae (Cheng và Faan, 1962, Yabuuchi et
al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010).
Ngoài gây hại trên cây lạc (Arachis hypogaea L.), vi khuẩn R. solanacearum
còn gây hại trên 450 loài cây thuộc 54 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn R.
solanacearum gây bệnh trên một số cây khác nhƣ Ageratum conyzoides, Amaranthus
spp., Artemisia pallens, Artemisia sp., Beta vulgaris var. cicla, Capsicum annuum,
Casuarina cunninghamiana, Casuarina equisetifolia, Casuarina glauca, Cereus
peruvianus, Coleus forskohlii, Coleus sp., Colocasia esculenta, Commelina communis,
Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma
longa, Cynara cardunculus var. scolymus, Emilia sonchifolia sp., Eucalyptus sp.,
Galinsoga parviflora sp., Gossypium sp., Heliconia sp., Heliconia caribaea, Hevea
brasiliensis, Hibiscus sabdariffa, Ipomoea batatas, Justicia adhatoda, Maranta
arundinacea, Musa sp., Musa x paradisiaca, Nicotiana tabacum, Olea europaea subsp.
europaea, Pelargonium sp., Platostoma chinensis, Plectranthus barbatus, Pogostemon
cablin, Polygonum capitatum, Portulaca oleracea, Ricinus communis, Siraitia
grosvenorii, Solanum cinereum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum
nigrum, Solanum tuberosum, Talinum fruticosum, Tectona grandis, Urtica dioica,
Washingtonia filifera, Zingiber officinale,... [25]. Tuy nhiên, loài vi khuẩn R.
solanacearum rất dễ bị biến dị và phân hoá hình thành nhiều nòi và biovar khác hẳn

5


nhau về tính chuyên hoá ký chủ, tính gây bệnh và tính độc, phân bố khác nhau ở các
vùng địa lý sinh thái.
Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định vi khuẩn R.

solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh. Theo Nguyễn Xuân Hồng và cs.
(1993) vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây
trồng khác. Đỗ Tấn Dũng (1995) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và gây hại
nghiêm trọng trên cây cà chua, khoai tây, lạc. Đoàn Thị Thanh và cs. (1995) cho biết vi
khuẩn R. solanacearum không những gây hại trên cây khoai tây mà còn ký sinh và gây
hại trên cây cà chua, thuốc lá, lạc, cây cà. Tác giả còn cho rằng đây là loài vi khuẩn đa
thực, có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng thuộc họ cà
(Solanaceae), họ đậu (Leguminaseae). N m 1977, Lê Lƣơng Tề (1997a) đã xác định vi
khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng
khác nhƣ cà chua, khoai tây, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và đay.
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn Ralstonia
solanacearum a. Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R. solanacearum.
Ralstonia solanacearum (Smith 1896) Yabuuchi et al. Tế bào loài R.
solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, tròn ở hai đầu, thƣờng ở dạng đơn, ghép
đôi hoặc ghép 4, ít khi kết thành chuỗi. Tuy có sự dao động đáng kể nhƣng kích thƣớc
của chúng khoảng 0,5-0,7 x 1,5-2,0 mm trong kích thƣớc. Nó là rất nhạy cảm với khô
hạn và bị ức chế trong môi trƣờng có nồng độ natri clorua (NaCl) thấp (2%). Đối với
0

hầu hết các chủng, nhiệt độ t ng trƣởng tối ƣu là 24-37 C ; Tuy nhiên một số chủng có
0

nhiệt độ thấp hơn tối ƣu 20-22,5 C. (Patrice G. Champoiseau và Timur M. Momol của
Đại học Florida). Hầu nhƣ chúng luôn chuyển động, có một đến vài tiên mao ở một
cực của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thƣờng nhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc không chảy,
màu trắng đục hoặc phớt hồng, hoặc trắng. Cả chủng có tính độc cao và tính độc thấp
đều có các lông nhỏ ở rìa [Mehan V. K., và Liao B, S., 1994].
Vi khuẩn R. solanacearum có cấu tạo đơn bào. Cấu trúc của tế bào vi khuẩn
gồm có: vỏ tế bào chiếm 15% đến 30% trọng lƣợng khô của tế bào có tác dụng bảo vệ

và giữ cho vi khuẩn có hình dạng xác định. Tế bào gồm chất nguyên sinh, chất này
chứa bào tƣơng, chất nhân (nucleus) và các hạt tròn nhỏ khác nhau trong có chứa chất
dinh dƣỡng dự trữ.Bào tƣơng giàu RNA còn nhân giàu DNA. Bằng kính hiển vi điện
tử có thể phân biệt đƣợc các cấu trúc đại phân tử với đƣờng kính khoảng 200 A
6

o


(Angstron), các cấu trúc này là tổng thể của RNA-Protein, là những ribosome. Các
phân tử ribosome chứa nhiều men cần cho sự tổng hợp protein. Trong tế bào vi khuẩn
không thể hiện rõ nhân nhƣ trong tế bào của các cây trồng bậc cao và động vật, nhƣng
trong bào tƣơng thƣờng có thể phân biệt đƣợc “những nhiễm sắc thể” mà thƣờng
đƣợc xem nhƣ tƣơng ứng với nhân. Tế bào chất nằm trong màng bào tƣơng, ngoài
màng bào tƣơng lại có một lớp vỏ tế bào rắn hơn bao bọc, nhờ đó tế bào có hình dạng
nhất định. Thức n vào tế bào qua màng nửa thẩm thấu và những chất trao đổi hình
thành trong bào tƣơng cũng qua màng đó mà bị thải ra ngoài (Kinaly và cs., 1983;
Izrainxki, 1988; Mehan et al., 1994).
b. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum
Vi khuẩn R. solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào tử và
nhuộm gram âm. Vi khuẩn này có khả n ng tổng hợp poly-B hydroxybutyrate nhƣ là
nguồn các bon dự trữ. Vi khuẩn R. solanacearum không hóa lỏng gelatin, không thủy
phân tinh bột, không có khả n ng tạo indol và không sử dụng arginin. Tuy nhiên, loài
vi khuẩn này có khả n ng tạo ra H2S, khử nitrat, có khả n ng thủy phân Tween 80, phản

ứng dƣơng tính Le-van, phân giải đối với sữa limut, có phản ứng oxidase và catalase,
urê, pectin, ôxi hóa acetat, malonate và gluconate. Vi khuẩn R. solanacearum chịu
đựng kém với muối NaCl. Các chủng của vi khuẩn R. solanacearum không thể phát
triển trên môi trƣờng chứa 2% NaCl và bị kìm hãm ở môi trƣờng có 0,5% đến
1,5% NaCl (Hayward, 1964; He et al., 1983; Ryan et al., 2008).

c. Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum.
Vi khuẩn R. solanacearum tồn tại trong đất, trong tàn dƣ thực vật. Nhiều loài cỏ
dại còn là ký chủ phụ của loài vi khuẩn này, là cầu nối giữa nguồn bệnh với cây trồng.
Vi khuẩn còn tồn tại trong hạt giống, trên vỏ hạt, vỏ lụa và trong phôi hạt (Middleton
và Hayward, 1990; Machmud, 1993; Anitha et al., 2003).
R. solanacearum sinh sống trong các mô mạch của vật chủ của nó. Vi khuẩn
thƣờng xâm nhập vào rễ cây từ đất thông qua vết thƣơng hoặc các lỗ tự nhiên nơi rễ
phụ nổi lên, xâm nhập khoang gian bào của vỏ rễ và nhu mô mạch, và cuối cùng đi vào
các mạch xylem và lan lên thân cây và lá cây, nơi mật độ tế bào mầm bệnh thƣờng
-9

vƣợt 10 CFU / g mô vật chủ. Sau R. solanacearum đã xâm chiếm các xylem, số lƣợng
lớn các tế bào vi khuẩn đƣợc đổ ra từ rễ, cung cấp một con đƣờng cho vi khuẩn trở lại

7


đất và bắt đầu lây nhiễm mới ,vật chủ bị ảnh hƣởng bị úa, còi cọc, héo, và thƣờng chết
nhanh chóng. [12]
Bệnh lây lan chủ yếu qua đất. Trong số các vi khuẩn hại cây trồng thì vi khuẩn
R. solanacearum bền vững nhất trong đất. Vi khuẩn R. solanacearum có thể sống sót
trong đất bỏ hoang vài n m thậm chí cả khi không có cây trồng trên đất đó. Vi khuẩn R.
solanacearum có thể sống qua đông trong đất, đất bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh ban
đầu quan trọng nhất. Vi khuẩn tồn tại lâu trong đất khi trồng liên tục cây ký chủ nhiễm
bệnh hoặc có sự kết hợp với cây ký chủ khác xen kẽ trên đồng ruộng. Vi khuẩn tồn tại
tốt ở đất đủ ẩm, thoáng khí, nhƣng bị kìm hãm ở đất khô và đất bị ngập nƣớc. Vi
khuẩn R. solanacearum lây lan chủ yếu qua đất nhƣng cũng dễ dàng truyền lan theo
nguồn nƣớc, qua mƣa gió và qua những vết thƣơng cơ giới, qua dụng cụ sản xuất của
con ngƣời, cũng có thể qua vết thƣơng ở rễ do côn trùng và tuyến trùng gây ra
(Middleton và Hayward, 1990).

d. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo

xanh vi khuẩn hại lạc
Sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có liên quan chặt
chẽ với các yếu tố thời tiết khí hậu nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, mƣa, gió, độ pH đất,... Từ lúc
xâm nhiễm tới khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên của bệnh phải trải qua một khoảng
thời gian nhất định. Thời gian đó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh.
Bệnh phát triển mạnh, thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm nhất là ở nhiệt
0

0

độ từ 25 C đến 35 C nên bệnh gây hại chủ yếu là ở vùng nhiệt đới. Đất có độ ẩm cao
>60% và độ pH 5 - 6,8 thích hợp cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn (Anitha et al., 2003).
Bệnh hại nặng hơn trên đất cát pha, thịt nhẹ, trên ruộng nghèo chất hữu cơ, độc canh
cây ký chủ… Bệnh phát triển kém, mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn trên các ruộng luân
canh lạc với lúa nƣớc, các loài cây không phải là ký chủ và trên đất kiềm hoặc bón vôi.
Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1995) cho rằng bệnh HXVK hại lạc là

một trong những bệnh phổ biến phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ
và ẩm độ tƣơng đối cao. Theo Lê Lƣơng Tề (1997b), bệnh HXVK hại lạc thƣờng phát
sinh ở cả hai thời vụ trồng là lạc Xuân và lạc Thu. Trong điều kiện nhiệt độ tƣơng đối
cao, ẩm ƣớt, cây sinh trƣởng kém, đất cát, nhất là trên đất trồng độc canh cây lạc, bệnh
gây hại nặng. Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa bệnh HXVK hại lạc với các yếu tố
sinh thái, kỹ thuật, Lê Lƣơng Tề (1997b) cho rằng bệnh có thể phát sinh ở các giai
8


đoạn sinh trƣởng của cây, cao điểm của bệnh là thời kỳ cây ra hoa đến quả non, sau đó
bệnh giảm ở giai đoạn quả già. Về ảnh hƣởng của phân bón thì vôi và kali có tác dụng

hạn chế tác hại của bệnh, cho n ng suất lạc cao hơn so với đối chứng. Chế độ luân canh
có ảnh hƣởng tới sự phát triển của bệnh, chu kỳ luân canh càng dài, mức độ gây hại
của bệnh càng giảm. Ở công thức luân canh lúa - lạc - lúa và mía - lạc thì tỷ lệ bệnh
HXVK thấp hơn so với công thức luân canh lạc Xuân - lạc Thu hoặc lúa - khoai tây lạc. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng ở phía bắc Việt Nam, bệnh HXVK phát
sinh và gây hại nặng trên vùng đất đồi, đất bãi ven sông, còn trên đất luân canh với lúa
nƣớc thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn. Đỗ Tấn Dũng (1999) nghiên cứu bệnh HXVK
hại lạc ở vùng Đông Anh, Hà Nội có nhận xét bệnh phát sinh và gây hại nặng từ giai
đoạn cây lạc ra hoa rộ đến quả non.
Nguyễn V n Viết và Phan Duy Hải (2010) nghiên cứu mối tƣơng quan giữa
bệnh và biện pháp canh tác đã cho rằng trồng lạc liên tục trên đất gò đồi và đất dốc
miền núi làm gia t ng tích lũy nguồn bệnh và làm t ng tỷ lệ bệnh các n m tiếp theo.
e. Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn và phân lập vi khuẩn gây bệnh.
Trên đồng ruộng có thể xác định bệnh nhanh bằng cách cắt một đoạn thân ngắn
khoảng 3 cm gần gốc thân cây bị bệnh, ngâm vào cốc nƣớc, sau một thời gian xuất
hiện dòng dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra từ vết cắt. Cắt dọc theo thân cây, dễ
dàng nhận thấy mạch dẫn bị chuyển màu thành nâu sẫm hoặc nâu nhạt (Wang và Hou,
1983). Phƣơng pháp chẩn đoán này cũng đã đƣợc áp dụng tại Việt Nam (Burgess et
al., 2009; Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng, 2010).
Có nhiều phƣơng pháp để xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo
xanh hại lạc nhƣ phân lập trên môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo, phƣơng pháp huyết
thanh, phƣơng pháp phân tích PCR (Mehan và Mc. Donald, 1995).
Theo Mehan (1995), môi trƣờng tetrazolium chloride agar (TZC) phù hợp để
phân lập vi khuẩn R. solanacearum, còn môi trƣờng sucrose peptone agar (SPA) phù
hợp để nhân vi khuẩn R. solanacearum. Trên môi trƣờng TZC khuẩn lạc vi khuẩn R.
solanacearum có hình tròn, nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt
hồng, còn trên môi trƣờng SPA, khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum có hình dạng
tròn, nhẵn bóng, màu trắng sữa.
Nhiều công trình nghiên cứu về phƣơng pháp và ứng dụng kỹ thuật PCR
(polymerase chain reaction) trong chẩn đoán bệnh trên cây trồng và các ứng dụng khác
9

trong bệnh học thực vật đã đƣợc công bố. Phƣơng pháp PCR có nhiều lợi thế hơn hẳn
so với các phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống nhờ có độ nhạy cao, tốc độ nhanh.
Bằng phƣơng pháp ứng dụng PCR, chỉ một vài giờ, từ một đoạn DNA ban đầu và đoạn
mồi có thể nhân lên hàng tr m triệu lần sau đó đi sâu phân tích kiểu gen, xác định, nhận
biết một cách chính xác nòi, biovar vi khuẩn R. solanacearum ở trong mẫu cây bệnh
cũng nhƣ trong đất nhiễm bệnh. Theo kết quả nghiên cứu của các phòng thí nghiệm
tham gia mạng lƣới nghiên cứu vi khuẩn héo xanh ở các nƣớc và vùng lãnh thổ châu
Á, Thái Bình Dƣơng nhƣ: Australasia, Đài Loan, Philippines,… thì sản phẩm PCR của
các mẫu phân lập thuộc loài R. solanacearum sử dụng với chỉ thị 759/760 có kích
thƣớc không đổi là 281 cặp bazơ (base pair-bp) và chỉ có các chủng cho sản phẩm PCR
có kích thƣớc nhƣ vậy mới có tính độc (Opina et al., 1997).
1.1.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum.
a. Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum
Trong hơn 40 n m qua, nhiều tác giả sử dụng khái niệm nòi và biovar để phân
biệt đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R. solanacearum. Biovar của vi khuẩn R.
solanacearum đƣợc xác định dựa trên khả n ng chuyển hóa cacbon hydrat, cụ thể là
khả n ng ô xy hóa 3 đƣờng đôi (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rƣợu Hexo - cacbon
(dulcitol, manitol, sorbitol) [25]. Hiện nay, 5 biovar của vi khuẩn R. solanacearum đã
đƣợc ghi nhận bao gồm:
- Biovar 1: không oxy hóa cacbon hydrat.
- Biovar 2: oxy hóa đƣờng nhƣng không oxy hóa rƣợu.
- Biovar 3: oxy hóa tất cả cacbon hydrat.
- Biovar 4: chỉ oxy hóa rƣợu.
- Biovar 5: oxy hóa lactose, maltose, cellobiose và manitol nhƣng không oxy hóa

sorbitol, dulcitol.
Các mẫu R. solanacearum thuộc biovar 2 phân lập từ vùng Amazon (châu Mỹ)
có đặc tính sinh hóa khá khác biệt (dựa trên khả n ng sử dụng đƣờng ribose và đƣờng

trehalose).Nhóm này đƣợc đặt tên là biovar 2-T (hoặc N2) còn biovar 2 gốc đƣợc đổi
thành biovar 2-A (Hayward, 1995b).
Biovar 1, biovar 3 và biovar 4 gây hại cho lạc còn biovar 2 và biovar 5 không
gây bệnh cho lạc. Biovar 1 gây bệnh trên lạc ở Mỹ, còn hầu hết các chủng gây bệnh
trên cây lạc ở các nƣớc châu Á, châu Phi chủ yếu là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1.
10


Theo Wu et al. (2013), 11 chủng của vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ các tỉnh
khác nhau của Trung Quốc thuộc biovar 3.
Buddenhahem và Kelman (1964), Hayward (1964), He et al. (1983) đã phân
chia các chủng vi khuẩn R. solanacearum thành 5 nòi (race) dựa trên phổ ký chủ. N m
nòi của R. solanacearum gồm:
Nòi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà (Solanaceae)
và một số cây họ đậu (Leguminoseae), phân bố chủ yếu ở vùng đất thấp của vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới. Nòi 1 gồm biovar 1, biovar 3 và biovar 4.
Nòi 2 (race 2): Gây bệnh trên chuối (Heliconia spp.) ở miền Trung và Nam Mỹ
gồm biovar 2 và biovar 3.
Nòi 3 (race 3): Phạm vi ký chủ hẹp gây bệnh chủ yếu cho khoai tây, cà chua và
đƣợc tìm thấy ở vùng ôn đới vĩ độ cao và ở những vùng nhiệt đới cao. Nòi 3 chỉ có
biovar 2.
Nòi 4 (race 4): Gây hại trên gừng, tìm thấy chủ yếu ở Philippines. Nòi 4 chỉ có
biovar 4.
Nòi 5 (race 5): Gây hại trên cây dâu tằm, lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Trung
Quốc. Nòi 5 chỉ có biovar 5.
Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng các nguồn vi khuẩn R.

solanacearum phân lập đƣợc kiểm tra đều có tính độc cao đối với cây lạc và một số
cây ký chủ khác, các mẫu phân lập đƣợc đều thuộc nòi 1, biovar 3 và biovar 4.
Đỗ Tấn Dũng (1999) cho rằng, tác nhân gây ra bệnh HXVK trên cây cà chua, cà

pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình đều do loài vi khuẩn R. solanacearum Smith,
thuộc nòi 1, biovar 3. Các chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập từ các cây ký
chủ đều có khả n ng lây bệnh chéo cho nhau, mức độ nhiễm bệnh khác nhau, điều đó
thể hiện tính độc, tính gây bệnh giữa các chủng vi khuẩn cũng khác nhau.
Qua một số kết quả nghiên cứu công bố gần đây cho thấy ở nƣớc ta vi khuẩn
gây bênh héo xanh ở cây và chua thuộc division Châu Á (Lê Lƣơng Tề, 2002), Race 1,
biovar 3 và 4 (Nguyễn Thị Yến, 2002).
b. Chủng
Cho tới nay, không có một định nghĩa chính thức về chủng (strain) của vi khuẩn
R. solanacearum. Các tác giả trên thế giới thƣờng sử dụng thuật ngữ chủng để chỉ các

11


mẫu vi khuẩn R. solanacearum khác nhau về bất cứ đặc điểm nào nhƣ nguồn gốc phân
lập, hình thái, sinh học, sinh thái và di truyền.
Chủng của vi khuẩn R. solanacearum khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ, phân
bố, độc tính, mối quan hệ dịch tễ và đặc tính sinh lý của vi khuẩn (Buddenhagen và
Kelman, 1964). Bên cạnh phƣơng pháp truyền thống xác định nòi dựa vào phạm vi ký
chủ và xác định biovar dựa vào phản ứng sinh hóa, nhờ thành tựu của sinh học phân tử,
ngày nay phân tích DNA trở thành phƣơng pháp chính xác và phù hợp để xác định
chủng nhiều loại ký sinh.
Nguyễn V n Tuất và cs. (2007) đã phân tích tính đa hình của 25 chủng vi khuẩn
với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy có sự sai khác về mặt di truyền của chúng và phân chia
thành 2 nhóm gồm nhóm I và nhóm II.
c. Loài phức
Khi phân tích đa dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh, Gillings và Fahy (1993) đã
nhận thấy vi khuẩn R. solanacearum rất đa dạng và gợi ý rằng vi khuẩn này có lẽ là
một loài phức (complex species). Theo Fegan và Prior (2005) “loài phức” là một tập
hợp các cá thể có quan hệ gần gũi nhƣng thuộc các loài khác nhau. Các nghiên cứu đa

dạng vi khuẩn dựa trên lai DNA cho thấy vi khuẩn héo xanh cực kỳ đa dạng với mức
độ tƣơng đồng DNA của các mẫu vi khuẩn thƣờng < 70% (là ngƣỡng thƣờng đƣợc sử
dụng để phân biệt vi khuẩn ở mức loài). Hiện nay, vi khuẩn R. solanacearum chính
thức đƣợc xem là một loài phức (Meng, 2013).
d. Kiểu gây bệnh
Các chủng vi khuẩn héo xanh còn đƣợc phân biệt thành các kiểu gây bệnh
(pathotype) dựa trên phản ứng đối với một loại cây trồng nào đó. Theo Tan et al.
(1994), 36 mẫu vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ 6 tỉnh của Trung Quốc đã đƣợc
xếp thành 7 kiểu gây bệnh khác nhau cụ thể dựa trên độc tính của chúng đối với 6
giống lạc chỉ thị (Xiekangking, Taishan sanlirou, Huangchuan zhigan, Lukang qing,
Fuhua Sheng, Ehua 1).
e. Kiểu quan hệ phả hệ
Gần đây, một hệ thống phân loại nữa gọi là kiểu quan hệ phả hệ (phylotype) 20
đã đƣợc áp dụng nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn R. solanacearum. Cách phân loại
này dựa trên phân tích trình tự các gen mã hóa nhƣ gen 16S RNA ribosome, gen egl,
gen hrpB, và gen mutS (Poussier et al., 2000; Allen et al., 2005; Prior và Fegan, 2005).
12


Có 4 phylotype (Denny, 2006) đã đƣợc ghi nhận và phân tích cho thấy các phylotype
tƣơng quan với nguồn gốc địa lý của các chủng: phylotype I gồm các chủng chủ yếu từ
châu Á, phylotype II từ châu Mỹ, phylotype III từ châu Phi và các đảo thuộc Ấn Độ
Dƣơng và phylotype IV từ Indonesia (Remenant et al., 2011). Nhìn chung, phylotype
là hệ thống phân loại rất ổn định và có ý nghĩa về mặt tiến hóa đối với phức hợp loài vi
khuẩn R. solanacearum (Meng, 2013).
1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam và trên Thế giới
a. Nghiên cứu bệnh héo xanh trên thế giới
Vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân bố rộng rãi khắp các nƣớc trên thế giới. Đã từ
lâu vi khuẩn Ralstonia solanacearum đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm,
nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum đã đƣợc công bố và đƣa

ra những kết quả rất có ý nghĩa khoa học kỹ thuật và trong sản xuất nông nghiệp.
Tại Đài Loan bằng phƣơng pháp PCR với cặp primer PS-IS đặc hiệu với vi
khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc race 1, kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum thu thập trên cà chua, khoai tây, ớt, lạc, cà tím và nhiều loại
cây trồng khác đều thuộc race 1 (Yung-An Lee, 2001).
Phân tích trên 120 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà chua,
khoai tây, cà tím, ớt và nhiều loại cây trồng khác từ Châu Á, Mỹ, Âu, Phi và châu Đại
Dƣơng cho thấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc division Châu Á thƣờng bao
gồm biovar 3 và 4, divison Châu Mỹ thƣờng bao gồm biovar 1 và 2.
Tác giả đã phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum từ cây cà chua có triệu
chứng héo xanh, nƣớc tƣới và đất. Phân tích gen gây bệnh thu đƣợc cặp mồi (Hrp_rs
2F:
5'-AGAGGTCGACGCGATACAGT-3'
và
Hrp_rs
2R:
5'CATGAGCAAGGACGAAGTCA-3') để khuếch đại bộ gen của vi khuẩn. DNA của 27
mẫu vi khuẩn R. solanacearum thuộc nòi 1 biovar 3 và 4 . Độ đặc hiệu của mồi đã
đƣợc thử nghiệm trên 13 chủng R. solanacearum so sánh vs nhóm vi khuẩn khác nhƣ
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, X. campestris pv. campestris, và X. citri subsp. citri.
Sản phẩm của đoạn mồi khuếch đại gen của R. solanacearum tại 323 bp.[32]
b. Nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum cũng đƣợc nhiều nhà nghiên cứu tại Việt
Nam điều tra và nghiên cứu.

13


Trƣơng Thị Hồng Hải và cs, 2016 “nghiên cứu đa dạng di truyền của các chủng
vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith ở một số tỉnh miền Bắc bằng chỉ thị RAPD”.

Đề tài đƣợc thực hiện nhằm đánh giá đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum Smith đƣợc thu thập ở các vùng trồng cây họ cà và bầu bí ở
miền bắc bằng chỉ thị phân tử RADP. Tổng số 100 chỉ thị phân tử RADP đƣợc dùng để
đáng giá kiểu gen của một số chủng vi khuẩn đại diện cho cây họ cà và bầu bí , trong
đó có 44 chỉ thị biểu hiện đa hình. Tuy nhiên , trong số các chỉ thị đa hình chỉ có 21 chỉ
thị phân tử RADP khuếch đại các đoạn DNA rõ nét và ổn định và đƣợc chọn để đánh
giá kiểu gen của 26 chủng vi khuẩn. Sản phẩm PCR của chỉ thị RADP đƣợc phân tích
bằng phần mềm NTSYSpc2.1. Kết quả cho thấy 26 chuẩn vi khuẩn đƣợc chia thành 6
nhóm chính.
Ngoài ra, bà và cs đã nghiên cứu thêm ở một số tỉnh miền Nam. Trong nghiên
cứu này , đã sử dụng 24 chỉ thị RADP để nghiên cứu đa dạng di truyền của 19 chủng vi
khuẩn Ralstonia solanacearum Smith đại diện cho một số vùng sinh thái khác nhau ở
Miền Nam đã thu đƣợc tổng số 923 b ng DNA. Dựa vào mức độ tƣơng đồng về hệ số
di truyền , 19 chủng vi khuẩn đƣợc chia thành 5 nhóm chính. Nhƣ vậy, các chuẩn vi
khuẩn Ralstonia solanacearum đƣợc thu thập trên các kí chủ khác nhau có sự khác biệt
về di truyền cao hơn so với các chủng ở các vùng sinh thái khác nhau.
Ngọ V n Ngôn và cs đã nghiên cứu và sử dụng 10 đoạn mồi RAPD để đánh giá
đa dạng di truyền của một số chủng vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại
lạc bao gồm: OPAB5, OPAL8, OPAK14, OPB7, OPC2, OPC15, OPE17, OPE18,
OPE19 và OPE20. Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các
phân đoạn DNA khi so sánh giữa các chủng với nhau trong cùng 1 mồi. Số phân đoạn
DNA nhân bản dao động từ 8 đến 30 phân đoạn tùy thuộc vào từng loại mồi RAPD
khác nhau. Kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy tất cả 10 mồi nghiên cứu đều cho đa hình.
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi
so sánh giữa các chủng với nhau trong cùng một mồi.[13]
1.2. Tổng quan về kỹ thuật RAPD
Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với
các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở
vị trí bắt mồi [17].

14