Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 trong điều trị chống ngưng tập tiểu cầu bằng thuốc clopidogrel trên bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da

MẪU 14/KHCN

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3839 /QĐ-ĐHQGHN ngày 24 tháng10 năm 2014
của Giám đốc Đại học Quốc gia Hà Nội)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO TỔNG KẾT
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài: Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 trong điều trị

chống ngưng tập tiểu cầu bằng thuốc Clopidogrel trên bệnh
nhân can thiệp động mạch vành qua da
Mã số đề tài: QG.15.32
Chủ nhiệm đề tài: Trịnh Hoàng Hà


PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG

1.1. Tên đề tài: Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 trong điều trị chống ngưng tập

tiểu cầu bằng thuốc Clopidogrel trên bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua
da.
1.2. Mã số: QG.15.32
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT

Chức danh, học vị, họ và tên

Đơn vị công tác

Vai trò thực hiện đề tài

1.

PGS.TS. Trịnh Hoàng Hà

Khoa Y Dược, và Bệnh Chủ nhiệmđề tài
viện ĐHQGHN

2.

PGS.TS. Dương Thị Ly Hương

Khoa Y Dược,
ĐHQGHN

Thư ký đề tài

3.

TS. Vũ Thị Thơm

Khoa Y Dược,
ĐHQGHN

Thành viên, tham gia thực hiện
nội dung 1

4.

CN. Nguyễn Hoàng Long

Khoa Y Dược,
ĐHQGHN

Thành viên, tham gia thực hiện
nhóm nội dung 2,3,4,5

5.

ThS.Vũ Ngọc Trung

Bệnh viện ĐHQGHN

Thành viên, tham gia thực hiện
nhóm nội dung 2,3,4,5

6.

PGS.TS. Nguyễn Lân Hiếu

Viện tim mạch quốc gia Thành viên, tham gia thực hiện
nhóm nội dung 2,3,4,5

7.

ThS. Chu Dũng Sỹ

Bệnh viện ĐHQGHN

Thành viên, tham gia thực hiện
nhóm nội dung 2,3,4,5

8.

ThS. Phạm Thị Hồng Nhung

Khoa Y Dược,
ĐHQGHN

Thành viên, tham gia thực hiện
nội dung 1

9.

Ths. Nguyễn Văn Chương

Bệnh viện đa khoa Vân Thành viên, tham gia thực hiện
Đình
nội dung 2

1.4. Đơn vị chủ trì: Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội
1.5. Thời gian thực hiện
1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 02 năm 2017
1.5.2. Gia hạn (nếu có): đến tháng 02 năm 2018
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 11 năm 2017
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên

nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)
1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 460 triệu đồng.
PHẦN II. TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Đặt vấn đề: Các bệnh tim mạch, đặc biệt là bệnh động mạch vành (ĐMV), hiện nay đứng
hàng đầu về tỷ lệ mắc và tử vong ở hầu hết các nước trên thế giới. Bệnh ĐMV bao gồm: cơn
đau thắt ngực ổn định (ĐTNKÔĐ), cơn đau thắt ngực không ổn định(ĐTNKoÔĐ) và nhồi máu
1


cơ tim (NMCT) rất thường gặp, để lại hậu quả trầm trọng về sức khoẻ cũng như kinh tế nếu
không được phát hiện và điều trị kịp thời [1].
Từ năm 1997, can thiệp ĐMV qua da được xem như một chiến lược tái thông mạch
máu hiệu quả của bệnh mạch vành. Có khoảng 1,2 triệu ca can thiệp được thực hiện mỗi
năm ở Mỹ và khoảng 2 triệu ca/năm trên toàn thế giới. Số liệu cũng cho thấy số ca can thiệp
tăng gấp 5 lần sau mỗi thập kỷ. So với điều trị nội khoa, can thiệp ĐMV đã làm giảm tỉ lệ
biến chứng ở người bệnh NMCT cấp hay ĐTNKoÔĐ nguy cơ cao, cũng như làm giảm mức
độ đau ngực và cải thiện chất lượng cuộc sống ở người bệnh ĐTNÔĐ [1],[2].
Stent phủ thuốc ngày càng được dùng nhiều ở Việt nam cũng như trên thế giới, ưu
điểm là giảm tỷ lệ tái hẹp trong stent, giảm tỷ lệ phải can thiệp tái tưới máu nhưng sau khi
can thiệp đặt stent phủ thuốc, người bệnh có tỷ lệ huyết khối cao hơn và phải dùng thuốc ức
chế ngưng tập tiểu cầu (NTTC) kéo dài hơn đối với người bệnh đặt stent thường [3],[4].
Cho đến nay clopidogrel vẫn là thuốc đầu tay cùng với aspirin được chỉ định để dự
phòng huyết khối cũng như các biến cố tim mạch khác cho người bệnh sau can thiệp ĐMV
qua da có đặt stent. Tuy nhiên vẫn còn một tỷ lệ đáng kể người bệnh còn nguy cơ tử vong,
NMCT, đột quỵ, huyết khối trong stent liên quan đến giảm khả năng ức chế tiểu cầu của
clopidogrel [5],[6].
Clopidogrel là một tiền chất không hoạt tính, đòi hỏi hoạt hóa ở gan bởi cytochrome
P450 trong đó chủ yếu là CYP2C19 để trở thành chất có hoạt tính, chất hoạt tính này ức chế
không hồi phục thụ thể P2Y12 của ADP tiểu cầu [7],[8].

Enzym CYP2C19 có tính đa hình cao, tùy theo sự xuất hiện các allen đột biến trong
kiểu gen sẽ quy định biểu hiện hoạt tính enzym bình thường (*1), giảm hoặc mất (*2
,*3,*4,*5,*6,*7,*8) và tăng (*17) [9].
Ở những người có hoạt tính enzym CYP2C19 bình thường hoặc tăng, liều
clopidogrel là 75 mg/ngày, dùng hàng ngày với thời gian tối ưu 1 năm có thể làm giảm đáng
kể các biến cố tim mạch. Tuy nhiên, những người có kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 thì liều
clopidogrel phải là 225 mg/ngày mới có được hiệu quả tương đương, còn với kiểu gen đồng
hợp tử CYP2C19*2 thì liều có lên tới 300 mg/ngày cũng không có tác dụng và phải chuyển
sang thuốc khác [10].
Một số nghiên cứu ở các quốc gia châu Á cho thấy tần số xuất hiện CYP2C19 loại *2
và *3 khá cao: 29% và 8,9% (tương ứng) đối với người Đông Á, 35% và 2,4% (tương ứng)
đối với người Trung và Nam Á [3],[11]. Với tần suất xuất hiện như trên, chắc chắn tỷ lệ tai
biến do clopidogrel ở người châu Á sẽ cao nếu dùng với liều khuyến cáo thông thường 75
mg/ngày.
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tính đa hình di truyền của enzym
CYP2C19, cũng như mối liên quan giữa đa hình di truyền enzym CYP2C19 với hiệu quả
điều trị của clopidogrel trên người bệnh can thiệp mạch vành qua da.
Xuất phát từ những vấn đề cấp bách trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 trong điều trị chống ngưng tập tiểu cầu bằng
thuốc Clopidogrel trên bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da”.
2. Mục tiêu:

Chúng tôi nghiên cứu đề tài này nhằm 3 mục tiêu:
2


1. Xây dựng được quy trình xác định kiểu gen CYP2C19.
2. Xác định được tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 ở người bệnh có can thiệp động
mạch vành tại một số bệnh viện ở Hà Nội.

3. Đánh giá được hiệu quả của việc phân tích đa hình gen CYP2C19 ứng dụng trong
điều trị chống ngưng tập tiểu cầu theo cá thể người bệnh sau can thiệp động mạch vành qua
da.
Trên cơ sở đó, đề xuất phác đồ điều trị chống ngưng tập tiểu cầu đối với người bệnh
đặt stent động mạch vành qua da.
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
Tất cả người bệnh sau đặt stent động mạch vành, tình trạng ổn định được chuẩn bị
dùng clopidogrel với liều duy trì 75mg/ngày phối hợp với Aspirin 100 mg/ngày. Loại trừ
những người bệnh trong tiêu chuẩn loại trừ dưới đây.
3.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Người bệnh phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào
khác ngoài aspirin và clopidogrel.
- Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng.
- Huyết động không ổn định.
- Tai biến mạch não dưới 3 tháng.
- Mới phẫu thuật dưới 1 tuần.
- Chống chỉ định dùng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu.
- Nguy cơ cao chảy máu.
- Suy thận, suy gan giai đoạn cuối.
- Không đồng ý tham gia nghiên cứu.
3.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2016-6/2017
- Địa điểm lấy mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam và Trung tâm Tim mạch Bệnh viện
Đại học Y Hà nội.
- Địa điểm nghiên cứu:
 Bộ môn Y Dược học cơ sở, khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội;
 Viện Tim mạch Việt Nam;
 Trung tâm Tim mạch Bệnh viện Đại học Y Hà Nội;

 Viện nghiên cứu hệ gen.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu ngang, có so sánh (comparative cross-sectional study).
3.2.2. Cỡ mẫu
- Cỡ mẫu: áp dụng công thức tính cỡ mẫu cho so sánh hai trị số trung bình:

3


μ1 = 71: mức độ % độ NTTC trung bình trong nhóm có CYP2C19*2 với clopidogrel
75mg (theo nghiên cứu trước đó).
μ2 = 57,5: mức độ % độ NTTC trung bình trong nhóm không có CYP2C19*2 với
clopidogrel 75mg (theo nghiên cứu trước đó) [12].
σ = 18,3: độ lệch chuẩn chung của 2 nhóm.
α = 0,05: mức ý nghĩa thống kê => Z(1-α/2) = 1,96
1-β = 0,80: lực mẫu => Z(1-β) = 0,84
Thay vào công thức, ta có cỡ mẫu cho mỗi nhóm là 29 người bệnh, cỡ mẫu với hệ số
thiết kế = 2 (tương ứng với hai cụm là hai bệnh viện nghiên cứu), ta có cỡ mẫu cho mỗi
nhóm là 58. Ước tính thêm 20% mẫu dự phòng bỏ cuộc => cỡ mẫu mỗi nhóm là 80. Tổng
cộng cỡ mẫu cần là 160 (người bệnh).
3.2.3. Chọn mẫu nghiên cứu.
- Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiện, chọn tất cả các người bệnh có chỉ
định đặt stent ĐMV qua da và điều trị dự phòng chống ngưng tập tiểu cầu bằng clopidogrel
75mg/ngày phối hợp với Aspirin 100 mg/ngày tại các địa điểm nghiên cứu cho đến khi đủ
cỡ mẫu. Người bệnh được lựa chọn hàng ngày dựa theo danh sách người bệnh dự kiến can
thiệp trong ngày tại trung tâm tim mạch bệnh viện Đại học Y Hà nội hoặc phòng can thiệp
tim mạch Viện Tim mạch Việt Nam.
 Sơ đồ chọn mẫu :
Người bệnh mắc bệnh mạch vành có

chỉ định chụp mạch vành xét can thiệp

Viện tim mạch ViệtNam

Bệnh viện Đại học Y Hà nội

Người bệnh được đặt stent động
mạch vành qua da
Và điều trị bằng clopdogrel
Xét nghiệm gen CYP2C19

Người bệnh mang gen kiểu
CYP2C19*1 or *17

Người bệnh mang gen
kiểu CYP2C19*2,*3

Tiếp tục điều trị
bằng clopidogrel

Chuyển điều trị bằng
Ticagrelor

4


3.3. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
3.3.1. Hóa chất
- Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT- Mỹ. Đây là mồi tự thiết kế.
- Lambda DNA/HindIII Marker, code: SM0103, hãng: Fermentas.

- GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code: SM0321, hãng Thermo Scientific.
- Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng: Neb (New England Biolabs).
- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code : D3392, hãng Omega-Biotek.
- GeneJET PCR Kit, hãng: Thermo Fisher Scientific.
- Chất kích tập là ADP 5 µM của hãng Nippon Corporation (Nhật bản).
3.3.2. Thiết bị
- Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh).
- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức).
- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ.
- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ.
3.4. Các bước nghiên cứu
3.4.1. Kỹ thuật xét nghiệm gen CYP2C19
- Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
Cách lấy mẫu: 4ml máu lấy từ tĩnh mạch được chứa vào ống chuyên dụng chứa sẵn chất
chống đông EDTA, đảm bảo không bị nhiễm bẩn và không bị lẫn các mẫu với nhau bằng cách
ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và mã code. Mỗi ống máu đủ cho nhiều hơn 1 lần tách DNA
tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định
được kiểu gen của bệnh nhân.
Cách bảo quản: Tại địa điểm thu nhận, mẫu được bảo quản trong điều kiện ngăn đá tủ
lạnh dân dụng không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh
học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia
Hà Nội. Mẫu máu được giữ lạnh ở -300C cho đến khi được sử dụng.
Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã người bệnh, tên, tuổi, ngày
lấy mẫu. Thông tin về mẫu máu của người bệnh phải được lưu trong sổ với các thông tin:
tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
- Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
+ Tách chiết DNA tổng số:
Nguyên lý: Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số. Nguyên lý của
kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện
nhất định với 4 giai đoạn chính: Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA liên kết với màng

silica-gel; Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer; Thu nhận DNA.
+ Kiểm tra chất lượng DNA tổng số:
Sản phẩm DNA sau quy trình tách chiết được kiểm tra theo hai phương pháp:
(1) Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang
Quy trình thao tác chung gồm các bước sau:
 Đo Blank: đo với môi trường dùng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA.
 Đo mẫu DNA.
5


Các mẫu được đo ở bước sóng 260nm và 280nm, mỗi mẫu DNA được đo ít nhất 2
lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu. Thực nghiệm trên được tiến
hành tại Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y dược, ĐHQGHN sử dụng máy Eppendorf Bio
Photometer Plus.
(2) Kiểm tra chất lượng DNA thông qua điện di
 Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 1,5% pha trong đệm TAE 1X, hiệu điện
thế 70 V trong 60 phút.
 Thể tích mẫu điện di: 5 µl mẫu + 1µl DNA 6X loading dye, 5 µl Ruler 100.
- Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, *3, *17 bằng PCR và kiểm tra
chất lượng sản phẩm
Nguyên lý: Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn.
Nguyên lý của kỹ thuật là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên các DNA mới từ 1
DNA khuôn ban đầu. Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khuôn, mồi, dung dịch
đệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP), DNA polymerase. Gồm 3 giai đoạn
chính:
Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95°C) để tách hai mạch của chuỗi DNA
xoắn kép.
Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào
sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào bản chất của mồi như trình tự và số lượng
Nucleotide của mồi.

Giai đoạn kéo dài: Tại 720C DNA polymerase sẽ hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotide
mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại deoxyrinucleotidtriphosphate [13].
Trình tự mồi và quy trình PCR cụ thể cho từng vùng gen chứa các alen *2, *3, *17
được trình bày dưới đây:
Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR:
Sử dụng phương pháp điện di tiến hành tương tự như điện di kiểm tra chất lượng
DNA sau khi tách chiết.
- Tinh sạch sản phẩm PCR
- Xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 sử dụng phương pháp cắt
bằng enzyme giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp GTT
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ pha loãng/cô đặc đến nồng 40-50 ng/µl và tiến
hành cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Để đảm bảo phản ứng cắt xảy ra hoàn toàn cũng như
kiểm tra độ lặp lại của phản ứng, mỗi mẫu sẽ được cắt (quá trình ủ) ở 2 thời gian trong vùng
thời gian cắt hoàn toàn tối ưu.
Sau khi có kết quả kiểu gen của SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3 sử dụng phương
pháp RFLP, để kiểm tra độ chính xác của phương pháp này, chúng tôi cũng tiến hành
phương pháp GTT ở 15 mẫu người bệnh đầu. Nếu kết quả của cả hai phương pháp cho kết
quả như nhau, điều đó cho thấy phương pháp RFLP được tối ưu tốt và cho kết quả chính
xác. Do đó, các mẫu người bệnh tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành phương pháp RFLP cho
xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3, vì phương pháp cho kết quả nhanh
và hiệu quả kinh tế cho người bệnh.
6


20µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu và sáng nét được gửi đi tinh sạch và giải trình
tự 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm
BioEdit version 7.1.9. Kết quả kiểu gen của các SNP dựa trên các pic thu được, với mỗi
SNP cũng cho ra 3 loại kiểu gen như đã nêu ở phương pháp RFLP.
- Xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*17 sử dụng phương pháp GTT
Do vị trí điểm đa hình của SNP CYP2C19*17 không có trình tự nhận biết cho

enzyme giới hạn, vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp GTT để xác định kiểu gen
CYP2C19*17. 20µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu và sáng nét được gửi đi tinh sạch và
giải trình tự 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng
phần mềm BioEdit version 7.1.9. Với alen CYP2C19*17: điểm đa hình thay thế C bằng T,
do đó alen CYP2C19*17 có kiểu gen dại: CC, dị hợp tử đa hình: CT và đồng hợp tử đa
hình: TT.
- Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19
Để tìm được kiểu gen của từng người bệnh trong nghiên cứu của chúng tôi, như đã
trình bày ở trên, chúng tôi cần tìm được kiểu gen của từng alen hay nói cách khác xác định
được từng SNP. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn 3 SNP: CYP2C19*2, CYP2C19*3
và CYP2C19*17 để phân tích. Mặc dù gen CYP2C19 còn một số SNP như CYP2C19*4,
*5, *6, *7, *8, nhưng tần số xuất hiện của các SNP rất thấp qua các nghiên cứu ở quần thể
người Châu Á, mức độ ảnh hưởng của chúng không nhiều cũng như hạn chế về mặt kinh
phí, nên với đề tài của chúng tôi đã coi các SNP này là alen kiểu dại (CYP2C19*1).
3.4.2. Xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu
Nguyên lý chung: khi cho thêm chất kích tập từ ngoài vào như ADP, collagen thì TC
có khả năng ngưng tập, qua đó phản ánh một trong những chức năng quan trọng của tế bào
này. Kỹ thuật đo độ ngưng tập tiểu cầu qua sự thay đổi mật độ quang học (phương pháp đo
quang) hoặc độ trở kháng được sử dụng phổ biến để đánh giá chức năng tiểu cầu [14].
Nguyên lý của phương pháp đo quang: một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố
định được dùng làm thiết bị đo độ NTTC. Một chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua một ống
chứa huyết tương giàu tiểu cầu và một chùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương
nghèo tiểu cầu. Khi đo, để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh sáng bị cản hoàn toàn và độ dẫn
truyền ánh sáng là 0%, người ta sử dụng một mẫu huyết tương giàu tiểu cầu của mẫu máu
cần đo. Bên cạnh đó, để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh sáng đi qua hoàn toàn và độ dẫn
truyền ánh sáng là 100%, người ta sử dụng huyết tương nghèo tiểu cầu của mẫu máu như
trên. Khi cho chất kích tập như ADP, collagen, thrombin, epinephrine, arachidonic acid,
ristocetin...vào huyết tương giàu tiểu cầu sẽ xảy ra hiện tượng các tiểu cầu ngưng tập với
nhau tạo thành đám vì vậy độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên. Độ dẫn truyền ánh sáng phản
ánh mức độ NTTC. Kết quả được thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyết tương

giàu tiểu cầu trong đó tiểu cầu đã ngưng tập tối đa [15].

7


Hình 2. Nguyên lý của xét nghiệm NTTC
(Nguồn: Principles of platelet aggregation in clinical trials, JAVA clinical Research)
Trị số bình thường [16]:
 Chất kích tập ADP: 59 - 88%.
 Chất kích tập COLLAGEN: 58 - 78%.
NTTC bị thay đổi trong nhiều bệnh rối loạn chức năng TC bẩm sinh và mắc phải. Ví
dụ như NTTC bị giảm với chất kích tập là ristocetin ở những người bệnh có hội chứng
Bernard Soulier (thiếu GP Ib) hoặc vWF; giảm ngưng tập với ADP ở những người bệnh
dùng aspirin...[17]
Tiến hành:
- Tiến hành trên máy Chrono – LOG của Mỹ.
- Sử dụng chất kích tập là ADP 5 µM của hãng Nippon Corporation (Nhật bản).
- Người bệnh được lấy máu tĩnh mạch theo cách thức không garo tĩnh mạch, để máu
tự chảy qua kim lấy máu vào ống xét nghiệm.
- Lấy 4 ml máu tĩnh mạch cho vào ống nhựa có sẵn chất chống đông citrat natri
3.8%, chống đông theo tỷ lệ 9 thể tích máu/1 tỷ lệ chống đông, sau đó nhẹ nhàng trộn đều
chất chống đông với máu.
- Làm xét nghiệm trong thời gian không quá 30 phút kể từ khi lấy máu. Vận chuyển
máu hết sức nhẹ nhàng, tránh vỡ hồng cầu.
- Các mẫu máu đo độ NTTC trước hết được đem ly tâm nhẹ với tốc độ 500
vòng/phút trong 10 phút để có được huyết tương giàu TC (cần phải có số lượng TC 200 –
400 G/l), sau đó đem ly tâm mạnh với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút để thu được
huyết tương nghèo TC; thực hiện trên máy ly tâm KUBOTA 5910 (Nhật Bản).
- Đánh giá độ NTTC dựa vào độ ngưng tập tối đa MA% (Maximum aggregation): chỉ số
NTTC ở người bình thường với chất kích tập ADP nồng độ 10 µM là 67±5%.

3.4.3. Thu thập các biến cố lâm sàng
- Các biến cố tim mạch bao gồm: Tử vong do mọi nguyên nhân, NMCT, đột quỵ,
huyết khối trong stent. Các tiêu chí an toàn: Chảy máu nặng không gây tử vong, chảy máu
nhẹ. Được thu thập khi người bệnh đang nằm viện, khám lại hàng tháng sau 1, 3, 6, 12
tháng.
- Các thông tin khác được thu thập qua thăm khám người bệnh lúc nằm viện:
8


+ Các thông tin chung của người bệnh: tuổi, giới, nghề nghiệp, địa lý.
+ Các yếu tố nguy cơ tim mạch: tăng huyết áp, tăng cholesterol máu, đái tháo đường,
hút thuốc lá, tiền sử gia đình.
+ Các xét nghiệm tình trạng lâm sàng: suy thận, EF, tiền sử NMCT.
+ Các xét nghiệm khác: số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu, hemoglobin.
3.4.4. Quy trình nghiên cứu
- Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:

3.5. Xử lý và phân tích số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0
Sử dụng các test thống kê: tính trị số trung bình, trung vị, T- test, 2, ANOVA test,
Fisher test…ở những chỗ phù hợp.
3.6. Đạo đức nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu được thông qua tại hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội, ngày 02/10/2015, theo mã số đề tài QG.15.32. Người bệnh trước khi
9


tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng
như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới người bệnh.
Những người bệnh tham gia nghiên cứu sẽ được ký bản đồng thuận tham gia

nghiên cứu. Người bệnh có quyền rút khỏi nghiên cứu bất kỳ lúc nào. Các thông tin của
người bệnh được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ được sử dụng cho mục đích nghiên
cứu.
4. Tổng kết kết quả nghiên cứu
4.1. Xây dựng được quy trình xác định kiểu gen CYP2C19.
Bước 1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm
Về lượng mẫu: 1.5 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chia đều vào 3 ống chuyên dụng
chứa sẵn EDTA chống đông (tối thiểu 300 µl máu/ ống). Mỗi ống máu đủ cho 1 lần tách
DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi
xác định được kiểu gen của người bệnh.
Cách bảo quản: Mẫu máu được giữ lạnh ở -200C cho đến khi được sử dụng. Nếu
không có tủ lạnh -200C, mẫu cần được giữ ở ngăn đá tủ lạnh dân dụng hoặc trong đá không
quá 1 ngày và không được giã đông trước khi tách DNA hoặc chuyển đến nơi có tủ -200C
để bảo quản.
Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã người bệnh, tên, tuổi,
ngày lấy mẫu. Thông tin về mẫu máu của người bệnh phải được lưu trong sổ với các thông
tin: tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
Bước 2. Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit
Chuẩn bị: Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng.
1. Lắc đều ống máu. Chuyển 250µl mẫu vào ống ly tâm vô trùng.
2. Thêm 25 µl OB Protease Solution và 250 µl BL Buffer. Lắc rung trong 10 giây.
3. Ủ 650C trong 10 phút. Chú ý: Sau khi ủ được 5 phút, Lắc rung trong 15 giây.
4. Thêm 260 µl Ethanol 100%. Lắc rung trong 20 giây.
5. Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên thành và
nắp ống.
Chú ý: tất cả các bước ly tâm phải cân và đối trọng các mẫu ly tâm.
6. Cài HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2ml.
7. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl).
8. Ly tâm14.000 vòng/ phút trong 1 phút.
9. Bỏ dịch lọc và Collection Tube.

10. Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml mới.
11. Thêm 500 µl HBC Buffer.
12. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút.
13. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube.
14. Thêm 700 µl DNA Wash Buffer.
15. Ly tâm trong 1 phút ở 10.000g.
16. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube.
17. Lặp lại các bước 14 đến16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer.
10


18. Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 vòng/ phút trong 2 phút để làm khô
cột.
19. Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới.
20. Thêm 100 µl Elution Buffer(đã làm ấm đến 650C). Ủ 650C trong 5 phút..
21. Ly tâm tại14.000 vòng/ phút trong 1 phút.
22. Thêm 50 µl Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
23. Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong1 phút.
24. Thu và bảo quản DNA ở -200C.
Bước 3. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số
- Kiểm tra chất lượng DNA thông qua điện di
Điều kiện điện di: Agarose 0.7%, đệm TAE 1X, điện di 60 V trong 60 phút, sử dụng
Lambda DNA/HindIII Marker. Như Hình 3, các mẫu có chất lượng tốt là các mẫu cho băng
điện di sáng, rõ, có 1 băng duy nhất tương ứng với băng 23,1 kb của Marker.

1 2 3M

Hình 3. Ảnh điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0.7%. Làn M: Lambda DNA/HindIII
Marker. Làn 1-3: DNA tổng số của bệnh nhân trong nghiên cứu.
- Xác định nồng độ DNA tổng số

Sử dụng máy quang phổ NP80 Nanophotometer để đo được nồng độ DNA của mẫu,
nồng độ DNA sẽ được máy tự động tính toán dựa vào giá trị A260 , A280 và số lần pha loãng
mẫu (nếu có). Quy trình thao tác chung gồm các bước sau:
- Đo mẫu trắng: đo với 1.5 µl môi trường dùng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA.
- Đo mẫu DNA:đo với 1.5 µl mẫu DNA, mỗi mẫu đo 2 lần và lấy giá trị trung bình
để xác định nồng độ DNA của mẫu.
Bước 4. Quy trình PCR
Điều kiện và thành phần của quá trình PCR nhân dòng các phân vùng gen chứa vị trí
đột biến tạo ra allen *2, *3 và *17 được trình bày trong Bảng 2, Bảng 3 và Bảng 4.
Bảng 2. Điều kiện và thành phần nhân dòng allen *2
Thành phần
Nồng độ hoạt động
DNA template
5-100 ng
dNTP mix, 2 mM
0.2 mM
Q5® Reaction Buffer 5X
1X
Mồi *2F 10 mM
0.25 µM
Mồi *2R 10 mM
0.25 µM
Q5 pol 2 u/µl
0.02 u/µl
Bảng 3. Điều kiện và thành phần nhân dòng allen *3
Thành phần
DNA template

Nồng độ hoạt động
40-170 ng

Điều kiện phản ứng
- Biến tính: 980C- 3 phút
- 35 chu kỳ:
+ 980C-10 giây;
+ 590C - 30 giây
+ 720C- 30 giây
- Kéo dài cuối: 720C- 5 phút
Điều kiện phản ứng
- Biến tính: 980C- 3 phút
11


dNTP mix, 2 mM
Q5® Reaction Buffer 5X
Mồi *3F 10 mM
Mồi *3R 10 mM
Q5 pol 2 u/µl

0.2 mM
1X
0.25 µM
0.25 µM
0.02 u/µl

- 35 chu kỳ:
+ 980C-10 giây;
+ 680C - 30 giây
+ 720C- 30 giây
- Kéo dài cuối: 720C- 5 phút

Bảng 4. Điều kiện và thành phần nhân dòng allen *17
Thành phần
Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template
40-170 ng
-Biến tính: 980C- 3 phút
- 35 chu kỳ:
dNTP mix, 2 mM
0.2 mM
+ 980C-10 giây;
Q5® Reaction Buffer 5X 1X
+ 680C - 30 giây
Mồi *3F 10 mM
0.25 µM
+ 720C- 30 giây
Mồi *3R 10mM
0.25 µM
- Kéo dài cuối: 720C- 5 phút
Q5 pol 2 u/µl
0.02 u/µl
Kết quả điện di được minh họa ở Hình 4. Kết quả điện di cho thấy các cặp mồi được
sử dụng là đặc hiệu, các yếu tố của quá trình PCR đã được tối ưu tốt. Các sản phẩm có thể
được sử dụng cho quy trình giải trình tự và RFLP.

Hình 4.Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân vùng chứa CYP2C19*2 (719bp, làn 2-1 đến 23),*3 (898bp,làn 3-1 đến 3-4), *17 (470bp,làn 17-1 đến 17-3) trên gel agarose 1%.Làn 2(-), 3(-),
17(-): Đối chứng âm. Làn M: Ruler 100 bp Plus DNA Ladder.

Bước 5. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR thông qua điện di
Điều kiện điện di: Agarose 1%, đệm TAE 1X, điện di 60 V trong 60 phút, sử dụng

Ruler 100 bp Plus DNA Ladder. Các mẫu có chất lượng tốt là các mẫu cho băng điện di
sáng, rõ, có 1 băng duy nhất.
Đánh giá độ nhạy và độ lặp lại của phương pháp PCR:

Để đánh giá độ nhạy của phân tích gen, chúng tôi tiến hành nhân dòng gen với các
nồng độ DNA khác nhau (Hình 4A-C). Kết quả nghiên cứu cho thấy, PCR nhân dòng thành
công với độ nhạy của mẫu DNA từ 5 ng trở nên. Kết quả điện di kiểm tra độ lặp lại được
minh họa ở Hình 4D. Kết quả điện di cho thấy các cặp mồi được sử dụng là đặc hiệu, các
yếu tố của quá trình PCR đã được tối ưu tốt. Các sản phẩm có thể được sử dụng cho quy
trình giải trình tự và RFLP.

12


Hình 5. Kết quả điện di trên gel agarose 1.5% kiểm tra độ nhạy của PCR với các mẫu có nồng độ
DNA khác nhau với allen CYP2C19*2 (hình A), *3 (hình B) và *17 (hình C) và độ lặp lại trên 3
mẫu (hình D). Làn M: DNA ladder. Làn ĐC (-), 2(-), 3(-), 17(-): đối chứng âm. Làn 2-1 đến 2-3:
CYP2C19*2 (719bp). Làn 3-1 đến 3-4: CYP2C19**3 (898bp). Làn 17-1 đến 17-3, CYP2C19*17
(470bp).

Bước 6. Chuẩn bị mẫu cho phân tích kiểu gen
25 µl phản ứng PCR sẽ được tinh sạch bằng kit E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit (Omegabiotek) theo quy trình khuyến cáo của hãng. Trước khi giải trình tự và cắt bằng enzym giới
hạn, sản phẩm PCR phải được tinh sạch và đo nồng độ DNA.
Bước 7. Phân tích kiểu gen
Cả 3 allen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17 đều có thể phân tích kiểu gen
bằng cách giải trình tự. 2 allen CYP2C19*2, CYP2C19*3 có thể phân tích kiểu gen thông
qua RFLP, phương pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thực hiện giảm đáng kể so với
giải trình tự.
7.1. Phân tích kiểu gen sử dụng giải trình tự
20µl sản phẩm PCR lên băng điện di đặc hiệu, đã được tinh sạch và có nồng độ tối

thiểu là 15 ng/µl tinh sạch sẽ được giải trình tự 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia). Kết
quả giải trình tự được mở bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9, dựa vào pic thu được,
chúng tôi sẽ đọc được kiểu gen trên từng allen của gen CYP2C19. Hình 5, 6, 7 thể hiện kết
quả kiểu gen lần lượt của allen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17. Trong nhóm
mẫu nghiên cứu, chúng tôi chưa thu được bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp về allen *17.

13


Hình 7. Kết quả Giải trình tự allen CYP2C19*17.

7.2. Phân tích kiểu gen bằng enzym cắt giới hạn
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ pha loãng/ cô đặc đến nồng 40-50 ng/ µl và tiến
hành cắt theo quy trình trình bày ở Bảng 5, 6.
Bảng 5. Phản ứng RFLP để xác định kiểu gen allen *2
Thành phần
Sản phẩm PCRallen *2 đã
tinh sạch
10X Buffer Tango

Thể tích
5 µl

SmaI 1U/µl

1 µl

Nước khử ion

8 µl

1 µl

Điều kiện phản ứng
- Ủ: 300C trong 2 điều kiện :1
giờ và 3 giờ
- Bất hoạt: 650C trong 20 phút

Bảng 6. Phản ứng RFLP để xác định kiểu gen allen *3
14


Thành phần
Sản phẩm PCRallen *3 đã
tinh sạch
10X FastDigest Buffer

Thể tích
5 µl

FastDigest BamHI

1 µl

Nước khử ion

8 µl

1 µl

Điều kiện phản ứng
- Ủ: 370C trong 2 điều kiện:5 phút
và 15 phút
- Bất hoạt: 800C trong 5 phút

Xác định kiểu gen của *2 dựa vào kết quả RFLP: Kiểm tra kết quả bằng điện di trên
agarose 1.5 % ở 100V trong 60 phút (so sánh với marker 100 bp):
Kiểu gen AA điện di cho 1 băng duy nhất kích thước 719 bp.
Kiểu gen GG điện di cho 2 băng có kích thước: 526 bp và 193 bp.
Kiểu gen GA điện di cho 3 băng có kích thước: 719, 526 và 193 bp.
Xác định kiểu gen của *3 dựa vào kết quả RFLP: Kiểm tra kết quả bằng điện di trên
agarose 1.5 % ở 100V trong 60 phút (so sánh với marker 100bp):
Kiểu gen AA điện di cho 1 băng duy nhất kích thước 898 bp.
Kiểu gen GG điện di cho 2 băng có kích thước: 523 bp và 375 bp.
Kiểu gen GA điện di cho 3 băng có kích thước: 898, 523 và 375 bp.
So sánh kết quả thu được từ giải trình tự và RFLP 2 allen CYP2C19*2, CYP2C19*3 ở
30 mẫu cho thấy độ tương đồng 100%. Kết quả RFLP các kiểu gen *2 và *3 được trình bày
trong Hình 8.

Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm RPLP của allen CYP2C19*2 và *3.
Làn M: 100 bp DNA ladder.
4.2. Tần số phân bố kiểu gen CYP2C19
Tổng số người bệnh tham gia nghiên cứu là 169 người, với tuổi trung bình là 64  11.
4.2.1. Tần số phân bố kiểu gen CYP2C19
Bảng 1. Tần số phân bố các kiểu gen CYP2C19 theo giới tính

15


Kiểu gen CYP2C19

*1*1

n
50

%
36,76

n
17

%
51,52

Tổng cộng
n
%
67
39,64

*1*2

56

41,18

10

30,30

66

39,05

*1*3

10

7,35

1

3,03

11

6,51

*2*2

12

8,82

4

12,12

16

9,47

*2*3

8

5,88

0

0

8

4,73

*3*3

0

0

1

3,03

1

0,59

136

100

33

100

169

100

Tổng số

Nam

Nữ

p

0,135

Sự khác biệt về tỉ lệ giới tính giữa các nhóm kiểu gen không có ý nghĩa thống kê
(p>0,05).
4.2.2. Tỷ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định
Bảng 2. Tỷ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định
Kiểu gen CYP2C19

Tổng số (n)

Nam

Nữ

Tổng cộng

n

%

n

%

n

%

Tác dụng kém

20

14,71

5

15,15

25

14,80

Tác dụng giảm

66

48,53

11

33,33

77

45,56

Tác dụng bình thường

50

36,76

17

51,52

67

39,64

Tổng số

136

100

33

100

169

100

p

0,253

* Tác dụng kém: (*2*2, *3*3, *2*3); giảm: (*1*2, *1*3); bình thường: (*1*1);
Sự khác biệt về tỉ lệ giới tính giữa các nhóm chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
4.2.3. Tỷ lệ người bệnh sử dụng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu theo kiểu gen
Bảng 3. Tần số và tỉ lệ người bệnh sử dụng thuốc chống NTTC theo kiểu gen
Loại thuốc sử dụng

Tổng
Ticagrelor
n
%
n
%

Tác dụng kém
7
23,33
25
14,80
Tác dụng giảm
12
40,00
77
45,56
Tác dụng bình thường
11
36,67
67
39,64
Tổng
30
100
169
100
P
0,349
Chưa thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về tỉ lệ sử dụng clopidogrel và
ticagrelor giữa các nhóm kiểu gen (p>0,05).
4.2.4. Chẩn đoán hội chứng động mạch vành cấp
Kiểu gen

Clopidogrel
n
%

18
12,95
65
46,76
56
40,29
139
100

16


Kiểu gen CYP2C19

Bảng 4. Chẩn đoán
NMCT không NMCT có ST
ĐTNKÔĐ
Tổng cộng
ST chênh lên
chênh lên
n
%
n
%
n
%
n
%

Tác dụng kém

10

40

7

28

8

32

25

14,8

Tác dụng giảm

25

32,47

16

20,78

36

46,75

77

45,56

Tác dụng bình thường

27

40,30

15

22,39

25

37,31

67

39,64

Tổng

62

100

38

100

69

100

169

100

p

0,651
Sự khác biệt về tỉ lệ các chẩn đoán hội chứng vành cấp giữa các nhóm không có ý
nghĩa thống kê (p>0,05).
4.3. Hiệu quả chống ngưng tập tiểu cầu liên quan đến kiểu gen CYP2C19
4.3.1. Kết quả độ NTTC theo kiểu gen ở nhóm sử dụng Clopidogrel
Bảng 5. Kết quả đo dộ NTTC theo kiểu gen ở nhóm sử dụng Clopidogrel
Nhóm kiểu gen
Độ NTTC

Tác dụng bình thường

Tác dụng giảm và
kém

56

83

Trung bình (X)

25,80

31,57

Độ lệch chuẩn (SD)

10,75

12,91

Số bệnh nhân (n)

p

0,0033

Kết quả phân tích cho thấy: ở những người bệnh sử dụng Clopidogrel, nhóm kiểu gen
tác dụng giảm có độ NTTC cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm tác dụng bình thường
(p=0,0033).
4.3.2. Kết quả độ NTTC của những người bệnh chuyển hóa giảm khi dùng
Clopidogrel và sau khi đã được chuyển sang dùng Ticagrelor
Bảng 6. Kết quả độ NTTC của những người bệnh chuyển hóa giảm khi dùng Clopidogrel
và sau khi đã được chuyển sang dùng Ticagrelor
Độ NTTC

Loại thuốc sử dụng

Mức chênh lệch
của độ NTTC

Clopidogrel

Ticagrelor

9

9

Trung bình (X)

36,44

18,88

17,55

Độ lệch chuẩn (SD)

16,23

15,31

16,43

Số bệnh nhân (n)

p

0,0352
Theo kết quả phân tích, độ NTTC ở nhóm người bệnhcó kiểu gen chuyển hóa giảm
(9 người) khi được can thiệp để chuyển sang dùng Ticagrelor (độ NTTC trung bình 18,9) đã
17


giảm hơn có ý nghĩa thống kê so với trước đó khi dùng Clopidogrel (độ NTTC trung bình
36,4) với p<0,05. Cụ thể, độ NTTC sau can thiệp có mức giảm trung bình là 17,55.
4.3.3. Kết quả độ NTTC theo kiểu gen và loại thuốc sử dụng
Bảng 7. Kết quả đo độ NTTC theo kiểu gen và loại thuốc sử dụng
Loại thuốc sử dụng
Tổng
Kiểu gen
Clopidogrel
Ticagrelor
n

X

SD

n

X

SD

n

X

P

SD

Tác dụng kém

18

32,83 13,73

7

14,29

8,90

25

27,64 15,02

Tác dụng giảm

65

31,22 12,76

12

14,42

8,59

77

28,60 13,61 <0,0001

Tác dụng bình
thường

56

25,80 10,75

11

7,45

6,15

67

22,79 12,20 <0,0001

Tổng

139 29,24 12,37

30

11,83

8,30

169

26,15 13,50 <0,0001

p

0,0224

0,0032

0,0853

Theo kết quả phân tích, độ NTTC ở nhóm bệnh nhân dùng Ticagrelor thấp hơn có ý
nghĩa thống kê so với nhóm dùng Clopidogrel ở tất cả các kiểu gen (p<0,05). Trong nhóm
sử dụng Ticagrelor không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa các
nhóm kiểu gen (p=0,0853). Ngược lại, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt đáng kể về độ
NTTC giữa các kiểu gen trong nhóm sử dụng Clopidogrel (p=0,0224). Cụ thể là nhóm tác
dụng kém (p=0,0137) và tác dụng giảm (p=0,0069) đều có độ NTTC cao hơn có ý nghĩa
thống kê so với nhóm tác dụng bình thường. Tuy nhiên giữa hai nhóm TD kém và TD giảm
không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p=0,3204).
4.3.4. Tỉ lệ xảy ra biến cố của nhóm người bệnh sử dụng Clopidogrel theo kiểu gen
Bảng 1. Tỉ lệ xảy ra biến cố NMCT (huyết khối) của của nhóm người bệnh sử dụng
Clopidogrel theo kiểu gen
Nhóm kiểu gen
Biến cố

Tác dụng giảm và kém

Tổng

Tác dụng bình thường

n

%

n

%

n

%

Có

3

3,49

0

0

3

2,11

Không

83

96,51

56

100

139

97,89

Tổng

86

100

56

100

142

100

p

0,1578
18


Theo kết quả phân tích trên những người bệnh sử dụng Clopidogrel, tỷ lệ xảy ra biến cố
NMCT (huyết khối) trong thời gian theo dõi ở nhóm có kiểu gen tác dụng giảm là 3,49%,
cao hơn so với nhóm tác dụng bình thường (tỉ lệ biến cố là 0%). Tuy nhiên sự chênh lệch
này chưa cho thấy có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 2. Tỉ lệ xảy ra biến cố tử vong của của nhóm người bệnh sử dụng Clopidogrel
theo kiểu gen
Nhóm kiểu gen
Biến cố

Tác dụng giảm và kém

Tổng

Tác dụng bình thường

n

%

n

%

n

%

Có

2

2,33

0

0

2

1,41

Không

84

97,67

56

100

140

98,59

Tổng

86

100

56

100

142

100

p

0,2504

Theo kết quả phân tích trên những người bệnh sử dụng Clopidogrel, tỷ lệ xảy ra biến
cố tử vong trong thời gian theo dõi ở nhóm có kiểu gen tác dụng giảm là 2,33%, cao hơn so
với nhóm tác dụng bình thường (tỉ lệ biến cố là 0%). Tuy nhiên sự chênh lệch này chưa cho
thấy có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 3. Tỉ lệ xảy ra biến cố chảy máu của nhóm người bệnh sử dụng Clopidogrel theo
kiểu gen
Nhóm kiểu gen
Biến cố

Tác dụng giảm và kém

Tổng

Tác dụng bình thường

n

%

n

%

n

%

Có

1

1,16

1

1,79

2

1,41

Không

85

98,84

55

98,21

140

98,59

Tổng

86

100

56

100

142

100

RR (KTC 95%)

0,65 (0,04 - 10,20)

p

0,7582

Theo kết quả phân tích trên những người bệnh sử dụng Clopidogrel, tỷ lệ xảy ra biến
cố chảy máu trong thời gian theo dõi ở nhóm có kiểu gen tác dụng giảm là 1,16%, thấp hơn
0,65 lần (RR=0,65 với khoảng tin cậy 95% là 0,04 - 10,2) so với nhóm tác dụng bình
19


thường (tỉ lệ biến cố là 1,79%). Tuy nhiên sự chênh lệch này chưa cho thấy có ý nghĩa thống
kê (p>0,05).
Bảng 4. Tỉ lệ xảy ra biến cố tái nhập viện (do mọi nguyên nhân) của nhóm người
bệnh sử dụng Clopidogrel theo kiểu gen
Nhóm kiểu gen
Biến cố

Tác dụng giảm và kém

Tổng

Tác dụng bình thường

n

%

n

%

n

%

Có

10

11,63

3

5,36

13

9,15

Không

76

88,37

53

94,64

129

90,85

Tổng

86

100

56

100

142

100

RR (KTC 95%)

2,17 (0,62 - 7,54)

p

0,2054

Theo kết quả phân tích trên những người bệnh sử dụng Clopidogrel, tỷ lệ xảy ra biến
cố tái nhập viện (do mọi nguyên nhân) trong thời gian theo dõi ở nhóm có kiểu gen tác dụng

giảm là 11,63%, cao gấp 2,17 lần (RR=2,17 với khoảng tin cậy 95% là 0,62 - 7,54) so với
nhóm tác dụng bình thường (tỉ lệ biến cố là 5,36%). Tuy nhiên sự chênh lệch này chưa cho
thấy có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 5. Tỉ lệ xảy ra biến cố tái nhập viện (không tính các trường hợp: xuất huyết,
NMCT, tử vong) của nhóm người bệnh sử dụng Clopidogrel theo kiểu gen
Nhóm kiểu gen
Biến cố

Tác dụng giảm và kém

Tổng

Tác dụng bình thường

n

%

n

%

n

%

Có

7

8,14

2

3,57

9

6,34

Không

79

91,86

54

96,43

133

93,66

Tổng

86

100

56

100

142

100

RR (KTC 95%)

2,28 (0,49 - 10,58)

p

0,2749

Theo kết quả phân tích trên những bệnh nhân sử dụng Clopidogrel, tỷ lệ xảy ra biến
cố tái nhập viện (không tính các trường hợp: xuất huyết, NMCT, tử vong) trong thời gian
20


theo dõi ở nhóm có kiểu gen tác dụng giảm là 8,14%, cao gấp 2,28 lần (RR=2,28 với
khoảng tin cậy 95% là 0,49 - 10,58) so với nhóm tác dụng bình thường (tỉ lệ biến cố là
3,57%). Tuy nhiên sự chênh lệch này chưa cho thấy có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
5. Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận
Chúng tôi đã hoàn thiện quy trình xét nghiệm gen CYP2C19, đảm bảo có thể áp
dụng tại các phòng thí nghiệm, xét nghiệm, cơ sở khám chữa bệnh có trang thiết bị sinh học
phân tử và phân tích DNA phù hợp.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi trung bình của người bệnh nghiên cứu là 64 
11, giới tính nam chiếm 80,4.So sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới về tuổi: có sự

tương đồng tuổi trung bình 64 (Hisao Ogawa và cs.) 63,8 11,0 (Guillaume Paré và cs.).
Tần số phân bố kiểu gen: Tần số *1*2 (39,05%) cao hơn so với kết quả nghiên cứu
PLATO (17%). Tần số *3 (11,83%) phù hợp với tỷ lệ xuất hiện allen này ở người châu á
(2-9%), cao hơn so với châu Âu và Mỹ (<1%).
Tỷ lệ người bệnh theo mức độ tác dụng dược lý do kiểu gen quy định với 14,80%
người bệnh tác dụng kém tỷ lệ này trên thế giới là (2-15%), trong đó 2-5% ở người da trắng
và châu Phi còn ở châu Á khoảng 15% giống như tỷ lệ trong nghiên cứu của chúng tôi.
45,56% người bệnh tác dụng giảm (18-45%), trong đó khoảng 15% ở người da trắng và
châu Phi còn ở châu Á là 29-35%. 39,64 % tác dụng bình thường so với trên thế giới (3550%) [13].
Về chẩn đoán hội chứng động mạch vành cấp, người bệnh của chúng tôi chủ yếu là
NMCT có ST chênh lên chiếm 40,82%, trong đó nhóm người bệnh có kiểu gen làm tác
dụng kém chiếm 32%, giảm chiếm 46,75%, kiểu gen bình thường chiếm 37,31%. Theo các
tác giả Nhật Bản trong nghiên cứu PRASFIT-ACS với 50% người bệnh là đau thắt ngực ổn
định và NMCT không ST chênh lên, trong đó nhóm người bệnh có kiểu gen làm tác dụng
kém là 20,1%, giảm là 44,6 %, và bình thường là 35,2%.
Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ người bệnh được dùng clopidogrel là 82,25%,
trong đó 13% có kiểu gen làm chuyển hóa thuốc kém, 47% làm giảm và 40% làm chuyển
hóa thuốc bình thường. Tỷ lệ dùng thuốc này cũng tương tự với các tác giả trên thế giới.
Theo Sammuel G. Johson và cộng sự 93% người bệnh dùng clopidogrel, 5% prasugrel và
chỉ có 2% người bệnh dùng Ticargrelor [3]. Trong thử nghiệm TRANSLATE-ACS 71,3 %
người bệnh dùng clopidogrel, và chỉ có 3,1 % người bệnh dùng Ticargrelor.
Độ NTTC ở nhóm người bệnh có kiểu gen làm tác dụng giảm 31,57 12,91 cao hơn
hẳnso với nhóm người bệnh có tác dụng bình thường (25,80  10,75) với p < 0,005.
Độ NTTC giảm đáng kể ở nhóm bệnh nhân có kiểu gen làm giảm tác dụng thuốc khi
dùng Clopidogrel (36,4  16,2) và được chuyển sang dùng ticargrelor (18,9 15,3) với p =
0,0352.
Trong nhóm dùng Clopidogrel có sự khác biệt rõ giữa các nhóm: độ NTTC ở nhóm
có tác dụng kém là 32,8313,73 và nhóm có tác dụng giảm là 31,2212,76 cao hơn so với
nhóm tác dụng bình thường là 25,8010,75 (p= 0,0137 và 0,0069); chưa có sự khác biệt
giữa độ NTTC giữa 2 nhóm tác dụng kém và tác dụng giảm với p= 0,3204.

Trong nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan phương trên người bệnh NMCT cấp ở thời
21


điểm 3 giờ sau khi được dùng liều nạp Clopidogrel và Aspirin độ NTTC là 24,27,8 ở thời
điểm sau 3 ngày là 31,97 16,9.
Sự khác biệt độ NTTC giữa các nhóm kiểu gen trong nghiên cứu của chúng tôi cũng
tương tự như một số nghiên cứu trên thế giới. Theo Jacob A. Doll, MD và các cộng sự PRU
trung bình sau 30 ngày trong nhóm có gen làm giảm tác dụng thuốc Clopidogrel là 230,9
cao hơn hẳn so với nhóm bình thường là 182,4 (HR: 39,93; 95% CI: 30.00 – 49,87) [8].
Antonio Tello–Montoliu và cộng sự khi so sánh độ NTTC giữa 2 nhóm người bệnh có gen
và không có gen làm chậm chuyển hóa thuốc: ở nhóm có *2: 54,2 12,5 so với nhóm không
có *2 là 47,1 14,3tuy nhiên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê với p=0,190[18].
Về các biến cố lâm sàng có thể gặp thì các trường hợp tử vong đều có kiểu gen làm
giảm chuyển hoá clopidogrel. Các biến cố chảy máu nặng đều xẩy ra ở các bệnh nhân có
kiểu gen chuyển hoá bình thường đặc biệt trường hợp xuất huyết não là trường hợp có kiểu
gen chuyển hoá thuốc bình thường, tuy nhiên lâm sàng có triệu chứng thiếu máu tái phát
nên dùng ticargrelor và sau đó đã được chuyển sang dùng clopidogrel trở lại.
Phác đồ đề nghị đối với điều trị kháng tiểu cầu cá nhân hóa với các thuốc chẹn
thụ thể P2Y12

22


Kết luận:
1. Tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 ở người bệnh đặt stent động mạch vành tại
một số bệnh viện ở Hà Nội bao gồm: tỷ lệ kiểu gen làm tác dụng bình thường là 39,64%;
làm giảm tác dụng là 45,56%; làm tác dụng kém là 14,80%.
2. Độ NTTC ở nhóm người bệnh có kiểu gen làm tác dụng giảm (31,57±12,91) cao
hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm người bệnh có tác dụng bình thường (25,80±10,75).

Độ NTTC ở nhóm người bệnh có kiểu gen làm giảm tác dụng thuốc khi dùng Clopidogrel
là (36,44±16,23) giảm đáng kể khi được chuyển sang dùng ticargrelor (18,88±15,31). Độ
NTTC ở nhóm có tác dụng kém (32,83±13,73) và nhóm có tác dụng giảm (31,22±12,76)
cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm tác dụng bình thường (25,80±10,75); chưa thấy có
sự khác biệt giữa độ NTTC giữa 2 nhóm tác dụng kém và tác dụng giảm.
3. Tỷ lệ các biến cố lâm sàng liên quan đến huyết khối gặp trong thời gian nghiên
cứu ớ nhóm người bệnh có kiểu gen làm giảm tác dụng thuốc clopidogrel cao hơn nhóm có
kiểu gen bình thường trong khi các biến cố chảy máu chỉ xẩy ra ở nhóm có kiểu gen bình
thường hoặc giảm. Tuy nhiên, chưa thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
6. Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
CYP2C19 là một trong những enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình hoạt hóa thuốc
chống ngưng tập tiểu cầu clopidogrel trong điều trị cho bệnh nhân sau đặt stent ĐMV. Allen
đột biến CYP2C19 *2 (c.681G > A), *3 (c.636G > A) và *17 (c. - 806C > T) gây thay đổi
hoạt tính của enzyme nên có thể dẫn đến khả năng đáp ứng thuốc khác nhau ở người bệnh.
Clopidogrel, ticagrelor, Prasugrel cùng với Aspirin thường được dùng cho các người bệnh
sau đặt stent ĐMV, trong đó Clopidogrel được dùng nhiều nhất. Một tỷ lệ đáng kể người
bệnh còn nguy cơ tử vong, NMCT, đột quỵ, huyết khối trong stent liên quan đến giảm khả
năng ức chế tiểu cầu của clopidogrel.
Xét nghiệm gen CYP2C19 và đo độ ngưng tập tiểu cầu là các xét nghiệm cơ bản để
đánh giá tình trạng hoạt hoá tiểu cầu.
Kết quả: Trong 169 người bệnh, tuổi trung bình 64  11; 80,47% Nam. Tỷ lệ có kiểu
gen làm tác dụng thuốc kém: 14,80%, giảm 45,56%, bình thường 39,64%. 82,25% người
bệnh được dùng Clopidogrel, 17,75% được dùng Ticagrelor. Độ NTTC ở nhóm dùng
Clopidogrel (29,24±12,37) cao hơn hẳn so với nhóm dùng Ticargrelor (11,83±8,30). Độ
NTTC ở nhóm người bệnh có kiểu gen làm tác dụng giảm (31,5712,91) cao hơn so với
nhóm người bệnh có tác dụng bình thường (25,80  10,75) với p < 0,005.
Độ NTTC giảm đáng kể ở nhóm người bệnh có kiểu gen làm giảm tác dụng thuốc
khi dùng Clopidogrel (36,44  16,23) và được chuyển sang dùng ticargrelor (18,88 15,31)
với p = 0,0352.
Trong nhóm dùng Clopidogrel có sự khác biệt rõ giữa các nhóm: độ NTTC ở nhóm

có tác dụng kém là 32,8313,73 và nhóm có tác dụng giảm là 31,22 12,76 cao hơn so với
nhóm tác dụng bình thường là 25,80  10,75 (p= 0,0137 và 0,0069); không có sự khác biệt
giữa độ NTTC giữa 2 nhóm tác dụng kém và tác dụng giảm với p= 0,3204.
Tỷ lệ các biến cố lâm sàng liên quan đến huyết khối gặp trong thời gian nghiên cứu ớ
nhóm người bệnh có kiểu gen làm giảm tác dụng thuốc clopidogrel cao hơn hẳn nhóm có
23


kiểu gen bình thường. trong khi các biến cố chảy máu chỉ xẩy ra ở nhóm có kiểu gen bình
thường hoặc giảm.
ASTRACT:
CYP2C19 is one of the principal enzymes involed in the antiplatelet prodrug
clopidogrel. Mutant alleles such as CYP2C19 *2 (c.681G > A), *3 (c.636G > A) and *17
(c. - 806C > T) have been associated with changing in enzyme activity, which may result in
the ability of various drug responses in patients. Clopidogrel, ticagrelor, Prasugrel with
Aspirin are commonly used in patients with acute coronary syndrome, in which clopidogrel
is most frequently used. Significant proportions of patients are at risk for death, MI, stroke,
and stent thrombosis associated with reduced platelet inhibitory capacity of clopidogrel.
The CYP2C19 genotyping and platelet aggregation measurements are the basic tests
to assess platelet activation.
In 169 consecutive patients (mean age: 64  11; 80.47% Male. Phenotypes based on
genotypes: 14,80% Poor metabolizer; 45,56% Intermediate metabolizer; 39,64% Extensive
metabolizer.
82.25% of patients used clopidogrel, 17.75% received ticagrelor. Platelet aggregation
in the clopidogrel group: 29.24  12.37 higher than the Ticagrelor group: 11.83  8.30 (p
<0.0001). Platelet aggregation levels were significantly reduced in patients with genotypic
effects with clopidogrel (36.44  16.23) and switched to ticargrelor (18.88  15.31) with p =
0.0352.
In the clopidogrel group: Platelet aggregation Poor metabolizer: 32.83  13,73;
Intermediate metabolizer: 31.22  12.76 significantly higher than Extensive metabolizer:

25.80  10.75 (p = 0.0137 and 0.0069).
The rate of clinical events associated with thrombosis encountered during the study
period in patients with genotypes that reduced the effects of clopidogrel was significantly
higher than that of the normal group. While bleeding events occur only in normal or reduced
genotypes.
Tài liệu tham khảo:
1. Hiền, N. T., & Đạt, P. Đ. (2011). Chăm sóc lâu dài bệnh nhân sau can thiệp động mạch
vành. Chuyên Tim mạch đề học.net, bản tin tổng hợp tháng 2 năm 2011.
2. Rupprecht, H. J., Blankenberg, S., Espinola-Klein, C., & Meyer, J. (2002). [Modern
therapy in acute coronary syndrome]. Med Klin (Munich), 97(4), 236–43. Retrieved
from />3. Hwang, S. J., Jeong, Y. H., Kim, I. S., Koh, J. S., Kang, M. K., Park, Y., … Hwang, J.
Y. (2011). The cytochrome 2C19*2 and *3 alleles attenuate response to clopidogrel
similarly in East Asian patients undergoing elective percutaneous coronary
intervention. Thromb Res, 127(1), 23–8. doi:10.1016/j.thromres.2010.10.021
4. Wang, Z. J., Zhou, Y. J., Liu, Y. Y., Yu, M., Shi, D. M., Zhao, Y. X., … Yan, Z. X.
(2009). Impact of clopidogrel resistance on thrombotic events after percutaneous
coronary intervention with drug-eluting stent. Thromb Res, 124(1), 46–51.
doi:10.1016/j.thromres.2008.10.007
5. Bonello, L., Tantry, U. S., Marcucci, R., Blindt, R., Angiolillo, D. J., Becker, R., …
Gurbel, P. A. (2010). Consensus and future directions on the definition of high on24