nhóm 14 phương pháp gián tiếp

Đại học Nông lâm TP.HCM
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO CHUYÊN NGÀNH

TẾ BÀO HỌC ĐỘNG VẬT
GV: Trần Thị Bích Liên
Chủ đề: Nhận biết sự phát triển của tế bào bằng phương pháp gián tiếp

Thành viên trong nhóm
1.Lê Nhật Tân

11126321

2.Lê Văn Vũ Linh

11126154

3.Nguyễn Lê Thụ Minh

11126164

4.Trần Thị Anh Thương

11126037

5.Đoàn Thị Mỹ Linh

11126016

6.Nguyễn Thị Kim Loan

11126155

Tháng 12,2012
0


Mục lục
Đặt vấn đề...................................................................................................................3
Chương I. Mở đầu................................................................................................4
I.1. Sự sinh trưởng của tế bào..............................................................5
I.2. Con đường sinh trưởng và phát triển của tế bào.......................5
Chương II. Nội dung............................................................................................6
II.1. Định nghĩa phương pháp gián tiếp.............................................6
II.2. Các phương pháp vật lý.............................................................6
II.3. phương pháp hóa học.................................................................18
II.4. Những nhân tố ảnh hưởng quá trình phát triển tế bào........21
Chương III. Kết luận..........................................................................................23
Tài liệu tham khảo..............................................................................................24

1


Đặt vấn đề
Xác định chính xác sự tăng trưởng tế bào là điều rất quan trọng để theo dõi một quá trình sinh
lý của động vật. Trực tiếp phương pháp để xác định các tế bào bao gồm đếm vi, điện tử đếm hạt,
giám sát sinh khối, và phân tích hình ảnh. Những phương pháp làm việc nhất chỉ đơn giản là khi
một mẫu khối lượng cố định có thể được lấy từ một bình nuôi cấy. Đếm hiển vi thì mất thời gian
nhưng dành lợi thế là cho phép khả năng sống được xác định nếu một loại thuốc nhuộm phù hợp.

Đếm hạt điện tử là một phương pháp nhanh chóng cho tái tạo mẫu, nhưng một số biến dạng dữ
liệu có thể xảy ra nếu mẫu có tế bào lớn, các mảnh vỡ hoặc tế bào cốt lõi. Việc sử dụng một đầu
dò sinh khối phát hiện các tế bào bởi các tính chất điện môi và có thể được sử dụng như một màn
hình liên tục của sự tiến bộ của một nền văn hóa. Phân tích dựa trên hình ảnh về việc sử dụng
hình ảnh máy ảnh kỹ thuật số được thông qua một kính hiển vi đã nâng cao nhanh chóng với sự
sẵn có của một số gói phần mềm thương mại có sẵn.
Phương pháp gián tiếp xác định tế bào liên quan đến việc phân tích hóa học của một quy trình
nuôi cấy, thành phần hoặc một số các hoạt động trao đổi chất. Những phương pháp này rất hữu
ích nhưng nó là khó khăn để có được mẫu tế bào nguyên vẹn. Tuy nhiên, mối quan hệ giữa các
thông số và số lượng tế bào có thể không được tính thông qua các giai đoạn của một quá trình
nuôi cấy tế bào. Việc xác định của axit nucleic (DNA) hoặc tổng số protein có thể được sử dụng
như một ước tính sinh khối, trong khi sự suy giảm của glucose có thể được sử dụng như một ước
tính của hoạt động tế bào. Các trạng thái tồn tại của tế bào có thể được đo bằng việc phát hành
một loại enzyme như lactate dehydrogenase (LDH) hoặc trực tiếp từ phí năng lượng trong tế bào
adenylate từ tế bào lysates. Ngoài ra, kỹ thuật phóng xạ có thể được sử dụng để cho chính xác
xác định tổng hợp protein của tế bào.
Sự phát triển của các tế bào động vật có vú trong nuôi cấy có thể được giám sát bởi một số các
thông số liên quan đến sự gia tăng sinh khối tế bào theo thời gian. Phương pháp đếm tế bào đơn
giản nhất là cách đếm tế bào đều đặn trong nuôi cấy tương ứng với thời gian tăng gấp đôi theo
ước tính của tế bào động vật có vú. Điều này cho thấy được sự sinh trưởng và phát triển của tế
bào.
Hai phương pháp tế bào đếm trực tiếp được sử dụng thường xuyên dựa trên kiểm tra trực quan
thông qua một kính hiển vi điện tử hoặc bằng một bộ đếm hạt. Cả hai phương pháp phụ thuộc
vào việc có một mẫu của một hệ thống các tế bào ổn định. Vì vậy, nó vô cùng quan trọng để đảm
bảo rằng việc nuôi cấy cũng được trộn lẫn bằng cách khuấy hoặc lắc trước khi lấy mẫu.
Phương pháp gián tiếp ước tính tăng trưởng tế bào dựa vào việc đo lường một thành phần tế
bào trong tế bào như DNA hoặc protein hoặc, cách khác, một ngoài thay đổi tế bào chẳng hạn
như sự suy giảm chất dinh dưỡng hoặc một hoạt động của enzyme được phát hành bởi các tế
bào. Phương pháp gián tiếp của dự toán tăng trưởng phụ thuộc vào mối quan hệ giữa các thông
số đo và nồng độ tế bào. Tuy nhiên, điều quan trọng là nhận ra rằng các mối quan hệ hiếm khi

tuyến tính trong quá trình nuôi cấy ghi dựng đường chuẩn. Nó cũng có ghi nhận rằng tổng hàm
lượng protein và mức độ hoạt động của enzyme cụ thể đo trên mỗi cơ sở tế bào thay đổi đáng kể
trong quá trình nuôi cấy như một kết quả của những thay đổi trong tốc độ tăng trưởng và thành
phần của môi trường nuôi cấy.

2


Trong một số trường hợp như có thể xảy ra, ví dụ, trong phản ứng sinh học tế bào cho phép đo
gián tiếp của tăng trưởng tế bào có thể là lựa chọn duy nhất. Điều này có thể được sử dụng để
theo dõi sự phát triển của quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, cần thực hiện nếu dữ liệu đó được sử
dụng trong phân tích so sánh giữa các môi trường nuôi cấy, như sự khác biệt có thể là một sự
phản ánh của những thay đổi trong chuyển hóa hoặc làm nồng độ tế bào tăng đáng kể.

I) Mở đầu:
I.1.Sự tăng trưởng của tế bào
Động vật cũng như nhiều loại sinh vật đa bào khác được cấu tạo từ các loại mô khác nhau.
Các mô được cấu tạo từ những tế bào cùng loại. Như vậy, tế bào là đơn vị cấu trúc nhỏ nhất của
một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống.
Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme
và các hoạt động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào,
khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân chia tế bào.
Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kết quả:
- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào.
- Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào.
Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng của tế bào động vật rất chậm. Do đặc điểm di
truyền, các tế bào vi khuẩn thường phân chia với tốc độ rất nhanh, khoảng 20-50 phút. Ở động
vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002). Nếu trong một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số
lượng một cách bất thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý.

Lưu ý: Khi nuôi cấy tế bào động vật cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi Trừ tế bào
máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá
đỡ để có thể sống và phân chia. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên
tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế
bào kiên tục từ mô bình
Hình 1.Các bào quan gồm: (1)hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, 4) túi tiết,(5) mạng lưới nội
chất (ER) hạt, (6) bộ máy Golgi, (7) khung xương tế bào, (8) ER trơn, (9) ty thể, (10) không bào,
(11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể.

3


I.2.Con đường
sinh trưởng và phát
triển của các tế bào.
1. Pha ức chế
Pha ức chế là pha
đầu tiên, nó phụ thuộc
rất nhiều yếu tố như
thành phần, mật độ,
trạng thái ban đầu của
tế bào... Pha này xảy
ra sớm, không tăng về
số luợng tế bào (số
lượng tế bào có thể
giảm). Nếu mật độ nuôi cấy và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này sẽ kéo dài
hơn.
2. Pha phát triển (pha lag)
Sau 3 – 4 ngày nuôi cấy, số lượng tế bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng. Trong chẩn đoán,
thường sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển)

Pha lag (hoặc pha tĩnh khởi đầu hoặc tiềm tàng) là thời kỳ khởi đầu của quá trình nuôi cấy,
trong suốt thời kỳ này sự thay đổi số lượng tế bào là bằng không hoặc không đáng kể. Mặc dù số
lượng tế bào không tăng lên,

4


3. Pha ổn định
Mật độ tế bào không tăng, tốc độ chết bằng tốc độ sinh trưởng. Sự sinh trưởng của tế bào bị
hạn chế do: Hết dinh dưỡng. Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể ức chế sự phát
triển của tế bào. Tế bào đã phủ kín trên chất nền, nên không còn chỗ bám và không thể sinh sản
tiếp được.
4. Pha tĩnh hay pha chết: Số lượng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm.
Sinh trưởng của quần thể tế bào thường bị hạn chế hoặc do sử dụng hết toàn bộ các chất dinh
dưỡng có sẵn hoặc do sự tích lũycác sản phẩm độc của sự trao đổi chất. Kết quả là tốc độ sinh
trưởng giảm và sự sinh trưởng cuối cùng đã dừng lại. Ở thời điểm này nuôi cấy được gọi là pha
5


tĩnh. Giai đoạn chuyển tiếp giữa pha hàm mũ và pha tĩnh bao gồm một thời kỳsinh trưởng
không cân bằng và trong suốt thời kỳ này các thành phần khác nhau của tế bào được tổng hợp ở
các tốc độ không bằng nhau. Kết quả là các tế bào trong pha tĩnh có một thành phần hóa học
khác với các tế bào trong pha hàm mũ.
Pha tĩnh thường được tiếp theo bởi pha chết mà trong đó các cơ thể trong quần thể bị chết. Sự
chết xuất hiện hoặc do sự suy yếu của việc bảo quản năng lượng của tế bào, hoặc do sự tích lũy
các sản phẩm độc tố. Giống như sự sinh trưởng, sự chết là một hàm mũ. Trong một số trường
hợp, cơ thể không chỉ chết mà còn phân hủy, một quá trình còn được gọi là sự phân giải.
Chính vì vậy việc quan sát sự phát triển của tế bào thường gắn với giai đoạn ổn định.

II) Nội dung:

II.1.Định nghĩa phương pháp gián tiếp là gì?
Là phương pháp không cần sử dụng kính hiển vi hoặc nuôi cấy tế bào động vật như phương
pháp đếm trực tiếp nhưng vẫn có thể nhận biết được sự phát triển của tế bào. Phương pháp này
thường được ứng dụng cho các nhà máy bởi việc tính toán tế bào là rất tốn kém thời gian cần có
1 phương pháp ước lượng mật độ tế bào đang phát triển để đi vào sản xuất.
II.2. Các phương pháp nhận biết sự phát triển của tế bào bằng phương pháp vật lý
2.1. Phương pháp đo độ đục của dinh dưỡng để xác định số lượng tế bào
Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hơn là dùng phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng.
Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Lúc nồng độ tế bào đạt đến 107 tế bào/ml
thì dịch nuôi cấy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cũng tăng theo và làm cản trở ánh
sáng đi qua dịch nuôi. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang phổ kế (spectrophotometer). Ở
một mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, giữa nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ
tuyến tính (hình 9). Chẳng hạn, thu tế bào trong một thể tích nhất định của dịch nuôi cấy, rửa
sạch đi rồi đo tổng lượng protein hay tổng lượng nitrogen, có thể thấy sự tăng lượng tế bào là
phù hợp với sự tăng tổng lượng protein (hay N). Cũng tương tự như vậy, việc xác định tổng
lượng chlorophyll có thể dùng để đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP có thể biết được sinh khối
của các vi sinh vật sống.
Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối. Khi số lượng tế bào
tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn và quang phổ kế sẽ đo
được mức độ tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng. Trên quang phổ kế có hai thang chia độ: phía

6


dưới là trị số hấp thụ ánh sáng, phía trên là mức độ thấu quang. Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng
lên thì mức độ thấu quang hạ xuống.
2.2. Định lượng DNA để xác định lượng tế bào bằng phương pháp quang phổ:
Một giao thức thường được sử dụng liên quan đến việc điều trị của các tế bào có khả năng hòa
tan với thuốc thử huỳnh quang liên kết với DNA. Phát hiện huỳnh quang cung cấp cao nhạy cảm
với thuốc thử như Hoechst 33.258 (8) hoặc 4e,6-diamidino-2-phenyl-indol (DAPI, 9) từ Sigma

Chemical Co.
1.Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base
purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260 nm – Optical
Density260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương
quan sau :
Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một nồng độ là :
- 50 μg/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.
- 40 μg/ml cho một dung dịch ADN hay ARN sợi đơn
Hàm lượng DNA được xác định bằng công thức:
[DNA] = OD260 x 50 x X (μg)
Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch DNA gốc ban đầu.
Phương pháp này đơn giản, nhanh, nhưng có hạn chế là giá trị đọc được về độ hấp thụ có thể
bị ảnh hưởng khi trong mẫu chứa RNA và protein. Trong thực tế phương pháp này thường được
dùng để định lượng các mẫu DNA tinh khiết.
Độ sạch DNA được xác định bằng tỉ số OD260/ OD280. Nếu tỉ số này > 1,8 thì dung dịch
DNA đem đo được coi là sạch. Khái niệm sạch ở đây là lượng protein còn lại trong dung dịch
DNA tách được.
OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 260 nm.
OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 280 nm.
n: Độ pha loãng (thường n = 100).

7


- Thực hiện: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến
nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: hút 5 µl dung dịch
DNA hòa tan với 495 µl TE 1X. Cho vào cuvet để tiến hành đo OD.
2.Vật liệu, hóa chất, dụng cụ
-

Dung dịch DNA

-

Dung dịch pha loãng DNA (TE)

-

Nước cất

-

Pipet

-

Ống đong

-

Máy quang phổ phân tích DNA / RNA

-

Bếp cách thủy

3.Tiến hành
-

Pha loãng dung dịch ADN ra 50, 100 lần từ dung dịch gốc 50 μl ADN.

- Cho 2 ml dung dịch ADN pha loãng vào cuvet và tiến hành đo ra giá trị OD ở bước sóng
260 nm và 280 nm ghi kết quả thu được.
- Lấy 2 ml dung dịch ADN vào ống effpendof đun cách thủy ở nhiệt độ 90 – 1000C (đun
nước sắp sôi thì cho ống vào, đun khoảng 2 -5 phút) để làm biến tính ADN.
II.2.2Phương pháp đếm gián tiếp bằng cách đo điện trở
Phương pháp gián tiếp để xác định sinh khối tế bào dựa trên phép tính hệ số tỷ lượng toàn
phần (overall stoichiometry) cho sự sinh trưởng và tạo thành sản phẩm, có thể được trình bày
trong một dạng chung như sau:
nguồn carbon+ nguồn nitrogen + phosphate + O2 → sinh khối tế bào + CO2+ H2O + sản
phẩm
Sự thay đổi sinh khối tế bào có thể được kiểm soát gián tiếp bằng cách xác định sự tiêu thụ
chất dinh dưỡng, tạo thành sản phẩm,các thành phần tế bào, giải phóng nhiệt hoặc các tính chất
vật lý khác của dịch nuôi cấy tế bào.
8


Biểu đồ 2.2 thể hiện mối quan hệ với điện trở và nhiệt độ đối với sự phát triển của tế bào
Máy đếm Coulter
Máy đếm Coulter là một thiết bị chuyên dùng cho việc đếm và đo kích thước các hạt trong
môi trường điện giải. Nó được sử dụng cho các loại tế bào, vi khuẩn, tế bào prokaryotic và virus.
Một máy đếm Coulter điển hình có một hay nhiều vi kênh (microchannels) phân cách hai buồng
chứa dung dịch điện giải. Khi dung dịch chứa các hạt hoặc chứa các tế bào đi qua mỗi vi kênh
nhỏ này, mỗi hạt này gây nên sự thay đổi ngắn về điện trở của dung dịch trong kênh. Máy đếm sẽ
phát hiện sự thay đổi về điện trở này.
-

Nguyên lý Coulter

Nguyên lý Coulter chỉ ra rằng các hạt đi qua một lỗ, cùng với dòng điện, tạo ra một điện trở

kháng tỉ lệ với kích thước hạt khi đi qua lỗ. Sự thay đổi trở kháng này xuất phát từ việc các hạt
chen vào dung dịch điện giải. Nguyên lý Coulter được đặt theo tên của người sáng tạo, Wallace
H. Coulter. Nguyên lý này có nhiều thành công trong công nghiệp y dược, đặc biệt là trong lĩnh
vực huyết học, lĩnh vực mà nó được áp dụng để đếm và đo kích thước của nhiều loại tế bào làm
nên máu.

9


Tế bào, một hạt dẫn điện kém, làm thay đổi tính dẫn điện của vi kênh. Nếu các hạt này dẫn
điện kém hơn so với dung dịch xung quanh, điện trở của kênh sẽ tăng, làm cho dòng điện đi qua
kênh giảm. Bằng cách quan sát sự thay đổi trong dòng điện, số lượng các hạt trong một lượng
chất lỏng nhất định có thể được đếm. Mức độ thay đổi dòng điện liên quan tới kích thước của các
hạt, cho phép việc đo sự phân bổ kích thước các hạt, điều này tương quan đến việc tính chuyển
động, điện tích bề mặt, và nồng độ các hạt.Máy đếm Coulter là một bộ phận quan trọng trong các
phòng thí nghiệm của bệnh viện hiện nay. Nhiệm vụ chính của nó là phân tích nhanh và chính
xác việc đếm toàn bộ máu (thường được gọi là CBC). CBC được sử dụng để xác định số lượng
bạch cầu và hồng cầu trong cơ thể. Trước đây, tiến trình này thường liên quan đến việc chuẩn bị
nhuộm tế bào máu và đếm thủ công từng loại tế bào dưới kính hiển vi, một quá trình thường mất
nửa giờ.
Máy đếm Coulter có nhiều ứng dụng bao gồm sơn, ceramic, thủy tinh, luyện kim và sản xuất
thức ăn. Chúng cũng thường được sử dụng trong việc quản lý chất lượng.Máy đếm Coulter đóng
vai trò quan trọng trong sự phát triển của máy phân loại tế bào đầu tiên, và có liên quan đến
những ngày đầu của việc phát triển máy đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry). Thậm chí đến
ngày hôm nay, một số máy đếm tế bào dòng chảy vẫn sử dụng nguyên lý Coulter để cung cấp
thông tin chính xác hơn về kích thước và số tế bào.
II.2.3 máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy
2.3.1. Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system)
Hệ thống tạo dòng chất lỏng là bộ phận căn bản nhất của một máy đếm tế bào dòng chảy. Hệ
thống tạo dòng chất lỏng gồm có 2 vùng chất lỏng có áp lực khác nhau. Dòng dịch lỏng bên

ngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch tạo dòng bao: có tác dụng “nắn chỉnh” dòng dịch
lỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là dòng lõi thành một dòng hẹp tới mức các tế
bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể đi qua khe hẹp đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế
bào/vật thể nhỏ có trong mẫu thành dòng tế bào đơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua
hệ thống quang học với tốc độ rất cao, khoảng 1000 tế bào/giây.
Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp
tiết diện dòng lõi, phù hợp với yêu cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu thì cần dòng lõi
lớn, phân tích ADN thì cần dòng lõi hẹp). Nhờ cơ chế này hệ thống mới có thể phân tích đồng
thời nhiều đặc tính trên từng tế bào một cách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu. Dịch dùng tạo
dòng sheath thường phải đáp ứng 2 yêu cầu: (1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm tan
tế bào); và (2) không làm ảnh hưởng đến độ chiết quang và độ huỳnh quang của hệ thống. Ở
một số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay thế cho dòng bao.

10


Hình 2.3.1 Hệ thống dòng chất lỏng trong buồng mẫu (flow cell)
2.3.2. Hệ thống quang học
Bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laser hoặc đèn hồ quang), hệ thống kính lọc
và các kênh thu tín hiệu quang học và tính hiệu huỳnh quang (FSC – Forward Scatter Chanel,
dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSC – Side Scatter Chanel, dùng thu nhận
tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL (Fluoressen Light), dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng
huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang và số kênh màu huỳnh quang có thể dao động t ừ 2 đến
18 FL tùy dòng máy; PMT – Photo Multiplier Tube, các ống nhân quang tương ứng với các
kênh màu huỳnh quang có vai trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang).
Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sáng sẽ tương tác với
vật thể sẽ tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ góc thẳng và tán xạ góc bên) và nếu tế bào/vật thể đó
được nhuộm màu huỳnh quang, dưới kích thích của nguồn sáng, chất màu huỳnh quang đó sẽ
phát ra ánh sáng huỳnh quang. Sau đó các tia sáng này sẽ đi qua hệ thống kính lọc (đó là các
11

thấu kính chỉ cho phép các tia sáng có bước sóng nhất định đi xuyên qua). Với hệ thống kính lọc
này các tia sáng tán xạ và ánh sáng huỳnh quang sẽ được phân chia và đi đến hệ thống thu nhận
tín hiệu một cách chính xác.

Hình 2.3.2Hệ thống quang học
2.3.3. Hệ thống điện tử (electronics system)
Hệ thống điện tử về bản chất là một hệ thống có trong máy, các tín hiệu của ánh sáng tán xạ
và tín hiệu huỳnh quang sau khi được khuếch đại ở PMT sẽ được hệ thống điện tử chuyển thành
tín hiệu số đo đếm được và được biểu hiện dưới dạng biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ
điểm trên máy tính thông qua các phần mềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy.

12


Hình 2.3.3 Hệ thống quang học và hệ thống điện tử thu nhận tín hiệu
2.3.4 Cơ chế nhuộm kháng nguyên bề mặt tế bào và quá trình thu nhận tín hiệu
2.3.4.1. Cơ chế nhuộm kháng nguyên bề mặt
Trên bề mặt các tế bào đích có các kháng nguyên đặc trưng cho từng quần thể tế bào. Ví dụ:
trong trường hợp tế bào T-CD4 sẽ có các kháng nguyên đặc trưng là CD3 và CD4. Thông qua
việc xác định sự hiện diện các kháng nguyên trên bề mặt tế bào này, người ta có thể xác định sự
có mặt cũng như số lượng và phần trăm các tế bào đích tương ứng trong quần thể tế bào phân
tích.
Thông thường, người ta sử dụng các kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang có
khả năng gắn đặc hiệu với các kháng nguyên bề mặt tế bào. Khi được ủ với mẫu phân tích, các
kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang sẽ gắn đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng
chúng có trên bề mặt tế bào.
Hình 2.3.4.1 Kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang sẽ gắn vào kháng nguyên
tương ứng nằm trên tế bào đích trong quá trình ủ.

13


2.3.4.2 Quá trình thu nhận tín hiệu
Tế bào/vật thể nhỏ khi di chuyển qua nguồn sáng sẽ tương tác với tia laser và sinh ra các tín
hiệu sáng:
Ánh sáng tán xạ góc thẳng sẽ được thu nhận qua các kênh FSC (Forward Scatter Chanel). Do
được thu nhận thẳng góc (song song) với trục ánh sánh nguồn, ánh sáng tán xạ góc thẳng phản
ánh kích thước tế bào/vật thể phân tích (hình minh họa). Ánh sáng tán xạ góc bên sẽ được thu
nhận qua kênh SSC (Side Scatter Chanel). Do được thu nhận ở góc bên (90 độ) theo trục ánh
sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc bên phản ánh độ phức tạp nhân và bào tương của tế bào.
Nếu tế bào có kích thước càng lớn, chỉ số FSC thu được càng lớn. Tế bào càng nhiều hạt hoặc
khoang trong bào tương, nhân càng quận, chia múi thì chỉ số SSC càng cao. Như vậy, trong các
thành phần bạch cầu có thể thấy chỉ số SSC của quần thể tế bào lympho là thấp nhất, của quần
thể mono cao hơn quần thể lympho, và SSC của quần thể bạch cầu hạt đa nhân sẽ lớn nhất.

14


Hình 2.3.4.2a Đồ thị 2 chiều SSC và FSC của mẫu máu toàn phần đã ly giải hồng cầu cho
thấy các quần thế tế bào bạch cầu được phân tách thành 3 quần thể rõ rệt theo kích thước và mức
độ phức tạp của cấu trúc bên trong tế bào.
Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng thể kháng nguyên
trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnh quang và được khuếch đại
trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube).
Khi tia laser chiếu vào các chất phát huỳnh quang này sẽ tạo ra các ánh sáng huỳnh quang và
sau đó các tín hiệu sáng này sẽ được thu nhận, chuyển đổi thành tín hiệu điện tử và biểu thị dưới
dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm tính với các huỳnh quang tương ứng với các
kháng nguyên cần khảo sát.

Hình 2.3.4.2b Hiển thị tín hiệu huỳnh quang trên máy tính phân tích
Các tế bào không gắn hoặc gắn rất ít với kháng thể đơn dòng sẽ biểu hiện thành cột âm tính
(góc trái) , quần thể tế bào gắn được nhiều kháng thể đơn dòng sẽ được biểu hiện thành cột
dương tính (góc phải). cũng có đôi chút khác biệt. Điều này cần chú ý vì sẽ liên quan đến việc
lựa chọn phối hợp màu huỳnh quang trong các phân tích đa màu.
Tổng hợp các tín hiệu về ánh sáng tán xạ góc thẳng, ánh sáng tán xạ góc bên và các tín hiệu
về ánh sáng huỳnh quang tương ứng của một tế bào sẽ giúp chúng ta phân biệt tế bào này với các
nhóm tế bào khác trong quần thể. Ngoài ra, việc khoanh vùng (gating) quần thể mong muốn còn
giúp thực hiện thống kê hoặc tiếp tục phân tích sâu hơn.
2.3.5 Đếm tế bào lympho T-CD4 kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy

15


Ứng dụng của nguyên lý tế bào dòng chảy được dùng trong việc xác định số lượng tuyệt đối
và phần trăm số lượng tế bào l ympho T-CD4 trong máu toàn phần còn được gọi là xét nghiệm
đếm tế bào lympho T-CD4.
Để xác định được quần thể tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn phần, các hãng khác nhau sử
dụng các chiến lược tạo cổng, kháng thể và cách thức tính số lượng tuyệt đối tế bào khác nhau để
xác định số lượng và phần trăm tế bào lympho T-CD4 có trong máu toàn phần.
Số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 trong máu toàn phần thường có thể xác định thông qua việc
sử dụng các hạt bi với số lượng xác định hoặc đo chính xác thể tích mẫu phân tích chính xác. Với
nguyên lý đo thể tích, thông thường nhà sản xuất thiết kế máy có khả năng đo chính xác một
lượng thể tích nhất định, sau đó căn cứ trên số tế bào thực tế đếm được, độ pha loãng và thể tích
mẫu máu ban đầu cho vào để tính toán số lượng tuyệt đối lympho T-CD4/µl.
Số lượng tế bào đếm được x Tổng thể tích mẫu sau xử lý
T-CD4 tuyệt đối/µl =

Thể tích mẫu được hút bởi máy x Thể tích mẫu máu

Trong khi đó, với nguyên lý xác định thể tích dựa trên bi chuẩn. Ban đầu nhà sản xuất hay
người sử dụng cho một lượng bi chuẩn với số lượng biết trước vào trong ống tuýp xử lý mẫu.
Sau khi trộn đều với mẫu máu, hỗn dịch tế bào máu và bi chuẩn xem như đồng nhất. Trong quá
trình đếm, máy sẽ đếm được một lượng nhỏ xác định bi chuẩn và tế bào máu. Từ các thông số
trên, máy sẽ tính toán ra giá trị số lượng tuyệt đối lympho T-CD4:
Số lượng tế bào đếm được x Tổng số bi chuẩn ban đầu
T-CD4 tuyệt đối/µl =

Số bi chuẩn được đếm bởi máy x Thể tích mẫu máu ban đầu

Các máy đếm tế bào lympho T-CD4 chuyên biệt có thể cho cả giá trị phần trăm và giá trị tuyệt
đối của tế bào lympho T -CD4 trong máu toàn phần hay còn gọi là hệ thống 1 máy. Tuy nhiên,
trong các trường hợp chỉ có thể ghi nhận giá trị phần trăm lympho T-CD4 hoặc số lượng tuyệt
đối tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn phần, người ta có thể kết hợp với giá trị tổng lympho
bào trong máu thu nhận từ máy huyết học để có thể xác định thông số còn lại. Trong trường hợp
sửdụng kết hợp máy đếm tế bào lympho T-CD4 và máy huyết học, người ta gọi đó là phương
pháp hai máy.
Cách tính giá trị phần trăm lympho T-CD4 khi có giá trị số lượng tế bào lympho T-CD4 và
tổng lympho bào:

16


2.3.6 Ứng dụng trong phân tích lượng glucose
Một sự thay đổi của hệ thống xét nghiệm glucose oxidase được sử dụng trong một máy phân
tích chẳng hạn như mô hình YSI 27 công nghiệp Analyzer (Instrument Co, Inc) . Công cụ được
cung cấp với màng khác nhau có chứa các enzyme cố định thích hợp để đo một chất phân tích
đặc biệt ví dụ như glucose hoặc axit lactic. Mẫu được tiêm vào màng , mà chuyển đổi glucose
thành hydrogen peroxide , có thể được xác định bởi một cảm biến hệ thống dựa trên một điện

cực Clark . Sau này bao gồm một điện cực bạch kim, mà các biện pháp hydrogen peroxide
amperometrically .
H2O2 2H + + O2 + 2e (1)
AgCl + e Ag + Cl (2)
Dòng chảy hiện tại cực dương bạch kim là tuyến tính tỷ lệ thuận với vùng nồng độ hydrogen
peroxide. Điện cực này được duy trì ở một mức 0,7 V đối với một bạc / bạc clorua tham chiếu
điện cực,khả năng đó được xác định bởi phương trình 2. Các tín hiệu hiện tại đó tỷ lệ thuận với
số lượng glucose tiêm, được chuyển đổi thành điện áp bằng thiết bị điện tử.

II.3 phương pháp hóa học
II.3.1Phương pháp định lượng protein
Đây là phương pháp gián tiếp xác định tế bào
Có một số phương pháp đo màu dựa trên các phép đo thành phần tế bào. Đây là những
phương pháp tương đối đơn giản và phù hợp với nhiều mẫu. Tuy nhiên, thành phần của các tế
bào có thể thay đổi đáng kể trong nuôi cấy.
17


Ví dụ, protein và enzyme trong thành phần trên tế bào sẽ cao trong thời gian phát triển tăng
trưởng nential nhưng thấp hơn trong giai đoạn trễ hoặc pha tĩnh
Protein tổng số tế bào có thể được sử dụng như một biện pháp sinh khối (tổng cộng hàm
lượng tế bào). Hàm lượng protein của tế bào động vật có vú thường là 100-500 pg / tế bào. Các
đo lường cũng rất hữu ích trong việc xác định các hoạt động enzyme cụ thể, thường được thể
hiện như tối đa đo vận tốc của phản ứng một loại enzyme trong tổng số protein của tế bào. Các
xét nghiệm đo màu phổ biến nhất là phương pháp Lowry và Bradford.
Trong số này, các xét nghiệm Bradford được ưa chuộng vì tốc độ, sự nhạy cảm, và sự can
thiệp đáng kể từ các thành phần tế bào khác .Bằng phương pháp ly giải tế bào này được thêm vào
thuốc thử, Coomassie màu xanh. Màu xanh đó phát triển trong 10 phút có thể được đo bằng máy
đo màu hoặc quang phổ kế và so sánh với các protein tiêu chuẩn.
-

Phản ứng biuret

Peptide và đặc biệt chứa từ 2 liên kết peptide trở lên đều có khả năng tạo phức cho màuMận
chin với dịch kiềm chứa CuSO4 nhờ tạo lien kết coordinate còn gọi là liên kết càng cua giữa
nguyên tử N tham gia liên kết với Cu+2 . Nồng độ peptide và protein trong dung dịch tỷ lệ với độ
đậm đặc của màu.
Người ta thương sử dụng albumin máu bò BSA để dựng đường chuẩn và đo giá trị OD ở bước
sóng 540nm, đối chứng là dịch biuret và đệm hoặc nước. Một số tác dụng gây cản trở phản ứng
là đệm amino acid và đệm Tris.
Phương pháp biuret có ưu điiểm cho kết quả ổn định với các loại protein khác nhau và dễ
dàng thực hiện.
Nhược điểm: chủ yếu là độ nhạy của phương pháp thấy
-

Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry

a. Nguyên tắc
Là phương pháp khá nhạy (đạt tới 5µl).Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein
khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất
mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm.
Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất
định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng
protein trong mẫu nghiên cứu.
b. Hoá chất cần dùng
- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000ml nước cất.
- Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc trong
18

dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%.
- Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi dùng).
- Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N.
- Albumin huyết thanh bò 1mg/ml.
c. Cách tiến hành
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống
nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút. Sau đó thêm vào hỗn hợp
trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, mầu vàng
của hỗn hợp chuyển sang mầu xanh da trời và đạt đến cường độ mầu cực đại. Đem so mầu của
hỗn hợp trên máy so mầu quang điện ở bước sóng 660nm. Xác định được trị số mật độ quang
học của dung dịch nghiên cứu. Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình.
- Mẫu đối chứng: 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và bước tiếp
theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
d. Xây dựng đường đồ thị chuẩn
Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin
huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn.
Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có
nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60,
80, 100, 120 g/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như trên cho vào
ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml
thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm.
- Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và
các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
Thứ tự việc thực hiện giống với phương pháp biuret, độ nhạy của phương pháp này cao
khoảng 100 lần. tuy nhiên nó có ảnh hưởng bởi đệm Tris, (NH4)2SO4 ở nồng độ > 15%. Glycine
ở nồng độ >0,5% và mercaptan. Ngoài ra protein do có hàm lượng tysosine và tryptophan khaccs
nhau sẽ cho kết quả khác nhau.
-

Phương pháp Braford

Khắc phục hạn chế của 2 phương pháp đầu nhờ sử dụng chất màu gắn protein( Braford, 1976,
Biorad, 1984). Chất màu Coomassie gắn với protein trong dung dịch có tính acid sẽ làm thay đổi
đỉnh hấp thụ từ 465nm của coomassie lên 595nm. Thường sử dụng globulin hoặc albumin trong
máu bò làm protein chuẩn. Pháp đo rất tiện vì chỉ sử dụng một loại chất. màu xuất hiện trong gần
2 phút và ổn định trong gần 1 giờ. Độ nhạy của phương pháp cao đạt tới 1-20µg, đôi khi nhạy
hơn cả phương pháp lowry, phương pháp Braford cho kết quả khác đối với các loại protein khác
nhau.
3.2 Xác định tế bào nhờ định lượng glucose
19


Huyết thanh dùng trong môi trường nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn là nguồn nhiễm bẩn
virus và mycoplasma. Do bản chất hóa học của huyết thanh chưa được xác định đầy đủ nên trong
một số trường hợp có thể ảnh hưởng xấu đến kết quả nuôi cấy. Sự hiện diện của nhiều protein
khác nhau trong huyết thanh cũng có thể làm phức tạp các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra
(downstream processing). Vì lý do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng công
thức môi trường không có huyết thanh. Những công thức này chứa các hormone và các nhân tố
sinh trưởng được tinh sạch để thay thế cho huyết thanh.
Trong môi trường có khoảng 5- 10% glucose. Như trong bảng môi trường dưới đây

:
Chính vì trong môi trường nuôi cây tế bào động vật có chứa glucose. Để biết được tế bào
động vật tiêu thụ glucose hay không và tiêu thụ được vào nhiêu thì người ta tiến hành:
- Glucose có thể được xác định thông qua xét nghiệm đo màu sử dụng hai enzyme, glucose
oxidase và peroxidase :
D-glucose + H2O + O2 axit D-gluconic + H2O2 (1)
H2O2 + 2H2O giảm o-dianisidine + oxy hóa o-dianisidine (màu nâu) (2)
Oxy hóa o-dianisidine (màu nâu) + H2SO4 oxy hóa o-dianisidine (màu hồng) (3)

Phương trình 1 được xúc tác bởi glucose oxidase (GOD) và phương trình 2 bởi peroxidase
(POD). Thuốc nhuộm, o-dianisidine hydrochloride, được giảm hydrogen peroxide để một sản
phẩm có một màu hồng trong sự hiện diện của acid sulfuric (3) và dùng đo màu. Bộ glucose
oxidase từ công ty Sigma Chemical Co.

20


- Glucose cũng có thể được đo enzym trong hai phản ứng sau xúc tác bởi hexokinase (HK)
và glucose 6-phosphate dehydrogenase ( G6PDH) :
D- glucose + ATP  glucose-6- P + ADP (1)
Glucose-6- P + NAD  6 phosphogluconate + NADH + H + (2)
HK chuyển đổi glucose thành glucose 6-phosphate trong sự hiện diện của ATP (1) . Glucose
-6- P ngay lập tức được chuyển đổi thành 6 phosphogluconate bởi G6PDH (2). Sự hình thành
liên kết của NADH được giám sát bởi các thay đổi trong hấp thụ ở 340 nm , và đây là tỷ lệ thuận
với nồng độ glucose ban đầu hiện nay . Bộ HK từ công ty Sigma Chemical Co chứa thuốc thử
HK/G6PDH .Bộ này bao gồm một giải pháp tiêu chuẩn đường (1 mg / ml )
II.4 Những ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào
4.1 Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng
Cần chọn một chất dinh dưỡng mà chất này không bao giờ được sử dụng để tổng hợp sản
phẩm trao đổi chẩt. Phosphate, sulfate hoặc magnesium có thể là những chọn lựa tốt. Khi sinh
khối tế bào là sản phẩm chính, thì nồng độ của nguồn carbon còn lại trong môi trường có thể
được đo để đánh giá sinh khối tế bào.
4.2 Tạo thành các sản phẩm
Điều quan trọng là cần kiểm tra sản phẩm tạo thành có được kết hợp với sự sinh trưởng hay
không. Một số sản phẩm được tạo thành sau khi sinh khối tế bào đạt tới pha tĩnh (stationary
phase) của chu kỳ sinh trưởng và vì thế, không được kết hợp với sự sinh trưởng. Sự giải phóng
CO2 có thể được xác định và nó có quan hệ tỷ lượng đối với sự sinh trưởng của tế bào.
Một sản phẩm hoàn toàn chung cho mọi phản ứng lên men là ion H+. Lượng kiềm bổ sung
vào dịch lên men sẽ duy trì độ pH thích hợp cho sinh trưởng.

4.3 Các thành phần tế bào
Đối với các nuôi cấy trải qua sự sinh trưởng cân bằng, thì các thành phần tế bào thuộc nhóm
đại phân tử như là protein, RNA và DNA có thể được xác định thay cho sinh khối tế bào. Tuy
nhiên, cần phải thận trọng do tỷ lệ của những nguyên liệu này trong tế bào có thể thay đổi theo
thời gian nếu nuôi cấy không trải qua sự sinh trưởng cân bằng.
4.4 Giải phóng nhiệt

21


Sự sinh trưởng của tế bào phát ra nhiệt. Lượng nhiệt phát ra tùy thuộc vào hiệu suất sử
dụng năng lượng carbon. Vì thế, việc xác định nhiệt độ của hệ lên men có thể kết hợp gián tiếp
với sự sinh trưởng của tế bào. Tuy nhiên, lượng nhiệt toàn phần tích lũy trong hệ lên men phụ
thuộc vào hiệu quả phối hợp của các nguồn sinh nhiệt và mất nhiệt khác nhau như: nhiệt từ quá
trình khuấy và bay hơi, nhiệt tiêu hao xung quanh thành của hệ lên men và nhiệt nhạy (sensible
heat) trong luồng không khí. Vì thế, để xác định sinh trưởng bằng sự giải phóng nhiệt, cần phải
thiết lập cân bằng năng lượng của hệ lên men mặc dù đây một công việc không dễ dàng.
4.5 Độ nhớt
Sinh trưởng của cơ thể hệ sợi (nấm) hoặc sự tạo thành polysaccharide đã làm tăng độ
nhớt của dịch lên men (fermentation broth). Vì thế, việc xác định độ nhớt của dịch lên men rất
hữu ích trong các quá trình lên men ở quy mô công nghiệp. Độ nhớt biểu kiến đo được ở tốc độ
dịch chuyển cố định có thể được dùng để đánh giá nồng độ tế bào hoặc nồng độ sản phẩm.

III. Kết luận
Xu hướng nuôi cấy tế bào nhân lên về tế bào không chỉ có ở thực vật nữa mà ở đây còn là ở
cả động vật, việc con người tác động vào các tế bào đã ảnh hưởng một phần không nhỏ đối với
sự phát triển của tế bào.
Các phương pháp nêu trên chỉ thấy được khả năng đo lượng nồng độ tế bào động vật nhờ
vậy mà khoa học tiến tới nhiều tri thức mới hơn.
Một sản phẩm được tinh sạch từ nuôi cấy tế bào động vật có vú không thể có 100% hoạt tính

sinh học mà tùy thuộc vào những biến đổi trong kiểu glycosylation hoặc trên sự thóai biến phân
22


giải protein. Hai thông số này chịu ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường. Phương thức
glycosyl hóa thay đổi trong phản ứng với nhiều nhân tố như kiểu nuôi cấy, pha sinh trưởng của
nuôi cấy mẻ, dù tế bào được sinh trưởng trong các microcarrier hoặc trong dịch huyền phù, nồng
độ glucose, nồng độ ammonium, hiệu quả của các hormone trong môi trường, sự hiện diện của
huyết thanh, hàm lượng của protein và lipid trong môi trường, pH và nồng độ O 2 hòa tan. Vì vậy,
việc chọn các điều kiện sinh lý thích hợp trong một quá trình sản xuất là quan trọng để có được
sự glycosyl hóa chính xác của một protein dược phẩm.
Không những chất lượng các sản phẩm động vật có vú mà toàn bộ hiệu suất của nuôi cấy tế
bào động vật có vú bị ảnh hưởng bởi nhiều thông số như pH, nồng độ các ion
ammonia/ammonium và lactate, nồng độ serum, phương pháp nuôi cấy, tuổi nuôi cấy, lượng mẫu
cấy gây và thành phần môi trường. Do sự phức tạp của sinh lý tế bào động vật có vú, trong sự
phối hợp với các môi trường và phương pháp nuôi cấy khác nhau được sử dụng, thường là khó
khăn trong việc tách riêng ra ảnh hưởng của một nhân tố đặc trưng. Tuy nhiên, thông số có một
ảnh hưởng chính rõ rệt lên hiệu suất đặc trưng của các sản phẩm của tế bào động vật có vú đó
chính là tốc độ sinh trưởng.Cả hai động học của sản xuất kết hợp có sinh trưởng và không sinh
trưởng đã xảy ra.

IV. Tài liệu tham khảo
Trang web
/> />
Sách tham khảo

23


1. Trần Văn Nhân và Ngô Thị Nga. 2002. Giáo trình Công nghệ xử lý nước thải. NXB Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Trần Thị Thanh. 2003. Công nghệ vi sinh. NXB Giáo dục, Hà Nội.
3. Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tiến Thắng. 1999. Những kiến thức cơ bản về công nghệ
sinh học.NXB Giáo dục, Hà Nội.
4. Arora M. 1998. Biological Control of Environmental Pollution. Vol 1, Anmol Publications
PVT, Ltd. New Delhi, India.
5. Ratledge C and Kristiansen B. 2002. Basic Biotechnology.Cambridge University Press,
UK.
6. Đái Duy Ban.2002. Công nghệ sinh học đối với cây trồng vật nuôi & bảo vệ môi trường

24