Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp chất ức chế Ezyme α Glucosidase và α Amylase (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------

PHÙNG THỊ HUỆ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT ỨC CHẾ
EZYME α-GLUCOSIDASE VÀ α-AMYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------

PHÙNG THỊ HUỆ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT ỨC CHẾ
EZYME α-GLUCOSIDASE VÀ α-AMYLASE
Chuyên ngành: Động vật học
Mã số: 8 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ NHƢ HẰNG

Hà Nội - 2018

i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã
nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, anh chị và gia đình.
Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Trần Thị Nhƣ Hằng ngƣời đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi thực
hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo của Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Trƣờng Đại Học Thái Nguyên đã tận tình truyền đạt cho tôi
kiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiên
cứu luận văn và cũng là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ths. Hoàng Kim Chi, Ths. Nguyễn
Đình Tuấn và tập thể cán bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện
Hoá học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn
thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi,
những ngƣời đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc để
tôi yên tâm học tập và hoàn thành khóa học này.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý thầy, cô, anh, chị và gia đình dồi dào
sức khỏe, thành công trong sự nghiệp!
Tôi xin chân thành cảm ơn!


ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là hoàn toàn trung thực, chƣa đƣợc sử dụng cho bảo vệ một học vị nào.
Mọi sự giúp đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã đƣợc cảm ơn. Các thông
tin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Phùng Thị Huệ


iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

DMSO

Dimethyl sulfoxid (Dimetyl sulfoxit)

EtOAc

Ethylacetat ( etyl axetat)

EtOH

Ethanol (Etanol)

IC50

Inhibitory concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%)

OD

Optical Density (Mật độ quang)

pNPG

p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside

VSV

Vi sinh vật

TĐ

Tiểu đƣờng

v.v.

Vân vân

PDA

Potato dextrose agar

HVA

Humic acid Vitamin agar

LB

Luria-bertani


iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Một số loại thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng và cơ chế tác dụng [17] .... 6
Hình 1.2. Hình minh họa chất ức chế tác động lên enzyme. ....................... 9
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng với sự tham gia của các gốc amino acid trong
trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase (Ogawa và cs. 2014). ........... 11
Hình 2.1: Quy trình thu nhận cặn chiết EtOAc từ dịch lên men của các
chủng VSV ............................................................................................... 25
Hình 3.1. Khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch LB từ các bộ phận khác nhau
của mẫu thực vật. ..................................................................................... 30
Hình 3. 2. (a) Chủng NĐR1 sinh trƣởng trên môi trƣờng HVA; (b) Chủng HCRt1 sinh trƣởng trên môi trƣờng LB; (c) Chủng HVA DL-NA 6 sinh trƣởng trên
môi trƣơng ISP4; (d) DTC-L-N5 sinh trƣởng trên môi trƣờng PDA. .............. 38
Hình 3. 3. Các thử nghiệm ức chế α-amylase và α-glucosidase ................ 39
Hình 3. 4. Các thử nghiệm đo nồng độ ức chế IC50 với enzyme α-amylase
(A) và α-glucosidase (B) .......................................................................... 41
Hình 3. 5. Nồng độ ức chế IC50 của dịch chiết các chủng (HVA)DL-NA6
lên enzyme α-amylase và DTC-Rt-N1.2 lên enzyme α-glucosidase so sánh
với Acarbose ............................................................................................ 42
Hình 3. 6. Sơ đồ phân loại của chủng DTC-Rt-N1.2 dựa trên đoạn trình tự
ITS………………………………………………………………………….47


v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Dịch chiết/hoạt chất chiết xuất từ thực vật có hoạt tính ức chế αglucosidase [6] ......................................................................................... 13
Bảng 3.1. Danh sách các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc và một số đặc
điểm hình thái .......................................................................................... 31
Bảng 3. 2. Phần trăm ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase ............ 40


vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon khác nhau đến hoạt tính ức
chế enzyme α-amylase của chủng (HVA)DL-NA6. .................................. 44
Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon khác nhau đến hoạt tính ức
chế enzyme α-glucosidase của chủng DTC-Rt-N1.2................................. 44


vii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................ i
CHƢƠNG

TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................... 3

1.1. Bệnh tiểu đƣờng ............................................................................ 3
Th c tr ng ệnh tiểu đƣờng tr n thế giới v t i Việt N m .......... 4
1.1.1. Trên thế giới ................................................................................... 4
1.1.2. Tại Việt Nam .................................................................................. 5

1.2. Một số phƣơng pháp điều trị ệnh tiểu đƣờng ............................ 6
1.2.1. Điều trị bằng chế độ ăn uống ........................................................ 7
1.2.2. Điều trị bằng thảo dƣợc ................................................................. 7
1.2.3. Sử dụng thuốc có hoạt tính chữa bệnh tiểu đƣờng....................... 7
1.3. Chất ức chế enzyme α- myl se v α-glucosidase ........................ 8
1.3.1. Khái niệm chất ức chế enzyme ..................................................... 8
1.3.2. Các loại chất ức chế: có 2 loại ...................................................... 8
1.3.3. Cấu tạo và phản ứng xúc tác của enzyme α-amylase và αglucosidase.............................................................................................. 10
1.3.3.1.α-Amylase .................................................................................. 10
1.3.3.2.Enzyme α-glucosidase ............................................................... 12
1.3.4. Vai trò của α-glucosidase và α-amylase đối với người bệnh tiểu
đường ....................................................................................................... 12
1.3.5. Chất ức chế hoạt động của α-glucosidase và α-amylase .......... 13
1.4. Tình hình nghi n cứu tìm kiếm hợp chất có ho t tính chống tiểu
đƣờng tr n thế giới v t i Việt N m .................................................. 15
1.4.1. Trên thế giới ................................................................................. 16


viii
1.4.2. Tại Việt Nam................................................................................. 18
1.5. Hợp chất thi n nhi n có ho t tính chống tiểu đƣờng từ vi sinh
vật ..................................................................................................... 21
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................... 22
2.1. Vật liệu v đối tƣợng nghi n cứu ............................................... 22
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 22
2.1.2. Môi trường phân lập và nuôi cấy vi sinh vật ............................. 22
2.1.3. Hóa chất và thiết bị...................................................................... 22
2.2. Phƣơng pháp nghi n cứu ............................................................ 23
2.2.1. Phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu thực vật ................. 23
2.2.2. Lựa chọn và lưu giữ giống .......................................................... 23

2.2.3. Phương pháp tách chiết dịch nuôi cấy ....................................... 23
2.2.4. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme ...................................... 25
2.2.4.1. Thử nghiệm ức chế enzyme α-amylase .................................. 25
2.2.4.2. Sàng lọc hoạt tính ức chế α-Glucosidase ............................... 26
2.2.5. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh
trƣởng và tổng hợp chất ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase 28
2.2.6. Định danh các chủng nấm bằng sinh học phân tử ..................... 28
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................... 30
3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu th c vật ... 30
3.2. Ho t tính ức chế enzyme α- myl se v α-glucosidase............... 38
3.3. Ảnh hƣởng củ nguồn c c on đến sinh trƣởng v tổng hợp chất
ức chế enzyme α- myl se v α-glucosidase ....................................... 43
3.4. Định d nh các chủng nấm ằng sinh học phân tử .................... 45


ix
3.4.1. Chủng DTC-Rt-N1.2 ................................................................... 45
CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................... 50
4

Kết luận ........................................................................................ 50

4 2 Kiến nghị ...................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 51


1
MỞ ĐẦU

Từ những năm 90 của thế kỷ 20, các chuyên gia y tế đã dự báo “Thế kỷ 21

là thế kỷ của các bệnh rối loạn chuyển hoá”. Tiểu đƣờng (TĐ) là bệnh do sự rối
loạn chuyển hoá carbohydrate khi hormone insulin của tuyến tu bị thiếu hay
giảm tác động trong cơ thể, và biểu hiện ở lƣợng glucose trong máu cao. Theo
ƣớc tính của Tổ chức Y tế thế giới WHO và Liên đoàn TĐ quốc tế IDF, số bệnh
nhân TĐ sẽ tăng từ 150 triệu ngƣời vào năm 2009 lên 399 triệu ngƣời vào năm
2025, tăng 214% so với năm 2006. Đáng chú ý, trong khi tốc độ gia tăng tỷ lệ
mắc bệnh ở các nƣớc phát triển chỉ là 42% thì ở các nƣớc đang phát triển trong
đó có Việt Nam là 170%. Bệnh TĐ có thể gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm và
là nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu cơ tim, đột qu , suy thận giai đoạn cuối
và mù lòa, làm tăng tỷ lệ tử vong lên gấp 2-4 lần. Trên thế giới cứ 10 giây đi qua
có thêm 1 ngƣời bị chết do TĐ và các biến chứng [4], [39].
Thực trạng trên đã khiến cho nhu cầu sử dụng thuốc chữa TĐ gia tăng, vì
vậy việc tìm kiếm các nguồn hợp chất có hoạt tính để điều trị bệnh tiểu đƣờng
đang trở nên vô cùng cấp bách. Các giải pháp đƣợc đặt ra cho việc tìm kiếm
nguồn chất điều trị bệnh tiểu đƣờng bao gồm tổng hợp hợp chất hóa học hoặc
bán tổng hợp, và khai thác các hợp chất thiên nhiên từ nguồn tài nguyên sinh
vật. Mặc dù cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu sàng lọc các chất nguồn
gốc thực vật có hoạt tính ức chế hoạt động của các enzyme có vai trò lớn
trong các bệnh nhân tiểu đƣờng là α-amylase và α-glucosidase, nhƣng các hợp
chất sử dụng làm thuốc phổ biến trong lâm sàng để điều trị bệnh tiểu đƣờng
lại có nguồn gốc từ vi sinh vật. Tuy nhiên các thuốc điều trị hiện hành đều
cho thấy hiệu quả ức chế không quá cao, thực tế đó đặt ra vấn đề việc sàng lọc
các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase và
α-amylase ở nồng độ ức chế thấp hơn, là một hƣớng đi tiềm năng và cần tập
trung nghiên cứu.


2
Xuất phát từ những yêu cầu và thực tế trên đây, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “Phân lập v tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng

sinh tổng hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase và α- myl se”.
Mục đích nghiên cứu của đề tài là: sàng lọc các chủng vi sinh vật, nhằm
tìm kiếm và khai thác các chất có khả năng ức chế enzyme α-amylase và αglucosidase tiềm năng.


3
CHƢƠNG
1.1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bệnh tiểu đƣờng
Bệnh tiểu đƣờng (TĐ) còn gọi là bệnh đái tháo đƣờng, là một bệnh rối

loạn trao đổi chất mãn tính đƣợc đặc trƣng bởi nồng độ glucose cao trong
máu (tăng đƣờng huyết), giảm tiết insulin hoặc giảm tác dụng của insulin
từ tuyến tụy trong cơ thể của ngƣời bệnh [28]. Insulin là một hormone
đƣợc tổng hợp trong các tế bào beta của tuyến tụy nhằm đáp ứng với các
kích thích khác nhau nhƣ từ glucose, sulphonylurea và arginine tuy nhiên
glucose là yếu tố chính. Tăng nồng độ đƣờng trong máu thời gian dài có
thể gây ra các biến chứng nhƣ bệnh tim, đột qu , mù lòa và bệnh thận, vì
thế TĐ đang là một trong ba bệnh hàng đầu gây tử vong cao trên thế giới
chỉ sau ung thƣ và các bệnh tim mạch [21], [24]. Bệnh TĐ có thể đƣợc
phân loại theo nhiều cách khác nhau, nhƣng theo phân loại của Hiệp hội
Tiểu đƣờng Hoa Kỳ, bệnh TĐ gồm: (1) Bệnh TĐ loại I (Phụ thuộc insulin IDDM) là do sự phá hủy các tế bào beta qua trung gian miễn dịch, dẫn đến
thiếu insulin; (2) Bệnh TĐ tự phát là bệnh TĐ loại I nhƣng không có
nguyên nhân rõ ràng và có liên quan di truyền; (3) Bệnh TĐ loại II (Không
phụ thuộc insulin - NIDDM) là do khiếm khuyết trong tiết insulin và kháng
insulin; (4) Đái tháo đƣờng thai kỳ là bất kỳ dạng không dung nạp nào với
glucose khi bắt đầu mang thai. Tuy nhiên, bệnh tiểu đƣờng chủ yếu đƣợc

phân loại thành hai loại chính: TĐ loại I (IDDM) và TĐ loại II (NIDDM),
trong đó bệnh TĐ loại II chiếm đến 90% các ca bệnh TĐ. Nguyên nhân gây
bệnh TĐ là do một số cơ chế để duy trì sự điều chỉnh giữa độ nhạy của các
mô với insulin bị phá vỡ dẫn đến sự tiết insulin bởi các tế bào beta tuyến
tụy bị suy yếu và tác dụng insulin bị suy giảm do hiện tƣợng kháng insulin
[16]. Bệnh TĐ loại II này liên quan chặt chẽ đến nhiều khiếm khuyết về di
truyền, và một số yếu tố môi trƣờng đặc biệt là béo phì từ đó gây ra các sai
lệch trong tế bào beta và kháng insulin ngoại mô [29].


4
1.1.

Th c tr ng ệnh tiểu đƣờng tr n thế giới v t i Việt N m

1.1.1. Tr n thế giới
Theo một thông báo vào năm 1998 của các chuyên gia thuộc Tổ chức
TĐ quốc tế, tỷ lệ ngƣời mắc bệnh TĐ trên toàn thế giới là: 110 triệu ngƣời
vào năm 1994, 135 triệu ngƣời vào năm 1995, dự kiến năm 2000 là 151
triệu ngƣời. Tuy nhiên con số thống kê thực tế cho thấy số bệnh nhân TĐ
trên toàn thế giới trong năm 2000 là 171 triệu ngƣời (chiếm 2,8% dân số
thế giới), tức là vƣợt 13% so với dự đoán của năm 1998. Ƣớc tính hiện có
366 triệu ngƣời trên thế giới bị bệnh TĐ, số lƣợng ca bệnh TĐ trên toàn
cầu tăng gấp đôi trong ba thập kỷ qua. Trong các trƣờng hợp mắc bệnh TĐ,
TĐ type 2 chiếm đa số. Tỷ lệ mắc bệnh tăng nhanh ở các nƣớc đang phát
triển là do sự thay đổi về lối sống, thói quen ăn uống, đặc biệt là lối sống ít
vận động thể lực. TĐ type 2 tiến triển một cách âm thầm và liên tục, nếu
không đƣợc theo dõi và quản lý, điều trị tốt sẽ gây nhiều biến chứng nguy
hiểm để lại di chứng nặng nề và đe dọa tính mạng ngƣời bệnh và là một
trong những nguyên nhân tử vong chính của bệnh TĐ [12]. Theo khuyến

cáo của Tổ chức IDF, trên thế giới mỗi năm có khoảng 3,2 triệu ngƣời chết
vì bệnh TĐ, nhƣ vậy một ngày có 8700 ngƣời và mỗi phút có 6 ngƣời chết do
TĐ. Trong số 17 triệu ngƣời chết vì đột qu tim mạch thì có 50-70% là do
nguyên nhân của bệnh TĐ, nhất là TĐ type 2 thƣờng do phát hiện bệnh muộn.
Có 30-90% TĐ type 2 không đƣợc chẩn đoán và 50% bệnh nhân đã có một
hoặc nhiều biến chứng vào thời điểm phát hiện bệnh. Nhiều bệnh nhân khi
phát hiện bệnh lại không đƣợc quản lý, theo dõi và điều trị đúng chuyên khoa
dẫn đến biến chứng sớm và nặng nề ảnh hƣởng đến đời sống của ngƣời bệnh,
đồng thời tốn kém kinh tế của gia đình và ngân sách xã hội [39].
Các khu vực đặc biệt bị ảnh hƣởng bởi căn bệnh TĐ này là Trung
Quốc và Ấn Độ, nơi tỷ lệ mắc bệnh TĐ loại II đã tăng lên đột ngột mặc dù


5
tỷ lệ béo phì tƣơng đối thấp. Với cùng một chỉ số khối cơ thể (BMI), ngƣời
châu Á có xu hƣớng có tỷ lệ mỡ trên cơ thể cao hơn ngƣời châu Âu do
thƣờng béo phì bụng hơn và khối lƣợng cơ ít hơn, điều này có thể là
nguyên nhân gia tăng TĐ loại II ở châu Á. Ngoài ra, dinh dƣỡng kém giai
đoạn mang thai và đầu đời, kết hợp với suy dinh dƣỡng cũng góp phần vào
sự gia tăng của bệnh TĐ loại II, đặc biệt là ở những ngƣời thay đổi thói
quen ăn uống đột ngột và ít hoạt động thể chất. Tỷ lệ bệnh TĐ loại II ở
nam giới cũng cao hơn một chút so với ở nữ giới [17].
1.1.2. T i Việt N m
Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh TĐ của các khu vực đã đƣợc điều chỉnh
phân chia theo cấu trúc tuổi của quần thể là: tỷ lệ mắc bệnh TĐ toàn quốc
là 2,7%, tỷ lệ mắc TĐ ở nữ là 3,7%, tỷ lệ tƣơng ứng ở nam là 3,3%. Tỷ lệ
mắc TĐ ở vùng núi cao là 2,1%, vùng trung du là 2,2%, vùng đồng bằng
ven biển là 2,7%, vùng đô thị và công nghiệp là 4,4%. Đặc biệt tỷ lệ mắc
bệnh TĐ ở nhóm đối tƣợng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30 đến 64 chiếm tỷ
lệ 10,5%, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 13,8%. Theo phân loại của

Hiệp hội Tiểu đƣờng quốc tế và Tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ mắc bệnh TĐ
ở Việt Nam nằm trong khu vực hai (tỷ lệ 2% - 4,99%) giống của các nƣớc
khác trong khu vực nhƣ Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia và thấp hơn các
nƣớc thuộc khu vực ba (tỷ lệ 5-7,99%) bao gồm Nhật Bản, Hàn Quốc,
Malaysia, Singapore, Australia… [6].
Tỷ lệ mắc TĐ ở Việt Nam tăng tỷ lệ thuận theo tuổi (p < 0,0005). Ở
lứa tuổi dƣới 40 tỷ lệ mắc bệnh TĐ vẫn thấp khoảng dƣới 1%, tỷ lệ bệnh
TĐ đƣờng tăng nhanh ở hai mốc tuổi là 45 (4,6%) và 60 tuổi (10,1%). Tỷ
lệ rối loạn dung nạp glucose cũng có diễn biến gần giống nhƣ tỷ lệ mắc
bệnh TĐ là tăng tỷ lệ thuận theo tuổi (p < 0,0005) nhƣng không có mốc
tăng đột ngột nhƣ tỷ lệ bệnh TĐ. Tuổi trung bình của các đối tƣợng mắc


6
bệnh TĐ là 52,4 tuổi. Hầu hết ngƣời bị bệnh TĐ đã đƣợc chẩn đoán từ
trƣớc đều đang đƣợc điều trị đều đặn (85,8%), số ngƣời bệnh không đƣợc
điều trị chỉ có 14,2% [4], [9].
1.2.

Một số phƣơng pháp điều trị ệnh tiểu đƣờng
Bệnh tiểu đƣờng loại 2 là một căn bệnh khó điều trị và không có một

công thức điều trị cụ thể nào phù hợp cho tất cả bệnh nhân mà đều phải dựa
vào dấu hiệu lâm sàng của từng ca bệnh. Hình 1.1 minh họa một số loại
thuốc phổ biến trong phƣơng pháp điều trị bệnh tiểu đƣờng đang đƣợc lƣu
hành hiện nay.

Hình 1.1. Một số loại thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng và cơ chế tác dụng [17]

7
Trong đó các phƣơng án điều trị bệnh TĐ tƣơng đối đa dạng và chủ
yếu tập trung vào các hƣớng điều trị với đơn thuốc đơn thuần (70,9%),
thuốc kết hợp với chế độ ăn (29,1%), chế độ ăn và luyện tập đơn thuần chỉ
có 2,9%. Các phƣơng pháp khác nhau tuy nhiên đều hƣớng đến một mục
tiêu chung là hạ chỉ số đƣờng huyết HbA1c xuống mức tiêu chuẩn. Trong
đó sử dụng các chất ức chế các enzyme có vai trò trong việc dung nạp
glucose (nhƣ α-amylase và α-glucosidase) cũng là một giải pháp. Một số
phƣơng pháp điều trị có thể kể đến nhƣ sau:
1.2.1. Điều trị ằng chế độ ăn uống
Một trong số những liệu pháp hiệu quả cho các bệnh nhân TĐ type 2
là điều chỉnh lƣợng đƣờng huyết thông qua chế độ dinh dƣỡng. Ngƣời bệnh
cần đảm bảo chế độ ăn đầy đủ chất đạm, béo, bột đƣờng, vitamin, muối
khoáng với số lƣợng hợp lý. Tuân thủ nguyên tắc thức ăn đa dạng, nhiều
thành phần, ăn đủ để có trọng lƣợng vừa phải, hạn chế ăn chất béo, đặc biệt
là mỡ động vật, ăn lƣợng vừa phải chất xơ, hạn chế ăn mặn, tránh rƣợu bia
và thức uống có cồn [24].
1.2.2. Điều trị ằng thảo dƣợc
Một số loại thảo dƣợc rất tốt cho ngƣời bệnh TĐ, điển hình nhƣ mƣớp
đắng, ổi, nha đam, cây cà ri, cây húng quế, lá xoài… Ngƣời bệnh có thể
kết hợp bổ sung các thảo đƣợc này trong chế độ ăn uống sẽ tốt cho quá
trình điều trị.
1.2.3. Sử dụng thuốc có ho t tính chữ

ệnh tiểu đƣờng

Đối với một số nhóm đối tƣợng bị TĐ cụ thể, việc điều trị bằng
insulin là giải pháp bắt buộc và chƣa có giải pháp thay thế. Tuy nhiên, sử
dụng các nhóm thuốc có thể bắt buộc và chƣa đƣợc coi là phƣơng án điều
trị nhanh và hiệu quả nhất. Song chế độ ăn uống phù hợp sẽ tốt cho quá

trình điều chỉnh lƣợng carbonhydrate trong cơ thể.


8
1.3.

Chất ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase

1.3.1. Khái niệm chất ức chế enzyme
Là phân tử nhỏ bám vào enzyme và làm giảm hoạt tính enzyme, chúng
phải có một số đặc tính sau:
-

Đặc thù với mỗi enzyme và hoạt động ở nồng độ thấp, và thƣờng
không phá hủy enzyme.
Bởi vì sự giảm hoạt tính của enzyme có thể làm chết tác nhân gây

bệnh hay sửa chữa sự mất cân bằng chuyển hóa, nên chất ức chế đƣợc sử
dụng làm thuốc bảo vệ thực vật (nông nghiệp diệt côn trùng, vi sinh vật
gây bệnh) hoặc làm thuốc chữa bệnh v.v.
Chất ức chế có thể bám vào trung tâm hoạt động enzyme hoặc vị trí
khác làm giảm phản ứng.
Sự bám của chất cảm ứng vào Enzyme có thể là (i) thuận nghịch hay (ii)
không thuận nghịch.
+ Bám không thuận nghịch thƣờng là chất ức chế phản ứng (gắn chặt)
với enzyme theo kiểu liên kết hóa trị, làm thay đổi các axit amin tại hoạt
động (ví dụ khí độc thần kinh (Ops kết hợp serin của enzyme
acetylcholine esterase).
+ Bám thuận nghịch, chất ức chế bám không có liên kết hóa trị (liên
kết hydro, k nƣớc, ions) với enzyme, và dễ bị loại bỏ bằng pha loãng

hoặc thẩm tích)
Một số kiểu ức chế khác: bám vào phức hợp enzyme/cơ chất, hoặc ức
chế kiểu tự sát (biến đổi chất ức chế)
1.3.2. Các lo i chất ức chế: có 2 loại
- Loại 1: ức chế cạnh tranh
Chất ức chế và cơ chất không thể bám vào enzyme cùng một thời điểm.
Thông thƣờng, chất ức chế rất giống cơ chất về cấu tạo, chúng cạnh
tranh nhau với vùng hoạt động của enzyme
- Loại 2: ức chế không cạnh tranh


9
+ Chất ức chế bám vào phức enzyme/cơ chất (hiếm gặp)
+ Chất ức chế bám vào enzyme tại vị trí khác với vị trí của cơ chất, làm
thay đổi cấu trúc tại vị trí hoạt động của enzyme. Thƣờng chúng hoạt
động không phụ thuộc nồng độ cơ chất.

Hình 1.2. Hình minh họa chất ức chế tác động lên enzyme.


10
1.3.3. Cấu t o và phản ứng xúc tác của enzyme α-amylase và αglucosidase
1.3.3.1. α-Amylase
 Cấu t o
Enzyme α-amylase là protein có phân tử lƣợng thấp, thƣờng nằm
trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Một số trƣờng hợp đặc biệt nhƣ αamylase từ loài vi khuẩn Bacilus macerans có phân tử lƣợng lên đến
130.000 Dal. Đến nay ngƣời ta đã biết rõ các chuỗi acid amin của 18 loại
α-amylase nhƣng chỉ có 2 loại α-amylase là taka-amylase từ Apergillus
orysee và α-amylase của tụy lợn đƣợc nghiên cứu kĩ về hình thể không
gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi

mạch acid amin và về vùng kị nƣớc cho thấy các chuỗi mạch amino acid
của tất cả các enzyme α-amylase đều có cấu trúc bậc 3 tƣơng tự nhau
 Phản ứng xúc tác củ α-amylase
Mặc dù có thể đƣợc thu từ các nguồn khác nhau, α-amylase (EC
3.2.1.1) đều tham gia xúc tác một phản ứng giống nhau. Alpha amylase
giúp phân cắt các liên kết α-1,4-glucosidae ở phía bên trong phân tử cơ
chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự
nào. Enzyme α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân
cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn:
+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị
thủy phân tạo thành một lƣợng lớn dextrin phân tử thấp ( -dextrin), độ
nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch
hóa nhanh) [40].
+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đƣờng hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành
bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine.


11
Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và
monosaccharide. Dƣới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá
nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose [15].
+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucosecolagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,
maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thuỷ
phân của amylose chƣa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của αAmylase lên amylopectin cũng xảy ra tƣơng tự nhƣng vì không phân cắt
đƣợc liên kết α-1,6-glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin
nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đƣờng nói
trên còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% [26]

Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng với sự tham gia của các gốc amino acid trong
trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase (Ogawa và cs. 2014).


12
1.3.3.2. Enzyme α-glucosidase
 Cấu t o
α-glucosidase
glucosidoinvertase,

có

nhiều

tên

gọi

khác

nitrophenyl-α-D-glucosidase,

nhƣ:

glucoinvertase,

maltase

glucoamylase,

glusosidosucrase, transglucosidase, glucosidoinvertase,

α-D-glucosidase,

α-

glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, maltase. α-Glucosidase có trên màng
ruột non và chiếm khoảng 2% tổng số protein. Enzym này phân bố trên toàn bộ
chiều dài ruột non với hoạt tính tăng chậm dần và đạt đỉnh ở hồi tràng. Ngoài ra,
α-glucosidase còn đƣợc tìm thấy ở biểu mô thận [26].
Enzym alpha glucosidase có 2 tiểu phần: tiểu phần N tận và tiểu phần C
tận. Cả 2 tiểu đơn vị này đều có trọng lƣợng phân tử ~100 kDa và thuộc gia đình
GH31 phân nhóm 1 do có chuỗi WiDMNE trong trung tâm xúc tác [37].
 Phản ứng xúc tác
Alpha glucosidase (EC.3.2.1.20) có vai trò xúc tác cho phản ứng
chuyển oligosacarid thành các phân tử đƣờng nhỏ hơn để đƣợc hấp thu vào
máu. Cơ chế của nó là cắt đứt liên kết α-D-1,4 glucose đầu không khử.
Cụ thể, khi thức ăn là các carbohydrate đƣợc đƣa vào cơ thể, dƣới tác
dụng của các enzym trong hệ tiêu hóa là α-amylase tuyến nƣớc bọt và
tuyến tụy, carbohydrat đƣợc thủy phân thành các phân tử đƣờng nhỏ hơn
nhƣ dextrin, maltotriose, maltose. Hỗn hợp này sau đó đƣợc thủy phân bởi
các enzym alpha-glucosidase ở màng ruột non (EC.3.2.1.20), enzym alpha
glucosidase

trong

lysosym

(EC.3.2.1.3)

và

sucrase-isomaltase

(EC.3.2.1.48, EC.3.2.10) thành glucose và đƣợc hấp thu vào máu [27], [40].
1.3.4. Vai trò của α-glucosidase và α-amylase đối với người bệnh tiểu đường
Biểu hiện bệnh của TĐ là lƣợng glucose trong máu cao hơn bình
thƣờng. Do đó, việc kiểm soát lƣợng glucose là một mục tiêu quan trọng để
làm giảm nguy cơ biến chứng sức kho lâu dài của bệnh TĐ. Carbohydrate


13
là nguồn cung ứng lớn glucose trong cơ thể. Phân tử carbohydrate bị thuỷ
phân thành các oligosaccharide bởi enzyme α-amylase (tu tạng), tiếp theo
ở ruột non, enzyme α-glucosidase thuỷ phân oligosaccharide thành glucose
và sau đó thẩm thấu vào máu. Do đó, nếu ức chế đƣợc 2 enzyme này thì
lƣợng glucose trong máu sẽ giảm, việc điều trị TĐ sẽ dễ dàng hơn.
Bằng cách ức chế hoạt động của enzyme alpha glucosidase có thể
làm giảm sự thủy phân carbohydrate và làm chậm quá trình hấp thu glucose
vào máu do đó giúp kiểm soát lƣợng glucose máu sau ăn [34].
1.3.5. Chất ức chế hoạt động của α-glucosidase và α-amylase
Hiện nay TĐ đƣợc kiểm soát bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ
sử dụng thuốc duy trì lƣợng glucose trong máu ổn định (Sulfonylurea), chất
ức chế tiêu hoá và hấp thụ tinh bột (Glucobay), thuốc cảm ứng độ nhạy của
insulin [3]. Các thuốc điều trị TĐ thƣờng hiếm và có giá thành cao. Vì vậy,
làm thế nào để tổng hợp đƣợc một số lƣợng lớn các chất có khả năng ức
chế enzym 2 α-glucosidase (EC 3.2.1.20) và α-amylase (EC 3.2.1.1) để
mang lại những loại thuốc với giá thành thấp hơn và đến đƣợc với tay của
mọi ngƣời dân là rất quan trọng. Bảng 1.1 liệt kê một số hợp chất có hoạt
tính ức chế enzyme α-glucosidase có nguồn gốc từ thực vật đã đƣợc nghiên

cứu và xác định giá trị ức chế IC50.
Bảng 1.1. Dịch chiết/ho t chất chiết xuất từ th c vật có ho t tính
ức chế α- glucosidase [6]
Th c vật

Bộ
phận
thu hái

Acosmium
Vỏ cây
panamense
(Onychiuroidea)–
Balsamo

Dịch chiết Ho t chất

Giá trị IC50

Dịch chiết buthanol

109 μg/mL


14
amarillo
Adhatoda vasica Lá
Nees
(Acanthaceae) –
Cang mai

Lá

Alstonia
scholaris
(Apocynaceae)–
Mò cua

Vasicine
Vasicinol

125 μg/mL
250 μg/mL

Quercetin
3-O-β-D- 1,96 mM (m)
pylopyranosyl
(1→2″)-β-D- 1,95 mM (s)
pyranoside (-)-lyoninesinol3-O- 1,43 mM (m)
β- Dglucopyranoside

Bergenia ciliate Thân rễ
(Saxifragaceae) –
Pakhanbhed

(-)-3-O-galloylepicatechin (-)-3- 560 μM (s), 334
O-galloylcatechin
μM (m) 297 μM
(s), 150 μM (m)

Cassia

auriculata
Avartaki

Dịch chiết methanol

0,023 mg/mL

Cecropia
Lá
obtusifolia
(Cecropiaceae) –
Guarumo

Dịch chiết buthanol

11,94 mM (s)
2,16 mM (m)

Asphodelaceae – Lá
Lô hội Trung
Quốc

Aloeresin A

11,94 mM(s)
2,16 mM (m)

Dịch chiết nước

ức

68,2±3,4%
100 mg

Curcuma longa Nghệ

Demethoxycurcumin
Bisdemethoxycurcumin

23,0 μM

Derris scandens
(Fabaceae)–Dây
tử quy

Scandenin A
Scandenone
Scandinone
4,5,7rihydroxybiprenylisoflavone

25,17±0,6
μg/mL
34,74±0,6
μg/mL

Cleistocalyx
operculatus
(Myrtaceae)
Vối

Hoa

–

Nụ hoa
–

chế
bởi