Nghiên cứu thu nhận và đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của prodigiosin tuyển chọn từ các chủng serratia marcescens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
----------

LUẬN VĂN THẠC SỸ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ
CỦA PRODIGIOSIN TUYỂN CHỌN TỪ
CÁC CHỦNG SERRATIA MARCESCENS

NGÔ THỊ BÍCH NGỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
----------

LUẬN VĂN THẠC SỸ
NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA PRODIGIOSIN TUYỂN
CHỌN TỪ CÁC CHỦNG SERRATIA MARCESCENS

NGÔ THỊ BÍCH NGỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 8420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Hướng dẫn 1: TS. ĐỖ MINH TRUNG
Hướng dẫn 2: TS. NGUYỄN SỸ LÊ THANH

HÀ NỘI - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm cộng sự.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào.
Tác giả luận văn
(Ký tên)

Ngô Thị Bích Ngọc


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Thiếu tá TS. Đỗ
Minh Trung – Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, TS.
Nguyễn Sỹ Lê Thanh – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt
Nam là người thầy đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu để em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các cán bộ của Viện Đại học Mở Hà
Nội, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y và Phòng Công
Enzym, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã tạo điều
kiện cho em trong suốt quá trình thực tập.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa sau đại học, Khoa công
nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang bị cho em những kiến thức nền
tảng và giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết đã luôn quan tâm, giải

đáp thắc mắc cũng như động viên em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà nội, ngày 16 tháng 11 năm 2018
Học viên

Ngô Thị Bích Ngọc


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
1.1. Prodigiosin............................................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm cấu tạo ...............................................................................................3
1.1.2 Nguồn gốc .........................................................................................................3
1.1.3. Hoạt tính sinh học của Prodigiosin ...................................................................6
1.1.4. Tình hình nghiên cứu về prodigiosin ................................................................9
1.1.5. Ứng dụng của prodigiosin ...................................................................................................... 14
1.2. Ung thư và các phương pháp điều trị hiện nay ................................................................ 15
1.2.1. Ung thư ........................................................................................................................................... 15
1.2.2. Các phương pháp điều trị ung thư....................................................................................... 17
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................................................... 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................... 20
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và vật tư tiêu hao ..............................................................20
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu chính ..............................................................................22
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................22
2.2.1. Các phương pháp vi sinh và hóa sinh .............................................................22
2.2.2.phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)............................................... 25
2.2.3. Nuôi cấy tăng sinh và đánh giá hoạt tính prodigiosin trên dòng tế bào ung thư
...................................................................................................................................29

2.2.4. Xử lý số liệu ....................................................................................................31
2.2.5. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................31
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 32
3.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Serratia sp có khả năng sinh tổng hợp
prodigiosin.................................................................................................................32


3.1.1. Kết quả nuôi cấy hoạt hóa các chủng vi khuẩn Serratia sp .............................32
3.1.2. Xác định hàm lượng prodigiosin .....................................................................34
3.1.3. Kết quả định danh các chủng Serratia bằng 16S rDNA .................................36
3.2. Kết quả thu nhận, tinh sạch và phân tích sản phẩm prodigiosin .............................. 39
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của prodigiosin trên dòng tế
bào Hep3B và MCF7 ............................................................................................................................. 41
3.3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính prodigiosin trên dòng tế bào Hep3B ...................41
3.3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính PG trên dòng tế bào MCF7 ..................................46
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 53
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 55


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

DMSO:

Dimethyl sulfoxit

FBS:

Fetal Brovine Serum

Huyết thanh bào thai bê

GvHD:

Graft-versus-host disease

Bệnh ghép chống chủ

Hep3B:

Homo sapiens Hepatocellular

Tế bào ung thư biểu mô gan

Carcinoma
IC50:

The half maximal inhibitory

Nồng độ ức chế 50%

concentration
MCF7

Human breast adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư vú

MTT:

3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) - 2,5
Diphenyltetrazolium Bromide

NRU

Neutral Red Uptake

OD:

Optical Density

Mật độ quang học

PBS:

Phosphate buffer saline

Đệm Phosphate

PG:

Prodigiosin

RPMI

Roswell Park Memorial Institute

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của PG…………………………………………………………..3
Hình 1.2: Cơ chế apoptosis (chết theo chu trình) của tế bào……………………......5
Hình 1.3: Cơ chế apoptosis (chết theo chu trình) của tế bào …………………….....9
Hình 2.1: Vector tách dòng pJET1.2/blunt………………………………………. 21
Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn prodigiosin...............................................................23
Hình 3.1: Hình ảnh các chủng vi khuẩn Serratia sp.được hoạt hóa trên đĩa môi
trường LB sau 18-24 giờ nuôi cấy ở 28°C…………………………………………33
Hình 3.2: Sắc ký lớp mỏng TLC các mẫu prodigiosin từ dịch tinh sạch sơ bộ của 14
chủng Serratia sp......................................................................................................35
Hình 3.3: Điện di DNA tổng số(A); Sản phẩm PCR (B); Sản phẩm cắt plasmid bằng
XhoI và XbaI (C).......................................................................................................37
Hình 3.4: Độ tương đồng của 3 chủng Serratia sp. Q1, Serratia sp.Q2, Serratia sp.
Q3 với các chủng trên Genbank................................................................................38
Hình 3.5: Cây phân loại chủng S. marcescens Q1, S. marcescens Q2, S. marcescens
Q3 với các chủng S. marcescens trên ngân hàng Genbank……………………..….39
Hình 3.6: Các phân đoạn Pg sạch được thu lại kiểm tra trên sắc ký bản mỏng........40
Hình 3.7. Hình ảnh tế bào Hep3B sau 24 giờ tiếp xúc với PG………………….....42
Hình 3.8. Một số hình ảnh tế bào Hep tiếp xúc với PG ở các nồng độ khác nhau sau
khi bổ sung MTT ở thời điểm 24 giờ……………………………………………...43
Hình 3.9: Hình ảnh tế bào MCF7 thời điểm 24 giờ tiếp xúc PG………………….47
Hình 3.10: Hình ảnh tế bào MCF7 tiếp xúc PG sau khi bổ sung MTT ……..……48


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Nguồn và sản lượng prodigiosin tổng hợp từ vi khuẩn…..…………… 12
Bảng 2.1: Thành phần các loại đệm và dung dịch……………………………………..…21

Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng cho nuôi cấy và thu nhận prodigiosin……………..….22
Bảng 2.3: Thành phần 1 phản ứng PCR………………………………………..….26
Bảng 3.1: Tuyển chọn các chủng Serratia sp.sinh tổng hợp prodigiosin……….…36
Bảng 3.2: Kết quả đo OD trên dòng tế bào Hep3B sau khi tiếp xúc PG ….......43
Bảng 3.3: Kết quả đo OD phản ứng MTT sau 24 giờ tiếp xúc PG với tế bào
MCF7……………………………………………………………………………...48


DANH MỤC ĐỒ THỊ

3.1: Phương trình hồi quy tuyến tính sau 24 giờ tiếp xúc PG của Hep3B....45
3.2: Phương trình hồi quy tuyến tính sau 48 giờ tiếp xúc PG của MCF7....50


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.1: Kết quả Sắc ký đồ phân tích sản phẩm prodigiosin tinh khiết so với PG
chuẩn…………………………………………………………………………….....41
3.2: Kết quả đo OD trên dòng tế bào Hep3B sau khi tiếp xúc PG ………….....44
3.2: Kết quả đo OD trên dòng tế bào MCF7 sau khi tiếp xúc PG …………......49


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) hàng năm trên thế giới có
khoảng 9-10 triệu người mới mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó chết vì căn
bệnh này. Dự đoán đến năm 2030 con số đó có thể lên tới 13 triệu người [1]. Tại
Việt Nam ung thư được xem là mối nguy hại lớn khi tỷ lệ tử vong cao, hệ lụy ảnh
hưởng đến tâm lý và tài chính cho cả người bệnh và gia đình. Theo số liệu vào
tháng 4/2014 của WHO về tỷ lệ chết do bệnh ung thư, Việt Nam đứng thứ 78 trong

172 quốc gia vùng lãnh thổ. Tỷ lệ chết vì ung thư ở Việt Nam là 110 ca/100.000
người.
Hiện nay có nhiều phương pháp điều trị ung thư như phẫu thuật, xạ trị, hóa
trị và tổng hợp các loại trị liệu (Elahian et al. 2013) [6]. Tuy nhiên mỗi một phương
pháp đều có ưu nhược điểm và có tác dụng phụ. Chính vì vậy ngày càng có nhiều
các nghiên cứu nhằm tìm ra các thuốc mới cũng như các phương pháp mới để đạt
được hiệu quả điều trị cao hơn.
Một trong những hướng nghiên cứu chính để phòng chữa ung thư là nghiên
cứu tìm các hợp chất tự nhiên có khả năng ngăn chặn sự hình thành phát sinh ung
thư hay tiêu diệt, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Một số các hoạt chất tự
nhiên có hoạt tính sinh học được sinh tổng hợp từ các chủng vi sinh vật được biết
đến là chủng Serratia marcescens. Chủng Serratia marcescens đã được biết đến là
có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất prodigiosin (PG). PG là chất chuyển hóa thứ
cấp tự nhiên có sắc tố đỏ, có công thức hóa học là C20H25N3O, khối lượng phân tử
khoảng 323.4 Da.
Hiện nay, prodigiosin đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà
nghiên cứu do khả năng ức chế miễn dịch và kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào
ung thư kháng thuốc (Elahian et al. 2013) [6 ]. Năm 2003 Campas.C và CS đã công
bố kết quả thử nghiệm Prodigiosin trên mẫu của 32 bệnh nhân ung thư máu dòng
lympho mãn tính, kết quả Prodigiosin có khả năng gây chết theo chu trình đối với
dòng tế bàolympho này [7]. PG cũng có có khả năng ức chế miễn dịch, gây ra chết
theo chu trình (apoptosis) ở các dòng tế bào ung thư tạo máu (Jurkat, NSO, HL - 60

1


và Ramos) [52] nhưng không ảnh hưởng tới các tế bào lành (Montaner et al. 2000)
[8]. Tác dụng kháng nấm của Prodigiosins đã được Wier.R.H và cộng sự năm 1952
[51] đã thử nghiệm trên lâm sàng trong điều trị nấm C. immitis, kết quả nghiên cứu
có sự phục hồi rõ ràng trên 14 bệnh nhân. Với mục đích thu nhận được sản phẩm

prodigiosin có hoạt tính. Nghiên cứu tiến hành tuyển chọn Serratia marcescens có
khả năng sinh tổng hợp PG. Tiến hành thu nhận sản phẩm PG từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn này và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của sản phẩm PG trên dòng
tế bào ung thư gan người (Hep3B) và ung thư vú người (MCF7). Xuất phát từ
những vấn đề trên em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thu nhận và đánh
giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của prodigiosin tuyển chọn từ các chủng
Serratia marcescens” với các mục tiêu như sau.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Tuyển chọn các chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin.
2. Đánh giá hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư in vitro của
prodigiosin thu nhận từ Serratia marcescens.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Prodigiosin
1.1.1. Đặc điểm cấu tạo
Prodiogiosin là chất chuyển hóa thứ cấp của vi khuẩn được phân lập lần đầu
tiên vào năm 1929 bởi Wrede và Rothhass nhưng đến năm 1934 người ta mới phát
hiện ra đặc điểm cấu trúc chính của nó. Prodiogiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa
học (4-methoxy-5-((5-methyl-4-pentyl-2H-pyrrol-2ylidene)methyl)-2,2′-bipyrrole),
công thức phân tử C20H25N3O, khối lượng phân tử 323,432 Da, là một họ các hạt đỏ
tự nhiên có đặc trưng là bộ khung pyrrolylpyrromethane [33]. Prodigiosin nhạy cảm
với ánh sáng và không tan trong nước, tan vừa phải trong alcohol, ether, tan tốt
trong chloroform, methanol, acetonitrile và dimethyl sulfoxide.

Hình 1.1. Cấu trúc của PG [33].

PG thường được tổng hợp bởi vi khuẩn Serratia sp, Pseudomonas sp,

Streptomyces sp và vi khuẩn Vibrio sp.

1.1.2. Nguồn gốc
Prodiogiosin là chất chuyển hóa thứ cấp tự nhiên được sinh tổng hợp bởi vi
khuẩn Gram âm và Gram dương như S. marcescens (Amit et al. 2007 [9]; de Araujo
et al. 2010 [10]), Hahella chejuensis (Cho et al. 2008; Huh et al. 2007 [11]),
Pseudomonas magnesiorubra (Gerber 1975) [11], Pseudomonas putida KT4040
(Klein et al. 2017) [13], Vibrio psychroerythreus (D'Aoust and Gerber 1974) [14].

3


Trong các loài vi khuẩn thì S. marcescens là loài có khả năng sinh tổng hợp
prodigiosin được biết tới sớm nhất và được tìm hiểu từ rất sớm (Huh et al. 2007)
[11].
Chủng S. marcescens là trực khuẩn hình que, Gram âm, vi khuẩn hô hấp tùy
tiện, thuộc họ Enterbacteriaceae. S. marcescens là một trong những vi sinh vật tốt
nhất để sản xuất ra prodigiosin. Sắc tố đỏ prodigiosin được phân lập từ S.
marcescens vào năm 1902 bởi Kraft. Tuy nhiên, S. marcescens cũng là một loài vi
khuẩn độc, là mầm bệnh gây ra những trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện như:
nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng mắt, viêm màng não và não áp
xe…(Perez-Tomas and Vinas 2010) [15]. Trong số các loài Serratia đã được mô tả
chỉ có ba loài có khả năng sinh tổng hợp prodiogiosin: S. plymuthica, S. rubidaea và
S. marcescens (de Araujo et al. 2010) [10].
Con đường tổng hợp prodigiosin:
Sinh tổng hợp PG có thể được thực hiện bằng hai bước. Bước đầu tiên còn
được gọi là bước tế bào chất sản xuất: MAP, MBC.
MAP (monopyrrole phân tử 2-metyl-3-n-amyl-pyrrole): có 3 pig (PiB, PigD,
PigE) tham gia vào quá trình này. Bước đầu tiên trong con đường MAP được cho là
được thực hiện bởi các enzyme sinh tổng hợp axit béo để tạo ra 2-octenal. Ngoài ra,

2- octenal có thể được tạo ra bởi quá trình tự oxy hóa các axit béo chưa bão hòa.
PigD cũng decarboxylates pyruvate nhưng mảnh 2-carbon sau đó thêm vào C-3 của
2-octenal tạo thành 3-acetyloctanal. Sau đó, sự chuyển dịch vào nhóm aldehyde
của 3-acetyloctanal và kết quả được aminoketone bằng PigB sẽ tự đóng vòng một
cách tự nhiên để tạo ra H2MAP vòng. Cuối cùng PigB chịu trách nhiệm cho sự oxy
hóa 2-electron của H2MAP tạo ra MAP (Harris và cộng sự, 2004, Williamson và
cộng sự, 2005).
MBC

(bipyrrolemmoietym4-methoxy-2,2-bipyrrole-5-carbaldehyde):

Tiền

chất để sản xuất pyrrol là acetate, serine và proline. Bước đầu tiên để tạo ra pyrrole
này bằng cách kích hoạt L-proline bởi ATP và sau đó chuyển nhóm L-proline đến
nhóm sulfate trong Pig G để hình thành prolyl-Pig G, sau đó quá trình oxy hóa bằng
PigA tạo thành Prolyl-2-carboxylPig G, sau đó chuyển của đơn vị pyrrole-2-

4


carboxyl từ Pig G đến cystine hoạt tính của PigJ, sau đó chuyển một nhóm malonyl
từ nhóm malony từ malonyl CoA sang phosphopantetheinyl sidechain của PigH và
decarboxylative của nhánh malonyl trên chất pyrrole- 2-carboxyl thioester tạo ra
một pyrrolyl-β -Ketothioester gắn với PigH, sau đó ngưng tụ serine từ PigH với
thioester Pyrrole-2-carboxy thành HBM (4-hydroxy-2,2bipyrrole5-methanol). Sự
oxy hóa của nhóm gốc rượu do PigM tạo thành HBC (4-hyroxy-2,2bipyrrole-5carbaldehyde).

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp PG [19].

Bước cuối cùng của con đường MBC, methyl hóa nhóm hydroxy của HBC,
liên quan đến hai enzyme PigF và PigN (Dairi và cộng sự, 2006, Williamson và
cộng sự, 2005). Thứ hai: Bước tổng hợp cuối cùng là sự ngưng tụ các sản phẩm
cuối của hai đường dẫn song song :MAP và MBC để tạo ra PG. Điều này được giải
thích bởi PigC như là enzym ngưng tụ (Ding và Williams, 1983, Williamson và
cộng sự, 2006).

5


1.1.3. Hoạt tính sinh học của Prodigiosin
PG được biết đến với hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm các hoạt tính như
chống sốt rét, kháng nấm, chống ức chế miễn dịch, kháng khuẩn [7], [10], [18], [23]
PG được biết đến nhiều về khả năng kích hoạt apoptosis của các tế bào ung thư ác
tính. PG gây ra apoptosis trong các tế bào ung thư tạo máu và các tế bào có nguồn
gốc từ các loại ung thư khác ở người, bao gồm dạ dày và ruột già không có độc tính
rõ rệt trong các dòng tế bào không tuyến. Cơ chế của sự ức chế này rất phức tạp và
có thể liên quan đến nhiều quá trình, bao gồm ức chế phosphatase, tạo ra sự phá vỡ
DNA đơn và đôi, thay đổi pH, điều chỉnh kinase protein kích hoạt mitogen và ức
chế sự tiến triển của chu kỳ tế bào. Chính vì vậy PG là một hoạt chất có nhiều tiềm
năng và ứng dụng cao, PG hiện đang nhiều nhà khoa học và có nhiều công trình
nghiên cứu quan tâm nghiên cứu ở giai đoạn tiền lâm sàng để điều trị một số loại
ung thư trong đó có ung thư tuyến tụy.
Kháng khuẩn:
Tác dụng ức chế của PG trên vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) được nghiên
cứu và cho thấy nó có tác dụng tốt hơn trên vi khuẩn Gram (+) bao gồm
Staphylococcus

aureus,

Staphylococcus

saprophyticus,

Bacillus

subtilus,

Enterococcus avium và Streptococcus pyogenes so với vi khuẩn Gram (-) như
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus
mirabilis và Klebsiella pneumonia.
Hoạt tính kháng khuẩn của PG thể hiện tác dụng kháng khuẩn không chỉ
như là các chất kháng sinh nhưng gián tiếp bằng cách ngăn chặn sự hình thành
màng sinh học của vi khuẩn và ức chế các enzyme đích như DNA gyrase và
topoisomerase IV, gây ức chế phát triển tế bào.
Hoạt tính kháng nấm:
Hoạt tính kháng một số loại nấm gây bệnh của PG cũng đã được thử nghiệm
và được sử dụng như một chất diệt nấm chống lại Coccidioides immitis, nhưng xảy
ra xơ cứng tĩnh mạch khi tiêm trong công thức có acid glutamic. Phổ kháng nấm
của PG lớn và bao gồm các loài Candida, Aspergillis, Penicillium, Saccharomyces

6


và Histoplasma. Những năm gần đây PG đã nghiên cứu và được xem xét đối với
tiềm năng ứng dụng trong điều trị kháng nấm.
Hoạt tính ức chế miễn dịch:
PG được nghiên cứu sử dụng như một chất ức chế miễn dịch. PG đã được
chứng minh là ức chế bệnh ghép chống chủ nhưng không có dấu hiệu gây độc khi
thử trên mô hình chuột (Han và cộng sự, 2001) [16]. Đã có sự chậm trễ tự miễn dịch

bệnh tiểu đường do PG. Ngoài ra, đã có những biện pháp phòng ngừa GvHD và
viêm khớp gây ra bởi collagen ở chuột (Han và cộng sự, 2001) [16]. Các dạng PG
khác như Undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin đều ức chế
chọn lọc sự tăng sinh tế bào T. Tuy nhiên, các mức độ khác nhau về độc tính trong
cơ thể cũng khác nhau (Pérez-Tomás và Montaner 2003) [17].
Chống sốt rét:
Trong những năm 1960, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng PG có hoạt tính kháng
sốt rét nhưng hoạt tính này lại ít được nghiên cứu nhất cho đến gần đây khi mà các
nghiên cứu chuyên sâu được tiến hành bao gồm phân tích định lượng các chỉ số
tương đồng phân tử để đánh giá ảnh hưởng các đặc điểm cấu trúc lên hoạt tính
kháng sốt rét của PG. PG, undecylprodigiosin và metacycloprodigiosin có hoạt tính
mạnh mẽ khi thử nghiệm in vitro kháng lại Plasmodium falciparum.
Mặc dù PG có tác dụng lâu dài lên sự sống sót của chuột nhiễm Plasmodium
nhưng những thử nghiệm trên cơ thể sống (số lượng chuột giới hạn – 5 con/lần điều
trị) cho thấy rằng liều lượng thuốc kháng sốt rét được áp dụng vừa không chỉ chữa
được mà còn gây độc cho vật chủ (Gerber 1975) [12]. Các thí nghiệm trên in vivo
với heptyl PG được tiêm dưới da chuột nhiễm Plasmodium berghei ANKA cho thấy
khả năng sống sót kéo dài nhưng cũng gây tổn thương xơ cứng ở khu vực tiêm
(Lazaro et al. 2002) [18].
Mặt khác, các hợp chất tương tự PG được thay một hoặc hai hydrogen làm
giảm mạnh ký sinh trùng (hơn 90%) ở bệnh nhân nhiễm Plasmodium yoelii ở chuột
nhắt sau khi uống thuốc và quan trọng là không có dấu hiệu gây độc rõ ràng. Hoạt
tính kháng sốt rét mạnh mẽ cả in vitro và in vivo đối với chloroquine-sensitive D6
và các loại kháng thuốc Dd2 thuộc lớp P. Falciparum cũng đã được ghi nhận

7


(Kancharla et al. 2011) [19]. Những kết quả này cho thấy mặc dù PG tự nhiên có
thể không hiệu quả trong chữa trị sốt rét nhưng tiềm năng kháng sốt rét vẫn có thể

được tìm thấy ở các loại prodigiosin tổng hợp mới .
Những phát hiện này đã thúc đẩy các nghiên cứu sâu rộng để có được thật
nhiều loại prodigiosin tổng hợp cũng như các nghiên cứu chuyên sâu đặc tính kháng
sốt rét của chúng thông qua mô hình pharmacophore.
Hoạt tính kháng tế bào ung thư:
PG đã được thử nghiệm chống lại hơn 60 dòng tế bào ung thư với nồng độ
ức chế trung bình 2.1 µM. PG cho thấy có nhiều dòng tế bào đích. Vì thế, cơ chế
hoạt động chính xác của prodiginine trong thúc đẩy quá trình tự chết của tế bào còn
chưa rõ ràng. Prodiginine cũng là những lựa chọn tốt bởi chúng không bị ảnh hưởng
bởi các kênh kháng thuốc, có thể tạo đề kháng cho các yếu tố chống ung thư khác.
Các prodiginine được mô tả như những hợp chất chống ưng thư gây tự chết tế bào
và gây ra stress cho tế bào như ngừng chu kỳ tế bào, gây tổn thương DNA và thay
đổi pH nội bào (pHi), tất cả gây ra tự chết tế bào. Vị trí trong tế bào của PG có thể
đưa ra dữ kiện về cơ chế hoạt động của nó, bởi PG được tìm thấy trong nhân, tập
trung ở bào tương, trong các hạt vùi gần nhân và trong màng ty thể. Hoạt động gây
tự chết tế bào của PG trong nhân tế bào được có thể hỗ trợ cho giả thuyết về phân
mảnh DNA. Tuy nhiên, chất kháng nước tự nhiên của prodiginine tổng hợp,
Obatoclax, được đánh giá là yếu tố quan trọng trong định vị hợp chất đối với màng
ty thể, có thể tạo ra tương tác với họ Bcl-2 kháng sự tự chết ở màng này Bcl-2. Hai
con đường chính của quá trình tự chết tế bào hợp lại các phân tử hoạt hóa capases.
Con đường nội sinh cũng được gọi là con đường chết ty thể, được kích hoạt bởi
phóng xạ, các thuốc gây độc cho tế bào, stress tế bào và thiếu hụt yếu tố sinh trưởng
tế bào. Con đường gây chết tế bào được nhận định do chức năng hoạt hóa một
caspase khởi phát, caspase - 8, phân giải Bid và hoạt hóa caspase - 3, caspase - 7
của ty thể. Con đường gây chết của tế bào được bắt đầu trực tiếp bởi các thụ cảm
thể chết tế bào Fas và yếu tố hoại tử u - liên quan tới tự chết tế bào - tạo ra phối tử
(TRAIL) của các thụ cảm thể. PG được thử nghiệm cho thấy có thể chèn vào

8

dsDNA. Trong điều kiện có mặt đồng, chúng gây oxi hóa các đoạn DNA (Melvin et
al. 2000) [20].

Hình 1.3. Cơ chế apoptosis (chết theo chu trình) của tế bào [20].

PG thúc đẩy kênh K+/Cl-, kết quả là gây axit hóa của tế bào chất và do đó
làm ngừng chu kỳ tế bào và cuối cùng là chết theo chu trình (Yamamoto et.al, 2000)
[21]. PG gây chết theo chu trình trong các dòng tế bào ung thư (Montaner và
PerezTomas, 2001) [22] và có hoạt tính chọn lọc chống lại ung thư vú, ung thư đại
tràng, ung thư máu, và các tế bào ung thư gan, phổi…

1.1.4. Tình hình nghiên cứu về prodigiosin
Những nghiên cứu trên thế giới:
Lịch sử nghiên cứu của prodiogiosin và bệnh ung thư bắt đầu vào năm 1891
bằng các nghiên cứu của Coley và cộng sự về vaccine ông tạo ra. Coley kết hợp các
chiết xuất của vi khuẩn Streptococcus sp. và vi khuẩn Bacillus prodigiosus (sau này
gọi là S. marcescens), và sau đó tiệt trùng hỗ hợp bằng nhiệt hoặc lọc. Hỗn hợp này

9


được gọi là độc tố Coley. Độc tố Coley đã được áp dụng trong điều trị các khối u
với kết quả khả quan ở các khối u có nguồn gốc trung bì. Một số độc tố có thể có
trong chất độc Coley, như prodiogiosin (Coley 1891) [23].
Sau này, hoạt tính sinh học của prodiogiosin được các nhà khoa học quan
tâm nghiên cứu nhiều hơn, tập trung chủ yếu vào việc nâng cao hiệu quả sinh tổng
hợp và xác định các hoạt tính, đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư của prodiogiosin.
Theo nghiên cứu Montaner và cộng sự (2003) [22], prodiogiosin và các dẫn
xuất hứa hẹn trở thành nguyên liệu mới và hiệu quả trong việc tổng hợp thuốc

chống ung thư vì những tác động quan trọng đến quá trình tự chết của tế bào –
apoptosis. Các nghiên cứu của Khanafari năm 2006 và Pandey năm 2007 cũng cho
các kết quả tương tự (Kawasaki et al. 2008) [24].
Năm 2002, Ruiz và cộng sự nghiên cứu về khả năng gây chết, sự biến đổi
hình thái biểu hiện của quá trình tự chết trên dòng tế bào ung thư dạ dày HGT-1.
Các tế bào được phân tích bằng các khảo nghiệm MTT (3-(4,5-dimethylthiozol-2yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide), sự phân mảnh của DNA, nhuộm Hoechst
33342 và nghiên cứu về cấu trúc sợi actin. Các tế bào được xử lý với prodiogiosin
đã cho thấy có sự sụt giảm số lượng tế bào bởi quá trình apoptosis. Phân tích hình
thái tế bào, xử lý bằng prodiogiosin cho thấy prodiogiosin gây ra co rút tế bào,
ngưng kết nhiễm sắc thể, tổ chức lại cấu trúc sợi actin và tách rời các tế bào từ chất
nền nuôi cấy. Từ các kết quả trên cho thấy prodiogiosin tác động tới quá trình
apoptosis trong tế bào ung thư dạ dày HGT-1 và prodiogiosin có khả năng được sử
dụng như một loại thuốc hóa trị liệu mới (Montaner et al. 2003) [17].
Bên cạnh đó, hai dẫn xuất của prodiogiosin là metacycloprodigiosin và
undecylprodigiosin cũng có hoạt tính gây độc với năm dòng tế bào ung thư ở người
P388, HL-60, A-549, BEL-7402, SPCA4 (Liu et al. 2005) [25]. Điểm đích mà
prodiogiosin và các dẫn xuất tác dụng đến chưa được xác định rõ ràng nhưng hoạt
tính kháng ung thư của chúng được cho là nhưng tác động liên quan chặt chẽ đến
quá trình tự chết apoptosis của tế bào (Montaner et al. 2000) [8].
Khả năng kháng ung thư của prodiogiosin được nghiên cứu trên tế bào ung
thư cổ tử cung bằng các phân tích MTT và NRU cho thấy. Liều lượng thuốc càng

10


tăng thì càng làm giảm tỷ lệ phát triển của dòng tế bào ung thư Hela-299. Kết quả
này cho thấy prodiogiosin có hoạt tính kháng ung thư và tác động tới quá trình
apoptosis chống lại tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung của con người.
Các nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư của prodiogiosin ngày càng nhiều
và đi sâu vào cơ chế tác động của nó đến các tế bào ung thư, mở ra nhiều hướng thử

nghiệm với các loại tế bào ung thư khác nhau.
Ngoài hoạt tính chống ung thư, prodiogiosin còn có hoạt tính kháng nấm,
kháng khuẩn, chống oxy hóa. S. plymuthica, S. rubidaea thuộc chủng Serratia phân
lập từ rễ cây cải dầu có khả năng kháng 18 chủng nấm. Hiệu quả kháng nấm dựa
vào kháng sinh (prodigiosin và pyrronitrin) cùng với enzyme (chitinase và beta-1,3glucanase) do các chủng vi khuẩn này tổng hợp (Kamble and Hiwarale 2012) [26].
Những nghiên cứu gần đây về quá trình sinh tổng hợp prodiogiosin tập trung
nhiều vào việc thử nghiệm các nguyên vật liệu mới làm môi trường nuôi cấy với chi
phí thấp và đem lại hiệu quả cao.
Sản lượng prodiogiosin sản xuất từ vi khuẩn chịu ảnh hưởng lớn bởi các yếu
tố dinh dưỡng và hóa lý như nguồn cung cấp nitơ, carbon, các muối vô cơ, nhiệt độ,
pH, và nồng độ oxy hòa tan (Chang et al. 2011; Giri et al. 2004) [27],[31]. Các yếu
tố chính ảnh hưởng đến sản xuất prodigiosin là thành phần môi trường. Một số
nghiên cứu cho thấy để sản xuất prodiogiosin, trong môi trường sử dụng nguồn
carbohydrate với nồng độ thấp, với môi trường bổ sung glucose nồng độ cao làm ức
chế tổng hợp ở S. marcescens (Clements-Jewery 1976; Kalivoda et al. 2010)
[28],[29]... Các tác động tiêu cực của glucose vào sản xuất undecylprodigiosin trong
Streptomyces cũng đã được báo cáo (Nada et al. 2014) [30]. Tuy nhiên, sản xuất
prodigiosin sản lượng được tăng lên đáng kể bằng cách bổ sung 0,5% (w/v) glucose
hoặc maltose trong môi trường nuôi cấy (Giri et al. 2004) [31]. Bên cạnh nguồn
carbon, nguồn nitơ trong môi trường và tỷ lệ cacbon so với nitơ cũng ảnh hưởng
đến khả năng sinh tổng hợp của prodiogiosin.

11


Bảng 1.1. Nguồn và sản lượng prodigiosin tổng hợp từ vi khuẩn

Chủng vi khuẩn
Serratia marcescens C3

Prodigiosin
Prodigiosin

Sản
lượng/lít
15,6 g

Serratia marcescens PProdigiosin
2,4 g
125
Serratia marcescens UCP
Prodigiosin
49,5 g
1459
Serratia rubidaea
Prodigiosin
10 mg
Hahella chejuensis
Prodigiosin
0,6 g
KCTC2396
Streptomyces sp. JS520
Undecylprodigios
138 mg
in
Streptomyces coelicolor
Undecylprodigios
2,79 mg
A3(2)
in

Saccharopolyspora sp
Metacycloprodigi
Na
osin
Zooshikella rubidus S1-1 Cycloprodigiosin
47,8 mg
and prodigiosin
Vibrio sp. DSM14379
Sắc tố giống
0,3 mg/mg
Prodigiosin
cdw
Streptomyces NRC50
Hỗn hợp
4g
prodigiosin

Tài liệu tham
khảo
Chen et al
( 013)
Su et al. (2011)
de Araújo et al.
(2010)
Siva et al. (2012
Kim et al. (2008)
Stankovic et al.
(2012)
Luti and Mavituna
(2011)

Liu et al. (2005)
Lee et al. (2011)
Staric et al. (2010)
El-Bondkly et al.
(2012)

Để nâng cao năng suất sinh tổng hợp prodiogiosin, Kim và cộng sự tối ưu
hóa thành phần trong môi trường cơ bản: NaHCO3, Na2SiO3, NH4NO3, Na2SO4 và
CaCl2 được xác định là quan trọng cho sinh tổng hợp prodiogiosin. Công thức môi
trường được tối ưu hóa sử dụng thiết kế Box-Behnken: 1% sucrose; 0,4% peptone;
0,1% yeast extract; và (g/L): NaCl 20; Na2SO4 9; CaCl2 1,71; KCl 0,4; và (mg/L):
H2BO3 10; KBr 50; NaF 2; NaHCO3 45; Na2SiO3 4,5; NH4NO3 4,5. Năng suất sinh
tổng hợp tối ưu là 1,495 g/L, cao hơn 3 lần so với môi trường cơ bản là 0,492 g/L
(Kim et al. 2008) [32].
Shahitha và Poomima (2012) [33] nghiên cứu tối ưu các thành phần môi
trường nuôi cấy ở chủng S. marcescens làm tăng khả năng sinh tổng hợp
prodigiosin. Kết quả cho thấy ở môi trường bột lạc khả năng sinh tổng hợp
prodiogiosin cao nhất đạt 37,6 mg/ml, bột vừng 16,5 mg/ml. Trong khi đó ở môi

12


trường NB khả năng sinh tổng hợp prodigiosin đạt 0,51 mg/ml và môi trường
peptone glycerol broth 0,3 mg/ml ở 28C. Môi trường NB có bổ sung maltose 1,82
mg/ml. Trong số các loại dầu khác nhau, dầu lạc cho năng suất sinh tổng hợp
prodigiosin là cao nhất đạt 2,72 mg/ml.
Năm 2013, Pradeep và cộng sự nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
prodiogiosin từ chủng S. mercescens MBB05. Kết quả cho thấy trong số 11 môi
trường khảo sát thì môi trường 2% bột lạc được xác định cho năng suất cao nhất
(560,4 mg/ml) cao hơn 4,5 lần so với môi trường cơ bản với các điều kiện nuôi cấy

là pH 7 ở 30C (Pradeep et al. 2013) [34].
Sun và cộng sự (2015) [35] đã sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tách
chiết prodiogiosin, hiệu suất prodiogiosin thu được đạt 4,3g/100g tế bào khô với các
thông số kỹ thuật: thời gian chiết 17,5 phút, nhiệt độ tách 23,4°C và tỷ lệ dung môi
để hòa tan =1:27,2 (Sun et al. 2015) [35].
Những nghiên cứu về prodigiosin ở Việt Nam:
Ở Việt Nam cũng có một vài công trình công bố nghiên cứu về Prodigiosin
từ vi khuẩn Serratia marcescens.
Nguyễn Hoài Hương và Nguyễn Hoàng Anh Kha (2015) [2] đã phân lập
được S. marcescens từ tuyến trùng ENP và nuôi cấy thu vi khuẩn này cũng như sắc
tố prodigiosin rồi thử nghiệm khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura, kết quả
chỉ ra rằng sau khi tiêm dịch chiết chứa prodigiosin với nồng độ 422 ng/sâu đã gây
chết hơn 65% sâu khoang sau 10 giờ (Nguyễn Hoài Hương and Nguyễn Hoàng Anh
Kha 2015) [2].
Vũ Trọng Lượng và cộng sự (2015) [3] đã công bố tách chiết, tinh sạch và
đánh giá được hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của hoạt chất chống ung thư
prodigiosin từ chủng Serratia marcescens M6 (Vũ Trọng Lượng et al. 2015) [3].
Nguyễn Sỹ Lê Thanh và Lê Đình Quyền (2015) [1] đã tinh sạch và đánh giá
hoạt tính kháng khuẩn của sắc tố đỏ prodigiosin từ Serratia marcescens M10. Hoạt
chất prodigiosin có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn S. aureus,

13


Bacillus subtilis mà không ức chế chủng E. coli (Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Lê Đình
Quyền 2015) [1].
Để thu được prodigiosin hiện nay các nghiên cứu thường tập trung vào đối
tượng sử dụng là chủng S. marcescens, bởi sinh tổng hợp prodigiosin từ S.
marcescens cho sản lượng cao, dễ nuôi cấy, sắc tố prodigiosin thu được có hoạt tính cao.

1.1.5. Ứng dụng của prodigiosin
Prodigiosin đã được tìm thấy có nhiều ứng dụng như làm thuốc kháng khuẩn,
kháng nấm, thuốc chống sốt rét, gây độc tế bào, làm chất màu thực phẩm, PG làm
thuốc nhuộm cho polyolefin, kem chống nắng, ngoài ra còn có hiệu quả như kiểm
soát sinh học chống lại tảo độc hại trong môi trường biển tự nhiên. Không chỉ vậy,
hiện nay người ta đã phát hiện nhiều tác dụng mới của prodiogiosin như ức chế
miễn dịch, kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư kháng thuốc. Prodigiosin
đã được ứng dụng trên lâm sàng. Năm 1953, Wier.R.H và CS đã thử nghiệm trên
lâm sàng PG trong điều trị nấm C.immitis, kết quả có sự phục hồi trên 14 bệnh
nhân.
Các sắc tố từ vi sinh vật có thể đóng vai trò là nguồn để thay thế các chất
màu tổng hợp sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, với một số hạn chế như độ
nhạy, độ tan và độ ổn định ngắn khi phơi nhiễm với pH, nhiệt độ ánh sáng và nhiệt
độ cao. Do đó PG đã được sản xuất bằng cách sử dụng kappa carrageenan và
maltodextrin làm chất đóng gói sau khi tối ưu hóa các thông số sấy phun trên năng
suất đóng gói (EY), độ ẩm, kích thước hạt, cường độ màu của các viên nang siêu
nhỏ PG. Các hạt đã được áp dụng thành công cho sữa chua, sữa và nước uống có ga
(Namazkar and Ahmad 2013).
Trong ngành công nghiệp hóa học và thực phẩm, các yêu cầu về màu sắc
cũng quan trọng trong đó mầu sắc có nguồn gốc từ hữu cơ nói chung được sử dụng
với nhiều ưu điểm như nhiệt độ khi sử dụng phù hợp, có độ ổn định, phân tán
tốt. Các sắc tố có nguồn gốc từ vi sinh vật có thể được coi là một trong nguồn cung
cấp các hợp chất có tính an toàn trong ngành công nghiệp hóa học. PG, một sắc tố
tự nhiên có thể là một chất thay thế cho màu sắc của polyolefines. PG cũng được sử

14