Nghiên cứu thành phần hóa học có hoạt tính diệt tế bào ung thư của loài dâu ăn tằm Morus Alba L.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN






TÓM TẮT LUẬN ÁN


NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÓ HOẠT TÍNH
DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LOÀI
DÂU TẰM MORUS ALBA L.




LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC



Nghiên cứu sinh Phùng Thị Xuân Bình
Chuyên ngành: Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62.44.01.17
Hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS Hoàng Thanh Hương

2. TS Nguyễn Tiến Đạt







HÀ NỘI - 2015

Công trình được hoàn thành tại: Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và Viện Hóa
sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam





Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Hoàng Thanh Hương
2. TS. Nguyễn Tiến Đạt

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:


Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Hóa học
các Hợp chất thiên nhiên, Cầu Giấy, Hà Nội vào hồi giờ ngày tháng năm

2015







Có thể tìm hiểu luận án tại Thư viện Quốc gia Hà Nội hoặc Thư viện Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

1

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Hiện nay ung thư là nguyên nhân chính thứ hai gây tử vong ở các nước phát triển
và phổ biến ở các nước đang phát triển. Trên thế giới, mỗi năm có khoảng 6 triệu
người chết vì ung thư. Con số này đang có xu hướng gia tăng. Bởi vậy việc tìm kiếm
thuốc đặc trị cũng như các thuốc hỗ trợ điều trị và các tác nhân dự phòng hóa học là
hết sức cần thiết và cấp bách.
Trải suốt lịch sử nhân loại, thực vật bậc cao đã trở thành nguồn nguyên liệu tiềm
năng cho phát triển các thuốc chống ung thư. Nhiều thuốc chống ung thư trên thị
trường hiện nay có nguồn gốc thiên nhiên hoặc được tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc
của hợp chất thiên nhiên. Các tác nhân chống ung thư nguồn gốc thiên nhiên cũng cho
ta cơ hội to lớn để đánh giá các hợp chất hóa học chống ung thư mới cũng như các cơ
chế tác dụng mới.
Trong những năm gần đây, các tiến bộ vượt bậc trong lĩnh vực sinh học phân tử đã
đem lại nhiều hiểu biết sâu sắc về cơ chế sinh bệnh thúc đẩy việc ứng dụng các phép
thử sinh học hiện đại ngay từ khâu sàng lọc và phân lập chất. Do có độ nhạy và chính
xác cao phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế NF-B trên dòng tế bào ung thư được

sử dụng khá hiệu quả ở các nước tiên tiến trong việc sàng lọc các chất có tác dụng
phòng và chống ung thư.
Trên cơ sở kết quả sàng lọc các dịch chiết thô của một số dược liệu Việt Nam về
các hoạt tính ức chế sự hoạt hóa NF-B và gây độc tế bào, cây dâu tằm Morus alba L.
(họ Moraceae) được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu của luận án. Loài cây này khá
phổ biến ở Châu Á và nhiều nơi trên Thế giới. Ngoài công dụng chính là nguồn cung lá
để nuôi tằm, quả làm đồ uống, Morus alba L. còn được dùng trong y học dân tộc của
nhiều nước, đặc biệt trong y học cổ truyền Trung Hoa để điều trị các bệnh tiểu đường,
viêm khớp, hô hấp, ung thư và một số bệnh đường tiêu hóa. Do đa dạng về thành phần
hóa học và tác dụng sinh học Morus alba L. đã và đang là mối quan tâm của nhiều
công trình trên Thế giới, đặc biệt trong một vài năm gần đây. Tuy nhiên tính tới thời
điểm luận án được tiến hành chưa có công trình nào trên thế giới nghiên cứu về thành
phần hóa học có tác dụng diệt tế bào ung thư của loài cây này theo sự dẫn đường của
hoạt tính ức chế NF-B, còn ở Việt Nam ngoài một số công bố về hoạt tính chống oxi
hóa và tác dụng điều trị tiểu đường, mới chỉ có nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa
học.Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học có hoạt tính diệt tế bào ung thư
của loài dâu tằm Morus alba L.” nhằm mục tiêu nghiên cứu thành phần hoá học theo
sự dẫn đường của phép thử sinh học để tìm ra được các hợp chất có hoạt tính diệt tế
bào ung thư theo cơ chế ức chế yếu tố NF-κB. Từ đó giúp định hướng khai thác sử
dụng nguồn dược liệu này một cách hiệu quả.
2. Đối tượng nghiên cứu và nội dung của luận án
Đối tượng nghiên cứu của luận án là loài dâu tằm (Morus alba L.)
Nội dung chính của luận án bao gồm:
2

1. Sàng lọc và phân lập các hợp chất từ lá và vỏ rễ loài dâu tằm theo sự dẫn
đường của phép thử hoạt tính ức chế NF-B trên dòng tế bào ung thư.
2. Xác định cấu trúc các chất đã phân lập.
3. Đánh giá hoạt tính ức chế NF-κB và gây độc tế bào của các hợp chất đã
phân lập.

3. Những đóng góp mới của luận án
3.1.Là công trình đầu tiên phân lập các chất có tác dụng diệt tế bào ung thư từ loài
Morus alba L. theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức chế hoạt động của NF-B
trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa).
3.2.Đã phân lập và xác định cấu trúc của 19 hợp chất LM1 – LM19 từ lá và 8 hợp
chất RM1 – RM8 từ vỏ rễ. Trong số đó có 2 hợp chất mới là: 3-prenyl-3-geranyl-
5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) và kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether (RM1).
Các hợp chất sanggenon J (LM2), sanggenon K (LM3), 8,3-diprenyl-5,7, 4-
trihydroxyflavone (LM4), 8-geranylapigenin (LM6) atalantoflavone (LM10) và
steppogenin (LM12) lần đầu tiên được tìm thấy từ loài dâu tằm (Morus alba L.).
3.3.Hầu hết các hợp chất phân lập được đều có hoạt tính mạnh ở cả hai phép thử
hoạt tính ức chế hoạt động của NF-B trên dòng tế bào ung thư HeLa và hoạt tính gây
độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7 và Hep-3B.
+ Hợp chất mới LM1 ức chế NF-B với IC
50
1,51 M và cũng có hoạt tính gây độc tế
bào mạnh trên cả 3 dòng tế bào ung thư với giá trị IC
50
lần lượt là 1,32, 3,92 và 5,22 M.
+ Hợp chất mới RM1 ức chế NF-B với IC
50
4,65 M và có hoạt tính gây độc tế
bào tốt với các giá trị IC
50
lần lượt là 8,44, 13,8 và 8,32 M.
3.4.Cặp đồng phân lập thể sanggenon C và sanggenon O ức chế mạnh sự sản sinh
NO trên dòng tế bào RAW264.7 bị kích hoạt bởi LPS với các giá trị IC
50
là 2,82
(sanggenon C) và 1,15 M (sanggenon O), hai hợp chất này cũng ức chế mạnh sự hoạt

hóa NF-B với các giá trị IC
50
lần lượt là 3,38 và 1,29 M trên dòng tế bào ung thư này.
3.5.Lần đầu tiên hợp chất sanggenon O được nghiên cứu hoạt tính ức chế hoạt động
NF-B ở mức độ phân tử qua sự đánh giá biểu hiện của gen iNOS, sự phosphoryl hóa
và giáng hóa của IB bằng phương pháp Western blot.
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 143 trang với 14 bảng số liệu, 85 hình, 178 tài liệu tham khảo và phụ
lục phổ. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (34 trang),
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (4 trang), Chương 3: Thực nghiệm
(18 trang), Chương 4: Kết quả và thảo luận (66 trang), Kết luận (2 trang), Các công
trình đã công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (16 trang).
II. NỘI DUNG LUẬN ÁN
Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, thực tiễn, tính thời sự và nhiệm vụ của
luận án.
3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
Phần này tổng hợp các nghiên cứu trên Thế giới và trong nước về:
+ Chi Dâu tằm (Morus L.) và loài dâu tằm (thực vật học, ứng dụng trong y học dân
tộc, hóa học và hoạt tính sinh học).
+ Yếu tố phiên mã NF-B và ung thư
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu: loài dâu tằm Morus alba L. ở Việt Nam
Mẫu thực vật: Lá và rễ loài dâu tằm (Morus alba L.) được thu hái vào tháng 3/2010
tại Mỹ Đức, Hà Nội và được PGS.TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh Thái và Tài nguyên
sinh vật giám định tên khoa học. Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại phòng Hoạt chất sinh
học, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
2.2. Mô hình nghiên cứu: chiết tách theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức
chế NF-B trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa).

2.3. Kỹ thuật phân lập các hợp chất bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký
mỏng điều chế, sắc ký cột (CC).
2.4. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất: kết hợp giữa các
thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: điểm nóng chảy, độ quay
cực ([]
D
), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng, phổ 1D, 2D-NMR.
2.5. Các phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: các phép thử đánh giá hoạt
tính sinh học được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nghiên cứu ung thư mức độ phân tử
– Viện Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (Laboratory of Molecular
Anticancer Research – KRIBB) và phòng Hoạt chất sinh học – Viện Hóa sinh biển, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và khả năng sống sót của tế bào: theo phương
pháp nhuộm màu với 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT).
Đánh giá hoạt tính ức chế NF-

B: theo phương pháp secreted alkaline
phosphatase (SEAP) và sử dụng kít thử TransAM NF-kB p65 Chemi Kit (Active Motif).
Đánh giá sự sản sinh NO theo phương pháp Griess.
Đánh giá tác động đến biểu hiện của iNOS và sự phosphoryl hoá, giáng hoá của
IκBα theo phương pháp Western blot.
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM
Phần này mô tả chi tiết các quá trình chiết suất, phân lập chất và đánh giá các hoạt tính
liên quan đến tác dụng diệt tế bào ung thư cùng dữ liệu phổ của các chất phân lập được.
Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất
Hợp chất LM1: 3-prenyl-3

-geranyl-5,7, 2

,4


-tetrahydroxyflavone (Hợp chất mới)
Dạng bột màu vàng. UV (MeOH) 
max
(log): 216,5 (4,49), 258,4 (4,37) và 328,5
(4,20) nm. IR (KBr) 
max
(cm
-1
): 3412, 1653, 1616. ESI-MS m/z: 513,5 [M+Na]
+
, 491,6
4

[M+H]
+
, 489,6 [M-H]

. HR-FAB-MS m/z: 491,2433 [M+H]
+
phù hợp với tính toán lý
thuyết đối với công thức C
30
H
35
O
6
491,2434).
1
H NMR (400 MHz, acetone-d

6
):  (ppm) 13,10 (1H, s, 5-OH), 7,01(1H, d, J =
8,4 Hz, H-6), 6,57 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5), 6,30 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8), 6,23 (1H,
d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,32 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-2), 5,08 (2H, m, H-10, 7), 3,46 (2H,
br d, J = 7,2 Hz, H-1), 3,08 (2H, br d, J = 6,8 Hz, H-9), 2,05 (2H, m, H-6), 1,97 (2H,
m, H-5), 1,78 (3H, br s, H-4), 1,61 (3H, br s, H-9), 1,55 (6H, br s, H-13, 10), 1,37
(3H, br s, H-12).
13
C NMR (100 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 162,1 (C-2), 122,2 (C-3), 183,2 (C-4),
105,4 (C-4a), 159,4 (C-5), 99,2 (C-6), 164,8 (C-7), 94,3 (C-8), 163,4 (C-8a), 113,2 (C-
1), 154,5 (C-2), 117,0 (C-3), 158,8 (C-4), 108,2 (C-5), 128,8 (C-6), 24,6 (C-9),
122,4 (C-10), 132,3 (C-11), 25,9 (C-12), 17,7 (C-13), 23,1 (C-1), 123,6 (C-2), 135,4
(C-3), 16,4 (C-4), 40,6 (C-5), 27,5 (C-6), 125,2 (C-7), 131,7 (C-8), 25,9 (C-9),
17,7 (C-10).
Hợp chất LM2: sanggenon J (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm)
Dạng bột màu vàng, []


: -18,3
o
(c 0,15, MeOH). ESI-MS m/z: 487,6 [M+H]
+
,
489,6 [M+Na]
+
, 419,4 [M-H]

.

1
H-NMR (500 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 7,10 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6), 6,82
(1H, d, J = 10 Hz, H-1), 6,48 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5), 6,32 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8),
6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6),5,73 (1H, d, J = 10 Hz, H-2), 5,12 (2H, m, H-10, 7),
3,10 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-9), 1,72 (2H, m, H-5), 2,11 (2H, m, H-6), 1,59 (3H, br s,
H-10), 1,65 (3H, br s, H-9), 1,56 (3H, br s, H-13), 1,42 (3H, br s, H-12), 1,39 (3H, br s, H-4).
13
C-NMR (125 MHz, CD
3
OD):  (ppm) 162,9 (C-2), 122,3 (C-3), 183,7 (C-4),
105,6 (C-4a), 160,0 (C-5), 99,7 (C-6), 165,6 (C-7), 94,7 (C-8), 163,3 (C-8a), 111,8 (C-
1'), 152,0 (C-2'), 115,0 (C-3'), 157,4 (C-4'), 109,4 (C-5'), 131,3(C-6'), 23,8 (C-9), 122,6
(C-10), 132,9 (C-11), 26,0 (C-12), 17,7 (C-13), 118,2 (C-1''), 129,4 (C-2''), 79,7 (C-3''),
26,9 (C-4''), 42,3 (C-5''), 24,8 (C-6''), 125,3 (C-7''), 132,6 (C-8''), 26,0 (C-9''), 17,8 (C-10'').
Hợp chất LM3: sanggenon K (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm)
Dạng bột màu vàng, []


: -22,7
o
(c 0,15, MeOH). ESI-MS m/z 489 [M+H]
+
, 511
[M+Na]
+
, 487 [M-H]

.

1
H-NMR (400 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 7,09 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 6,78
(1H, d, J = 10 Hz, H-1), 6,56 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,31 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8),
6,25 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,69 (1H, d, J = 10 Hz, H-2), 5,08 (2H, m, H-10 và H-
7), 3,10 (2H, br d, J = 7,0 Hz, H-9), 1,68 (2H, m, H-5), 2,08 (2H, m, H-6), 1,59
(3H, br s, H-9), 1,57 (3H, br s, H-10), 1,46 (3H, br s, H-13), 1,43 (3H, br s, H-12),
1,35 (3H, br s, H-4).
13
C-NMR (100MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 162,7 (C-2), 122,1 (C-3), 183,4 (C-4),
105,6 (C-4a), 159,6 (C-5), 99,7 (C-6), 165,2 (C-7), 94,6 (C-8), 163,6 (C-8a), 110,7 (C-
5

1'), 153,5 (C-2'), 114,2 (C-3'), 156,2 (C-4'), 108,8 (C-5'), 131,4 (C-6'), 23,7 (C-9),
123,1 (C-10), 132,7 (C-11), 26,3 (C-12), 18,1 (C-13), 118,3 (C-1''), 129,4 (C-2''), 80,2
(C-3''), 26,9 (C-4''), 42,3 (C-5''), 25,0 (C-6''), 125,4 (C-7''), 132,6 (C-8''), 26,2 (C-9''),
18,2 (C-10'').
Hợp chất LM4: 8,3

-diprenyl-5,7,4

-trihydroxyflavone (Hợp chất lần đầu tiên
phân lập được từ loài dâu tằm)
Dạng bột màu vàng. ESI-MS m/z: 407,5 [M+H]
+
, 429,4 [M+Na]
+

, 405,5 [M-H]

.
HR-FAB-MS m/z: 407,1844 [M+H]
+
phù hợp với tính toán lý thuyết đối với công thức
C
25
H
26
O
5
).
1
H-NMR (400 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 7,84 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-2), 7,76
(1H, dd, J = 2,4 và 8,4 Hz, H-6), 7,04 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5), 6,55 (1H, br s, H-3),
6,33 (1H br s, H-6), 5,41 (1H, m, H-10), 5,34 (1H, m, H-2), 3,57 (2H, br d, J = 7,0
Hz, H-9), 3,42 (2H, br d, J = 7,0 Hz, H-1), 1,82 (3H, br s, H-13 và H-5), 1,75 (3H,
br s, H-4), 1,65 (3H, br s, H-12).
13
C-NMR (100 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 165,5 (C-2), 104,0 (C-3), 183,6 (C-4),
105,1 (C-4a), 161,0 (C-5), 100,0 (C-6), 165,0 (C-7), 108,1 (C-8), 156,5 (C-8a), 123,4
(C-1), 129,2 (C-2), 130,3 (C-3), 160,3 (C-4), 116,8 (C-5), 127,1 (C-6), 22,9 (C-9),
123,4 (C-10), 132,3 (C-11), 18,4 (C-12), 26,4 (C-13), 29,5 (C-1), 124,3 (C-2), 133,5
(C-3), 18,7 (C-4), 26,4 (C-5).
Hợp chất LM6: 8-geranylapigenin (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài

dâu tằm)
Dạng bột màu vàng. ESI-MS m/z: 407,5 [M+H]
+
, 429,4 [M+Na]
+
, 405,5 [M-H]

.
1
H-NMR (400 MHz, CD
3
OD):  (ppm) 7,82 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2 và H-6),
6,91 (2H, d, J = 8,4 Hz, H-3 và H-5), 6,56 (1H, br s, H-3), 6,47 (1H, br s, H-6), 5,23
(1H, br t, J = 6,0 Hz, H-2), 5,05 (1H, br t, J = 6,4 Hz, H-7), 3,31 (2H, br d, J = 7,0
Hz, H-1), 2,06 (2H, m, H-5), 1,96 (2H, m, H-6), 1,77 (3H, br s, H-4), 1,49 (3H, s,
H-10), 1,54 (3H, br s, H-9).
13
C-NMR (100 MHz, acetone-d
6
): (ppm) 165,0 (C-2), 103,8 (C-3), 183,7 (C-4),
105,6 (C-4ª), 161,2 (C-5), 99,9 (C-6), 164,4 (C-7), 108,5 (C-8), 156,4 (C-8a), 123,2
(C-1'), 129,3 (C-2'), 116,7 (C-3'), 162,5 (C-4'), 116,7 (C-5'), 129,3 (C-6'), 24,1 (C-1''),
123,7 (C-2''), 135,2 (C-3''), 16,5 (C-4''), 40,2 (C-5''), 27,5 (C-6''), 125,2 (C-7''), 131,7
(C-8''), 25,8 (C-9''), 17,5 (C-10'')
Hợp chất LM7: cyclomulberrin
Dạng bột màu vàng, điểm nóng chảy 247
o
C. ESI-MS m/z: 421,4 [M+H]
+
, 443,4

[M+Na]
+
, 419,4 [M-H]

.
1
H-NMR (400 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 7,67 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6), 6,62
(1H, dd, J = 2,0 và 8,4 Hz, H-5), 6,41 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-3), 6,32 (1H, s, H-6), 6,17
(1H, d, J = 9,6 Hz, H-9), 5,46 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-10), 5,33 (1H, m, H-15), 3,57 (2H,
m, H-14), 1,93 (3H, s, H-12), 1,84 (3H, s, H-13), 1,67 (3H, s, H-18), 1,66 (3H, s, H-17).
6

13
C-NMR (100 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 159,1 (C-2), 107,8 (C-3), 179,0 (C-4),
104,7 (C-4a), 155,3 (C-5), 99,7 (C-6), 164,1 (C-7), 107,7 (C-8), 165,6 (C-8a), 109,1
(C-1), 156,3 (C-2), 105,1 (C-3), 160,7 (C-4), 111,3 (C-5), 126,0 (C-6), 70,4 (C-9),
122,5 (C-10), 138,3 (C-11), 18,7 (C-12), 18,2 (C-13), 22,4 (C-14), 124,0 (C-15), 131,6
(C-16), 25,9 (C-17, 18).
Hợp chất LM8: cyclomorusin
Dạng bột màu vàng, điểm nóng chảy 258
o
C. ESI-MS m/z 417,5 [M-H]

.
1
H-NMR (400 MHz, acetone-d

6
):  (ppm) 7,79 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6), 6,92
(1H, d, J = 10 Hz, H-14), 6,64 (1H, d, J = 7,6 Hz, H-5), 6,43 (1H, s, H-3), 6,19 (1H,
d, J = 9,2 Hz, H-9), 6,15 (1H, s, H-6), 5,77 (1H, d, J = 10 Hz, H-15), 5,48 (1H, d, J =
9,6 Hz, H-10), 1,94 (3H, s, H-12), 1,68 (3H, br s, H-13), 1,47 (6H, s, H-17, 18).
13
C-NMR (100 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 159,7 (C-2), 108,6 (C-3), 179,8 (C-4),
101,6 (C-4a), 152,5 (C-5), 100,8 (C-6), 165,1 (C-7), 106,5 (C-8), 165,1 (C-8a), 110,4
(C-1), 157,1 (C-2), 105,4 (C-3), 160,4 (C-4), 111,6 (C-5), 126,9 (C-6), 70,8 (C-9),
122,6 (C-10), 139,4 (C-11), 19,1 (C-13), 26,3 (C-12), 115,9 (C-14), 129,2 (C-15), 79,3
(C-16), 28,7 (C-17, C-18).
Hợp chất LM10: atalantoflavone (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài
dâu tằm)
Dạng bột màu vàng. ESI-MS m/z 337,3 [M+H]
+
, 359,4 [M+Na]
+
, 335,3 [M-H]

.
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d
6
):  (ppm) 7,96 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2, 6), 6,92
(2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, 5), 6,87 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-9), 6,85 (1H, s, H-3), 6,22
(1H, s, H-6), 5,79 (1H, d, J = 10 Hz, H-10), 1,44 (6H, s, H-12, 13).
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-d

6
):  (ppm) 163,7 (C-2), 104,5 (C-3), 181,9 (C-4),
102,9 (C-4a), 161,3 (C-5), 99,2 (C-6), 158,6 (C-7), 100,9 (C-8), 151,2 (C-8a), 120,9
(C-1), 128,5 (C-2, C-6), 116,0 (C-3, C-5), 160,8 (C-4), 114,3 (C-9), 128,0 (C-10),
78,0 (C-11), 27,7 (C-12, C-13).
Hợp chất LM12: steppogenin (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm)
Dạng bột màu vàng, điểm nóng chảy 255
o
C,


25
D

: -3,5
o
(c 0,12, MeOH).
1
H-NMR (500 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 7,31 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 6,47
(1H, d, J = 2,0 Hz, H-3), 6,43 (1H, dd J = 2,0 và 8,0 Hz, H-5), 5,96 (1H, d, J = 2,0
Hz, H-6), 5,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,71 (1H, dd J = 3,0 và 13,0 Hz, H-2), 3,18
(1H, dd, J = 13,0 và 17,0 Hz, H-3a), 2,72 (1H, dd, J = 2,5 và 17,0 Hz, H-3b), 12,2 (5-OH).
13
C-NMR (125 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 75,3 (C-2), 42,5 (C-3), 197,7 (C-4),
103,1 (C-4a), 165,2 (C-5), 96,7 (C-6), 167,2 (C-7), 95,7 (C-8), 164,8 (C-8a), 117,3 (C-
1), 156,7 (C-2), 103,4 (C-3), 159,5 (C-4), 107,8 (C-5), 128,9 (C-6).

Hợp chất LM13: moracin M
Dạng tinh thể màu nâu nhạt, điểm nóng chảy 235-237
o
C. ESI-MS (negative) m/z
241 [M-H]

.
7

1
H-NMR (500MHz, CD
3
OD):  (ppm) 7,35 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-4), 6,93 (1H, d,
J = 2,0 Hz, H-7), 6,92 (1H, s, H-3), 6,80 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 6), 6,75 (1H, dd, J =
2,0 và 8,5 Hz, H-5), 6,29 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4).
13
C-NMR (125 MHz, CD
3
OD):  (ppm) 156,1 (C-2), 98,4 (C-3), 123,0 (C-3a),
122,0 (C-4), 113,2 (C-5), 157,1 (C-6), 103,5 (C-7), 156,7 (C-7a), 133,8 (C-1), 103,9
(C-2 và C-6), 159,8 (C-3 và C-5), 102,2 (C-4).
Hợp chất LM14: moracin P
Dạng bột màu nâu nhạt, điểm nóng chảy > 300
o
C. ESI-MS (negative) m/z 325,3 [M-H]

.
1
H-NMR (500 MHz, CD
3

OD):  (ppm) 7,22 (1H, s, H-4), 6,87 (1H, s, H-3), 6,86
(1H, s, H-7), 6,74 (2H, d, J = 2,4 Hz, H-2, 6), 6,26 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 3,78 (1H,
dd, J = 5,6 và 8,4 Hz, H-2), 3,08 (1H, dd, J = 5,2 và 16,4 Hz, H-1b), 2,85 (1H, dd, J=
8,4 và 16,4 Hz, H-1a), 1,37 (3H, s, H-5), 1,28 (3H, s, H-4).
13
C-NMR (125 MHz, CD
3
OD):  (ppm) 156,5 (C-2), 101,8 (C-3), 124,1 (C-3a),
121,7 (C-4), 117,6 (C-5), 152,5 (C-6), 99,6 (C-7), 155,9 (C-7a), 133,7 (C-1), 104,0 (C-
2 và C-6), 159,9 (C-3 và C-5), 103,6 (C-4), 32,4 (C-1), 70,6 (C-2), 78,2 (C-3),
21,0 (C-4), 25,9 (C-5).
Hợp chất LM15: moracin O
Bột vô định hình màu nâu nhạt. ESI-MS (negative) m/z 325 [M-H]

.
1
H-NMR (500 MHz, CD
3
OD):  (ppm) 7,29 (1H, s, H-4), 6,88 (1H, s, H-3), 6,85
(1H, s, H-7), 6,74 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 6), 6,35 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 4,62 (1H,
t, J = 8,4 Hz, H-2), 3,23 (2H, m, H-1), 1,26 (3H, s, H-5), 1,22 (3H, s, H-4).
13
C-NMR (125 MHz, CD
3
OD):  (ppm) 156,3 (C-2), 102,4 (C-3), 123,9 (C-3a),
116,9 (C-4), 125,0 (C-5), 159,8 (C-6), 93,2 (C-7), 156,1 (C-7a), 133,8 (C-1), 103,8 (C-
2 và C-6), 159,9 (C-3 và C-5), 102,4 (C-4), 31,1 (C-1), 91,3 (C-2), 72,5 (C-3),
25,2 (C-4), 25,3 (C-5).
Hợp chất LM16: mulberrofuran K
Dạng bột màu nâu đỏ, điểm nóng chảy 176

o
C.
1
H-NMR (500 MHz, CD
3
OD):  (ppm) 7,35 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-4), 7,12 (1H, d,
J = 8,5 Hz, H-20), 7,00 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-14), 6,94 (1H, s, H-3), 6,92 (1H, d, J
= 1,5 Hz, H-7), 6,91 (1H, d, 1,5 Hz, H-2), 6,84 (1H, d, 1,5 Hz, H-6), 6,75 (1H, dd, J
= 2,5 và 8,5 (Hz, H-5), 6,66 (1H, d, J = 10 Hz, H-21), 6,48 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5
Hz, H-19), 6,42 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-2), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-17), 6,19 (1H,
d, J = 9,0 Hz, H-13), 5,61 (1H, d, J = 10, Hz, H-22), 3,33 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-4),
3,30 (1H, dd, J = 6,0 và 11,0 Hz, H-3), 2,95 (1H, dt, J = 6,0 và 11,0 Hz, H-5), 2,70
(1H, dd, J = 6,0 và 17,0 Hz, H-6a), 2,01 (1H, dd, J = 12,0 và 17,0 Hz, H-6b), 1,80
(3H, s, H-7), 1,34 (3H, s, H-24), 1,32 (3H, s, H-25).
8

13
C-NMR (125 MHz, CD
3
OD):  (ppm) 155,1 (C-2), 102,2 (C-3), 123,1 (C-3a),
121,9 (C-4), 113,3 (C-5), 156,8 (C-6), 98,5 (C-7), 152,9 (C-7a), 131,7 (C-1'), 104,8
(C-2'), 155,1 (C-3'), 118,2 (C-4'), 155,7 (C-5'), 105,5 (C-6'), 133,9 (C-1''), 123,2
(C-2''), 38,2 (C-3''), 35,1 (C-4''), 28,7 (C-5''), 37,0 (C-6''), 23,9 (C-7''), 102,6 (C-8''),
113,7 (C-9''), 158,5 (C-10''), 111,6 (C-11''), 157,3 (C-12''), 107,6 (C-13''), 129,2 (C-
14''), 119,1 (C-15''), 153,5 (C-16''), 104,0 (C-17''), 157,8 (C-18''), 109,9 (C-19''), 128,0
(C-20''), 118,3 (C-21''), 129,5 (C-22''), 76,9 (C-23''), 27,7 (C-24''), 27,6 (C-25'').
Hợp chất RM1: kuwanon J 2,4,10

-trimethyl ether (Hợp chất mới)
Dạng bột màu vàng,



25
D

: + 102,5
o
(c 0,1, MeOH). UV (MeOH) 
max
(log): 225
(3,95), 292 (3,46) và 384 (3,77) (nm). IR (KBr) 
max
(cm
-1
): 3375, 1707, 1628 và 1221.
HR-ESI-MS m/z: 721,3023 [M+H]
+
(tính toán lý thuyết đối với công thức C
43
H
45
O
10

721,3013).

1
H-NMR (500 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 14,30 (1H, s, 2-OH), 8,49 (1H, d, J =

8,5 Hz, H-14), 8,10 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-

), 7,86 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6), 7,80
(1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 7,74 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-α), 6,97 (1H, d, J = 8,5Hz, H-
20), 6,62 (1H, d, J = 2,5Hz, H-3), 6,59 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5 Hz, H-5), 6,55 (1H, d,
J = 9,0 Hz, H-13), 6,51 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-17), 6,34 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5),
6,30 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5 Hz, H-19), 5,66 (1H, s, H-2), 5,08 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-
22), 4,67 (1H, t, J = 4,4 Hz, H-4), 4,15 (1H, s, H-3), 3,93 (3H, br s, 10-OMe), 3,87
(3H, br s, 4-OMe), 3,85 (3H, br s, 2-OMe), 3,83 (overlap, H-5), 3,20 (2H, d, J = 7,0
Hz, H-21), 2,27 và 2,50 (mỗi 1H, d, J = 18,7 Hz, H-6), 1,92 (3H, s, H-7), 1,69
(3H, s, H-25), 1,57 (3H, s, H-24).
13
C-NMR (125 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 117,4 (C-1), 161,3 (C-2), 98,9 (C-3),
164,4 (C-4), 107,0 (C-5), 131,2 (C-6), 114,5 (C-1), 165,2 (C-2), 117,0 (C-3), 164,0
(C-4), 110,0 (C-5), 130,9 (C-6), 134,9 (C-1), 123,2 (C-2), 32,8 (C-3), 47,7 (C-
4), 36,1 (C-5), 32,8 (C-6), 23,7 (C-7), 209,6 (C-8), 114,5 (C-9), 163,8 (C-10),
117,4 (C-11), 162,7 (C-12), 103,2 (C-13), 132,4 (C-14), 121,8 (C-15), 156,4 (C-
16), 103,6 (C-17), 157,8 (C-18), 107,4 (C-19), 128,7 (C-20), 22,1 (C-21), 123,0
(C-22), 131,5 (C-23), 25,7 (C-24), 17,7 (C-25), 118,8 (C-α), 139,8 (C-

), 193,0
(C=O), 55,9 (2-OMe), 56,1 (4-OMe), 56,2 (10-OMe).
Hợp chất RM3: sanggenon C
Dạng bột vô định hình màu vàng tươi,


25
D


: +265,2
o
(c 0,1, MeOH). UV (MeOH)

max
(log): 283 (4,16), 308 (3,97) (nm). ESI-MS m/z 731,6 [M+Na]
+
, 707,6 [M-H]
¯
.
1
H-NMR (400 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 8,34 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-27), 7,30
(1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 6,92 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-33), 6,47 (1H, dd, J = 2,0 và 8,0
Hz, H-5), 6,44 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-30), 6,35 (1H, dd, J = 2,4 và 9,0 Hz, H-26), 6,32
9

(1H, d, J = 2,0 Hz, H-3), 6,27 (1H, dd, J = 2,4 và 8,4 Hz, H-32), 6,18 (1H, d, J = 2,0
Hz, H-24), 5,74 (1H, s, H-8), 5,52 (1H, br s, H-15), 5,17 (1H, m, H-10), 4,55 (1H, dd, J
= 5,6 và 6,0 Hz, H-20), 4,10 (1H, br s, H-14), 3,85 (1H, dd, J = 5,6 và 5,0 Hz, H-19),
2,70 và 3,08 (1H, m, H-9), 2,24 và 2,37 (1H, m, H-18), 1,84 (3H, br s, H-17), 1,57
(3H, br s, H-12), 1,49 (3H, br s, H-13).
13
C-NMR (100 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 91,9 (C-2), 103,5 (C-3), 188,2 (C-4),
99,5 (C-4a), 163,9 (C-5), 108,8 (C-6), 167,7 (C-7), 96,5 (C-8), 161,1 (C-8a), 122,2 (C-
1), 161,1 (C-2), 99,9 (C-3), 161,9 (C-4), 109,7 (C-5), 125,6 (C-6), 32,0 (C-9),

118,5 (C-10), 136,8 (C-11), 18,1 (C-12), 26,0 (C-13), 32,8 (C-14), 122,8 (C-15), 134,9
(C-16), 23,8 (C-17), 33,9 (C-18), 35,8 (C-19), 48,3 (C-20), 208,7 (C-21), 113,9 (C-22),
166,0 (C-23), 103,7 (C-24), 166,8 (C-25), 107,6 (C-26), 129,1 (C-27), 121,3 (C-28),
156,4 (C-29), 102,4 (C-30), 157,7 (C-31), 109,0 (C-32), 134,7 (C-33).
Hợp chất RM4: sanggenon O
Dạng bột màu vàng tươi,


25
D

: 15,7
o
(c 0,1, MeOH). UV (MeOH) 
max
(nm):
287 (3,24), 309 (3,22). ESI-MS m/z 731,6 [M+Na]
+
. 707,7 [M-H]
¯
.
1
H-NMR (400 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 8,36 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-27), 7,33
(1H, d, J = 8,2 Hz, H-6), 6,93 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-33), 6,50 (1H, dd, J = 2,4 và 8,2
Hz, H-5), 6,46 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-30), 6,36 (1H, dd, J = 2,4 và 9,0 Hz, H-26), 6,36
(1H, d, J = 2,4 Hz, H-3), 6,27 (1H, dd, J = 2,4 và 8,4 Hz, H-32), 6,20 (1H, d, J = 2,0
Hz, H-24), 5,72 (1H, s, H-8), 5,55 (1H, br s, H-15), 5,06 (1H, m, H-10), 4,56 (1H, dd, J
= 5,6 và 6,0 Hz, H-20), 4,09 (1H, br s, H-14), 3,84 (1H, dd, J = 5,6 và 5,0 Hz, H-19),

2,69 và 3,09 (1H, m, H-9), 2,27 và 2,42 (1H, m, H-18), 1,87 (3H, br s, H-17), 1,53
(3H, br s, H-12), 1,20 (3H, br s, H-13).
13
C-NMR (100 MHz, acetone-d
6
):  (ppm) 91,9 (C-2), 103,5 (C-3), 188,3 (C-4),
99,5 (C-4a), 163,8 (C-5), 108,8 (C-6), 167,9 (C-7), 96,7 (C-8), 161,3 (C-8a), 122,2 (C-
1), 161,3 (C-2), 99,8 (C-3), 161,9 (C-4), 109,7 (C-5), 125,6 (C-6), 32,0 (C-9),
118,5 (C-10), 136,9 (C-11), 18,1 (C-12), 25,5 (C-13), 32,7 (C-14), 122,9 (C-15), 135,3
(C-16), 23,8 (C-17), 33,9 (C-18), 35,7 (C-19), 48,1 (C-20), 208,7 (C-21), 114,0 (C-22),
166,2 (C-23), 103,7 (C-24), 166,8 (C-25), 107,6 (C-26), 129,3 (C-27), 121,4 (C-28),
156,5 (C-29), 102,3 (C-30), 157,8 (C-31), 109,0 (C-32), 134,7 (C-32).
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. CHIẾT TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN CHỌN LỌC
Lựa chọn các phần chiết thô và phân đoạn nhỏ có mức độ ức chế  50% trong các
phép thử ức chế sự hoạt động của NF-B và gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư cổ
tử cung người (HeLa) (Hình 4.1, 4.2 và Bảng 4.1, 4.2).

10


Hình 4.1: Sơ đồ chiết tách các phân đoạn có hoạt tính từ lá dâu tằm

Hình 4.2: Sơ đồ chiết tách các phân đoạn có hoạt tính từ vỏ rễ dâu tằm
Bảng 4.1: Kết quả thử hoạt tính ức chế NF-

B trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung
(HeLa) của các phân đoạn chiết từ lá và vỏ rễ dâu tằm.
Phân đoạn chiết từ lá
(10 g/ml)

% ức chế
Phân đoạn chiết từ vỏ rễ

(10 g/ml)
% ức chế
Methanol (LM) 61,4 Methanol (RM) 68,5
Bột khô lá dâu tằm (LM)
Morus alba L.(3 kg)
Cao MeOH tổng
(250g)
Chiết MeOH
Chiết n-Hexane/H
2
O: 2/1
Bổ sung 2 lít nước
LM-H
Cao n-hexane (74g)
Chiết EtOAc/H
2
O: 1/1
LM-W
Lớp nước
LM-E
Cao EtOAc (55 g)
Lớp nước
Bổ sung n-Hexane
Bổ sung EtOAc
LM-E3 LM-E4
Gradient C.M
(100-0 V)

LM-E1 LM-E2 LM-E7 LM-E8LM-E5 LM-E6
Bột khô vỏ rễ dâu tằm (RM)
Morusalba L.(2 kg)
Cao MeOH tổng
(185g)
Chiết MeOH
Chiết n-Hexane/H
2
O: 2/1
Bổ sung 2 lít nước
RM-H
Cao n-hexane (27,5g)
Chiết EtOAc/H
2
O: 1/1
RM-W
Lớp nước
RM-E
Cao EtOAc(85,2 g)
Lớp nước
Bổ sung n-Hexane
Bổ sung EtOAc
RM-E3 RM-E4
Gradient C.M
(100-0 V)
RM-E1 RM-E2 RM-E5 RM-E6
11

Hexane (LM-H) 35,7 Hexane (RM-H) 40,4
Ethyl acetate (LM-E) 74,5 Ethyl acetate (RM-E) 72,3

Nước (LM-W) 22,5 Nước (RM-W) 47,4
LM-E1 8,5 RM-E1 17,0
LM-E2 32,9 RM-E2 26,2
LM-E3
57,2
RM-E3
87,0
LM-E4
59,8
RM-E4
51,6
LM-E5 44,5
RM-E5
75,6
LM-E6
72,4
RM-E6
79,4
LM-E7
64,8 Deguelin (1μg/ml) 92,9
LM-E8
78,4
Bảng 4.2: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung
(HeLa) của các phân đoạn chiết từ lá và vỏ rễ dâu tằm.
Phân đoạn chiết từ lá
(10 g/ml)
% ức chế
Phân đoạn chiết từ vỏ rễ

(10 g/ml)

% ức chế
Methanol (LM) 65,5 Methanol (RM) 55,2
Hexane (LM-H) 43,1 Hexane (RM-H) 42,8
Ethyl acetate (LM-E) 86,5 Ethyl acetate (LM-E) 68,5
Nước (LM-W) 32,5 Nước (RM-W) 31,7
LM-E1 14,2 RM-E1 29,5
LM-E2 38,0 RM-E2 33,6
LM-E3
60,4
RM-E3
80,5
LM-E4
62,1
RM-E4
62,7
LM-E5 50,6
RM-E5
70,5
LM-E6
69,5
RM-E6
68,0
LM-E7
66,7 Deguelin (1μg/ml) 29,8
LM-E8
82,1
Các phân đoạn LM-E3, LM-E4, LM-E6, LM-E7 và LM-E8 từ lá và các phân
đoạn RM-E3, RM-E4, RM-E5 và RM-E6 từ vỏ rễ dâu tằm được lựa chọn để phân lập
các hợp chất tinh khiết.
12

4.2. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN CHỌN LỌC CỦA
LÁ VÀ VỎ RỄ LOÀI DÂU TẰM
4.2.1. Phân lập các hợp chất từ phân đoạn chọn lọc của lá
Các phân đoạn chọn lọc của lá được phân tách tiếp theo sơ đồ trình bày ở Hình 4.3


Hình 4.3:Sơ đồ phân lập các hợp chất từ các phân đoạn chọn lọc của lá
Từ phân đoạn LM-E3 phân lập được các hợp chất LM3, LM7 và LM9. Từ phân
đoạn LM-E4 phân lập được các hợp chất LM4, LM5, LM6 và LM10. Từ phân đoạn
LM-E6 phân lập được các hợp chất LM1, LM2 và LM8. Từ phân đoạn LM-E7 phân
lập được các hợp chất LM11, LM12, LM13, LM14, LM15, LM16 và LM17. Từ
phân đoạn LM-E8 phân lập được hai hợp chất LM18 và LM19.
4.2.2. Phân lập các hợp chất từ các phân đoạn chọn lọc của vỏ rễ
Từ phân đoạn RM-E3 phân lập được các hợp chất RM1 và RM8. Từ phân đoạn
RM-E4 phân lập được các hợp chất RM5, RM6 và RM7. Từ phân đoạn RM-E5 phân lập
được hợp chất RM2. Từ phân đoạn RM-E6 phân lập được các hợp chất RM3, RM4.
Sephadex C.M 1/1
LM-E6
LM2
(70 mg)
LM1
(32,4 mg)
Chất mới
LM8
(3,6 mg)
LM9
(8,1 mg)
LM3
(6,2 mg)

LM7
(5,5 mg)
H.E 4/1
LM-E3
LM5
(18,5 mg)
LM6
(3,6 mg)
LM4
(3,0 mg)
H.E 4/1
LM-E4
LM10
(6,6 mg)
LM-E8
C.M 10/1
LM-E8.1
LM-E8.2
LM18
(30 mg)
LM-E8.3
M.W 3/1
LM19
(7,0 mg)
LM-E7
LM-E
LM-E7.1
LM-E7
H.E 1/1
LM-E7.1.1

M.W 2/1
…
LM-E7.3
C.M 1/1
LM-E7.3.1
LM-E7.3.2
LM-E7.3.3.1 LM-E7.3.2.2
Sephadex M.W 1/1
LM12
(22mg)
LM13
(34mg)
LM-E7.3.3
H.C.M 0,5/1/0,1
LM14
(70mg)
LM15
(80mg)
LM17
(5,4 mg)
LM-E7.1.2
H.C.M 0,5/1/0.12
LM16
(100mg)
LM-E7.1.3
LM-E7.2 LM-E7.5
LM-E7.4
LM11
(11mg)
13

Hình 4.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ các phân đoạn chọn lọc của vỏ rễ
4.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của các hợp
chất được phân lập từ lá và vỏ rễ loài dâu tằm, trong đó có 2 hợp chất hợp chất mới lần
đâu tiên được công bố (LM1và RM1) và 6 hợp chất LM2, LM3, LM4, LM6, LM10
và LM12 là các hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm.

3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetra-
hydroxyflavon (LM1-chất mới)

Sanggenon J (LM2)

Sanggenon K (LM3)

Kuwanon S (LM5)

Ge:

3,8-diprenyl- 4',5,7-
trihydroxyflavone (LM4)


8-geranylapigenin
(LM6)

Cyclomulberrin (LM7)

O

OOH
O
OH
O

Cyclomorusin (LM8)


Morusin (LM9/RM8)

Atalantoflavone
(LM10)

Keampferol (LM11)


Steppogenin (LM12)

RM1
(11,6mg)
Chất mới
RM8
(6,1 mg)
C.M 10/1
RM-E3 RM-E4
RM-E4.3.3
H.C.M
0,5/1/0,1
RM6
(16mg)

RM7
(24mg)
RM-E4.1
H.A 2/1
RM-E4.3
C.M 1/1
RM-E4.3.1
RM-E4.3.2
Sephadex
M.W 1/1
RM5
(22mg)
RM-E4.2 RM-E4.4 RM-E4.5
RM2
(6,8 mg)
M.W 2/1
RM-E5 RM-E6
C.M 10/1
RM-E6.1
RM-E6.2
RM3
(18 mg)
RM-E6.3
M.W 3/1
RM4
(5,5 mg)
RM-E
14

Moracin M
(LM13/RM5)

Moracin O
(LM14/RM6)

Moracin P
(LM15/RM7)
Mulberrofuran K (LM16)
Sanggenon C
(LM18/RM3)

Sanggenon O
(LM19/RM4)

Kuwanon
R(LM17/RM2)

Kuwanon J 2,4,10''-
trimethyl ether (RM1)

Chất mới
Hình 4.22:Tổng hợp cấu trúc các hợp chất phân lập được từ các phân đoạn chọn lọc
của là và vỏ rễ dâu tằm
* Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của 2 hợp chất mới là:
3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) (phân lập từ lá dâu tằm) và
kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether (RM1) (phân lập được từ vỏ rễ dâu tằm):
Hợp chất 3-prenyl-3
-geranyl-5,7, 2,4-tetrahydroxyflavon (LM1)
Hợp chất LM1 phân lập được dưới dạng chất bột màu vàng. Phổ khối lượng phân giải

cao HR-FAB-MS xuất hiện pic ion tại m/z 491,2433 [M+H]
+
phù hợp với tính toán lý thuyết
đối với công thức C
30
H
35
O
6
. Điều này khẳng định LM1 có công thức phân tử C
30
H
34
O
6
.
Phổ IR của hợp chất LM1 cho các vân đặc trưng của các nhóm hydroxy (3412 cm
-1
),
carbonyl (1653 cm
-1
) và vòng thơm (1616 cm
-1
).
Phổ
1
H-NMR đặc trưng cho một hợp chất flavone với sự hiện diện một tín hiệu
đơn ở vùng trường thấp δ
H
13,10 ppm do proton của nhóm hydroxy tạo liên kết cầu

hydro với nhóm carbonyl (C-4) và hai tín hiệu proton ghép cặp meta δ
H
(ppm) ở 6,23
(1H, d, J = 2,0 Hz), 6,30 (1H, d, J = 2,0 Hz) thuộc vào hai proton H-6 và H-8 ứng với
cấu trúc 5,7-dihydroxy của vòng A. Hai tín hiệu proton thơm ở vị trí ortho δ
H
(ppm) tại
6,57 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,01 (1H, d, J = 8,4 Hz) thuộc về hai proton ở vị trí H-5' và
H-6' cho phép dự đoán vòng B có thế ở vị trí 2, 3, 4. Ngoài ra, trên phổ còn có các tín
hiệu đặc trưng của một nhóm ,-dimethylallyl và một nhóm geranyl bao gồm 3 proton
olefin tại 5,08 (2H, m, H-10, 7) và 5,32 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-2) và các proton của
hai nhóm methylene liên kết với vòng thơm tại 3,08 (2H, br d, J = 6,8 Hz, H-9) và 3,46
(2H, br d, J = 7,2 Hz, H-1), hai nhóm methylene tại 1,97 (2H, m, H-5) và 2,05 (2H,
m, H-6), năm nhóm methyl tại 1,37 (3H, br s, H-12), 1,55 (6H, br s, H-13, 10), 1,61
(3H, br s, H-9) và 1,78 (3H, br s, H-4). Sự vắng mặt tín hiệu đơn ứng với H-3 cho
phép dự đoán một trong hai nhóm thế sẽ được gắn vào C-3.
15

Phổ UV của LM1 trong methanol cho các cực đại tại  216,5, 258,4 và 328,5 nm. Khi
bổ sung NaOAc phổ có các cực đại tại  220, 267 và 398 nm. Sự chuyển dịch mạnh cực đại
ứng với hệ cinnamoyl vòng B (328 – 398 nm) chứng tỏ có nhóm OH tự do ở C-4 [109].
Kết quả phân tích chi tiết phổ
13
C-NMR và HMQC hoàn toàn phù hợp với nhận xét
trên. Ngoài các tín hiệu ứng với khung flavone trong đó có 4 cacbon aromatic liên kết
trực tiếp với nhóm hydroxy là C-5 (
C
159,4), C-7 (
C
164,8), C-2 (

C
154,5) và C-4
(
C
158,8) [14] và 2 cacbon aromatic liên kết với cacbon của nhóm thế là C-3 (
C

122,2) và C-3 (
C
117,0) còn có mặt các tín hiệu của một nhóm ,-dimethylallyl tại 
C
(ppm) 24,6 (C-9), 122,4 (C-10), 132,3 (C-11), 25,9 (C-12) và 17,7 (C-13) cùng các tín
hiệu của một nhóm geranyl tại 
C
(ppm) 23,1 (C-1), 123,6 (C-2), 135,4 (C-3), 16,4
(C-4), 40,6 (C-5), 27,5 (C-6), 125,2 (C-7), 131,7 (C-8), 25,9 (C-9), 17,7 (C-10).
Cấu trúc của khung flavone, các nhóm thế prenyl và sự gắn kết giữa chúng được
khẳng định qua các tương tác trên phổ HMBC (Hình 4.5f).
Các tương tác xa của H-6 với C-4a và C-8, H-8 với C-4a và C-6, H-5 với C-1 và
C-3, H-6 với C-2 cũng như tương tác giữa proton của nhóm 5-OH với C-4, C-4a và
C-5 đã khẳng định cấu trúc 5,7,2,4-tetrahydroxyflavone có hai nhóm thế không liên
kết với vòng thơm qua oxy tại C-3 và C-3.
Cấu trúc nhóm thế prenyl dạng ,-dimethylallyl được khẳng định qua các tương
tác của H-12 và H-13 với C-11 cùng tương tác của H-9 với C-10 và C-11. Cấu trúc
nhóm thế geranyl được khẳng định qua các tương tác của H-1 với C-2, C-3 và C-
4, H-4 với C-2, H-5 với C-3, H-9 với C-7 cùng tương tác của H-10 với C-7 và C-8.
Sự xuất hiện tương tác của proton H-9 (
H
3,08) với các cacbon C-2 (
C

162,1), C-
3 (
C
122,2) và C-4 (
C
183,2) chứng tỏ nhóm prenyl được gắn kết vào vị trí C-3. Đồng
thời tương tác giữa proton H-1
(
H
3,46) với C-2 (
C
154,5), C-
3 (
C
117,0) và C-4 (
C
158,8)
khẳng định vị trí gắn kết nhóm
geranyl là C-3.
Bằng cách phân tích chi tiết
các tương tác nhận được trên phổ
HMBC (Hình 4.5e) cho phép
khâu nối các mảnh cấu trúc lại
với nhau và xác định được toàn
bộ cấu trúc phẳng của hợp chất LM1 như đã được mô tả trong hình 4.5f.
Như vậy LM1 có cấu trúc 3-prenyl-3
-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone.
Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được công bố.
Hợp chất kuwanon J 2,4,10
-trimethyl ether (RM1)

Hợp chất RM1 phân lập được dưới dạng chất bột màu vàng, [


] + 102,5
o
(c 0,1
MeOH).
O
OO
HO
OH
OH
H
2
3
5
6
8
8a
1'
2'
4'
6'
9
10
12
13
1''
2''
4''

5''
7''
8''
9''
10''

Hình 4.5f:Cấu trúc v
à các tương tácHMBC
của hợp chất LM1
16

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại pic m/z 721,3023 [M+H]
+
phù hợp
với tính toán lý thuyết đối với công thức C
43
H
45
O
10
.
Phổ IR của hợp chất RM1 cho các vân đặc trưng của nhóm hydroxy (3375 cm
-1
),
nhóm cacbonyl (1707 cm
-1
) và vòng thơm (1628 cm
-1
). Phổ UV có các cực đại hấp thụ
tại 225 (3,95), 292 (3,46) và 384 (3,77) nm.

Phổ
1
H-NMR của RM1 có các tín hiệu của 2 hệ proton ABX vòng thơm ở 
H
6,62
(1H, d, J = 2,5 Hz, H-3), 6,59 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5 Hz, H-5) và 7,80 (1H, d, J = 8,5
Hz, H-6) và 6,51 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-17), 6,30 (1H, dd, J = 8,5 và 2,5 Hz, H-19),
6,97 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-20) cùng 4 tín hiệu của 2 cặp proton liền kề tại 6,34 (1H, d,
J = 9,0 Hz, H-5), 7,86 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6), 6,55 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-13) và
8,49 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-14). Hai tín hiệu kép ở 
H
(ppm) 7,74 (1H, d, J = 15,5 Hz)
và 8,10 (1H, d, J = 15,5 Hz) cho thấy đặc trưng của hai proton liên kết đôi trans ở vị trí
H-

và H-

của khung chalcone,và một tín hiệu đơn ở vùng trường thấp 
H
= 14,30
ppm được cho là do nhóm hydroxy (2-OH) tạo liên kết cầu hydro với nhóm carbonyl.
Dữ liệu này cho phép nhận định hợp chất RM1 có một phần cấu trúc khung chalcone
và một nhóm prenyl tại 
H
= 3,20 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 5,08 (1H, t, J = 7,0 Hz,
H-22), 1,57 (3H, s, H-24), và 1,69 (3H, br s, H-25). Ngoài ra, còn xuất hiện các tín
hiệu cộng hưởng từ của vòng methylcyclohexene gồm bốn proton của nhóm methine ở

H
= 5,66 (1H, s, H-2), 4,15 (1H, s, H-3), 4,67 (1H, t, J = 4,4 Hz, H-4), 3,83

(overlap, H-5), hai tín hiệu proton của nhóm methylene ở 
H
2,27 và 2,50 (mỗi 1H, d,
J = 18,7 Hz, H-6) cùng tín hiệu proton của nhóm methyl ở 
H
1,92 (3H, s, H-7).
Những nhận định trên hoàn toàn phù hợp với các tín hiệu thu được trên phổ
13
C-
NMR và DEPT (Hình 4.19c và Bảng 4.9) bao gồm 43 tín hiệu đặc trưng cho 2 nhóm
ketone, 3 nhóm methoxy, một nhóm prenyl, hai vòng benzene bị thế ở vị trí 1, 2, 3, 4
và 2 vòng benzene bị thế ở vị trí 1, 2, 4 cùng với vòng methylcyclohexene.
Phân tích chi tiết phổ
13
C-NMR cho thấy RM1 có độ dịch chuyển hóa học tương tự
như kuwanon J (Bảng 4.9). Từ dữ liệu này cho phép xác định hợp chất RM1 có cấu
trúc giống kuwanon J ngoại trừ việc có thêm 3 nhóm methoxy [14], [77], [156]. Các
phổ NMR cho thấy ba nhóm methoxy này qua các tín hiệu cộng hưởng ở 
H
(ppm)
3,85 (3H, br s, 2-OMe)/ 
C
161,3 (C-2), 
H
3,87 (3H, br s, 4-OMe)/ 
C
164,4 (C-4) và

H
3,93 (3H, br, s, 10''-OMe)/

C
163,8 (C-10).
Vị trí gắn kết được xác định bằng phổ HMBC (Hình 4.19e) qua các tương tác giữa
tín hiệu proton của nhóm methoxy với C-2 (
C
161,3), C-4 (
C
164,4), và C-10'' (
C
163,8). Điều này cho thấy 3 nhóm methoxy nằm ở vị trị C-2, C-4 và C-10''.
Cấu hình tương đối của vòng methylcyclohexene được xác định đầu tiên bằng cách
so sánh số liệu phổ
1
H -NMR cùng giá trị hằng số tương tác J proton-proton với các số
liệu đã được công bố cho hợp chất kuwanon J có cấu trúc tương tự [77], [156] và được
khẳng định thêm bởi các tương tác không gian nhận được trên phổ NOESY (Hình
4.19f). Hằng số tương tác nhỏ giữa H-3''/H-4'' và H-4''/H-5'' chỉ ra mối quan hệ pseudo
–diequatorial hoặc equatorial-axial của các proton này. Tương tác giữa H-3'' và H-4''
17

trên phổ NOESY của hợp chất RM1 chỉ ra rằng 2 proton này nằm cùng một phía mặt
phẳng của vòng cyclohexene. Như vậy, vòng cyclohexen có dạng cis-trans như hình 4.19g.
Từ các số
liệu thu được từ
phổ NMR một
chiều và 2
chiều, kết hợp
với số liệu thu
được từ phổ
khối lượng

phân giải cao
và phổ hồng
ngoại xác định
được hợp chất
RM1 là
kuwanon J
2,4,10''-trimethyl ether (Hình 4.19h) và đây là một chất mới lần đầu tiên được công bố.
4.3.3. Nhận xét
Bằng mô hình chiết tách hoạt chất theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức chế
NF-B trên dòng tế bào ung thư HeLa đã phân lập được 19 hợp chất LM1 – LM19 từ
lá và 8 hợp chất RM1 – RM8 từ vỏ rễ loài dâu tằm Morus alba L. ở Việt Nam (Hình
4.22). Trong số đó các hợp chất 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone
(LM1) và kuwanon J 2,4,10-trimethylether (RM1) là những hợp chất mới lần đầu
tiên được công bố. Các hợp chất sanggenon J (LM2), sanggenon K (LM3), 8,3-
diprenyl-5,7,4-trihydroxyflavone (LM4), 8-geranylapigenin (LM6), atalantoflavone
(LM10) và steppogenin (LM12) lần đầu tiên được tìm thấy ở loài Morus alba L.
Tất cả các hợp chất phân lập được đều thuộc lớp polyphenol bao gồm các
flavonoid, benzofuran và sản phẩm cộng hợp Diels-Alder. Ngoại trừ keampferol
(LM11), steppogenin (LM12) và moracin M (LM13) các hợp chất đều có nhóm thế
prenyl, yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính sinh học của lớp chất polyphenol và các
thực vật thuộc chi Dâu tằm (Morus L.).
Sự hiện diện các cặp đồng phân LM2/LM3, LM4/LM5/LM6, LM7/LM9,
LM14/LM15 và RM3/RM4 cùng các hợp chất được tạo thành do phản ứng đóng vòng
của nhóm prenyl với nhóm hydroxy phenolic như LM2, LM3, LM7, LM8, LM9,
LM10 chứng tỏ tính đa dạng về cấu trúc hóa học của loài Morus alba L. do sự xuất
hiện nhóm thế prenyl.
4.4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC
4.4.1 Hoạt tính ức chế NF-
B
Xác định khả năng ức chế NF-B trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa)

theo phương pháp SEAP hoặc dùng kit thử sẽ đánh giá được ảnh hưởng của các chất

Hình 4.19g: Các tương tác HMBC (

) và NOESY (

)
của hợp chất RM1
18

thử đến hoạt động của yếu tố NF-B. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng
4.11. Khả năng ức chế hoạt động NF-B được đánh giá thông qua giá trị IC
50
.
Bảng 4.11: Kết quả thử hoạt tính ức chế NF-

B và tỷ lệ sống sót của tế bào của các
hợp chất phân lập được
Chất
NF-B
(IC
50
µM)
Tỷ lệ tế bào
sống sót (%)
3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1)
1,51 ± 0,13 52,4
Sanggenon J (LM2) 1,47 ± 0,12 23,9
Sanggenon K (LM3) 0,58 ± 0,04 50,2
8,3′-diprenyl-5,7,4′-trihydroxyflavone (LM4) 8,47 ± 0,66 18,1

Kuwanon S (LM5) 0,41 ± 0,01 92,5
8-geranylapigenin (LM6) 1,59 ± 0,4 58,3
Cyclomulberrin (LM7) 0,042 ± 0,01 88,2
Cyclomorusin (LM8) 0,37 ± 0,02 85,7
Morusin (LM9/RM8) 0,32 ± 0,02 40,2
Atalantoflavone (LM10) 3,09 ± 0,07 41,6
Kaempferol (LM11) 78,23 ± 11,4 100
Steppogenin (LM12) 36,5 100
Moracin M (LM13/RM5) >100 100
Moracin P (LM14/RM6) >100 100
Moracin O (LM15/RM7) >100 100
Mulberrofuran K (LM16) 53,8 100
Kuwanon R (LM17/RM2) 7,38 ± 1,05*

88,1
Sanggenon C (LM18/RM3) 1,82 ± 0,27 98,3
Sanggenon O (LM19/RM4) 1,02 ± 0,15 96,7
Kuwanon J 2,4,10′′-trimethyl ether (RM1) 4,65 ± 0,94*

90,0
Deguelin 0,22 ± 0,04 100
Celastrol 0,15±0,03*
* Đánh giá theo TransAM NF-

B p65 Chemi Kit
Ngoại trừ moracin M, O, P tất cả các hợp chất đều có tác dụng ức chế hoạt động
của NF-B trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa). Các hợp chất chứa nhóm thế
“prenyl” thể hiện hoạt tính mạnh hơn. Các hợp chất kuwanon S, cyclomulberrin,
cyclomorusin, sanggenon C và sanggenon O có hoạt tính rất mạnh (IC
50

0,042 – 1,82
M). Hợp chất mới LM1 có IC
50
là 1,51 M, còn hợp chất mới RM1 có IC
50
là 4,65 M.

19

4.4.2. Tác dụng gây độc tế bào
Thử hoạt tính gây độc tế bào của tất cả các hợp chất đã phân lập được từ lá và vỏ rễ
loài dâu tằm trên các dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư vú (MCF-7) và ung
thư gan (Hep-3B). Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện bằng
phương pháp tạo phức formazan với 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium
bromide (MTT) sử dụng deguelin làm chất so sánh.
Bảng 4.12: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được
Chất
Hoạt tính gây độc tế bào (IC
50
µM)
HeLa MCF-7 Hep-3B
3-prenyl-3

-geranyl-5,7,2

,4

-
tetrahydroxyflavone (LM1)
1,32 ± 0,51 3,92 ± 0,91 5,22 ± 0,95

Sanggenon J (LM2) 2,28 ± 0,40 4,56 ± 0,71 5,30 ± 1,45
Sanggenon K (LM3) 2,29 ± 1,64 3,51 ± 0,59 3,09 ± 0,67
8,3

-diprenyl-5,7,4

-
trihydroxyflavone
(LM4)
1,66 ± 0,27 5,27 ± 1,02 4,71 ± 1,04
Kuwanon S (LM5) 1,64 ± 0,21 7,02 ± 1,66 8,47 ± 2,07
8-geranylapigenin (LM6) 2,24 ± 0,48 3,21 ± 0,87 3,65 ± 0,81
Cyclomulberrin (LM7) 3,69 ± 0,86 7,19 ± 0,77 6,64 ± 1,23
Cyclomorusin (LM8) 1,66 ± 0,27 7,85 ± 1,30 7,55 ± 2,14
Morusin (LM9/RM8) 0,64 ± 0,14 7,88 ± 1,89 9,21 ± 2,06
Atalantoflavone (LM10) 1,25 ± 0,46 6,54 ± 1,23 4,33 ± 0,75
Kaempferol (LM11) 23,05 ± 4,15 21,47 ± 3,92 36,18 ± 6,86
Steppogenin (
LM12
)
>100 >100 >100
Moracin M (
LM13/RM5
)
>100 >100 >100
Moracin P (
LM14/RM6
)
>100 >100 >100
Moracin O (

LM15/RM7
)
>100 >100 >100
Mulberrofuran K (
LM16
)
>100 >100 >100
Kuwanon R (LM17/RM2) 15,6 ± 4,21 27,3 ± 6,16 7,35 ± 2,08
Sanggenon C (LM18/RM3) 2,64 ± 0,43 3,14 ± 0,82 5,55 ± 1,62
Sanggenon O (LM19/RM4) 1,87 ± 0,36 3,03 ± 0,53 4,16 ± 0,97
Kuwanon J 2,4,10′′-trimethyl ether (RM1) 8,44 ± 1,68 13,8 ± 3,05 8,32 ± 1,65
Deguelin 6,40 ± 1,68 5,3 ± 1,32 29,3 ± 3,14
20

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào (Bảng 4.12) của tất cả các hợp chất phân lập
được trên ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư vú (MCF-7) và ung thư
gan Hep-3B cho thấy hầu hết các hợp chất đều có hoạt tính tốt, đặc biệt 12 hợp chất thể
hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC
50
0,66 - 5,30 M. Các hợp chất prenyl flavonoid có
hoạt tính mạnh hơn các flavone. Hợp chất 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-
tetrahydroxyflavone ức chế mạnh cả ba dòng tế bào với giá trị IC
50
là 1,32 μM (HeLa),
3,92 μM (MCF-7) và 5,22 μM (Hep-3B), trong khi hợp chất mới kuwanon J 2,4,10-
trimethyl ether thể hiện hoạt tính trung bình với giá trị IC
50
lần lượt là 8,44, 13,8 và
8,32 M. Trong ba dòng tế bào được thử nghiệm, các hợp chất prenyl flavonoid có tác
dụng mạnh nhất đối với dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa). So sánh giá trị IC

50

của các hợp chất được thử nghiệm cho thấy morusin (LM9) có khả năng kháng dòng tế
bào ung thư cổ tử cung (HeLa) lớn nhất với giá trị IC
50
là 0,64 μM. Lee và cộng sự
cũng phân lập được hợp chất này từ loài Morus australis và đã chứng minh tác dụng
thúc đẩy sự chết theo chương trình theo cơ chế ức chế sự hoạt hóa NF-B trên dòng tế
bào ung thư đại trực tràng người HT-29 [102].
So sánh hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư cổ tử cung của hai hợp chất LM8 và
LM9. Hai hợp chất này có cấu trúc gần giống nhau và chứa nhóm isoprenyl ở vị trí C-
3 và C-8, tuy nhiên có thể sự khác biệt về nhóm thế “prenyl” ở các vị trí C-3 và C-8 đã
dẫn đến sự khác biệt về hoạt tính. Hoạt tính của hợp chất LM9 (IC
50
là 0,64 μM) cao
hơn so với hợp chất LM8 (IC
50
là 1,66 μM) có thể là do hợp chất LM9 có nhóm prenyl
đóng vòng ở C-8 làm tăng sự liên hợp. Ngoài ra, có thể sự có mặt nhóm prenyl dạng
vòng ở C-3 có tác dụng làm giảm hoạt tính, đồng thời các nhóm cho điện tử (-OH) ở vị
trí C-2 (như ở chất LM9) lại làm tăng hoạt tính dẫn đến hoạt tính của hợp chất LM9
lớn hơn hợp chất LM8. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả
Mazimba (2011) [108] về hoạt tính chống oxi hóa và kháng khuẩn của một số prenyl
flavonoid ở loài Morus nigra. Điều này chỉ ra rằng các nhóm prenyl hoặc geranyl cũng
như sự đóng vòng của các nhóm này với nhóm hydorxy phenolic đã làm tăng hoạt tính
gây độc tế bào của các flavone.
4.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của sanggenon C và sanggenon O
4.4.3.1. Tác dụng ức chế sự sản sinh NO
Nitric oxide (NO) là tác nhân tham gia điều chỉnh các quá trình sinh lý khác
nhau trong động vật có vú và sự sản sinh NO quá mức gây ra các bệnh lý viêm, ung

thư và tiểu đường. Tác dụng ức chế sự sản sinh NO của hai hợp chất sanggenon C và
sanggenon O trên dòng tế bào RAW264.7 kích thích bằng LPS được thực hiện trong
24 giờ theo phương pháp Griess. Kết quả chỉ ra rằng sanggenon C và sanggenon O ức
chế mạnh sự sản sinh NO với giá trị IC
50
là 2,82 và 1,15 μM (Hình 23aA). Kết quả
đánh giá khả năng sống sót của tế bào theo phương pháp MTT cho thấy cả hai hợp chất
không có biểu hiện gây độc ở nồng độ ức chế sự sản sinh NO.
21

4.4.3.2. Tác dụng ức chế hoạt động NF-

B trên dòng tế bào RAW264.7
Một số nghiên cứu cho thấy sự hoạt động của NF-B liên quan mật thiết đến sự
sản sinh NO, vì vậy sự ức chế NF-B có thể ngăn chặn sự sản sinh NO.
Tác dụng ức chế
mạnh sự hoạt hoá NF-
κB ở nồng độ tương
đương với nồng độ ức
chế sự sản sinh NO
của hai hợp chất
sanggenon C và
sanggenon O trên
dòng tế bào
RAW264.7 kích thích
bằng LPS (1 μg/mL)
được thực hiện theo
phương pháp SEAP.
Kết quả cho thấy
sanggenon C và

sanggenon O ức chế
mạnh sự hoạt hoá NF-
κB với giá trị IC
50
là
3,38 và 1,29 μM (Hình
4.23aB). Hoạt tính ức
chế NF-B của hai
hợp chất này trên dòng
tế bào RAW264.7
cũng mạnh như trên dòng tế bào HeLa.
4.4.3.3. Tác dụng ức chế biểu hiện iNOS trên dòng tế bào RAW264.7
Sự sản sinh NO phụ thuộc vào hoạt động của các enzyme tổng hợp nitơ oxit
(NOS) trong đó đáng chú ý là enzyme iNOS. Kích thích biểu hiện iNOS là một phản
ứng cơ bản của sự sản sinh NO. Bình thường, iNOS không xuất hiện trong các tế bào
không hoạt động tích cực, nhưng trong điều kiện sinh bệnh thì các iNOS xuất hiện và
sản sinh ra một lượng lớn NO tương ứng với các tín hiệu viêm, ví dụ như cytokines và
lipopolysaccharides (LPS) [169]. Trong hầu hết các loại tế bào, yếu tố phiên mã NF-
B là một yếu tố chính điều chỉnh biểu hiện iNOS tương ứng với các tín hiệu viêm. Vì
vậy, sự ức chế NF-B có thể ngăn chặn sự sản sinh NO và sự biểu hiện của iNOS đã
trở thành mục tiêu quan trọng trong điều trị các bệnh liên quan [169].
Vì sanggenon C và sanggenon O có khả năng giảm mạnh sự sản sinh NO và hoạt

Hình 4.23a: Tác dụng của sanggenon C và O đến sự sản
sinh NO (A) và hoạt tính NF-κB (B) ở dòng tế bào RAW264.7.
22

hóa NF-κB nên chúng tôi đã đánh giá tác dụng của các hợp chất này đến biểu hiện
iNOS ở dòng tế bào RAW264.7 kích thích bằng 1 μg/mL LPS trong 24 giờ theo
phương pháp phân tích Western blot. Hình 4.23b chỉ ra rằng ở nồng độ 1 và 10µM hai

hợp chất này làm giảm mạnh biểu hiện iNOS.
4.4.3.4. Tác dụng ngăn chặn sự phosphoryl hoá, giáng hoá IκBα
Do sự hoạt hoá NF-κB bởi những yếu tố kích thích khác nhau xảy ra trước quá
trình phosphoryl hoá và sự giáng hoá của protein IκBα trên tế bào RAW264.7 bị kích
thích bởi LPS [25] nên tiếp tục đánh giá tác dụng của hai hợp chất này đến sự
phosphoryl hoá và giáng hoá IκB. LPS kích thích sự giáng hoá và phosphoryl hoá
IκBα được chỉ ra trong hình 4.23b (làn 1 và 2). Sự giáng hoá và phosphoryl hoá này
giảm đáng kể khi có mặt sanggenon C và sanggenon O (làn 36). Như vậy tác dụng
ức chế NF-κB của sanggenon C và sanggenon O là do sự bất hoạt protein IκBα.

Hình 4.23b: Tác dụng của sanggenon C và O đến biểu hiện của iNOS và sự phosphoryl
hoá, giáng hoá của IκBα ở tế bào RAW264.7 được kích thích bằng LPS (1 μg/mL)
Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng sanggenon C ức chế sự sản sinh NO và biểu
hiện iNOS bằng cách ngăn chặn sự hoạt hóa NF-κB thông qua tác dụng ức chế quá
trình phosphoryl hóa IB và ngăn cản sự giáng hóa IB khỏi phức hợp với NF-B.
Điều thú vị là sanggenon C và sanggenon O là các đồng phân lập thể ở vị trí C-2 và C-
3 và tác dụng ức chế NF-κB và sản sinh NO của sanggenon O mạnh hơn của
sanggenon C cho phép giả thiết rằng cấu hình lập thể ở vị trí C-2 và C-3 có thể đóng
vai trò quan trọng trong việc ức chế sự sản sinh NO và hoạt động của NF-κB. Đây là
nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính ức chế sự sản sinh NO của sanggenon C và sanggenon
O và cũng là nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính ức chế NF-B của sanggenon O ở mức
độ phân tử. Qua nghiên cứu này có thể thấy cả hai hợp chất đều có thể là những tác
nhân kháng viêm và ung thư đầy tiềm năng.
1 2 3 4 5 6 Làn
Protein đối chứng
23

4.4.4. Nhận xét
Ngoại trừ các hợp chất moracin M, O, P không thể hiện hoạt tính cùng hợp chất
steppogenin và mulberrofuran K có hoạt tính yếu, tất cả các hợp chất phân lập được

đều ức chế mạnh hoạt động NF-B trên dòng tế bào ung thư HeLa. Kết quả này hoàn
toàn phù hợp với kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào HeLa,
MCF-7 và Hep-3B. Điều này chứng tỏ mô hình sàng lọc các chất có tác dụng diệt tế
bào ung thư theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức chế hoạt động NF-B trên
dòng tế bào ung thư là hữu hiệu. Đáng chú ý là cả hai hợp chất mới 3-prenyl-3-
geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) và kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether
(RM1) đều có hoạt tính ức chế mạnh hoạt động của NF-B và sự phát triển của ba dòng
tế bào ung thư HeLa, MCF-7, Hep-3B.
Các hợp chất có nhóm thế prenyl thường có hoạt tính mạnh hơn và hoạt lực ức
chế còn phụ thuộc vào vị trí gắn kết với vòng thơm cũng như khả năng tạo vòng với
nhóm hydroxy phenolic như LM1/LM2/LM3, LM7, LM8, LM9, LM10.
Các hợp chất moracin M, P, O tuy không thể hiện hoạt tính ở các thử nghiệm ức
chế NF-B và gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7 và Hep-3B
nhưng theo những nghiên cứu của các tác giả trước đây chúng được xem làm những
phytoalexin bởi tác dụng kháng khuẩn mạnh [19], [108] tác dụng ức chế sự phát triển
của virus viêm gan C (HCV) [171] và có tác dụng kích thích miễn dịch. Moracin M
cũng đã được chứng minh hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư máu chuột
P-388 [49]. Ngoài ra, moracin M và steppogenin còn ức chế mạnh enzyme tyrosinase ở
cả hai phản ứng oxy hóa trong quá trình tạo thành melamin. Các kết quả nghiên cứu
này chứng tỏ các hợp chất này cũng có thể là những tác nhân phòng chống ung thư
theo những cơ chế khác.
KẾT LUẬN
1.Về thành phần hóa học
Đây là công trình đầu tiên phân lập các hợp chất có tác dụng chống ung thư từ lá
và vỏ rễ loài dâu tằm Morus alba L. theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức chế
yếu tố phiên mã NF-B trên dòng tế bào ung thư.
1.1 Từ phần lá của loài dâu tằm (Morus alba L.) thu hái tại Mỹ Đức, Hà Nội đã
phân lập và xác định được cấu trúc của 19 hợp chất là: 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-
tetrahydroxyflavone (LM1), sanggenon J (LM2), sanggenon K (LM3), 8,3-diprenyl-
5,7,4-trihydroxyflavone (LM4), kuwanon S (LM5), 8-geranylapigenin (LM6),

cyclomulberrin (LM7), cyclomorusin (LM8), morusin (LM9), atalantoflavone
(LM10), kaempferol (LM11), steppogenin (LM12), moracin M (LM13), moracin P
(LM14), moracin O (LM15), mulberrofuran K (LM16), kuwanon R (LM17),
sanggenon C (LM18), sanggenon O (LM19). Trong số đó, hợp chất 3-prenyl-3-