Nghiên cứu bệnh do streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm (lates calcarifer) và biện pháp phòng bệnh tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản
Mã ngành: 9620301

TRƯƠNG THỊ HOA

NGHIÊN CỨU BỆNH DO Streptococcus iniae
GÂY RA TRÊN CÁ CHẼM (Lates calcarifer)
VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG BỆNH

Cần Thơ, 2019


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn: PGS.TS. Đặng Thị Hoàng Oanh

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp
trường
Họp tại:
Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm …..

Phản biện 1: …………………………………………………….
Phản biện 2: ……………………………………………….........

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.

Thư viện Quốc gia Việt Nam.


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Trương Thị Hoa, Nguyễn Ngọc Phước và Đặng Thị Hoàng
Oanh, 2018. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ một số
loài cá nước lợ có khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus iniae
gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm (Lates calcarifer). Tạp chí
Nông nghiệp và phát triển nông thôn. 338: 99 – 106.
2. Trương Thị Hoa, Nguyễn Ngọc Phước và Đặng Thị Hoàng
Oanh, 2018. Nghiên cứu đặc điểm bệnh học của vi khuẩn
Streptococcus iniae trên cá chẽm (Lates calcarifer). Tạp chí
Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 54(3B): 156-163.

i


Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Giới thiệu
Trên cá chẽm, bệnh do S. iniae được báo cáo lần
đầu tiên vào năm 1999 tại Úc (Bromage et al., 1999), sau
đó bệnh tiếp tục xuất hiện trên cá chẽm nuôi tại Úc năm
2006 (Creeper và Buller, 2006), tại Thái Lan năm 2010
(Suanyuk et al., 2010). Bệnh do S. iniae trên cá chẽm gây
xuất huyết trên da, vây và mắt lồi đục (Bromage et al.,
1999). Một số dấu hiệu khác như lở loét ngoài da hay
xuất huyết ở các gốc vây, nắp mang, hậu môn đã được
quan sát trên cá chẽm và cá rô phi nhiễm S. iniae
(Suanyuk et al., 2010). Bệnh do S. iniae có thể gây ra tỷ

lệ chết lên đến 70% ở giai đoạn cá chẽm giống (Creeper
và Buller, 2006).
Ở Việt Nam, bệnh do S. iniae được báo cáo xuất
hiện đầu tiên trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa vào năm
2013 (Trần Vĩ Hích, 2014). Tại Thừa Thiên Huế, từ năm
2007, để hạn chế dịch bệnh và ô nhiễm môi trường do
nuôi thâm canh tôm thẻ chân trắng gây ra, tỉnh đã phát
triển nuôi các đối tượng cá nước mặn, lợ như cá mú, cá
hồng, cá dìa, cá chẽm…, để thay thế các vùng nuôi tôm
bị dịch bệnh. Trong đó, cá chẽm được người dân địa
phương nuôi khá phổ biến và mang lại hiệu quả kinh tế
cao (Tôn Thất Chất và ctv., 2010). Tuy nhiên, việc mở
rộng diện tích mặt nước nuôi cá chẽm thiếu quy hoạch
chặt chẽ đã làm nghề nuôi cá gặp rất nhiều khó khăn về
môi trường và dịch bệnh, trong đó bệnh xuất huyết trên
cá chẽm rất phổ biến.
Thuốc kháng sinh thường được sử dụng để trị bệnh
do vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản nuôi. Việc sử
dụng kháng sinh để trị bệnh do vi khuẩn đã mang lại
những thành công nhất định, nhưng cũng làm gia tăng
những dòng vi khuẩn kháng thuốc (Weston, 1996; Tu
Thanh Dung et al., 2008). Do đó nghiên cứu sử dụng vi
khuẩn có khả năng kháng với vi khuẩn gây bệnh trên động
1


vật thủy sản ngày càng được quan tâm. Trong đó có vi
khuẩn lactic, có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh và có
lợi với sức khỏe vật chủ khi được bổ sung đủ số lượng
trong đường ruột (Nirunya et al., 2008). Vi khuẩn lactic

sản xuất một số chất kháng khuẩn như axit hữu cơ, các
hợp chất kháng nấm và bacteriocin để ức chế sự phát triển
của mầm bệnh (Ringo et al., 2005; Gatesoupe, 2007).
Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ nhiều
nguồn khác nhau như từ các sản phẩm lên men, từ ruột
gia súc và các loài động vật thủy sản. Một số nghiên cứu
về vi sinh vật đường ruột của cá trong các môi trường
sống khác nhau cho thấy vi khuẩn lactic tồn tại trong ruột
cá nhưng không chiếm ưu thế trong hệ vi sinh đường ruột
(Ringo et al., 2010). Do đó, có thể bổ sung vi khuẩn
lactic vào khẩu phần ăn của cá để ức chế vi khuẩn gây
bệnh và nâng cao sức đề kháng bệnh cho cá (Lauzon và
Ringo, 2011). Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có các
nghiên cứu về ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn
lactic vào thức ăn đến các chỉ tiêu miễn dịch không đặc
hiệu của cá chẽm.
Xuất phát từ thực tiễn đó, thực hiện đề tài “Nghiên
cứu bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm
(Lates calcarifer) và biện pháp phòng bệnh” nhằm cung
cấp thông tin về bệnh do vi khuẩn S. iniae trên cá và góp
phần phát triển nghề nuôi cá chẽm bền vững.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung: Cung cấp thông tin về bệnh do vi
khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm làm cơ sở khoa học
cho việc quản lý dịch bệnh và góp phần phát triển nghề
nuôi cá chẽm bền vững.
Mục tiêu cụ thể: Xác định đặc điểm gây bệnh của
vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm và đề xuất giải pháp phòng
bệnh làm cơ sở cho việc chẩn đoán và phòng bệnh xuất
huyết trên cá chẽm.

1.3 Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu tập trung tìm hiểu bệnh xuất huyết do
2


vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm nuôi tại tỉnh Thừa
Thiên Huế, tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng đối
kháng vi khuẩn S. iniae từ ruột cá dìa, cá chẽm và cá rô
phi, đồng thời xác định một số chỉ tiêu huyết học và khả
năng kháng vi khuẩn S. iniae của cá chẽm giai đoạn
giống.
1.4 Nội dung nghiên cứu
Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae trên cá
chẽm
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng
đối kháng vi khuẩn S. iniae từ ruột một số loài cá nước lợ
Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi
khuẩn lactic vào thức ăn đến một số chỉ tiêu huyết học và
khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá
chẽm.
1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp thông tin
về bệnh vi khuẩn trên cá, đặc biệt là bệnh xuất huyết do
vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm. Đồng thời đánh giá
ảnh hưởng của vi khuẩn lactic phân lập từ ruột một số
loài cá nước lợ đến một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc
hiệu ở cá chẽm. Kết quả của luận án còn có ý nghĩa trong
việc sử dụng vi khuẩn lactic có tính đối kháng với mầm
bệnh vi khuẩn S. iniae tạo chế phẩm sinh học phòng bệnh
xuất huyết trên cá. Bên cạnh ý nghĩa khoa học và ứng

dụng trong thực tiễn, luận án còn giúp nâng cao kiến
thức, năng lực nghiên cứu cho người tham gia và là
nguồn tài liệu tham khảo bổ sung cho nghiên cứu và
giảng dạy sinh viên trong các trường đại học.
1.6 Điểm mới của luận án
Bệnh xuất huyết do S. iniae được nghiên cứu và mô
tả về đặc điểm bệnh học trên cá chẽm nuôi tại Thừa
Thiên Huế
Đã định danh và lưu giữ được ba chủng vi khuẩn
Lactobacillus fermentum từ ruột cá dìa và cá chẽm có khả
năng đối kháng mạnh với vi khuẩn S. iniae gây bệnh xuất
3


huyết trên cá chẽm.
Sử dụng chủng vi khuẩn L. fermentum (C21) bổ
sung vào thức ăn cho cá chẽm làm tăng cường một số
chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu giúp nâng cao khả
năng đề kháng đối với vi khuẩn S. iniae gây bệnh xuất
huyết trên cá chẽm.
Chương 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá chẽm
(Lates calcarifer) bệnh xuất huyết.
Vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá chẽm (Lates
calcarifer), cá dìa (Siganus guttatus) và cá rô phi
(Oreochromis niloticus).
Cá chẽm (Lates calcarifer)
3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2014 đến tháng
8/2018. Các thí nghiệm được tiến hành và phân tích tại
phòng thí nghiệm khoa Thủy sản, trường Đại học Nông
Lâm – Đại học Huế.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm gây bệnh của
vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm
3.4.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn S. iniae gây bệnh xuất
huyết trên cá chẽm
Phương pháp thu mẫu
Tổng số có 87 mẫu cá chẽm bị bệnh xuất huyết được
thu tại 10 hộ nuôi lồng, nuôi đơn cá chẽm ở tỉnh Thừa
Thiên Huế trong thời gian từ tháng 01/2016 đến tháng
12/2016. Mẫu cá được thu có dấu hiệu xuất huyết trên da,
mắt cá bị lồi, mờ đục và xuất huyết. Cá được giữ trong
thùng xốp sau khi thu và vận chuyển về phòng thí nghiệm
để tiến hành phân lập vi khuẩn.
Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn và xác định
4


các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn
Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm
được tiến hành theo phương pháp của Frerichs và Millar,
(1993).
Định danh bằng bằng phương pháp giải trình tự gen
đặc hiệu
Phương pháp định danh vi khuẩn S. iniae được tiến
hành bằng phương pháp khuếch đại đoạn gen đặc hiệu
(PCR)

với
cặp
mồi
Sin
1:
CTAGAGTACACATGTAGCT(AGCT)AAG và Sin 2:
GGATTTTCCACTCCCATTAC và kích thước sản phẩm
là 300 bp (Zlotkin et al., 1998). Thành phần phản ứng
PCR phát hiện S. iniae được thực hiện theo qui trình của
Zlotkin et al. (1998) gồm 1X dung dịch đệm 10X;
1,5mM MgCl2; 200μM dNTPs; 2,5 U Taq DNA
polymerase; 0,5μL mồi xuôi (Sin1); 0,5μL mồi
ngược (Sin 2) và 500 ng mẫu DNA. Chu kì nhiệt của
PCR là 94°C trong 3 phút; sau đó 94°C trong 60 giây;
55°C trong 60 giây; 72°C trong 90 giây; lặp lại chu kì
trên 35 lần; 72°C trong 10 phút. Sản phẩm khuếch đại
đặc hiệu ở vị trí 300 bp.
Sản phẩm PCR sau đó sẽ được tinh sạch bằng kít
KIT Isolate II PCR và Gel (BioLine, Đức) và được gửi
đến phòng thí nghiệm Macrogen – Hàn Quốc để tiến hành
giải trình tự axit nucleic.
3.4.1.2 Xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm của vi
khuẩn S. iniae
Chuẩn bị cá thí nghiệm
Cá thí nghiệm ở giai đoạn giống, có chiều dài trung
bình là 6,6±0,4 cm/con, khối lượng trung bình 7,2±0,5
g/con. Cá khỏe mạnh, được nuôi ở điều kiện thí nghiệm 14
ngày để quen với môi trường thí nghiệm và cho ăn bằng
thức ăn Nanolis C (Ocialis, Việt Nam) 2 lần/ngày vào lúc 8
giờ và 17 giờ, mỗi lần cho ăn 8% khối lượng thân.

Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Xác định độc lực của vi khuẩn
Thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn được tiến

5


hành theo phương pháp của Dilok (2012). Thí nghiệm được
bố trí gồm 11 nghiệm thức, trong đó có 10 nghiệm thức thí
nghiệm cảm nhiễm với 10 chủng vi khuẩn S. iniae với mật
độ 109 CFU/mL vào xoang bụng của cá. Những chủng vi
khuẩn S. iniae gây chết cá trong 3 ngày thí nghiệm được
xem là những chủng có độc lực và được sử dụng cho thí
nghiệm 2.
Thí nghiệm 2: Xác định liều gây chết 50% (LD50 Lethal dose 50)
Thí nghiệm xác định liều gây chết 50% được tiến
hành theo phương pháp của Reed và Muench (1938). Thí
nghiệm được tiến hành trong 14 ngày, kiểm tra cá 4
lần/ngày để theo dõi số lượng cá chết.
Liều gây chết 50% được xác định dựa trên tỉ lệ chết
tích lũy ở từng nghiệm thức sau khi kết thúc thí nghiệm.
Thí nghiệm 3: Xác định khả năng gây bệnh thực
nghiệm của vi khuẩn
Xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm của vi
khuẩn được tiến hành theo phương pháp của Dilok (2012),
(Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh
của chủng HTA1 và HTA3 trên cá chẽm
Chủng vi Lô thí
Cá thí nghiệm Mật độ vi khuẩn Số lần

khuẩn
nghiệm
(con/bể)
(CFU/mL)
lặp lại
HTA1
1
10
LD50
3
HTA3
2
10
LD50
3
ĐC
10
NMSL
3
Thí nghiệm trong 14 ngày, kiểm tra cá 4 lần/ngày
để theo dõi tình trạng sức khỏe của cá và thu những cá có
dấu hiệu bệnh lý để phân lập lại vi khuẩn và nghiên cứu
mô bệnh học.
3.4.1.3 Xác định đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm cảm
nhiễm S. iniae
Mẫu cá chẽm giống có biểu hiện bệnh và cá khỏe
được thu từ thí nghiệm 3 để phân tích mô học. Mẫu mô
gan, lách, thận, não cá bệnh và cá khỏe được cố định
trong dung dịch formalin 4%. Sau khi bảo quản mẫu sẽ

6


được làm tiêu bản theo phương pháp của Mohamed
(2009). Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi và nhận dạng
bệnh tích dựa vào một số thay đổi cấu trúc của mô.
3.4.2 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ ruột
một số loài cá nước lợ có khả năng ức chế S. iniae
3.4.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ ruột cá chẽm,
cá dìa và cá rô phi
Thu mẫu
Chọn cá rô phi, cá dìa và cá chẽm được đánh bắt từ
tự nhiên, cá có kích cỡ thương phẩm, cá khỏe mạnh và
không thể hiện dấu hiệu bệnh lý. Cá sau khi thu được
mang về phòng thí nghiệm, giải phẫu và lấy mẫu vi
khuẩn ở ruột để phân lập vi khuẩn lactic
Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic
Tiến hành phân lập và nuôi cấy các chủng vi khuẩn
lactic trong ruột cá chẽm, dìa và rô phi theo phương pháp
của Nirunya et al. (2008).
Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý
vá sinh hóa của vi khuẩn lactic
Tiến hành nhuộm Gram, thử phản ứng catalase,
oxidase, kiểm tra khả năng di động, khả năng sinh bào tử
của vi khuẩn; khả năng phân giải CaCO3 và khả năng làm
dịch hóa gelatin. Vi khuẩn lactic được xác định theo cẩm
nang của Cowan và Steels (Barrow và Feltham, 1993).
3.4.2.2 Xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn S.
iniae của vi khuẩn lactic
Thử nghiệm khả năng đối kháng với vi khuẩn S.

iniae của vi khuẩn lactic theo phương pháp của Hamza et
al. (2012). Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch
để xác định khả năng đối kháng với chủng S. iniae HTA1
của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được. Xác định
khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic theo
phương pháp của Galindo (2004).
3.4.2.3 Định danh các chủng vi khuẩn lactic có khả năng
đối kháng mạnh với vi khuẩn S. iniae
Phương pháp định danh vi khuẩn lactic được tiến
7


hành bằng phương pháp khuếch đại đoạn gen đặc hiệu
(PCR)
với
cặp
mồi
xuôi
LacF:
AGCAGTAGGGAATCTTCCA và mồi ngược LacR:
ATTCCACCGCTACACATG và kích thước sản phẩm là
345 bp (Nikolaou et al., 2011). Thành phần phản ứng
PCR phát hiện vi khuẩn lactic được thực hiện theo qui
trình của Nikolaou et al. (2011). Thành phần phản ứng
gồm: 50 ng DNA, 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi
ngược, 5 µL dung dịch đệm PCR (10X), 10 pmol dNTP,
5U Enzyme pfu và bổ sung nước cất vô trùng cho đủ thể
tích 50 µL. Điều kiện phản ứng: 95C trong 5 phút; tiếp
đến là 30 chu kỳ: 95C trong 45 giây, 48C trong 30 giây
và 72C trong 1 phút; cuối cùng là 72C trong 7 phút.

Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở vị trí 345 bp.
Sản phẩm PCR sau đó sẽ được tinh sạch bằng kít
KIT Isolate II PCR và Gel (BioLine, Đức) và được gửi
đến phòng thí nghiệm Macrogen – Hàn Quốc để tiến
hành giải trình tự acid nucleic.
3.4.3 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của việc bổ sung
chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn đến một số chỉ tiêu
huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của
huyết thanh cá chẽm
3.4.3.1 Cá chẽm thí nghiệm
Số lượng cá bố trí thí nghiệm là 240 con, cá có chiều
dài trung bình 8,3±0,4 cm/con và khối lượng trung bình
11,4±2,3 g/con. Cá được cho ăn bằng thức ăn Nanolis C
(Ocialis, Việt Nam), cho ăn 2 lần/ngày vào lúc 8 giờ và 17
giờ, mỗi lần cho ăn 8% khối lượng thân.
3.4.3.2 Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm
Sử dụng chủng vi khuẩn S. iniae HTA1 để cảm
nhiễm, mật độ là 1,9x105 CFU/mL và chủng vi khuẩn L.
fermentum C21, mật độ 109 CFU/mL.
3.4.3.3 Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm theo phương pháp của Allameh et
al. (2013). Thí nghiệm được bố trí với 04 nghiệm thức và
03 lần lặp lại. Nghiệm thức đối chứng âm (nghiệm thức 1
8


(NT 1)): Không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức
ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang
bụng cá; Nghiệm thức đối chứng dương (nghiệm thức 2
(NT 2)): Không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức

ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá sau
14 ngày thí nghiệm với liều tiêm là 1,9x105 CFU/mL/cá;
Nghiệm thức thí nghiệm 1 (nghiệm thức 3 (NT 3)): Bổ
sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn, mật độ 109
CFU/g thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae;
Nghiệm thức thí nghiệm 2 (nghiệm thức 4 (NT 4)): Bổ
sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn, mật độ 109
CFU/g thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang
bụng cá sau 14 ngày cho ăn với liều tiêm là 1,9x105
CFU/mL/cá.
Theo dõi thí nghiệm trong 28 ngày, tiến hành lấy
máu ở động mạch đuôi vào ngày thí nghiệm 1; 14; 21 và
28 ở các nghiệm thức (mỗi lần thu mẫu lấy 03 con/bể) để
xác định số lượng tế bào máu, khả năng ức chế S. iniae
của huyết thanh và hoạt tính lysozyme trong huyết thanh.
3.4.3.4 Phương pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
Định lượng hồng cầu: Số lượng hồng cầu trong
máu của cá được xác định theo phương pháp của Natt và
Herrick (1952).
Định lượng tổng bạch cầu
Chuẩn bị tiêu bản máu trên lame và nhuộm mẫu
máu theo Humason, 1979 (trích dẫn bởi Rowley, 1990).
Số lượng tổng bạch cầu và các loại bạch cầu trong
máu cá được xác định theo phương pháp của Chinabut et
al. (1991) và Hrubec et al. (2000).
3.4.3.5 Xác định khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của
huyết thanh
Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh
cá chẽm được xác định theo phương pháp của Phuong et
al. (2007). Số vi khuẩn S. iniae bị ức chế (Suc (%)) bởi

huyết thanh của cá chẽm được tính theo công thức:
9


Suc (%) =

OD mẫu - OD blank
OD control - OD bank

x
100

Trong đó: Suc (%): Tỷ lệ (%) vi khuẩn bị ức chế bởi
huyết thanh; OD- Optical Density - Mật độ quang
3.4.3.6 Xác định hoạt tính lysozyme trong huyết thanh
Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh cá chẽm
được xác định theo phương pháp của Kumar et al.
(2007). Hoạt tính lysozyme được xác định bằng đơn
vị/phút/mg protein của huyết thanh. Một đơn vị lysozyme
(U) được xác định là lượng lysozyme sẽ làm giảm độ hấp
thụ ở bước sóng 450 nm với 0,001 đơn vị hấp
phụ/phút/mg (U/phút/mg).
3.4.3.7 Phương pháp xác định tỷ lệ sống của cá
Theo dõi thí nghiệm, xác định tổng số cá sống sau
14 ngày cảm nhiễm S. iniae. Tỷ lệ sống của cá được xác
định theo công thức (Kumar et al., 2007):
Tỷ lệ sống (%) =

Số cá sống sau cảm nhiễm S. iniae
Số cá cảm nhiễm S. iniae

x 100

Hiệu quả sử dụng vi khuẩn L. fermentum bổ sung
vào thức ăn được đánh giá bằng tỉ lệ bảo hộ (relative
percentage of survival - RPS) (%) theo công thức (Ellis,
1988).
3.5 Xử lý số liệu
Số liệu thô thí nghiệm được nhập và xử lý sơ bộ
trên phần mềm Microsoft Excel 2016, sau đó phân tích
phương sai (ANOVA) theo mô hình tuyến tính tổng quát
(General Linear Model) trên phần mềm SPSS version 20.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae trên cá
chẽm
4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm
4.1.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Tổng số mẫu cá thu để phân lập vi khuẩn là 87 con.
Cá bị bệnh xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý như giảm ăn,
10


bơi lờ đờ trên mặt nước, màu sắc da tối; xuất huyết trên
thân và vây; mắt cá bị lồi, mờ đục và xuất huyết; xoang
bụng có chứa dịch nhầy, nội tạng bị xuất huyết, thận
sưng, não xuất huyết (Hình 4.1).

Hình 4.1. Cá chẽm bị bệnh xuất huyết do vi khuẩn
(A-mắt cá bị lồi và xuất huyết; B- mắt lồi và mờ đục,

xoang bụng chứa dịch nhầy)
Từ các mẫu cá chẽm bị bệnh xuất huyết thu được ở
các vùng nuôi đã phân lập được 42 chủng vi khuẩn
Streptococcus từ não, thận, lách và gan của cá. Trong đó
có 20 chủng phân lâp từ não, chiếm tỷ lệ 47,6%, 9 chủng
ở thận (21,4%), 7 chủng ở lách (16,7%) và 6 chủng ở gan
(14,3%).
4.1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các
chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm

Hình 4.2: Hình dạng khuẩn lạc và nhuộm Gram vi khuẩn S.
iniae (A- Hình dạng khuẩn lạc S. iniae trên môi trường TSA+;
B - Hình dạng vi khuẩn S. iniae sau khi nhuộm Gram (100X))
Kết quả thu mẫu, phân lập và nuôi cấy vi khuẩn cho
thấy trên môi trường TSA+, sau 24 đến 48 giờ nuôi cấy ở
nhiệt độ 28oC, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc
nhỏ có đường kính khoảng 0,7 – 1 mm, màu trắng đục, rìa
đều, không sinh sắc tố. Kết quả nhuộm Gram xác định vi

11


khuẩn Gram (+), có dạng hình cầu hoặc liên cầu (Hình 4.2).
Kết quả nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa cho thấy các
chủng vi khuẩn phân lập được đều không di động, phản ứng
catalase và oxidase âm tính, phản ứng lysin decarboxylase âm
tính; phản ứng dương tính với bile esculin, huyết tương thỏ
đông khô; các chủng vi khuẩn này có khả năng thủy phân tinh
bột, không phát triển trên môi trường TSB có bổ sung 6,5%
NaCl và môi trường TSA không bổ sung NaCl. Kết quả xác

định kiểu huyết thanh bằng phương pháp ngưng kết miễn dịch
cho thấy 42 chủng vi khuẩn phân lập được đều âm tính với 6
kiểu huyết thanh A, B, C, D, F, G của nhóm Lancefield. Trên
môi trường BA+, khuẩn lạc của vi khuẩn tạo vòng dung huyết
β.
Kết quả định danh bằng kít API 20 Strep cho thấy 42
chủng Streptococcus thủy phân esculin và không thủy phân
hippurate. Các chủng này đều cho phản ứng pyrrolidonyl
arylamidase, β-Glucuronidase, alkaline phosphatase, arginine
dihydrolase và leucine arylamidase dương tính, phản ứng
Voges-Proskauer, α-Galactosidase, β-Galactosidase âm tính.
Dựa vào kết quả xác định các chỉ tiêu sinh hóa và so
sánh với kết quả nghiên cứu của Bromage et al. (1999) và
Rahmatullah et al. (2017), 42 chủng vi khuẩn đã phân lập
được định danh là S. iniae.
4.1.2 Khả năng gây bệnh thực nghiệm của S. iniae trên cá
chẽm
4.1.2.1 Kết quả xác định độc lực vi khuẩn
Kết quả xác định độc lực vi khuẩn cho thấy 2 chủng
gây chết cá (100%) trong 3 ngày thí nghiệm là HTA1 và
HTA3. Do đó 2 chủng HTA1 và HTA3 được chọn để xác
định giá trị LD50 trên cá chẽm.
4.1.2.2 Kết quả xác định LD50 của S. iniae trên cá chẽm
Giá trị LD50 của 2 chủng HTA1 và HTA3 bằng cách
tiêm vào xoang bụng cá chẽm lần lượt là 1,9x105 CFU/mL
và 1,5x105 CFU/mL.
4.1.2.3 Kết quả gây bệnh thực nghiệm
Kết quả gây bệnh thực nghiệm 2 chủng HTA1 và
HTA3 trên cá chẽm cho thấy sau 48 giờ cảm nhiễm với 2
chủng HTA1 và HTA3, cá chẽm có dấu hiệu bơi lờ đờ trên

12


mặt nước, xuất huyết trên da và gốc vây, mắt lồi và xuất
huyết. Sau 72 giờ, cá bắt đầu chết và tỉ lệ chết tích lũy cao
nhất sau 8 ngày là 76,7% (chủng HTA1) và 80% (chủng
HTA3), (Hình 4.6). Trong khi đó ở lô đối chứng, cá không
thể hiện dấu hiệu bệnh lý, không chết cũng như không phân
lập được vi khuẩn S. iniae.
Tỷ lệ chết tích lũy (%)

100.0
80.0
60.0

40.0
20.0

HTA1

HTA3

ĐC

0.0
1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14

Ngày sau cảm nhiễm S. iniae (ngày)
Hình 4.6: Tỷ lệ chết tích lũy của cá chẽm trong 14 ngày cảm
nhiễm hai chủng S. iniae HTA1 và HTA3

Kết quả theo dõi tỷ lệ chết tích lũy của cá chẽm ở
thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm của
hai chủng HTA1 và HTA3 cho thấy cá chết sau 72 giờ
cảm nhiễm và tỷ lệ chết ở 2 nghiệm thức thí nghiệm là
20%. Sau 8 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chết tích lũy của cá
chẽm cảm nhiễm hai chủng HTA1 và HTA3 cao nhất, lần
lượt là 76,7% và 80%, tuy nhiên không có sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê ở hai nghiệm thức này (p>0,05); đến
ngày thứ 9, không xuất hiện cá chết ở 2 lô thí nghiệm.
Trong khi đó, cá ở lô đối chứng không chết trong 14 ngày
thí nghiệm.
4.1.2.4 Đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm cảm nhiễm S.
iniae

Kết quả nghiên cứu mô học cá chẽm cảm nhiễm S.
iniae trong điều kiện thực nghiệm cho thấy vi khuẩn S.
iniae gây biến đổi cấu trúc mô của gan, thận, lách và não
cá. Vi khuẩn S. iniae gây xuất huyết và hoại tử trên các
mô gan, thận, lách và não cá.
13


Hình 4.7: Mô gan cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae ((nhuộm
H&E), (100X); (vi khuẩn S. iniae trong mô gan cá chẽm sau 3 ngày
cảm nhiễm (mũi tên))

Hình 4.8: Mô thận cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae ((nhuộm
H&E), (100X); (a-trung tâm đại thực bào sắc tố trong mô thận (mũi
tên); b-cấu trúc ống thận bị biến đổi (mũi tên))

Hình 4.9: Mô lách cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae ((nhuộm
H&E), (100X), (trung tâm đại thực bào sắc tố tập trung nhiều trong
mô lách (mũi tên))

14


Hình 4.10: Mô não cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae
((nhuộm H&E), (100X); (vi khuẩn S. iniae trong mô não cá
chẽm sau 3 ngày cảm nhiễm (mũi tên))
4.1.2.5 Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự
nucleotide của đoạn gen 16S rRNA của hai chủng HTA1 và
HTA3
Kết quả định danh 2 chủng HTA1 và HTA3 bằng

phương pháp khuếch đoạn gen đặc hiệu và giải trình tự
đoạn gen được khuếch đại, xác định 2 chủng trên là S. iniae.
4.2 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng
đối kháng vi khuẩn S. iniae từ ruột một số loài cá nước
lợ
4.2.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic
Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 61 chủng vi
khuẩn lactic. Các chủng vi khuẩn này đều là vi khuẩn Gram
dương, hình que hoặc hình cầu, không hình thành bào tử,
không di động, phản ứng catalase và oxidase âm tính, có
khả năng phân giải CaCO3 và không làm tan chảy gelatin.
(Bảng 4.7)
Bảng 4.7: Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ cá chẽm, cá
rô phi và cá dìa
Số lượng
Cơ quan
Số chủng vi
Loài cá
(con)
phân lập
khuẩn lactic
Cá chẽm
50
Ruột
27
Cá rô phi
50
Ruột
19
Cá dìa

50
Ruột
15

15


Bảng 4.8. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa
của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá dìa, cá
chẽm và cá rô phi
Chỉ tiêu sinh hóa

Màu sắc khuẩn lạc

Hình dạng tế bào
Hình que
Hình cầu
Gram
Di động
Sinh bào tử
Catalase
Oxidase
Phân giải CaCO3
Dịch hóa Gelatin

Kết quả thử sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic
Cá chẽm
Cá rô phi
Cá dìa
(n = 27)

(n = 19)
(n = 15)
Trắng đục
Trắng đục
Trắng đục
18
9
+
+
-

14
5
+
+
-

13
2
+
+
-

+
+
+

+
+
+

+
+
+

+
+

+
+

+
+

+
+

+
+

+
+

MRS agar bổ sung

1% NaCl
1,5% NaCl
2% NaCl
TSA bổ sung
1,5% NaCl

2% NaCl
TSA bổ bổ sung
1,5% NaCl
Nhiệt độ 4oC
Nhiệt độ 28oC
Nhiệt độ 37oC

Ghi chú: (+) phản ứng dương tính; (-) phản ứng âm tính

Hình 4.13. Hình dạng vi khuẩn lactic sau khi nhuộm Gram
(100X), (A - Vi khuẩn có dạng hình que; B – Vi khuẩn có
dạng hình cầu)

16


4.2.2 Kết quả xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn S.
iniae của vi khuẩn lactic

Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của các
chủng vi khuẩn lactic với S. iniae cho thấy trong 61
chủng vi khuẩn lactic có 28 chủng có khả năng kháng S.
iniae, trong đó 3 chủng C21, D1 và D7 có khả năng
kháng mạnh (đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn 20
mm). (Bảng 4.9)
Bảng 4.9: Kết quả xác định khả năng đối kháng với vi
khuẩn S. iniae HTA1 của các chủng vi khuẩn lactic
Chủng vi
khuẩn
D1

D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
D13
D14
D15
C1
C2
C3
C4
C5
C6

Khả năng
kháng S.
iniae
+++
++
+
+++
+
++

+
+
+
+
+
++

Chủng vi
khuẩn
C7
C8
C9
C10
C11
C12
C13
C14
C15
C16
C17
C18
C19
C20
C21
C22
C23
C24
C25
C26
C27

Khả năng Chủng vi Khả năng
kháng S.
khuẩn
kháng S.
iniae
iniae
R1
+
R2
++
R3
++
R4
++
R5
+
R6
R7
R8
R9
R10
+
+
R11
R12
+
R13
+
R14

+++
R15
R16
+
+
R17
+
R18
++
R19
+
+
-

Ghi chú: Ký hiệu thể hiện khả năng kháng như sau: (-): không kháng, d<1
mm; (+): kháng yếu, 1≤d≤5 mm; (++): kháng trung bình, 6≤d≤20 mm;
(+++): kháng mạnh, d>20 mm

17


4.2.3 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn lactic có
khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn S. iniae
Kết quả điện di sản phẩm PCR của đoạn gen 16S
rRNA tách chiết từ 03 chủng C21, D1 và D7 ghi nhận
vạch 345 bp, đặc hiệu cho Lactobacillus fermentum. Kết
quả định danh 3 chủng C21, D1 và D7 bằng phương pháp
khuếch đoạn gen đặc hiệu, giải trình tự đoạn gen được
khuếch đại và xây dựng cây phát sinh thể hiện mối quan
hệ di truyền xác định 3 chủng trên là Lactobacillus

fermentum.
4.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic
vào thức ăn đến một số chỉ tiêu huyết học và khả năng
ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm
4.3.1 Kết quả xác định các chỉ tiêu huyết học của cá
chẽm
Các chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng S. iniae
của huyết thanh cá chẽm được đánh giá vào 1, 14, 21 và
28 ngày thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy số
lượng tế bào hồng cầu và tổng bạch cầu của cá ở NT 3
(bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn và không
cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae) và NT 4 (bổ sung vi khuẩn
L. fermentum vào thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S.
iniae) vào ngày thứ 21 cao hơn so với NT 1 (không bổ
sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn và không cảm
nhiễm vi khuẩn S. iniae) và NT 2 (không bổ sung vi
khuẩn L. fermentum vào thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn
S. iniae), (p<0,05). Đến ngày thứ 28, số lượng tổng bạch
cầu ở NT 1 (không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào
thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae) thấp hơn
có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức khác.

18


Hồng cầu (x106 tế bào/mm3)

6

NT 1

NT 2

NT 3

NT 4
c

5
b b

4
3

ac
a

a a

a a
a a

c
a

d
b

b

2

1
0
1

14

21

28

Tổng bạch cầu (x105 tế
bào/mm3)

Thời gian thí nghiệm (ngày)
Hình 4.18: Biến động số lượng hồng cầu trong máu cá chẽm
NT 1

NT 2

NT 3

NT 4

5.00

b b
b b

4.00
3.00

b

a a a

a

a

a

a

a

b b

a

2.00
1.00
0.00
1

14

21

28

Thời gian thí nghiệm (ngày)

Hình 4.19. Biến động số lượng tổng bạch cầu trong máu
cá chẽm
4.3.2 Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết
thanh cá chẽm
Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn S.
iniae của huyết thanh cá chẽm cho thấy khả năng ức chế
vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm ở NT 4 cao
hơn có ý nghĩa thống kê so với NT 1 và NT 2, (p<0,05).
(Bảng 4.10)
19


Bảng 4.10: Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết
thanh cá chẽm
Ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh (%);
(TB±SD)
1 ngày
14 ngày
21 ngày
28 ngày
NT 1
21,3±3,2a 26,7±1,5a
31,0±4,6a 35,0±5,0a
NT 2
24,7±5,0a 30,0±5,6a
43,0±3,0b 46,3±3,5b

a
a
NT 3
26,0±4,0
32,3±8,0
55,0±5,0c 60,7±1,2c
a
a
NT 4
24,7±2,9
34,3±4,7
74,0±2,6d 64,3±2,1c
Các giá trị trong cùng cột có các chữ cái (a, b, c, d) khác nhau
thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Nghiệm thức
thí nghiệm

4.3.3 Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh
Kết quả xác định hoạt tính lysozyme của huyết
thanh cá chẽm cho thấy ở NT 3 (bổ sung vi khuẩn L.
fermentum vào thức ăn, mật độ 109 CFU/g thức ăn và
không cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae) và NT 4 (bổ sung vi
khuẩn L. fermentum vào thức ăn, mật độ 109 CFU/g thức
ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá sau
14 ngày cho ăn với liều tiêm là 1,9x105 CFU/mL/cá) sau
14 ngày bổ sung L. fermentum vào thức ăn, hoạt tính
lysozyme cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê
(p<0,05) so với NT 1 (không bổ sung vi khuẩn L.
fermentum vào thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn S.
iniae vào xoang bụng cá) và NT 2 (không bổ sung vi

khuẩn L. fermentum vào thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn
S. iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày thí nghiệm với
liều tiêm là 1,9x105 CFU/mL/cá). Sau khi cảm nhiễm S.
iniae ở NT 2 (không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào
thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng
cá sau 14 ngày thí nghiệm với liều tiêm là 1,9x105
CFU/mL/cá) và NT 4 (bổ sung vi khuẩn L. fermentum
vào thức ăn, mật độ 109 CFU/g thức ăn và cảm nhiễm vi
khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày cho ăn với
liều tiêm là 1,9x105 CFU/mL/cá) hoạt tính lysozyme ở
NT 4 cao hơn nhưng không khác biệt có ý nghĩa thống kê
so với NT 2 (p>0,05). (Hình 4.28)
20


Hoạt tính lysozyme (U/phút/mg)

1600.0

NT 1

NT 2

NT 3

NT 4

1400.0
bc c

1200.0
1000.0

a a a a

800.0

a

ab

b b
b

b

b
b

a

a

600.0
400.0
200.0
0.0
1

14

21

28

Thời gian thí nghiệm (ngày)

Hình 4.28. Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh cá chẽm

4.3.4 Tỷ lệ sống của cá
Tỷ lệ sống của cá sau 14 ngày cảm nhiễm S. iniae,
ở NT 2 (không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức
ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá sau
14 ngày thí nghiệm với liều tiêm là 1,9x105 CFU/mL/cá)
và NT 4 (bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn,
mật độ 109 CFU/g thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S.
iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày cho ăn với liều tiêm
là 1,9x105 CFU/mL/cá) lần lượt là 23,7% và 52,3% (Hình
4.29). Tỷ lệ bảo hộ khi bổ sung L. fermentum vào thức ăn
cho cá chẽm là 37,5%.

Tỷ lệ sống (%)

NT 1

NT 2

NT 3

NT 4

120.0
100.0
80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
1

2

3

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ngày sau cảm nhiễm S. iniae

Hình 4.29. Tỷ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm S. iniae
21


Hình 4.30. Kết quả cảm nhiễm S. iniae trên cá chẽm
(A-cá khỏe trước khi thí nghiệm; B-cá khỏe sau thí nghiệm; C- cá
bị xuất huyết; D- mắt cá lồi đục, nội quan tích dịch; E- não cá
khỏe; F- não cá bị xuất huyết)

Kết quả cảm nhiễm S. iniae trên cá chẽm cho thấy ở
NT 2 và NT 4, cá bị xuất huyết trên da, mắt lồi đục, xoang
bụng tích dịch và não xuất huyết (Hình 4.30). Trong khi
đó cá ở NT 1 và NT 3 không thể hiện dấu hiệu bệnh lý,

không chết cũng như không phân lập được vi khuẩn S.
iniae.
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1 Kết luận
Vi khuẩn S. iniae là tác nhân chính gây bệnh xuất
huyết trên cá chẽm nuôi tại Thừa Thiên Huế. Kết quả xác
định giá trị LD50 của 2 chủng S. iniae HTA1 và HTA3
trên cá chẽm giống lần lượt là 1,9x105 CFU/mL và
1,5x105 CFU/mL. Kết quả gây bệnh thực nghiệm 2 chủng
HTA1 và HTA3 bằng phương pháp tiêm vào xoang
22