PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Lệ


CLOSTRIDIUM PERFRINGENS


CÁC TRIỆU CHỨNG GÂY NGỘ ĐỘC THỰC
PHẨM CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
  Buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy nước
  Ít có biểu hiện ói mữa hay sốt
 Thời gian khởi phát là 8-24h sau khi tiêu thụ
thực phẩm bị nhiễm một lựợng lớn
Clostridium perfringens.
 Tự hết sau 24h


Nguyên lý

môi trường thạch Tryptose Sulfide Cycloserin
(TSC) trong điều kiện kỵ khí ở 35-370C sau 20h
các tính chất sinh hoá đặc trưng: khử nitrat thành
nitrit, di động, sử dụng lactose, hóa lỏng gelatin


Thiết bị cần dùng
Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp)
Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37  1oC.

Bình nuôi cấy kỵ khí, hoặc có thể sử dụng bình tự tạo nhưng đảm bảo được môi
trường kỵ khí.
pH mét, có thể đọc chính xác đến  0,01 đơn vị pH ở 250C, có thể đo phép đo
chính xác đến 0,1 đơn vị pH.
Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc niken- crôm, đường kính khoảng 3mm, và
các kim cấy sâu.
Ống nghiệm, bình hoặc chai có dung tích thích hợp
Pipet chia độ xả hết có dung tích 1ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng 0,1 và
0,5 ml.
Đĩa petri bằng thuỷ tinh hoặc chất dẻo đường kính 90mm đến 100mm.
Nồi cách thuỷ có thể hoạt động ở 440C – 470 C.
Máy đếm khuẩn lạc
Máy đồng nhất mẫu
Máy lắc Vortex


Môi trường nuôi cấy và thuốc thử
Môi trường thạch sunfit xycloserin (TSC)
Môi trường nitrat để thử tính di động
Môi trường lactose – gelatin
Thuốc thử để phát hiện nitrit
Bụi kẽm


Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù và
các dung dịch pha loãng

Sản phẩm dạng lỏng
Sản phẩm dạng khác

Cấy và ủ mẫu
• Dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml mẫu
thử (sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc 1ml huyền
phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) cho vào
giữa hai đĩa petri trống. Làm tương tự với các
đậm độ pha loãng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy
hai đĩa.


Cấy và ủ mẫu
• Rót vào mỗi đĩa 10ml đến 15ml thạch TSC (đã
đun chảy để nguội ở 450C đến 470C trong nồi
cách thuỷ) trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa
theo hai chiều trái, phải. Để đông tự nhiên, sau
đó phủ trên bề mặt của mỗi đĩa một lớp thạch
phủ (cùng loại thạch TSC) 15 ml, để đông đặc
lại. Ủ ấm trong điều kiện kỵ khí ở 370 C trong
20  2h. Thời gian ủ kéo dài có thể làm các đĩa
bị quá đen.


Đếm và chọn các khuẩn lạc
• Chọn tất cả các đĩa có ≤ 150 khuẩn lạc điển
hình.
• Nếu hai đĩa của cùng một đậm độ có ít hơn
hoặc bằng 150 khuẩn lạc điển hình, đếm tổng
số khuẩn lạc trên cả hai đĩa và lấy giá trị trung
bình.
• Nếu bốn đĩa của hai đậm độ liên tiếp có từ 15150 khuẩn lạc điển hình, tính giá trị trung bình

của hai đậm độ.


Đếm và chọn các khuẩn lạc
• Nếu đĩa cấy bị đen hoặc không thể đếm được
các khuẩn lạc riêng rẽ thì đếm các đĩa của độ
pha loãng cao hơn kế tiếp.
• Đếm số khuẩn lạc điển hình của Cl.
perfringens: khuẩn lạc đen, có kích thước 0,5
mm trở lên trên mỗi đĩa và chọn ra 5 khuẩn lạc
để thử khẳng định sinh hoá


Khẳng định sinh hoá


Tính di động


Khả năng khử nitrat thành nitrit
Các chủng cho phản ứng
yếu đối với nitrit (tức là
có màu hồng) phải được
loại

bỏ,

vì

Cl.

perfringens luôn luôn có
phản ứng mạnh và phản
ứng tức thì.


Sử dụng lactose


Hóa lỏng gelatin


Tính kết quả
Tính số lượng a vi khuẩn Cl. perfringens có
mặt trên mỗi đĩa, sử dụng công thức:
a = (b/A) x C
Trong đó:
b: Số khuẩn lạc xác định đúng là vi
khuẩn Cl. perfringens
A: Số khuẩn lạc chọn để thử khẳng định
C: Tổng số khuẩn lạc điển hình đếm
được trên đĩa


Sơ đồ định lượng Cl. perfringens


Bước 2: Pha loãng và cấy mẫu
Bước 3: Ủ ấm. Úp ngược đĩa thạch để
trong bình kỵ khí. Để 370C/20 - 24 giờ

Bước 4: Chọn đĩa thạch: chọn đĩa < 150
khuẩn lạc điển hình để đếm.
Bước 5: Xác định tính chất sinh vật hóa
học:
Lactose (+); Di động (-), gelatinase (+),
Nitrat (+)


Tỉ lệ nhiễm Clostridium
Perfringens trong hội
chứng tiêu chảy của lợn
nuôi tại Hà Nội và vùng
phụ cận


Hết