cau hoi on tap thuc hanh sinh hoc phan tu 123doc

Thiên Kiều

Trang 1/6

ÔN TẬP SINH HOC PHÂN TỬ
I. CÁCH SỬ DỤNG PIPET, MÁY LY TÂM, PHA LOÃNG HÓA CHẤT
1. Công thức pha loãng hóa chất:
Vdd mẹ cần lấy = (Nồng độ dd pha/Nồng độ dd mẹ) x V
muốn pha
Ví dụ: Pha 200 (µl) dd TAE 1X từ dd TAE 10X
- Tính V dd TAE10X cần lấy = (1/10) x 200 = 20 (µl) + 180(µl) H2O
- Dùng micropipet 10 - 200 µl (lưu ý tùy theo thể tích đề bài yêu cầu chọn loại micopipet
thích hợp)
- Chỉnh đến V 20 µl để hút dung dịch TAE 10X (nhấn 1 nấc, xả 2 nấc), cho vào eppendorf
- Sau đó, thay đầu tip khác và chỉnh về V 180 µl để hút H2O cho vào eppendorf đã chứa dd
TAE10X
- Trộn đều ( bằng cách đảo trộn bằng tay, hoặc bằng micopipet, hoặc bằng máy trộn vontex)
2. Sử dụng máy ly tâm
- Chọn từng cặp eppendorf giống nhau về hình dáng và thể tích
- Kiểm tra dung dịch chứa bên trong có đồng lượng không ( V bằng nhau) theo từng cặp đã
chọn ở trên. Cặp nào không đồng lượng thì loại ra.
- Đặt từng cặp đối xứng vào máy, quai hướng ra ngoài
3. Một số câu hỏi phụ và lưu ý cần nhớ:
 Có 3 loại micopipet : 0.5 - 10(µl), 20 -100 (µl), 100 – 1000 (µl)
 Có 2 loại eppendorf : V = 1.5 ml ( đầu nhọn), V = 2ml ( đầu bằng)
 Sử dụng micopipet:
- Hút 1 lần 1 V nhất định : nhấn 1 nấc, xả 2 nấc
- Hút nhiều lần cùng 1 V : nhấn 2 nấc, xả 1 nấc, đến lần cuối cùng sau khi nhả 1 nấc
vào eppendorf, phần còn lại sẽ xả bỏ ra ngoài
 Tại sao quai hướng ra ngoài : vì khi ly tâm ở tốc độ cao, cặn sẽ lắng xuống ở đáy
ống phía đối diện với trục ( phía dưới quai). Như vậy ta biết được vị trí của cắn nên

khi thao tác sẽ tránh không làm ảnh hưởng đến cắn.
 Tại sao phải đặt cân bằng và đối xứng: do ly tâm tròn đều và hướng tâm, nếu để ko
cân bằng hoặc ko đối xứng, lực tác dụng bị lệch có thể dẫn đến gãy ổ bi, gãy ổ trục
của máy


Thiên Kiều

Trang 2/6


Thiên Kiều

Trang 3/6

II. CHIẾT TÁCH AND
Plasmid
Má người

- Qui trình chiết tách
Ngoài ba bước cơ bản có
thêm bước thu sinh khối

- Qui trình chiết tách
Ba bước: phá màng TB,
biến tính protein, tủa
ADN

- Các dd sử dụng:
1. Phá màng: SDS kiềm

- Các dd sử dụng:

2. Biến tính protein: SDS
kiềm

1. Phá màng: SDS
2. Biến tính protein:
chloroform hoặc phenol
pH8, hoặc cả hai

3. Tủa ADN: ethanol 960
0

3. Tủa ADN: ethanol 96

4. Rửa tủa : cồn 700

- Qui trình chiết tách
Ngoài ba bước cơ bản
thêm bước dùng nitơ lỏng
(-1960C) để làm giòn vách
cellulose
- Các dd sử dụng:
1. Phá màng: SDS hoặc
CTAB
2. Biến tính protein:
chloroform hoặc phenol
pH8, hoặc isoamyl alcol
(pp mitsui)

3. Tủa ADN: isopropanol
4. Rửa tủa : cồn 700

4. Rửa tủa : cồn 700
Thực vật
 Một số lưu ý cần nhớ:
1. Tại sao trong chiết tách ADN plasmid sử dụng SDS kiềm mà không phải là SDS :
vì mục đích muốn loại bỏ bộ gen NST của VK, trong môi trường kiềm (pH = 12)
ADN NST biến tính ko hồi phục, còn ADN plasmid biến tính có hồi phục do đó ta loại
được ADN NST.
2. Biến tính ADN NST là như thế nào: là ADN NST bị tách đôi sợi ra.
3. Tại sao người ta hay sử dụng pp CTAB trong chiết tách ADN thực vật: trong TB
thực vật có rất nhiều polysarcharid, CTAB có khả năng liên kết thuận nghịch với ADN
( CTAB – ADN) và CTAB – polysarcharid, do đó có thể loại được polysarcharid ngay
bước đầu tiên.
4. Vai trò các hóa chất:
Dung dịch phá màng trong chiết tách AND má người gồm: tris-HCl 50mM pH8,
EDTA 450mM, SDS1%, NaCl 10mM
- Tris : ổn định PH
- EDTA: ức chế hoạt động các enzyne thủy phân ADN
- SDS 1% Tác nhân chính phá vỡ màng TB
- NaCl 10mM gây xáo trộn áp suất thẩm thấu
- Chloroform:biến tính protein
- Ethanol 96% (100%) lạnh làm tủa ADN


Thiên Kiều

Trang 4/6

- Ethanol 70% rửa muối , làm sạch ADN để thu được ADN tinh khiết
- Bảo quản ADN trong nước hay trong TE ( Tris 0.1M – EDTA 0.001M) để lâu hơn, To 200c bảo quản trên 6 tháng , 40C bảo quản vài tuần
DD hòa mẩu GTE (glucose- Tris- EDTA)để phân tán vi khuẩn
Phải luôn giử lạnh vì để ức chế hoạt động của các men nội bào
RNAse 10mg/ml -> phân hủy ARN
III. PP ĐO QUANG
1. Nguyên tắc pp đo quang:
Dùng tia sáng tử ngoại chiếu qua mẫu thử, nếu là phân tử hấp thụ ánh sáng sẽ hấp thụ ánh
sáng ở các bước sóng thích hợp và cho mật độ quang. Dựa vào mật độ quang ta đánh giá
được độ tinh sạch của mẫu.
- OD ADN = 260nm, OD protein = 280nm, OD thực vật = 230nm
2. Mục đích của pp đo quang :
- Xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh kiết của phân tử ADN trong dd
- PP đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại của dd ADN ở bức sóng
260nm.
- Độ hấp thụ tỷ lệ với nồng độ ADN biểu thị thông qua mật độ quang OD ( oftic density)
+ OD260nm= 50μg/ml cho 1 dd ADN mạch kép
+ OD260nm= 40μg/ml cho 1 dd ADN mạch đơn
Chú ý : Cần phải làm sạch ARN vì ARN cũng có độ hấp thụ as tử ngoại ở bức sóng OD260nm
nên làm sai lệch mật độ quang
3.Công thức :
Nồng độ ADN (μg/ml)= 50 ×OD260nm
×n
OD260nm độ hấp thụ của dd ADN ở bước sóng 260nm
50: hệ số chuyển đổi của dd nồng độ ADN sợi đôi (sợi đơn ×40)
n: hệ số pha loãng
4. Đánh giá độ tinh sạch :
- Đo dd ở bức sóng 260nm là mức hấp thụ cực đại của ADN
- Đo dd ở bức sóng 280nm là mức hấp thụ cực đại của protein
- Lập tỷ số: OD260/OD280 :

Thiên Kiều

Trang 5/6

+ Nếu kết quả = 1,8 – 2,0 : dịch chiết ADN tinh sạch
+ Nếu kết quả > 2

: ADN bị biến tính hoặc phân hủy , còn lẫn ARN

+ Kết quả < 1,8

: dd ADN còn lẫn tạp chất

Lưu ý : ADN thực vật thì đo thêm OD230nm
Tính độ tinh sạch AND thực vật: OD260nm/ OD230nm để loại polysacaric
5. Các bước cần tiến hành khi đến trạm đo quang
 Yêu cầu: Đặt một mẫu thử vào máy đo quang
- Chọn 1 mẫu thử đúng ( V mẫu thử phải đủ 2ml)
- Cầm rửa cốc đo, lau cốc ( chỉ lau bên ngoài)
- Đổ mẫu thử vào cốc đo
- Đặt cốc đo vào máy ( lưu ý để mặt trong của cốc theo chiều ánh sáng đi qua)
- Chỉnh bước sóng phù hợp với yêu cầu đề bài
IV. ĐIỆN DI
1. Nguyên tắc:
Là sự dịch chuyển của các phân tử tích điện về hướng các điện cực trái dấu với nó trong dd
dưới tác dụng
của điện trường .
Lưu ý: ADN mang điện tích âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương

2. Ứng dụng pp điện di:
Định tính và thu nhận mẫu ADN hiển thị trực tiếp:
- Sản phẩm ADN nguyên vẹn
- Sản phẩm ADN bị cắt giới hạn
- Sản phẩm ADN khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR
3. Thành phần bộ điện di:
- Bồn, dd đệm, có dòng điện đi qua
- 2 điện cực ( -), (+)
- Giếng chứa ADN làm từ thạch ( bản nền để ADN di chuyển)
4. Chú ý khi đặt thạch:
- Giếng quay về cực âm
- Đè miếng thạch ngập nước
5. Tốc độ di chuyển của ADN phụ thuộc vào:
- Kích thước, cấu trúc ko gian của phân tử ADN


Thiên Kiều

Trang 6/6

- Nồng độ của chất cấu thành gel (nồng độ thạch cao: di chuyển các phân tử nhỏ, nồng
độ thạch thấp: di chuyển của các phân tử lớn)
6. Tại sao dùng bản thạch làm nền để các ADN di chuyển : vì cấu trúc của thạch là
polyme, tạo ra những khe (mắc lưới) cho phân tử đi qua.