Luận văn : ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ part 3 pps

32













Ở hai mẫu một và hai là sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan
với nồng độ 30ng. Trong khi hai mẫu còn lại là kết quả thu được khi chạy PCR hai
mẫu trên với nồng độ 10ng.
Chúng tôi tạm thời không thể giải thích rõ ràng kết quả trên tuy nhiên nó cho ta
thấy nồng độ DNA mẫu cũng quyết định kết quả PCR Ở nồng độ 30ng mẫu chỉ cho
ra sản phẩm là một band DNA duy nhất chứng tỏ mẫu DNA ly trích là mẫu tinh sạch
không tạp nhiểm với DNA của bất kì một loài nào khác.
Sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan ở nồng độ 10ng cho hai
band rõ ràng, độ sáng như nhau. Kích thước hai band này chênh lệch nhau khoảng
100bp.
Chúng tôi có thể giải thích kết quả trên như sau: thứ nhất nguyên nhân này có
thể là do hai mẫu nấm này đã bị tạp nhiễm trong quá trình pha loãng ở nồng độ 10 ng
cho nên sản phẩm PCR ở nồng độ 10 ng cho ra hai band khác; thứ hai do quá trình pha
loãng không đáng tin cậy. Sản phẩm pha loãng ở 10 ng có nồng độ cao hơn sản phẩm
pha loãng ở 30 ng và kích thước đoạn trình tự này có vùng lập lại cho nên trong điều

kiện nhất định cặp mồi ITS4 – ITS5 có thể bắt cặp ở nhiều vị trí khác nhau và cho ra
sản phẩm PCR có đến hai hay ba band khác nhau trên cùng một vùng trình tự, các
band này có độ sáng như nhau.
900bp
Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai
(1) và (3) PCR mẫu DL1 ở nồng độ 30ng và 10ng
(2) và (4) PCR mẫu DL2 ở nồng độ 30ng và 10ng



33
Như vậy, kết quả chạy PCR ở trên không thể định danh được hai mẫu
Phytophthora. Để định danh được hai mẫu nấm trên, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch
sản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự chúng một cách chính xác hơn.
4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR dùng để giải trình tự cũng nhằm mục đích như tinh
sạch mẫu DNA dùng cho phản ứng PCR. Cả hai nguyên tắc tinh sạch này là như nhau
nhưng với qui trình tinh sạch để giải trình tự đòi hỏi phải được thực hiện nghiêm ngặt
hơn. Bởi vì qui trình này phải đảm bảo độ tinh sạch của sản phẩm PCR là tối ưu nhất
đủ để thực hiện phương pháp giải trình tự bằng máy giải trình tự trực tiếp.
Qui trình tinh sạch được chúng tôi đề nghị thực hiện theo hai phương pháp khác nhau:
- Phƣơng pháp tinh sạch bằng thao tác tay: phương pháp này thực
hiện khá đơn giản, ta có thể sử dụng các hoá chất dùng cho tinh sạch mẫu DNA ly
trích để tinh sạch phẩm PCR với mục đích đọc trình tự. Vấn đề đòi hỏi của phương
pháp này là thao tác thực hiện phải chính xác.
Do thao tác thực hiện trong quá trình tinh sạch còn kém nên. Chúng tôi
đã không thu được sản phẩm tinh sạch từ phương pháp này. Nguyên nhân chính có
thể là do công đoạn tủa DNA và rửa DNA bằng ethanol không đạt hiệu quả làm mất đi
sản phẩm khuếch đại.
- Phƣơng pháp tinh sạch bằng cột GFX: Đây là phương pháp tinh sạch

bằng kit; thao tác thực hiện đơn giản, nhanh và cho sản phẩm tinh sạch với nồng độ
cao.
DNA của hai mẫu nấm Phytophthora trên địa lan trước khi được tinh
sạch bằng cột phải được chạy điện di và thông qua công đoạn cắt gel để đảm bảo độ
tinh sạch cho sản phẩm. Tuy nhiên, ta cũng nên lưu ý một số điểm sau: công đoạn cắt
gel đòi hỏi phải chính xác cắt dúng vị trí band DNA trên gel; công đoạn dùng hoá chất
phải nhỏ chính xác giữa cột ,








34












4.5 Xử lý kết quả giải trình tự
Đoạn gen khuếch đại được giải trình tự bằng máy đọc trình tự ABI PRISM

3100. Chúng tôi đã thu được trình tự hai mẫu nấm này trên hai chiều ( xuôi và ngược)
phản ứng của kỹ thuật giải trình tự. Độ dài mỗi đoạn trình tự trên hai chiều xuôi và
ngược của phản ứng khoảng 840- 850 bp. Để đơn giản cho quá trình so sánh trình tự
với các loài nấm khác, chúng tôi chỉ chọn trình tự hai mẫu DL1, DL2 trên mồi ITS5.
4.5.1. Trình tự mẫu DL1
TTANGAAGAGGNAGGACATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCC
CTTTAGTTGGGGGTCTTGCTTGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCG
TGCTGGGCGAGCCCTATCATGGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGT
TTTAAACCCATTCTTTAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTA
GATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACT
GCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGC
ACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTT
CTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTT
CGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGC
GTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTA
CGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCT
TATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTT
GGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTC
GATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAG
GCAAGATTAC
4.5.2. Trình tự mẫu DL2
GACTGCGGAAGACATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTT
AGTTGGGGGTCTTGCTTGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCT
GGGCGAGCCCTATCATGGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTA
Hình 4.6. Mẫu tinh sạch dùng cho phản ứng giải trình tự
(1) Sản phẩm PCR của DL1; (2) Sản phẩm PCR của DL2
900bp


35

AACCCATTCTTTAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATA
GCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGA
TACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTT
CCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTC
CTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGG
TCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGG
TATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGC
GTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATT
GGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTTGGTC
TTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATC
CATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAGGCAA
GATTACCCGC
Kết quả giải trình tự (ngược và xuôi) hai mẫu nấm này được xử lý độ chính xác
bằng phầm mềm CLUSTALX.
So sánh độ tương đồng các mẫu giải trình tự với các nguồn nấm đã công bố
trên ngân hàng gen của NCBI (Mỹ) bằng phần mềm BLAST.
Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen đƣợc dùng để so sánh

Tên dòng nấm
Accession Number
linear
Tác giả
1
P.multivesiculata
AF266790
24-
FEB-
2005

Cooke,D.E., Drenth,A.,

Duncan,J.M., Wagels,G.
Brasier,C.M
2
P.multivesiculata
CBS545.96
DQ335639
16-
JAN-
2006

Belbahri,L., Calmin,G.
Lefort,F.
3
P.syringae
L41386
01-JUL-
2005
Crawford,A.R., Bassam,B.J.,
Drenth,A., Maclean,D.J.
Irwin,J.A.G.

4
P.citricola
AY995355
25-
APR-
2005
Catal,M., Fulbright,D.W.,
Stadt,S. Jacobs,J.
Thực hiện thí nghiệm so sánh trình tự của hai mẫu nấm trên địa lan với một số

loài trong bảng 4.2 bằng phần mềm ClustalX.


36
Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2
Dl1 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT
P.multivesiculata CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT
P.multiCBS545.96 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT
Dl2 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT
P.syringae CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT
P.citricola CCACACCTTAAAAAACTTTTCACGTGAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTCTTGCT
******** ********** ******************** *******************

Dl1 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT
P.multivesiculata TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT
P.multiCBS545.96 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT
Dl2 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT
P.syringae TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT
P.citricola T TTTT GCGAGCCCTATCAT
* *** **************

Dl1 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT
P.multivesiculata GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT
P.multiCBS545.96 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT
Dl2 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT
P.syringae GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT
P.citricola GGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTTAAACCCATTCTACAAT
***** ******** ******** ************* **************** ***

Dl1 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT

P.multivesiculata ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT
P.multiCBS545.96 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT
Dl2 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT
P.syringae ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT
P.citricola ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT
************************************************************

Dl1 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT
P.multivesiculata GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT
P.multiCBS545.96 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT
Dl2 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT
P.syringae GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT
P.citricola GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT
************************************************************

Dl1 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG
P.multivesiculata GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG
P.multiCBS545.96 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG
Dl2 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG
P.syringae GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTGGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG
P.citricola GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG
*************************** ********************************

Dl1 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG
P.multivesiculata GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG
P.multiCBS545.96 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG
Dl2 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG
P.syringae GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG
P.citricola GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG
************************************************************

Dl1 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT
P.multivesiculata TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT
P.multiCBS545.96 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT
Dl2 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT
P.syringae TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT
P.citricola TGGAGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGGTGTCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT
******* * ********************* ** ***********************

Dl1 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG
P.multivesiculata TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG


37
P.multiCBS545.96 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG
Dl2 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG
P.syringae TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG
P.citricola TTGAAATGTACTGAACTGTACT-TCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGGTTGTGG
********************** *********************** *** *********

Dl1 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT
P.multivesiculata AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT
P.multiCBS545.96 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT
Dl2 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT
P.syringae AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT
P.citricola AGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTTAATGGAGGAGT
** ******* ***************************** *******************

Dl1 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC

P.multivesiculata GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC
P.multiCBS545.96 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC
Dl2 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC
P.syringae GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTCC
P.citricola GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGCTTATTGTATGCTTTTCCTGC
************************************ ********* * * ******* *

Dl1 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT
P.multivesiculata TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT
P.multiCBS545.96 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTNTGGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT
Dl2 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT
P.syringae TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTACCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT
P.citricola TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTGT-GGCTTGGCTTTTGAATCGGCTTT
*************************** ****** ******* **************

Dl1 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT
P.multivesiculata GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT
P.multiCBS545.96 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT
Dl2 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT
P.syringae GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGCCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT
P.citricola GCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGG-TCGATCCATTT-GGGAACTT
***************** ********** ********** *********** ***** **

Dl1 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT
P.multivesiculata TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAA
P.multiCBS545.96 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAA
Dl2 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT
P.syringae TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT
P.citricola TGTGTGCACCTCGGTGCGCATCTCAATT
****** ** ****************

Dựa trên kết quả so sánh ở bảng 4.2 ta thấy hai mẫu địa lan có cấu trúc trình tự
rất giống nhau và khá tương đồng với trình tự của ba dòng nấm là P.multivesiculata,
P.multivesiculata CBS545.96 và P.syringae
Chúng tôi tiến hành so sánh cây phát sinh loài của hai mẫu nấm trên địa lan với
ba dòng nấm trên bằng phần mềm Treeview








38
Hình 4.7. Cây phát sinh loài của hai mẫu địa lan













Theo hình 4.7 hai mẫu nấm này có thể có chung một nguồn gốc thuộc loài

P.multivesiculata ( dòng CBS545.96).
Chúng tôi đã thực hiện thêm một số so sánh nhằm xác định các tiểu phần gen
trong vùng (ITS1-5,8S-ITS2) dựa trên trình tự tương đồng vùng ITS của dòng nấm
P.multivesiculata chủng CBS545.96.
Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2

P.multi
CBS545.96
Độ tương đồng
Số lượng Nucleotide
DL1
DL2
DL1
DL2
ITS1
5,8S
ITS2
100%
100%
99,99%
100%
100%
99,99%
225
160
420
225
160
420

Tỉ lệ tương đồng trên vùng ITS1 của mẫu là 100%; trên vùng ITS2 là 99,5%;
trên vùng 5,8S là 100%.
Dựa trên trình tự ITS1, trình tự ITS2 và trình tự vùng 5.8S chúng tôi đã thu
được bảng kết quả sau



39
Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan
#18S
NAAGCTGGAGAGAGACTTCCCC

#ITS1
CCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCTT
GGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCATG
GCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTAAACCCATTCTTTAATAC
TGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAG

#5_8S
AACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATA
CGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCC
GGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTA

#ITS2
GTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAA
GTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACT
CTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCG
GCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTG
GCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTG
AACCGTAGCTGTGTTNTGGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGG

CGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCA
TCTCAA

#28S
ATATCAGGCAAGATTA

Theo kết quả ở bảng 4.4, chúng tôi đi đến một số điều cần thảo luận như:
- Kết quả BLAST đoạn trình tự trên ngân hàng gen cho thấy sản phẩm hai mẫu nấm
trên thuộc giống Phytophthora ( phù hợp với kết quả định danh bằng quan sát hình
thái của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy).
- Vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm này có 850 nucleotide. Điều này cũng khá
phù hợp khi kết quả PCR của hai mẫu nấm này cho ra sản phẩm khoảng 800 bp.
- Kết quả so sánh bằng phần mềm ClustalX trên toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 và vẽ
cây phát sinh loài bằng phần mềm Treeview cho thấy hai mẫu nấm trên có quan hệ rất
gần với loài P. multivesiculata, đặc biệt là dòng P. multivesiculata CBS545.96.
- Để khẳng định lại kết quả trên chúng tôi đã tiến hành so sánh các trình tự ngay trên
từng tiểu phần nhỏ như ITS1; ITS2; 5,8S. Tỉ lệ tương đồng của phép so sánh này đạt
gần 100%. Chúng tôi kết luận hai mẫu trên cùng thuộc loài P. multivesiculata dòng
CBS545.96.
- Đối chiếu với bảng danh mục các loài Phytophthora có mặt tại Việt Nam ( A. Drenth
và I. Guest, 2004) chứng minh rằng đây là một loài mới xuất hiện tại Việt Nam kể từ
năm 2004.



40
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Kết quả giải trình tự cho ta một số kết luận như:
- Ứng dụng của kỹ thuật PCR chúng tôi phát hiện hai mẫu nấm trên tiêu Bà Rịa và sầu

riêng Đồng Nai đều thuộc giống Phytophthora nhưng chưa xác định rõ hai mẫu nấm
trên địa lan.
- Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan có cấu trúc trình tự gần giống nhau.
Trình tự của hai mẫu nấm này sau khi so sánh trên ngân hàng gen cho kết quả rất gần
với ba dòng nấm bao gồm P.multivesiculata, P. multivesiculata CBS545.96 và P.
syringae. Kết quả thu được trên cây phát sinh loài cho thấy hai mẫu nấm này có trình
tự tương đồng với dòng P. multivesiculata CBS545.96.
- So với bảng danh mục các loài Phytophthora xuất hiện tại Việt Nam do A. Drenth và
I. Guest điều tra năm 2004 cho thấy loài nấm này không có mặt trong bảng danh mục
các loài nấm Phytophthora gây bệnh ở Việt Nam.
5.2. Đề nghị
- Giải trình tự trực tiếp hai nấm Phytophthora trên tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai.
- Tăng số lượng các mẫu phân tích nhằm phát hiện mức độ đa dạng của các loài nấm
trên cùng một đối tượng.
- Áp dụng qui trình định danh trên cho những nghiên cứu về các loài nấm trên các loại
lan ở Lâm Đồng.


41
Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Trịnh Thị Phương Vy, 2005. Định danh nấm Phytopthora spp. bằng kỹ thuật
PCR ( Polymerase Chain Reaction) kết hợp mô tả hình thái học.
2. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử, giới thiệu phương
pháp và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
3. André Drenth và David I. Guest, 2004. Diversity and Management of
Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International
Agricultural Research Canberra.

4. James C. Correll . Genetic, Biochemical, và Molecular Techniques for the
Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi.
5. Alex A. Appiad, Isaac Y. Opoku và Andrews Y. Akrofi, 2004. Natural
occurrence and distribution of stem cankers caused by Phytophthora palmivora
on cocoa.
6. S.E. Zitko và L.W. Timmer,1994. Competitive Parasitc Abilities of
Phytophthora parasitica and P. palmivora on Fibrous Roots of Citrus.
7. D. Cooke, N. Williams và J. M. Duncan, The uses of ITS regions in
Phytophthora species.
8. C. Silvar, J. M. Duncan, D.E.L. Cooke, N.A. Williams, J. Diaz và F. Merino,
2004. Development of specific PCR primers for identification and detection of
Phytophthora capsici Leon.
9. T. Wangsomboondee và J.B. Ristaino, 2002. Optimization of Sample Size and
DNA Extraction Methods to Improve PCR Detection of Different Propagules of
Phytophthora infestans.
10. A. Drenth và J.A.G. Irwin, 2001. Routine DNA based Diagnostic Test for
Phytophthora.
11. F. Yamak, T.L. Peever, G.G. Grove, và R.J. Boal, 2002. Occurrence and
Identification of Phtophthora spp. Pathogenic to Pear Fruit in Irrigation Water
in the Wenatchee River Valley of Washington State.


42
12. Frank N. Martin và Paul W. Tooley, 2004. Identification of Phtophthora to
Species Level Using Restriction Fragment Length Polymophism Analysis of a
Polymerase chain Reaction-Amplified Region of Mitochondrial DNA.
13. P. Chowdappa, D. Brayford, J. Smith và J. Flood, 2003. Molecular
discrimination of Phytophthora isolates on cocoa and their relationship with
coconut, black pepper and bell pepper isolates based on rDNA repeat and AFLP
fingerprints, CURRENT SCIENCE, VOL. 84, NO. 9.

14. C.M. Brasier, D.E.L Cooke và J.M. Duncan, 1999. Origin of a new
Phytophthora pathogen through interspecific hydridization.




43



44


45


46



47



48



49

50



51



52