Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng biocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
======

NGUYỄN THỊ THÀNH MƠ

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
TẠO MÀNG BIOCELLULOSE ỨNG DỤNG TRONG
BẢO QUẢN THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội, 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
======

NGUYỄN THỊ THÀNH MƠ

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
TẠO MÀNG BIOCELLULOSE ỨNG DỤNG TRONG
BẢO QUẢN THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2019


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, em đã
được các thầy cô giáo giảng dạy nhiệt tình tận tâm, truyền đạt cho em những
kiến thức bổ ích để làm hành trang cho sự phát triển của bản thân sau này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Đinh Thị
Kim Nhung đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình giúp em trong suốt quá trình học tập
và thực hiện đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực
Vật – Vi Sinh, khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ em thực hiện đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thư viện,
phòng thí nghiệm Vi Sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện
thuận lợi để em thực hiện và hoàn thành đề tài này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người
luôn quan tâm, động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu đề tài này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thành Mơ


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, tất cả
các số liệu đều được thu thâp từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, hoàn toàn
không có số liệu sao chép. Đề tài này nghiên cứu không trùng với công trình
nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác làm
dẫn chứng, tôi xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận
của mình.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ.
Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thành Mơ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 1
3. Nội dung chính của đề tài, các vấn đề cần giải quyết.................................. 1
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................... 1
5. Tính mới của đề tài..................................................................................... 2
NỘI DUNG.................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter trong
sinh giới ......................................................................................................... 3
1.2. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa của Gluconacetobacter ................................. 4
1.3. Biocellulose ............................................................................................. 5
1.3.1. Cấu trúc ................................................................................................ 5
1.3.2. Một số tính chất.................................................................................... 5
1.3.3. Cơ chế tổng hợp ................................................................................... 6

1.3.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter ..............
7
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay ................ 7
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới......................................................... 7
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam....................................................... 8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ........................ 10
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 10
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian ............................................ 10
2.3. Thiết bị và hóa chất ............................................................................... 10
2.3.1. Thiết bị ............................................................................................... 10
2.3.2. Hóa chất ............................................................................................. 10


2.3.3. Môi trường ......................................................................................... 11
2.3.3.1. Môi trường giữ giống....................................................................... 11
2.3.3.2. Môi trường nhân giống .................................................................... 11
2.3.3.3. Môi trường lên men ......................................................................... 11
2.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 11
2.4.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................... 11
2.4.1.1. Phân lập chủng Gluconacetobacter theo phương pháp truyền
thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck) .......................................... 11
2.4.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế
bào trên tiêu bản nhuộm kép......................................................................... 12
2.4.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch
nghiêng ........................................................................................................ 13
2.4.1.4. Phương pháp tuyển chọn giống vi khuẩn Gluconacetobacter cho
màng mỏng................................................................................................... 13
2.4.1.5. Phương pháp hoạt hoá giống............................................................ 13
2.4.2. Phương pháp hóa sinh......................................................................... 14
2.4.2.1. Xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ ............................. 14

2.4.2.2. Phát hiện hoạt tính catalase.............................................................. 14
2.4.2.3. Phát hiện khả năng oxi hóa acid acetic............................................. 14
2.4.2.4. Phát hiện khả năng oxi hóa rượu etylic thành acid acetic ................. 15
2.4.2.5. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose ............................................. 15
2.4.3. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng Biocellulose ......... 15
2.4.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả .............................................. 15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................... 17
3.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo màng
Biocellulose.................................................................................................. 17


3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo màng
Biocellulose.................................................................................................. 17
3.1.2. Tuyển chọn chủng Gluconacetobacter xylinus T3 có khả năng lên
men tạo màng Biocellulose........................................................................... 18
3.2. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng Gluconacetobacter
xylinus T3 .....................................................................................................
25
3.3. Ứng dụng lên men tạo sản phẩm............................................................ 28
3.4. Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm..................................................... 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 33
1. Kết luận.................................................................................................... 33
2. Kiến nghị.................................................................................................. 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 1
PHỤ LỤC ...................................................................................................... 3


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sợi cellulose của màng Biocellulose ............................................... 5
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter ............... 7

Hình 3.3. Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập trên môi trường thạch đĩa ................ 17
Hình 3.4. Vi khuẩn của mẫu T1 phân lập trên môi trường thạch nghiêng ..... 18
Hình 3.5. Vi khuẩn của mẫu Y1 phân lập trên môi trường thạch nghiêng..... 18
Hình 3.6. Vòng phân giải CaCO3 ................................................................. 20
Hình 3.7. Đặc điểm màng của 4 chủng Biocellulose..................................... 21
Hình 3.8. Hình thái tế bào học của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter T3.......
23
Hình 3.9. Hình thái tế bào học của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Y2 ......
23
Hình 3.10. Cấy vi khuẩn vào bình nuôi lắc ................................................... 24
Hình 3.11. Nuôi lắc chủng vi khuẩn phân lập được ...................................... 24
Hình 3.12. Màng Biocellulose sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter ......... 24
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn động thái phát triển của chủng vi khuẩn T3 .... 26
Hình 3.14. Màng Biocellulose sau 5 ngày lên men ....................................... 29
Hình 3.15. Hình ảnh bảo quản thịt trong 3 điều kiện khác nhau.................... 31
Hình 3.16. Thịt để ngoài môi trường không bảo quản hỏng sau 2 ngày ........ 32
Hình 3.17. Thịt bọc trong túi nilong hỏng sau 2 ngày................................... 32


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
theo Frateur năm 1950 .................................................................... 4
Bảng 3.2. Đặc điểm của các chủng phân lập được ........................................ 17
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thành màng Biocellulose của 4 chủng
Gluconacetobacter ....................................................................... 20
Bảng 3.4. Hàm lượng acid acetic hình thành của 4 chủng
Gluconacetobacter ....................................................................... 21
Bảng 3.5. Hoạt lực lên men của các chúng vi khuẩn..................................... 23
Bảng 3.6. Khả năng kết lắng của 2 chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
xylinus T3 và Y2........................................................................... 24

Bảng 3.7. Quá trình sinh trưởng của chủng vi khuẩn T3............................... 26
Bảng 3.8. So sánh bảo quản một số loại thực phẩm bằng màng
Biocellulose, túi nilong và không bảo quản................................... 30


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Màng Biocellulose được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn, có bản chất
là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn. Màng này vừa có cấu trúc
và đặc tính cơ học rất giống với cellulose của thực vật, nhưng lại có một số
tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao,
đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn.
Màng Biocellulose có nhiều ứng dụng đa dạng trong các lĩnh vực khác
nhau như y học, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường, công nghiệp đặc biệt là trong
lĩnh vực thực phẩm. Theo xu hướng của thời đại, xã hội ngày càng phát triển
thì việc chú trọng đến sức khỏe là điều thiết yếu. Xuất phát từ lí do trên,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn chủng vi sinh vật có
khả năng tạo màng Biocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”.
2. Mục tiêu của đề tài
Tuyển chọn được 1 đến 2 chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng
Biocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.
3. Nội dung chính của đề tài, các vấn đề cần giải quyết
3.1. Phân lập, tuyển h n hủng vi sinh vật ó khả năng tạo màng
Biocellulose
3.2. Nghiên ứu động thái phát triển của chủng tuyển h n
3.3. Xá định quá trình lên men tạo sản phẩm và ứng dụng bảo quản thực
phẩm
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa h : Nghiên cứu đặc tính và quá trình lên men tạo màng
của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu

góp phần bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của màng
Biocellulose trong đời sống.
4.2. Ý nghĩa thự tiễn: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
xylinus T3 có khả năng tạo màng Biocellulose mỏng, dai, nhẵn ứng dụng

1


trong bảo quản thực phẩm, giúp giữ thực phẩm tươi ngon, lâu bị hỏng
bởi vi sinh vật gây hại ở điều kiện thường.
5. Tính mới của đề tài
Dựa vào hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc và đặc tính sinh học
của 12 chủng vi khuẩn phân lập được thì qua quá trình sơ tuyển lần 1 chúng
tôi đã sơ tuyển được 2 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gluconacetobacter
xylinus; tuyển chọn lần 2 thu được 1 chủng vi khuẩn là Gluconacetobacter
xylinus T3 có khả năng lên men tạo màng Biocellulose mỏng, dai, nhẵn, có
thể ứng dụng trong bảo quản thực phẩm giúp giữ thực phẩm lâu hơn so với
bảo quản bằng túi nilong mà vẫn giữ được độ tươi ngon và độ cứng của sản
phẩm.


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter trong
sinh giới
Trên thế giới đã có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic như
Rothenback 1898, Beijerinck 1989, Hoyer 1899, Heneberg 1926, Frateur
1950,... Thuật ngữ “Gluconacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân
loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận
thấy thành phần ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi khuẩn

acetic khác nhau.
Gluconacetobacter thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonasdaceae, bộ
Pseudomonasdales, lớp Schizomycetes.
Ngày nay, việc phân loại vi khẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy,
đòi hỏi cần nghiên cứu sâu hơn về loại vi khuẩn này.
Gluconacetobacter là loại trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong,
kích thước khoảng 2µm. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi,
không có khả năng di động. Các tế bào này được bao bọc bởi lớp màng nhày
có bản chất là hemicellulose, màng này khi nhuộm acid H2SO4 bắt màu xanh
và nhuộm fucshin thì bắt màu hồng. Trong môi trường, Gluconacetobacter có
khả năng tích lũy 4,5% acid acetic, khi nồng độ acid trong môi trường quá cao
sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [8]. Chúng có thể sống chung với nấm men
trong một loại nước giải khát dân gian làm bằng nước chè và đường loãng, pH
0

thích hợp từ 5,4 – 6,2, nhiệt độ thích hợp từ 25 – 30 C, còn gọi là “ Thủy hoài
sâm”, ở Nga người ta gọi là “Nấm chè”, ở Trung Quốc có tên “ Hải bảo”, “ Vị
nấm”, người Pháp gọi là “Champiognon De Lougue Vie – Nấm trường sinh.
Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hóa dị
dưỡng. Tế bào của chúng thường được tìm thấy trong nhiều nơi như giấm,
dịch rượu, nước ép hoa quả hoặc trong đất.


Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng [5], vi khuẩn Gluconacetobacter có
bao nhầy cấu tạo bởi cellulose. Thành phần cấu tạo của bao nhầy chủ yếu là
các polysaccarit (chủ yếu là glucose), ngoài ra còn có polypeptit, protein. Bao
nhầy này có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào
giá thể.
1.2. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa của Gluconacetobacter

Đặc điểm sinh lý: Chủng Gluconacetobacter có thể phát triển ở nhiệt
0

độ từ 25 – 35 C và pH = 4 – 6. Nhiệt độ và pH tối ưu sẽ thay đổi dựa vào từng
0

giống. Ở 37 C, tế bào sẽ suy thoái ngay cả ở trong môi trường tối ưu. Chủng
Gluconacetobacter chịu được pH thấp, vì vậy thường bổ sung acid acetic vào
môi trường nuôi cấy để giảm sự nhiễm khuẩn lạ.
Đặc điểm sinh hóa: Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa
phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn như: Khả năng oxy hóa acid acetic
thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường
Hoyer,.. Đặc điểm phân biệt của chủng Gluconacetobacter với các chủng
khác trong một chi được trình bày trong bảng 1.1:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter theo Frateur năm 1950
STT

Đặc điểm

Hiện tượng

Kết quả

1

Oxy hóa ethanol thành acid Chuyển
hóa
môi trường chứa
acetic

Bromphenol Blue 0,04% từ màu xanh
sang màu vàng

+

2

Hoạt hóa catalase

Hiện tượng sủi bọt khí

+

3

Sinh trưởng trên
trường Hoyer

Sinh khối không tăng

-

4

Chuyển hóa Glycerol thành Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau khi
dihydroxyaceton
lên men

+

5

Chuyển hóa Glucose thành Xuất hiện vòng sáng xung quanh khuẩn
acid
lạc trên môi trường chứa CaCO3

+

6

Kiểm tra khả năng sinh sắc Không hình thành sắc tố nâu
tố nâu

-

7

Kiểm tra khả năng tổng Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam
hợp cellulose

+

môi


1.3. Biocellulose
1.3.1. Cấu trú
Màng Biocellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4
glucopyranose mạch thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose
thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của chúng lại khác xa nhau.

Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose khi mới hình thành sẽ liên kết với
nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết
tinh tạo sợi lớn hơn – gọi là các sợi vĩ mô, những sợi vĩ mô này thường kết
hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo thành những dải lớn. Những dải
lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào
khác bằng liên kết hiđro hoặc vandesvan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp
màng mỏng. Khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng thì kích thước của màng sẽ
tăng lên [9], [4], [15].
Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác với cellulose của thực vật ở
chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần
khác mà chúng được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song
song. Sau đó chúng sẽ kết hợp với nhau tạo thành mạng lưới cellulose [11].

Hình 1.1. Sợi cellulose của màng Biocellulose
1.3.2. Một số tính hất
Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu tính chất của Biocellulose như độ
cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối... lên tính chất


2

của Biocellulose [12]. Các mảnh Biocellulose có độ cứng là 3,68 kg/cm . Độ
cứng của các màng Biocellulose tăng lên khi được nhúng bằng dung dịch
muối và sẽ giảm khi nhúng vào dung dịch đường. Các sản phẩm từ cellulose
vi khuẩn có một số tính chất sau:
Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp của
màng.
Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của
cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.

Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose (kiểm
soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose.
Như chúng ta thấy, cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất
được tổng hợp mà không gắn lygnin, mặt khác có thể dễ dàng bị một số nhóm
vi sinh vật phân khác giải. Vì vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật
liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai [9], [6].
1.3.3. Cơ hế tổng hợp
Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bước
được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa
nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [1], [10].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự thì thì quá trình tổng hợp
Biocellulose có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn
Gluconacetobacter là: Glucokinase, Phosphoglucomutase, Glucose - 1 phosphate uridylytransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose
synthase (CS). Trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất.


Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter
1.3.4. Chứ năng ủa ellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter
Màng Biocellulose nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác
dụng như một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trước
các nhân tố có hại của môi trường. Nhiều tài liệu cho rằng cellulose bao
quanh tế bào vi khuẩn giúp bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế
bào Gluconacetobacter được bao bọc bởi màng Biocellulose sống sót sau 1
giờ xử lí bằng tia cực tím. Khi tách Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống
sót của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3%.
Ngoài ra, màng Biocellulose còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi
khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy các chất dinh dưỡng từ môi trường một
cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới
cellulose.
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay

1.4.1 Tình hình nghiên ứu trên thế giới
Trên thế giới, màng Biocellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình
xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng
làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi


trường cơ chất sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Tuy nhiên,
những ứng dụng phổ biến trên thế giới của màng Biocellulose là dùng trong
ngành thực phẩm và mỹ phẩm. Một số tác giả: Hamlyn và cộng sự (1997),
Cienchanska (2004), Legeza và cộng sự (2004), Wan và Millon (2005), Czaja
và cộng sự (2006) đã sử dụng màng Biocellulose đắp lên các vết thương hở,
vết bỏng và đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được
đăng ký bản quyền về làm màng Biocellulose từ Acetobacter xylinum dùng để
trị bỏng. Các nhà khoa học Jonas và Farad (1998), Czaja và cộng sự (2006) đã
dùng màng làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
1.4.2. Tình hình nghiên ứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về Gluconacetobacter và màng
Biocellulose còn khá mới mẻ nhưng đã thú hút được sự quan tâm của nhiều
tác giả. Các nghiên cứu mới chỉ quan tâm với cấu tạo, đặc tính và quá trình
tạo màng với các ứng dụng trong thực tiễn như chế tạo màng sinh học dùng
trong trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da, sản xuất thạch dừa. Năm 1997 có công
trình của tác giả Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi
trường nước giá đỗ thay thế nước dừa trong sản xuất thạch dừa từ chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter xylinus. Năm 1995 – 2000 các công trình nghiêm
cứu về ki khuẩn Gluconacetobacter và khă năng lên men sinh acid của nhóm
tác giả Lê Văn Nhương, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn
Văn Cách. Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu quá trình sinh
acid, khả năng tạo màng Biocellulose, đặc tính của màng. Công trình nghiên
cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thu Hương, Nguyễn Khắc

Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự về ảnh hưởng của môi trường dinh
dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ứng
dụng làm thạch dừa năm 2000. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh trưởng
bộ môn Vi sinh – Ký sinh trường Đại học Y dược học thành phố Hồ Chí
Minh đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng phương
pháp lên men. Năm 2008 có nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã
chọn được 1 chủng Gluconacetobacter NH1, khảo sát khả năng tạo màng của
chủng này. Công trình của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Trần Thị Mai,


Nguyễn Trung Kiên năm 2013 nghiên cứu môi trường thay thế nước dừa
trong lên men tạo màng Biocellulose cho chủng Gluconacetobacter BHN2.
Gần đây, những nghiên cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung về
thu nhận màng từ vi khuẩn Gluconacetobacter, ứng dụng màng trong điều trị
bỏng. Hiện nay nhóm nghiên cứu đang tập trung theo hướng tuyển chọn cho
màng dai và mỏng.


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng
Biocellulose.
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian
- Phạm vi nghiên cứu: Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo
màng Biocellulose trong ứng dụng bảo quản thực phẩm.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
- Thời gian : Từ 08/2018 – 05/2019.
2.3. Thiết bị và hóa chất
2.3.1. Thiết bị
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng những dụng

cụ thiết bị như: nồi hấp khử trùng, tủ sấy (Haraeus, Đức), box cấy vô trùng
(Haraeus, Đức), cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ), micropipep
(Gilson, Pháp), tủ lạnh (Tawasi, Nhật), kính hiển vi quang học (olympus
CX41, Nhật), hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác,
lam kính, lamen, đèn cồn,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
Tất cả các dụng cụ, thiết bị và hóa chất trên đều do phòng Vi sinh,
Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.3.2. Hóa hất
- Nguồn đường: glucose, saccarose, ethanol, fructose, sorbitol...
- Nguồn nitơ:
+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4
+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton, cao thịt
- Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH
- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch
lugol.
- Nước dừa, agar,…


2.3.3. Môi trường
2.3.3.1. Môi trường giữ giống
Glucose: 20g

(NH4)2SO4 : 3g

Pepton: 5g

Thạch agar: 20g

MgSO4.7H2O: 2g

KH2PO4: 2g

Nước máy: 1000 ml
CaCO3: 10g
2.3.3.2. Môi trường nhân giống
Glucose: 20g

(NH4)2SO4: 3g

KH2PO4: 2g

MgSO4.7H2O: 2g

pH: 5,0 - 6,0

Acid acetic : 2 %

Nước dừa: 1000 ml
2.3.3.3. Môi trường lên men
Glucose: 20g

(NH4)2SO4: 3g

KH2PO4: 2g

MgSO4.7H2O: 2g

pH: 5,0 - 6,0

Acid acetic: 2%

Nước dừa: 1000ml
CaCO3: 10g
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp vi sinh
2.4.1.1. Phân lập chủng Gluconacetobacter theo phương pháp truyền
thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck)
Nguồn vật liệu: dung dịch nước dừa bổ sung dịch lên men Kombucha tỉ
lệ 2% lên men tĩnh trong vòng 4 ngày tạo lớp màng trắng trong dày 2 mm.
Sử dụng phương pháp pha loãng Pasteur. Chuẩn bị 10 ống nghiệm có
đậy nút bông sấy vô trùng, cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, đậy nút


0

bông hấp thanh trùng trong nồi hấp giữ ở 115 C, làm trong thời gian 120
phút. Chuyển vào bốc cấy vô trùng, dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch từ bình
tam giác chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông,
-1

vontex trong 5 phút, thu được ống dịch pha loãng mức 10 . Tiếp tục hút 1ml
-1

dịch từ ống có độ pha loãng 10 cho vào ống nghiệm thứ 2. Tiếp tục pha
-3

-4

-10

loãng ở các độ pha loãng 10 , 10 …10 . Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có
-6

-8

trong mẫu, chúng tôi chọn các mẫu có độ pha loãng 10 – 10 để tiến hành
các bước tiếp theo.
Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa: chuẩn bị môi trường,
hấp khử trùng, đổ môi trường thạch đĩa. Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch
-6

-8

màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10 – 10 ) nhỏ vào các hộp
lồng đã chứa môi trường thạch, dùng que trang thủy tinh trang đều khắp bề
0

mặt thạch. Đặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, giữ trong tủ ấm 30 C.
Sau 3 – 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thước, màu sắc, mép
viền khuẩn lạc, độ trơn bóng, vòng phân giải CaCO 3).
Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng đã loại bỏ CaCO 3, tách các khuẩn
lạc riêng rẽ từ hộp lồng, cấy truyền vào các ống nghiệm chứa môi trường
0

thạch nghiêng đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở 30 C. Sau 3 – 4 ngày, quan
sát làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram.
2.4.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế
bào trên tiêu bản nhuộm kép
Lấy các khuẩn lạc trên các ống nghiệm thạch nghiêng, làm vết bôi trên
lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tế

bào bằng phương pháp nhuộm Gram:
1. Tím gentian: 2 phút
2. Rửa nước
3. Dung dịch Lugol: 2 phút
4. Rửa nước
0

5. Cồn 96 : 20 giây
6. Rửa nước
7. Dung dịch Fucshin: 2 phút


8. Rửa nước
9. Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn
Đưa lên vật kính 5 – 40 quan sát sau đó đưa lên tiêu bản dưới kính dầu
100 với độ phóng đại 1000 lần. Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm màu hồng (Gram
âm) đó chính là vi khuẩn Gluconacetobacter.
2.4.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch
nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập và sơ bộ đã xác định là
Gluconacetobacter được cấy trên môi trường thạch nghiêng (đã loại bỏ
0

CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 – 4 ngày ở 30 C. Cấy truyền giữ giống trên môi
trường thạch nghiêng 2 tháng 1 lần.
2.4.1.4. Phương pháp tuyển chọn giống vi khuẩn Gluconacetobacter cho
màng mỏng
Mục đích nghiên cứu này là tuyển chọn các chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter cho màng mỏng, nhẵn, dai để chế tạo màng sinh học làm
túi đựng bảo quản thực phẩm. Vì vậy cần tiến hành các chỉ tiêu sau:

 Quan sát đặc điểm quá trình tạo màng Biocellulose (thời gian tạo
màng, đặc điểm của màng, độ dày mỏng của màng,...).
 Quan sát kích thước và hình dạng tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram,
kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng mới phân lập.
Các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sau khi tuyển chọn sẽ được
nuôi trong môi trường dịch thể để kiểm tra khả năng tạo màng. Chúng tôi
tuyển chọn 3 lần liên tiếp để thu được chủng có khả năng tạo màng tốt nhất
dùng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
2.4.1.5. Phương pháp hoạt hoá giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử
dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật
cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu
0

chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 110 C trong 20 phút. Sau


đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng
vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ.
2.4.2. Phương pháp hóa sinh
2.4.2.1. Xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ
Cho 10ml dung dịch lên men vào bình tam giác dung tích 100ml, thêm
vào đó 1 – 2 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1%. Chuẩn độ bằng dung dịch
NaOH 0,1N lắc nhẹ cho tới khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Tính
số gam acid acetic tạo thành trong 10 ml dung dịch lên men (biết rằng 1ml
NaOH 0,1N tương ứng với 0,06g acid acetic).
Cách tính:

X=

(g/l)

Trong đó: X: Số gam acid acetic trong 1 lít dịch lên men
V: Thể tích của NaOH 0,1N đem chuẩn độ
10: Số thể tích đem chuẩn độ

2.4.2.2. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt
khí thì chủng vi khuẩn đó có hoạt tính catalase (catalase +). Ngược lại nếu
không thấy có hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó không có hoạt
tính catalase (catalase -).
2.4.2.3. Phát hiện khả năng oxi hóa acid acetic
Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxi hóa acid acetic của vi
khuẩn tuyển chọn:
Thành phần:

Cao nấm men: 10g

CaCO3: 10g

Thạch agar: 20g

Nước máy: 1000ml
0

Pha môi trường trong bình tam giác đem hấp khử trùng ở 121 C trong
20 phút, để nguội rồi phân phối ra đĩa peptri, cấy vi khuẩn tuyển chọn vào đĩa
thạch nuôi 4 – 6 ngày ở điều kiện thích hợp.

Quan sát hiện tượng: nếu xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng phân
giải canxi là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính.
2.4.2.4. Phát hiện khả năng oxi hóa rượu etylic thành acid acetic
Nuôi vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường bao gồm:
Cao nấm men: 10g

Rượu etylic: 10 – 15%

Blue bromphenol 0,04%: 20ml

Nước máy: 1000ml
0

Phân phối môi trường vào ống nghiệm (4 – 5ml). Khử trùng ở 121 C
0

trong 20 phút, để nguội 30 C bổ sung vi khuẩn nghiên cứu nuôi trong 7 ngày
ở điều kiện thích hợp. Quan sát môi trường đổi sang màu vàng là dương tính
và ngược lại là âm tính.
2.4.2.5. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose
0

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ từ 28 – 30 C
trong 3 – 4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu
của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugon và acid H2SO4 60% nó
chuyển hóa thành màu xanh thẫm.
2.4.3. Phương pháp xá định tr ng lượng tươi ủa màng Bio ellulose
Sau khi nuôi cấy từ 3 – 4 ngày màng được lấy ra, để màng ráo nước
trên khay nhựa khoảng 4 – 5 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Tiến hành cân
màng trên cân điện tử. Đọc chỉ số và ghi lại kết quả.

2.4.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong
cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” và “Thống kê và ứng dụng” như:
Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm.

n

X  X i
1 i1
n
Trong đó : X: Trung bình tổng thể
n: Số lần thí nghiệm
Xi: Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n


n

Trung bình bình phương các sai lệch  

( X
i 1

i

 X )2

n 1

Trong đó: δ: độ lệch chuẩn

Xi: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n
X: trung bình tổng thể

Sai số đại diện của trung bình cộng

m 

Hệ số biến thiên (Cv%): Cv% =


n

X

.100%

Trong đó: Cv: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể
δ: độ lệch chuẩn
X: trung bình tổng thể