Nghiên cứu về khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

NGUYỄN TÚ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE

TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬ N TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Hà Nội, 20 tháng 5 năm 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

NGUYỄN TÚ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE

TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬ N TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn:

ThS. HÀ THỊ MINH TÂM
Hà Nội, 20 tháng 05 năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Ban Giám
hiệu Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; các quý thầy, cô trong khoa Sinh-KTNN; các quý
thầy, cô ở Viện Nghiên cứu khoa học và ứng dụng Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp
đỡ em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời biết ơn chân thành nhất tới ThS. Hà Thị Minh Tâm. Vì
đây là lần đầu tiên đi vào làm nghiên cứu khoa học nên bƣớc đầu còn nhiều bỡ ngỡ
và thiếu sót cả về mặt kiến thức cũng nhƣ kỹ năng, tuy nhiên đƣợc sự chỉ bảo tận
tình của cô nên em đã hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Không có sự thành công nào mà không gắn liền với sự hỗ trợ, vì vậy
em rất mong nhận đƣợc sự góp ý từ quý thầy, cô và các bạn sinh viên để khóa luận
tốt nghiệp của em hoàn chỉnh hơn nữa. Em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Tú Hƣơng


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan khóa luận “Nghiên cứu về khả năng hấp thụ thuốc
Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi
cấy trong môi trƣờng chuẩn” là đề tài nghiên cứu của em dƣới sự hƣớng dẫn tận
tình của Ths.Hà Thị Minh Tâm. Các kết quả, số liệu có đƣợc là do quá trình nghiên
cứu của bản thân em, không có sự trùng lặp của bất cứ đề tài nào. Em xin chịu trách
nghiệm về lời cam đoan của bản thân nếu có sai sót!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Tú Hƣơng


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BC

: Cellulose vi khuẩn

cs

: Cộng sự

MTC

: Môi trƣờng chuẩn

PC

: Plant cellulose

OD

: Optical density

VLC

: Vật liệu cellulose

G. xylinus

: Gluconacetobacter xylinus


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...................................................................................................................1
NỘI DUNG............................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................... 3
1.1. Giới thiệu tổng quan đối tƣợng và lĩnh vực nghiên cứu....................................3
1.1.1. Giới thiệu về Diclofenac..................................................................................3
1.1.2. Tổng quan về Bacterial cellulose....................................................................4
1.1.3. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinum..................................... 5
1.2. Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc........................6
1.2.1. Trên thế giới.................................................................................................... 6
1.2.2. Ở Việt Nam...................................................................................................... 6
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........7
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................................ 7
2.2. Phạm vi nghiên cứu............................................................................................7
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................... 7
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu..........................................................................................7
2.3.2. Phương pháp chế tạo vật liệu BC....................................................................9
2.3.3. Phương pháp xử lý thống kê..........................................................................13
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................14
3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu BC.......................................................................14
3.1.1. Tạo màng BC từ các môi trường lên men..................................................... 14
3.1.2. Thu màng BC thô...........................................................................................14

3.1.3. Xử lý màng BC trước khi hấp thụ..................................................................15
3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC............................................................ 15
3.1.5. Xây dựng phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac........................17
3.1.6. Khảo sát khả năng hấp thụ màng BC............................................................17
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................23
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu..........................................................7
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu...................................................... 8
Bảng 2.3. Thành phần thuốc và khối lượng tương ứng............................................. 9
Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng BC (n=3) (OD – 283 nm)..............19
Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng BC tại thời điểm 2 giờ....................20
Bảng 3.3. Hiệu suất hấp thụ thuốc các loại màng BC trong 2 giờ.......................... 21


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac..................................................3
Hình 3.1. Màng BC đang hình thành...................................................................... 14
Hình 3.2. Rửa màng dưới vòi nước..........................................................................15
Hình 3.3. Màng BC tinh chế.................................................................................... 16
Hình 3.4. Màng BC được chia vào các bình tam giác.............................................16
Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn của diclofenac............................................. 17
Hình 3.6. Chuẩn bị dịch đo quang phổ....................................................................18
Hình 3.7. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng BC có sự khác biệt..........................20
Hình 3.8. Hiệu suất hấp thụ thuốc của các loại màng BC.......................................21


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Diclofenac đƣợc biết là loại thuốc chống viêm không steroid. Thuốc
Diclofenac có tác dụng hạ sốt, giảm đau và chống viêm, do nó ức chế hoạt tính của
cyclogenase. Vì vậy, giảm sự tạo thành prostanglandin, prostacyclin và
thromboxane là những chất trung gian trong quá trình viêm. Ngoài ra, Diclofenac
điều hòa con đƣờng lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu. Diclofenac còn gây hại cho
đƣờng tiêu hóa do làm giảm khả năng tổng hợp Prostaglandin gây ức chế tạo mucin
(là chất bảo vệ cho đƣờng tiêu hóa). Prostaglandin là chất có vai trò duy trì tƣới
máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp Prostaglandin gây
viêm cầu thận, hội chứng thận hƣ và hoại tử nhú đặc biệt biểu hiện rõ ở những
ngƣời bệnh thận, ngƣời suy tim. Với những ngƣời bệnh trên, các thuốc chống viên
không steroid gây suy thận cấp và suy tim cấp.[5]
Trong tự nhiên xuất hiện một số vi khuẩn sinh màng cellulose. Nuôi cấy các
vi khuẩn này trong môi trƣờng chứa glucose, glycerol hoặc một số nguồn cacbon
hữu cơ khác nhau thì chúng có hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose sinh
học thuần khiết, hay còn gọi là màng sinh học Bacterial cellulose (BC).

BC cấu tạo bởi các sợi microfibril tạo thành những bó sợi song song hình
thành mạng cellulose có độ bền cơ học, đô tinh khiết và thấm hút cao. BC là sản
phẩm trao đổi chất sơ cấp, tạo màng bảo vệ. BC là nguồn polymer mới, giải pháp
giúp cho nhiều nhà khoa học tìm ra nhiều nguồn nguyên liệu mới hiện nay, ứng
dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau.[5]
Với mục đích đánh giá đƣợc khả năng hấp thu thuốc Ranitidin của vật liệu
BC và khảo sát các đặc tính lý hóa của vật liệu BC trƣớc và sau khi hấp thụ
thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc
Diclofenac natri của vật liệu Cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus
nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn”.

1

2. Mục đích của nghiên cứu
- Mục đích nghiên cứu:
Thiết kế đƣợc hệ thống màng BC lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc
nạp thuốc diclofenac natri.
Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc tạo màng BC hấp thụ thuốc nhiều nhất.

- Nhiệm vụ nghiên cứu:
Chế tạo ra vật liệu BC, xử lý vật liệu BC trƣớc khi hấp thụ thuốc diclofenac
natri, xác định lƣợng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết vật liệu BC.
Khảo sát tối ƣu hóa khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri vào vật liệu BC.
Khảo sát đặc tính thuốc diclofenac natri trƣớc và sau khi đƣợc hấp thụ thuốc.

3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu Cellulose
tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng BC lên men trong môi trƣờng chuẩn.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Từ kết quả nghiên cứu chọn ra đƣợc trƣờng hợp hấp thụ thuốc tốt nhất.
Từ kết quả nghiên cứu trên có thể áp dụng vào thực tiễn đời sống.
5. Tính mới của đề tài
- Nâng cao khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri trong điều trị giảm
đau, chống viêm.
- Khắc phục nhƣợc điểm của thuốc từ chính kết quả nghiên cứu áp dụng
vào điều trị bệnh.

2

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu tổng quan đối tƣợng và lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Giới thiệu về Diclofenac
-Tên quốc tế: Diclofenac
-Tên biệt dƣợc: Cambia, Cataflam, Voltaren-XR, Zipsor, Zorvolex,
Voltaren, Dyloject.
- Công thức:
Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac

- Dạng thuốc và hàm lƣợng:
Diclofenac thƣờng đƣợc dùng ở dạng muối natri. Liều lƣợng tính theo
diclofenac natri:
Viên nén: 25mg; 50mg; 100mg
Viên đạn: 25mg; 100mg
Ống tiêm: 75mg/2ml; 75mg/3ml
Thuốc gel bôi ngoài: 10mg/g
3


Thuốc nƣớc nhỏ mắt: 0,01%
-Tác dụng của thuốc Diclofenac:
Diclofenac đƣợc dùng để giảm đau, giảm sƣng và cứng khớp do viêm
khớp. Diclofenac là một thuốc kháng viêm không steroit (NSAID). [5]
Công dụng khác là:
Diclofenac có thể sử dụng điều trị các tình trạng đau khác nhau nhƣ đau
nhức răng, đau nhức cơ bắp, đau sau khi sinh và đau sau khi phẫu thuật.

-Tác dụng phụ: nhức đầu, đau thƣợng vị, buồn nôn, chƣớng bụng, ù tai,
chán ăn, khó tiêu.
-Liều lƣợng thuốc tùy thuộc vào tình trạng sức khỏe, đáp ứng theo điều trị
với các loại thuốc phù hợp. Không sử dụng quá số lƣợng thuốc đƣợc chỉ định.[5]

1.1.2. Tổng quan về Bacterial cellulose
- Cellulose vi khuẩn là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và tạo màng bảo vệ.
- BC là sản phẩm của chủng G.xylinum. Màng sinh học BC có cấu trúc,
đặc tính giống cellulose thực vật, tuy nhiên, chúng khác nhau về cấu trúc đại thể
[1]. Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, có đƣờng kính là 1,5 nm, kết hợp với nhau tạo thành bó, các bó
hợp thành dãy, mỗi dãy khoảng 100 nm, rộng khoảng 3-8 nm.
- Tính chất độc đáo màng BC: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn,
khả năng thấm hút nƣớc cao, bị thủy phân bởi enzym,…
Chính vì vậy, BC ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghiệp nhƣ:
màng BC làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc, làm chất màng
đặc biệt cho pin và năng lƣợng tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học,
công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy … Đối với y học, màng BC đƣợc
ứng dụng làm da thay thế da trong điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị
bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Trƣờng Đại học Y dƣợc
thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu màng BC có tấm dầu mù u tạo màng trị
4


bỏng thực nghiệm ở thỏ. Kết quả là màng BC giúp mau lành vết thƣơng và ngăn
nhiễm trùng. Ngoài ra, các sợi cellulose có cấu trúc màng BC tạo hệ thống vận
chuyển, phân phối thuốc giúp tăng sinh khả năng của thuốc và giúp thuốc không
bị phá hủy khi ở môi trƣờng acid [1].
1.1.3. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinum
- G.xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ

Pseudomnadaceae, hiếu khí bắt buộc, có chu mao và có khả năng sản xuất
cellulose ngoại bào [2].
Theo khóa phân loại của Bergey, A.xylinum thuộc:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
- Đặc điểm
Hình thái: Thẳng, dạng hình que, hơi cong, dài khoảng 2-3 µm, kích thƣớc
bề ngang khoảng 0,6-0,8 µm, không có khả năng sinh bào tử, không di động,
gram âm, xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, tế bào già tế bào phình to, phân
nhánh, có biến đổi [2].
Sinh lý, sinh hóa: Nhiệt độ tối ƣu là 25-30 0C, ở 370C tế bào suy thoái. Vi
khuẩn phát triển với khoảng pH từ 3-8, tối ƣu sản xuất cellulose là 5,5.
- Sau 36- 48 giờ lớp màng dày, trong và sau 7-19 ngày thì đạt độ dày nhất định.
- Sinh tổng hợp BC: việc sử dụng đƣờng của Acetobacter xylinum đóng

vai trò vô cùng lớn trong quá trình tổng hợp BC vì môi trƣờng nuôi cấy
Acetobacter xylinum là môi trƣờng tổng hợp nguồn dinh dƣỡng cần thiết nhƣ
nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur, phosphot và các yếu tố tăng trƣởng, vi lƣợng.

5


1.2. Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.2.1. Trên thế giới
- Trên thế giới, đã có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng BC trong hệ
thống vận tải và phân phối thuốc (năm 2014) đã đƣợc báo cáo [7].
- Nghiên cứu của Wei B. và cs (2011) màng BC thu đƣợc sau khi ngâm
trong benzalkonium chloride có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện

tích bề mặt đã đƣợc tìm thấy là 0.116 kg/cm2. Tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất
24 giờ chống lại hoạt động của S. Aureus và B. Subtilis.
1.2.2. Ở Việt Nam
- Các kết quả nghiên cứu BC mới dừng lại ở bƣớc đầu thí nghiệm nghiên cứu.
- Gần đây nhóm nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã đƣa ra hƣớng

nghiên cứu điều trị ở thỏ [3], công tác gồm việc phẫu thuật, cấy ghép, tạo màng
trị bỏng… sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên để điều trị bỏng nhƣ da
ếch, màng ối màng chitosan. Các thuốc trong tự nhiên có nhiều đặc tính tốt chữa
lành các vết thƣơng, vết loét nghiêm trọng
- Điều trị bỏng bằng thuốc tự nhiên sẽ đƣợc sử dụng rộng rãi ở các nƣớc.

Điều trị bỏng tự nhiên sẽ ít gây ra phản ứng phụ và lành tính.[5]

6


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men
từ môi trƣờng chuẩn.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu ở quy mô Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn G.xylinus dùng lên men thu nhận BC đƣợc nhập từ Nhật
Bản, dự trữ bởi Phòng sạch Vi sinh – Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và
Ứng dụng, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.

2.3.1.2. Hóa chất nghiên cứu
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT

Tên nguyên liệu

1

Diclofenac 99,5%

2

D- Glucose

3

Axit axetic

4

Amoni sunfat

5

Disodium phosphate

6

Axit citric

7

Cao nấm men

8

Pepton
7


9

Natri hidroxit

10

Nƣớc cất 2 lần

11

Methanol

12

Kali dihidrophotphat

2.3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị

Nƣớc sản xuất

Máy đo quang phổ UV- Vis 2450

Shimadru- Nhật Bản

Tủ sấy, tủ ấm

Binder – Đức

Buồng cấy vô trùng

Haracus

Cân phân tích

Sartorius- Thụy Sỹ

Cân kỹ thuật TE 412
Nồi hấp khử trùng HV100/HIRAIAMA

Nhật Bản

Khuấy từ gia nhiệt

IKA- Đức

Máy lắc tròn tốc độ chậm

Orbital Shakergallenkup Anh

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu
Bể rung siêu âm S60/H
* Dụng cụ: Bình tam giác chia vạch, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh chia
vạch, bình thủy tinh 500 ml, micropipet 20-200µl, pipet (1ml, 2ml, 5ml, 10ml,
25ml), kẹp gỗ, thƣớc, giấy lọc, giấy thấm, giấy bạc, khăn xô, kéo, bật lửa, đèn
cồn và một số dụng cụ hóa sinh khác.

8


2.3.2. Phương pháp chế tạo vật liệu BC
2.3.2.1. Môi trường lên men thu vật liệu BC
Vật liệu BC đƣợc tạo lên môt trƣờng chuẩn (MTC)
Bƣớc 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ, sau khi sấy xong lấy ra và để nguội

Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng:
Bảng 2.3. Thành phần thuốc và khối lượng tương ứng

Thành phần

Môi trƣờng MTC

Glucose

20g

Pepton

5g

Diamoni photphat

2,7g

Cao nấm men

5g

Axit citric

1.5g

Axit axetic

2%

Nƣớc cất 2 lần

1000ml

Dịch giống

10%

Lƣu ý: pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh bằng HCl hoặc NaOH;
pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh = 4-6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm
những vi khuẩn khác.

Bƣớc 3: Hấp khử trùng các môi trƣờng ở 1210C trong 15 phút (phải bọc
các bình bằng giấy bạc).
Bƣớc 4: Lấy các môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi
để nguội môi trƣờng.

9


Bƣớc 5: Bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều
trong dung dịch (trong quá trình này phải chú ý để môi trƣờng và dịch giống
không bị nhiễm khuẩn).
Bƣớc 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thƣớc nghiên cứu,
dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4-14 ngày ở 280C.
Bƣớc 7: Thu vật liệu BC thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc (xả nƣớc nhẹ).

2.3.2.2. Xử lý vật liệu BC
a. Xử lý màng BC trƣớc khi hấp thụ thuốc
Mục đích:
Cần nuôi cấy tĩnh giúp loại đi các tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy và
độc tố của vi khuẩn.
Phƣơng pháp:
Vật liệu chứa lƣợng lớn vi khuẩn vì vậy hấp vật liệu trong NaOH nóng
3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng để phá vỡ
thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ.
Sau khi ngâm NaOH, vớt vật liệu đặt dƣới vòi nƣớc chảy đến khi vật liệu trắng
trong. Thử quỳ tím trên bề mặt vật liệu BC là trung tính, thu đƣợc BC tinh khiết.

b. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC
Mục đích: Sau khi xử lý, màng BC loại đi các tạp chất gây độc hại.
Phƣơng pháp:

- Màng BC tinh chế sẽ mang đi cắt nhỏ, cho 50ml nƣớc cất.
- Chia màng BC đã cắt vào các bình tam giác và đổ dung dịch thuốc
Diclofenac natri.
- Lắc máy rung siêu âm 10 phút, chế độ lắc 200 vòng/phút.

10


- Sau đó, sử dụng dung dịch axit triclor acetic 1% để kiểm tra protein trong
dịch chiết màng. Mẫu chứng âm là nƣớc cất, mẫu chứng dƣơng là dung dịch
pepton 1%. Phản ứng dƣơng cho kết tủa đục.
- So sánh với mẫu đối chứng âm (nƣớc cất) ta thu đƣợc màng dẻo dai,
mềm, mỏng, có thể hút nƣớc và dịch mô.
2.3.2.3. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri
- Nguyên lý: Sử dụng máy UV- 2450 đo quang phổ hấp thụ của thuốc
diclofenac với các nồng độ khác nhau ở bƣớc sóng 283 nm [4].
- Thực hiện:
Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu chuẩn diclofenac với các nồng độ tƣơng ứng trong
dung môi Methanol. Trong đó, mẫu trắng là methanol.
Bƣớc 2: Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên tại bƣớc
đã lựa chọn với mẫu trắng và xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn mối tƣơng quan
giữa độ hấp thụ và nồng độ diclofenac natri.
Bƣớc 3: Dùng máy đo quang phổ từ ngoại UV- 2450 để đo mật độ quang
phổ (OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở hấp thụ cực đại (λ max).
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc diclofenac
natri để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc. Phƣơng trình tuyến tính biểu diễn
mối quan hệ giữa nồng độ diclofenac natri và độ hấp thụ. Phƣơng trình biểu diễn
giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng:
y= ax + b với R2 là hệ số tƣơng quan
Trong đó: y: độ hấp thụ của dung dịch tại λ max

x: nồng độ của dung dịch
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau.

11


2.3.2.4. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC, tính hiệu suất
Tiến hành thử nghiệm trên 4 mẫu MTC.
- Mẫu 1: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 0,5cm.
- Mẫu 2: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 0,5cm, ép loại nƣớc 50%.
- Mẫu 3: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm.
- Mẫu 4: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm, ép loại nƣớc 50%.
Chuẩn bị trƣớc 12 bình tam giác chứa 25mg thuốc diclofenac cùng 100ml
dung dịch Methanol khuấy tan. Cho 12 màng vào 12 bình trên, rồi cho vào máy
lắc 150 vòng/ phút. Sau các quãng thời gian 30 phút, 1giờ, 1,5 giờ, 2 giờ rút mẫu
đo quang phổ bằng máy UV – 2450.
Thu đƣợc giá trị OD thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta nhận đƣợc
nồng độ diclofenac (C%) có trong dung dịch.
(1)
C%: nồng độ phần trăm khối lƣợng, thể tích chỉ số mg chất tan có trong
100ml dung dịch.
mct: khối lƣợng chất tan trong dung dịch (mg).
mdd hay Vdd: thể tích của dung dịch (ml).
Khối lƣợng diclofenac hấp thụ là:
(2)

mht = mtr - ms

mht : khối lƣợng diclofenac đƣợc hấp thụ vào màng BC (mg).
mtr: khối lƣợng diclofenac trong dung dịch ban đầu (mg).

ms: khối lƣợng diclofenac còn lại trong 100ml dung dịch diclofenac 25% (mg)

Tỷ lệ % diclofenac hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn:
(3)
12


EE: phần trăm thuốc hấp thụ vào màng.
Qt: lƣợng thuốc lý thuyết (mg).
Qd: lƣợng thuốc còn lại (mg).
2.3.3. Phương pháp xử lý thống kê
Xử lý các dữ liệu qua phần mềm excel 2016 và phần mềm JMP phiên
bản 9.0. Kết quả sau khi xử lý biểu diễn dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn.
Kiểm định giả thiết giá trị trung bình của các mẫu bằng cách sử dụng test thống
kê. Những khác biệt có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0,05.

13


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN 3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu BC
3.1.1. Tạo màng BC từ các môi trường lên men
Sau một tuần, vi khuẩn G. xylinus sử dụng chất dinh dƣỡng nhằm tổng
hợp cellulose, màng BC hình thành trên bề mặt môi trƣờng. Độ dày màng tùy
thời gian nuôi cấy.
3.1.2. Thu màng BC thô
- Tùy thời gian nuôi cấy thu màng có độ dày 1cm và 0,5cm
- Màng dẻo, chứa nhiều nƣớc, dễ tách khỏi môi trƣờng.

Hình 3.1. Màng BC đang hình thành

14


3.1.3. Xử lý màng BC trước khi hấp thụ
- Hấp BC thô trong NaOH nóng 3% bằng nồi hấp khử trùng, nhiệt độ
1130C trong 10 phút, thu màng có màu vàng nâu.
- Xử lý BC trƣớc hấp thụ để loại bỏ tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy.
- Màng đặt dƣới vòi nƣớc, xả nhẹ nƣớc trên bề mặt màng đến khi màng trắng
trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trƣờng là trung tính. Thu đƣơc BC tinh khiết.

Hình 3.2. Rửa màng dưới vòi nước

3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC
- Màng BC tinh khiết loại 0,5cm và 1cm lần lƣợt đƣợc cắt nhỏ cho vào
bình và thêm 50ml nƣớc cất.

15


Hình 3.3. Màng BC tinh chế

Hình 3.4. Màng BC được chia vào các bình tam giác

- Chia màng BC đã cắt vào các bình tam giác và đổ dung dịch thuốc
Diclofenac natri.
- Lắc máy rung siêu âm 10 phút, chế độ lắc 200 vòng/phút.

16

3.1.5. Xây dựng phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac
- Dùng phần mền Excel 2010, dựng đồ thị biểu diễn và lập phƣơng trình
đƣờng chuẩn diclofenac, hình 3.4.1.

Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn của diclofenac

Phƣơng trình đƣờng chuẩn:
y=0,2432x – 0,1655 (R2 = 0,996)
Trong đó,
x: Nồng độ diclofenac mg/ml.
y: Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ
x. R: Hệ số tƣơng quan bình thƣờng.
3.1.6. Khảo sát khả năng hấp thụ màng BC
- Cho màng vào bình chứa 100ml dung dịch Diclofenac.
- Sau khi cho màng vào bình, đặt bình vào máy lắc với chế độ lắc 200
vòng/phút.

17