Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA: SINH - KTNN

TRẦN MỸ LINH

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO
RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, năm 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA: SINH - KTNN

TRẦN MỸ LINH

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO
RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn: Th.S Phạm Thị Kim Dung

Hà Nội, năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời nghiên cứu và hoàn thành khóa luận của mình tôi vô cùng
may mắn khi nhận được sự giúp đỡ từ thầy cô,bạn bè và gia đình.
Lời đâu tiên cho tôi xin được gửi lời cảm ơn đến Th.S Phạm Thị Kim Dung
người đã giúp đỡ tôi rất nhiều, truyền dạy cho tôi những kinh nghiệm cũng như kiến
thức để tôi có thể hoàn thành khóa luận của mình
Tiếp sau nữa tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô làm việc tại khoa Sinh –
KTNN nói chung và các thầy cô ở Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 nói riêng đã nhiệt tình giúp đỡ cũng như tạo điều kiện
giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Sau cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong quá trình làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội,ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Mỹ Linh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn của Th.S Phạm Thị Kim Dung. Các thông số, số liệu trong bài đều được lấy từ
thực nghiệm và được xử lý thống kê bằng các phần mềm. Mọi thông tin trích dẫn
được sử dụng trong bài khóa luận đều được nêu rõ nguồn gốc.
Hà Nội,ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Mỹ Linh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...................................................................................................................... 1
1.

Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1

2.

Mục đích .......................................................................................................... 1

3.

Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2

4.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ............................................................ 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. Đặc điểm của Gluconacetobacter Xylinus ..................................................... 3
1.1.1. Phân loại Gluconacetobacter xylinus....................................................... 3
1.1.2. Hình thái của Gluconacetobacter Xylinus................................................. 3
1.1.3. Đặc điểm sinh lí sinh hóa của Gluconacetobacter .................................... 3
1.2. Cellulose vi khuẩn ........................................................................................... 3
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose vi khuẩn ................................................. 3
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn ............................................. 4

1.2.2. Các tính chất đặc biệt ................................................................................ 4
1.2.3. Quá trình tạo màng cellulose vi khuẩn từ vi khuẩn Gluconacetobacter... 4
1.2.4. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn ..................................................... 4
1.3. Lịch sử nghiên cứu .......................................................................................... 4
1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................... 4
1.3.2. Tại Việt Nam .............................................................................................. 5
1.4. Thuốc Diclofenac Natri .................................................................................. 5
1.4.1. Tính chất. ................................................................................................... 6
1.4.2. Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng ......................................................... 6
1.4.3. Chỉ định...................................................................................................... 6
1.4.4. Chống chỉ định ........................................................................................... 6
1.4.5. Tác dụng không mong muốn của thuốc ..................................................... 6
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 8
2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu......................................................... 8


2.1.1. Chủng vi sinh vật ....................................................................................... 8
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu. ................................................................................... 8
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................... 8
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 9
2.2.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 9
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 9
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 13
3.1. Kết quả tạo màng cellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus. ............ 13
3.1.1. Kết quả tạo chủng vi khuẩn Gluconacetobacter từ dịch trà.................... 13
3.1.2. Kết quả tạo màng cellulose vi khuẩn từ 3 môi trường............................. 13
3.2. Kết quả thu màng thô từ 3 môi trường ........................................................... 14
3.3. Kết quả xử lý màng trước khi hấp thụ ............................................................ 14
3.4. Kết quả quét phổ hấp thụ thuốc diclofenac .................................................... 15
3.5. Kết quả dựng đường chuẩn thuốc diclofenac ................................................ 16

3.6. Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ thuốc của màng ....................................... 17
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 23
I. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 23
II. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 24
* Tài liệu nước ngoài ................................................................................................. 25


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn...................................................... 4
Hình 1.2. Công thức hóa học ....................................................................................... 5
Hình 3.1. Dịch giống lên men sau 7 -10 ngày ........................................................... 13
Hình 3.2. Màng cellulose vi khuẩn ............................................................................ 14
Hình 3.5. Xử lý màng................................................................................................. 15
Hình 3.6. Phổ hấp thụ của thuốc ................................................................................ 16
Hình 3.7. Phương trình đường chuẩn của diclofenac ................................................ 16
Hình 3.8. Đưa màng vào hấp thụ ............................................................................... 17
Hình 3.9. Thu mẫu đo OD sau thời gian hấp thụ ....................................................... 17
Hình 3.10. Biểu đồ so sánh khả năng hấp thụ thuốc của màng không ép nước trong 3
môi trường.................................................................................................................. 21
Hình 3.11. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng ép nước trong 3 môi trường
.................................................................................................................................... 21
Hình 3.12. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng có độ dày 0,5cm ở 3 môi
trường khác nhau........................................................................................................ 22
Hình 3.13. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ thuốc của màng 1cm trong 3 môi
trường khác nhau........................................................................................................ 22

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách vật liệu sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 8
Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị dùng trong nghiên cứu ............................................ 8

Bảng 2.3. Thành phần của môi trường lên men tạo màng ........................................... 9
Bảng 3.1. Nồng độ diclofenac và giá trị OD tương ứng (n = 3) ................................ 16
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng ........................................................... 18
Bảng 3.3. Lượng thuốc hấp thụ vào màng sau thời gian 2 giờ .................................. 19
Bảng 3.4. Hiệu suất thuốc hấp thụ vào các loại màng trong 2 giờ ............................ 20


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thấp khớp là một bệnh lý mà rất nhiều người dân trong các quốc gia trên thế giới
mắc phải và Việt Nam của chúng ta cũng không ngoại lệ. Tỉ lệ người Việt Nam mắc
bệnh cao chiếm khoảng 20% số người mắc bệnh trên thế giới ở bất cứ độ tuổi và
nghề nghiệp nào
Diclofenac – dạng thuốc chống viêm không steroid dùng chủ yếu dưới dạng muối
Natri, dẫn chất của acid phenylacetic có thể chống viêm, giảm sốt và giảm đau.[2]
Diclofenac ức chế mạnh hoạt tính của COX (cyclooxygenase), do đó làm giảm sự
tạo thành các chất trung gian của quá trình tiêu viêm như: prostaglandin,
prostacyclin và thromboxan[2].
Cũng như một số loại thuốc chống viêm không steroid hiện nay, diclofenac natri
có ảnh hưởng không tốt đến đường tiêu hóa vì chúng giảm khả năng tổng hợp
prostaglandin dẫn đến tạo mucin có thể gây một vài chứng bệnh về thận như viêm
thận kẽ hay viêm cầu thận ngoài ra có thể gây hoại tử nhú và một số bệnh liên quan
khác[2]
Cellulose vi khuẩn được tạo thành từ các chuỗi không phân nhánh, gồm nhiều sợi
siêu nhỏ kết hợp với nhau tạo thành bó có bản chất là hemicellulose được gọi là
chuỗi polimer β – 1,4 glucopyranose khác cellulose thực vật về cấu trúc đại thể.
Cellulose vi khuẩn có các tính chất như độ bền cao, bị phân hủy sinh học, đàn hồi
tốt, không độc,... đặc biệt là có khả năng ngăn cản vi khuẩn tốt. Vì có những đặc tính
ưu việt như vậy mà cellulose vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong các ngành công
nghiệp đời sống như thực phẩm, công nghiệp, mĩ phẩm và đặc biệt là y học[7,12,21].

Với mục đích nhằm khảo sát các đặc tính của vật liệu cellulose trước khi cho hấp
thụ và sau khi cho hấp thụ thuốc Diclofenac natri ở các môi trường khác nhau và so
sánh khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose được tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường nuôi cấy chúng tôi thực hiện đề
tài: “ Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac Natri của vật liệu
Cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường”.
2. Mục đích
- Tạo ra vật liệu cellulose từ Gluconacetobacter Xylinus trong 3 loại môi trường
khác nhau.
1


- So sánh sự hấp thụ thuốc thuốc Diclofenac Natri từ 3 môi trường khác nhau: môi
trường chuẩn,môi trường nước dừa, môi trường nước vo gạo từ đó tìm ra môi trường
nào có khả năng hấp thụ được nhiều hơn.
3. Nội dung nghiên cứu
- Chế tạo màng cellulose vi khuẩn từ Gluconacetobacter Xylinus được nuôi dưỡng
và lên men trong 3 môi trường: môi trường chuẩn, môi trường nước dừa và môi
trường nước vo gạo.
- Tiến hành hấp thụ thuốc Diclofenac Natri vào màng cellulose vi khuẩn trong các
khoảng thời gian cố định,xác định được màng đã hấp thụ được bao một lượng thuốc
là bao nhiêu và hiệu suất hấp thu của màng ở các môi trường đó là bao nhiêu.
- So sánh lượng thuốc được màng hấp thụ và hiệu suất mà màng hấp thụ được ở cả
ba môi trường.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp thêm nhiều kiến thức về màng cellulose vi khuẩn và ứng dụng của nó
trong đời sống.
- Tăng nhận thức về vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus trong việc tạo màng
cellulose và từ đó tìm ra môi trường có khả năng hấp thu thuốc tốt hơn.

- Ứng dụng kiến thức về Gluconacetobacter Xylinus để tạo màng cellulose vi khuẩn
ứng dụng vào trong các nghiên cứu để khắc phục điểm hạn chế của một số loại thuốc
hiện nay.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Biết được các tạo ra màng cellulose vi khuẩn từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
Xylynus.
- Tạo ra được màng cellulose để nạp thuốc nhằm khắc phục những hạn chế của
thuốc.
- Khắc phục được những hạn chế của thuốc diclofenac natri từ đó tăng hiệu quả của
thuốc trong điều trị.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của Gluconacetobacter Xylinus
1.1.1. Phân loại Gluconacetobacter xylinus
Tên: Gluconacetobacter Xylinus
Chi: Gluconacetobacter
Họ: Acetobacteraceaea
1.1.2. Hình thái của Gluconacetobacter Xylinus.
Gluconacetobacter là chủng vi khuẩn không thể di chuyển có cấu tạo tế bào
dạng hình que, thường đứng riêng lẻ hoặc có đôi lúc thành chuỗi, có tế bào dạng
thẳng hoặc cong, kích thước khoảng 2 µm, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn
gram âm hóa dị dưỡng và hiếu khí.Khi nồng độ acid vượt quá giới hạn thì vi khuẩn
sẽ bị ức chế hoạt động [7].
Khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng thì vi khuẩn Gluconacetobacter hình
thành một lớp màng phía trên bề mặt môi trường. Còn nếu nuôi ở môi trường lắc thì
sẽ tạo thành các hạt nhỏ kích thước không đồng đều và phân tán khắp mọi nơi [7].
Gluconacetobacter xylinus có thể sản xuất cellulose khi được phát triển trong

điều kiện hiếu khí. Cellulose do sinh vật này sản xuất rất tinh khiết và có tiềm năng
sử dụng trong ngành y sinh
1.1.3. Đặc điểm sinh lí sinh hóa của Gluconacetobacter Xylinus
Ngưỡng nhiệt thuận lợi cho sự phát triển của Gluconacetobacter từ 25 -35 độ C.
Có khả năng chịu được pH ở nồng độ thấp [9]
1.2. Cellulose vi khuẩn
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose vi khuẩn
A.J.Brown đã trình bày sự tổng hợp cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter
vào năm 1886. Nhưng cellulose vi khuẩn thật sự được quan tâm và được nghiên cứu
nhiều là vào những năm đầu của thế kỉ XX [17].
Màng cellulose vi khuẩn có thể được tạo ra bởi một số chi vi khuẩn phổ biến:
Achromobacter,Agrobacterium,Azotobacter,Sarcina,Zoogloea, Gluconacetobacter.
Hiện nay họ Acetobacteriaceae có 10 chi, trong đó Gluconacetobacter là chi duy
nhất có khả thể tổng hợp được cellulose [17].
Cellulose vi khuẩn được cấu tạo bởi chuỗi β – 1,4 glucopyranose, mạch
thẳng, có đường kính nhỏ hơn 100Ao[17], có khả năng thấm hút cao, sự kết tinh cao
(60%), độ polymer hóa lớn, độ bền cơ học cao,... [17].
3


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn
1.2.2. Các tính chất đặc biệt
- Màng cellulose có độ tinh sạch cao hơn các màng khác có khả năng phục hồi và tái
sinh.
- Có độ bền cơ học cao, trọng lượng thấp, lực căng tốt và kích thước màng ổn định.
- Khả năng giữ nước tốt hơn các màng khác, độ ẩm cao.
1.2.3. Quá trình tạo màng cellulose vi khuẩn từ vi khuẩn Gluconacetobacter
Vi khuẩn Gluconacetobacter hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài
vào bên trong cơ thể để trao đổi chất. Điều này chỉ xảy ra trong môi trường nhiều
chất dinh dưỡng như carbonhydrate, các loại vitamin như B1, B12, B2,... và các chất

kích thích sinh trưởng. Một phần tổng hợp cellulose thải ra môi trường bên ngoài tạo
thành màng. [7]
Gluconacetobacter Xylinus sẽ thực hiện trao đổi chất bằng việc hấp thụ đường và
các acid béo trong môi trường lỏng để tạo thành tiền chất tiết ra ngoài nhờ hệ thống
lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme.
1.2.4. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn
Màng cellulose vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của cuộc sống
và đặc biệt là y học khi màng cellulose vi khuẩn có thể dùng để che phủ vết thương,
chế tạo màng trị bỏng vào năm 2012 có tẩm dung dịch Becberin clorid 0,1%, không
gây đau, dị ứng hay kích ứng da.[1,7,11 - 13,15 - 17,21- 23]
1.3. Lịch sử nghiên cứu
1.3.1. Trên thế giới
Công trình nghiên cứu tạo màng cellulose vi khuẩn được tổng hợp từ
Gluconacetobacter Xylinus được quan tâm đến từ khá sớm trên thế giới. Tuy nhiên
phải đến thế kỉ thứ XX thì vấn đề này mới được quan tâm một cách rõ nét hơn nhờ
vào các công trình nghiên cứu nổi trội ở thời điểm đó. Một trong những công trình
4


nghiên cứu đó không thể không kể đến công trình nghiên cứu khả năng tổng hợp
cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus của Hestrin et al. vào năm 1954.
Đây được coi là viên gạch đầu tiên đặt nền móng cho những nghiên cứu sau này về
sự lên men tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus [26]
Tiếp theo công trình nghiên cứu của Hestrin vào năm 1957, Next và Colvin đã
đưa ra được minh chứng cho việc trong môi trường có ATP và đường thì
Gluconacetobacter Xylinus có thể tự tổng hợp được. Ngoài ra việc nghiên cứu sử
dụng màng để kiểm soát in vitro của thuốc Becberine được Huang et al. nghiên cứu
và cho ra kết quả rằng thuốc đã được giải phóng chậm hơn, thí nghiệm này của ông
còn được thực hiện ở trên dạ dày và ruôt cũng cho kết quả tương tự [3]
1.3.2. Tại Việt Nam

Việc nghiên cứu và ứng dụng màng cellulose trong các nghành công nghiệp, y tế
ở Việt Nam hiện nay vẫn còn khá mới lạ và mới thu hút được sự quan tâm của các
nhà nghiên cứu trong vài năm trở lại đây. Các nghiên và đề tài này vẫn còn khá ít
chủ yếu là nghiên cứu dừng lại ở việc tạo màng trị bỏng, hay liên quan đến ngành
thực phẩm.[7][11]
1.4. Thuốc Diclofenac Natri
Diclofanac là một dẫn xuất của acid 2 – amino benzen acetic, có sinh khả dụng
thấp do kém tan. Vì vậy, dạng được dùng thường là muối của nó có độ tan lớn hơn,
ổn định hơn như muối: Na+, K+, diethylamin, N- ( 2- hydroxy ethyl) pyrrolidin.
Trong đó muối Natri Diclofenac được sử dụng nhiều hơn cả [2]

Hình 1.2. Công thức hóa học
- Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2
- Loại chống viêm không steroid
- Tồn tại ở nhiều loại khác nhau như viên nén, thuốc tiêm, thuốc đạn, gel bôi,...[2]

5


1.4.1. Tính chất.
Dạng bột có màu trắng hoặc vàng. Dễ tan trong methanol, tan trong ethanol và ít
tan trong nước.
1.4.2. Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng
Diclofenac Natri là thuốc chống viêm không steroid có tác dụng rất tốt trong việc
chống viêm, giảm đau,... ức chế sự tạo thành COX từ đó làm giảm sự tạo thành các
chất trung gian của quá trình tiêu viêm [2][4]
Diclofenac gây hại cho đường tiêu hóa, ức chế sự tổng hợp prostaglandin do đó
có thể gây nên những bệnh liên quan đến thận như viêm thận, thận hư hay một số
căn bệnh khác như hoại tử nhú, suy tim thận [2]
Diclofenac hấp thụ qua đường tiêu hóa và hấp thụ nhanh vào lúc đói.Sau 2 giờ

khi uống nồng độ đạt tối đa ở huyết tương, sau 4-6 giờ nồng độ trong bao hoạt dịch
đạt mức cao nhất. Tác dụng của thuốc xuất hiện sau tiêm bắp từ 20- 30 phút, sau khi
cho thuốc vào trực tràng từ 30-60 phút, sau khi uống từ 60-120 phút [2][4].
1.4.3. Chỉ định
- Viêm khớp mạn, thoái hóa khớp.
- Thống kinh nguyên phát.
- Đau cấp và đau mạn
- Viêm đa khớp dạng thấp thiếu niên [2]
1.4.4. Chống chỉ định
- Viêm loét dạ dày
- Bệnh nhân bị hen suyễn, co thắt phế quản, chảy máu, bệnh tim,ứ máu, suy gan suy
thận và những bệnh nhân mẫn cảm với các thành phần khác như aspirin hay các
thuốc chống viên không steroid khác.
- Người đang dùng thuốc chống đông Coumarin [2], [4]
1.4.5. Tác dụng không mong muốn của thuốc
- Tác dụng phụ thường gặp:
+ Đau nhức đầu, trong người cảm giác bồn chồn khó chịu.

6


+ Đau bụng trên, mất cảm giác muốn ăn, tiêu chảy, muốn nôn và nôn, khó
tiêu, đầy bụng,...
+ Tăng các transaminase ở gan
- Tác dụng phụ ít gặp:
+ Đau bụng , đi ngoài ra máu, kích ứng tại chỗ, chảy máu đường tiêu hóa,...
+ Dị ứng, nổi mề đay, choàng, huyết áp giảm đột ngột, viêm mũi,...
+ Trầm cảm, muốn ngủ, hay ngủ gật, lo lắng vô cứ, dễ kích động, người cảm
thấy khó chịu bất an,...
+ Nổi mề đay

+ Co thắt phế quản
+ Thị lực giảm sút.
+ Ù tai
- Tác dụng phụ hiếm gặp:
+ Dị ứng toàn thân, phù toàn thân,...
+ Viêm màng não vô khuẩn.
+ Giảm số lượng bạch cầu, giảm số lượng bạch cầu trung tính, giảm số lượng
tiểu cầu, , tăng số lượng bạch cầu ái toan,…
+ Rối loạn các chức năng của gan.
+ Suy giảm một số chức năng của thận [4].

7


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Vi khuẩn được tạo ra từ lên men dịch trà xanh nuôi cấy tại phòng thí nghiệm
của viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Bảng 2.1. Danh sách vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT
Tên vật liệu
Nguồn gốc
1. Thuốc Diclofenac
Trung Quốc
2. Acid Acetic
Việt Nam
3. D - Glucose
Trung Quốc

4. Amoni sulfat
Trung Quốc
5. Disodium photphate
Trung Quốc
6. Acid Citric
Trung Quốc
7. Cao nấm men
Mỹ
8. Peptone
European Union
9. Natri hidroxit
Việt Nam
10. Nước cất 2 lần
Viện NDKH&ƯD
11. Methanol
Trung Quốc
12. Nước dừa già
Viện NCKH&ƯD
13. Nước vo gạo
Viện NCKH&ƯD
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
STT
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị
Nước sản xuất
Nồi hấp khử trùng HV- 110/HIRAIAMA Nhật Bản
Máy đo quang phổ UV – Vis 2450
Shimardu – Nhật Bản
Cân phân tích
Sartorius – Thụy Sỹ
Buồng cấy vô trùng
Haraeus
Tủ sấy, tủ ấm
Binder – Đức
Khuấy từ gia nhiệt
IKA – Đức

Dụng cụ nghiên cứu: Bình định mức, pipet, micropipet, erlen, thiết bị lên men tạo
màng kích thước 1,5cmx0,5cm và 1,5cmx1cm, buồng nuôi cấy, bình tam giác, ống
nghiệm, becher,…

8


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1: Tạo màng cellulose từ ba môi trường: môi trường chuẩn, môi
trường nước dừa và môi trường nước gạo.
- Thí nghiệm 2: Xử lý màng và kiểm tra độ sạch của màng.
- Thí nghiệm 3: Tính toán xác định phổ hấp thụ của thuốc Diclofenac.
- Thí nghiệm 4: Dựng đường chuẩn thuốc Diclofenac.
- Thí nghiệm 5: Cho màng nạp thuốc trong 2 giờ.
- Thí nghiệm 6: So sánh khả năng hấp thụ thuốc ở 3 loại màng.

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Chế tạo hệ mạng lưới cellulose vi khuẩn

Bước 1: Chuẩn bị môi trường [5,6,8,13,20]
Bảng 2.3. Thành phần của môi trường lên men tạo màng
Các loại môi trường
Thành phần
MT1
MT2
MT3
( MTchuẩn) (MT dừa) (MT gạo)
Glucose
20 g
20 g
20 g
Pepton
5g
10 g
10 g
Dinatri phosphat khan (Na2HPO4)
2,7 g
Acid Ctric
1,15 g
Cao nấm men
5g
Nước cất 2 lần
1000 ml
Diamoni photphat
0,3 g
0,3 g

Amoni sulfat
0,5 g
0,5 g
Nước dừa già
1000 ml
Nước vo gạo
1000 ml
Dịch giống
10%
10%
10%
Bước 2: Hấp khử trùng ở nhiệt độ 115⁰C trong 15 phút.
Bước 3: Khử trùng môi trường bằng tia UV trong 15 phút.
Bước 4: Cho thêm vào môi trường 10% dịch giống, lắc đều tay.
9


Bước 5: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy, bịt kín miệng bằng gạc đã được khử
trùng, đặt trong nơi tĩnh khoảng 7 – 14 ngày trong nhiệt độ 28⁰C.
Bước 6: Thu hoạch màng, xử lý màng.
2.2.2.2. Xử lý màng trước khi hấp thụ và đánh giá độ sạch của màng

Mục đích:Loại bỏ các chất bẩn, độc hại có trong môi trường nuôi cấy..
Phương pháp: Vi khuẩn lên men tạo màng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
+ Để giải phóng các độc tố và phá vỡ tế bào vi khuẩn đem màng đi hấp trong NaOH
3% trong thời gian 15 phút.
+ Vớt màng đã ngâm NaOH đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng trắng trong. Thử
quỳ tìm đến khi đạt trung tính ta thu được màng sạch [13,6]
2.2.2.2.2. Đánh giá độ sạch của màng
Mục đích: Đảm bảo có thể loại bỏ vi khuẩn có hại

* Tìm sự hiện diện của protein trong màng tinh chế
Nguyên tắc: Xác định lượng protein còn lại trong màng bằng cách tạo kết tủa
Tiến hành: Cắt nhỏ màng sạch bỏ vào 50ml nước cất và rung trong máy rung
siêu âm 10 phút. Acid triclor acetic 1% sẽ phát hiện sự có mặt của protein trong dịch
chiết. Mẫu dương ở đây là pepton còn mẫu âm là nước cất 2 lần. Phản ứng dương sẽ
cho kết tủa đục. So sánh với mẫu âm không chứa protein [24,11].
Màng cellulose vi khuẩn đã được làm sạch dùng để tạo màng hấp thụ thuốc
phải đạt được những tính chất:
+ Mềm, dẻo, áp sát vào da và có độ che phủ tốt.
+ Có khả năng hút nước và dịch mô, độ ẩm thích hợp [18]
2.2.2.3. Tìm phổ hấp thụ của thuốc diclofenac

Nguyên lí: Để tìm bước sóng mà thuốc diclofenac natri hấp thụ tối đa ta dùng
máy đo UV – 2450.
Thực hiện: Cân 0,025g thuốc diclofenac rồi pha trong 90ml dung dịch đệm
Methanol. Methanol chính là dung dịch mẫu trắng dùng để hòa tan thuốc. Giới hạn
bước sóng ở khoảng 200 – 800nm, tiến hành đo 3 lần để có kết quả có độ tin cậy.
10


2.2.2.4. Cách dựng đường chuẩn diclofenac

Nguyên lí:Đo quang phổ hấp thụ của thuốc diclofenac ở các nồng độ khác
nhau bằng máy đo UV -2450 với bước sóng có phổ hấp thụ cao nhất.
Thực hiện: Chuẩn bị mẫu diclofenac ở các nồng độ: 10%, 20%, 40%, 60%,
80%, 100% trong dung dịch Methanol. Mẫu trắng là Methanol. Dựng đường chuẩn
và lập phương trình đường chuẩn của diclofenac bằng phần mềm Excel 2010 [10].
Để có độ tin cậy cao ta lặp lại 3 lần.
2.2.2.5. Lượng thuốc mà màng hấp thụ được. Tính hiệu suất.

Để xác định được lượng thuốc mà màng hấp thụ ta tiến hành trên 4 loại màng
cellulose vi khuẩn ở 3 loại môi trường khác nhau. Môi trường chuẩn, nước dừa và
gạo.
-

Mẫu 1: Màng dày 0,5 cm.
Mẫu 2: Màng dày 0,5 cm ép nước 50%
Mẫu 3: Màng dày 1 cm
Mẫu 4: Màng dày 1cm ép nước 50%

Chuẩn bị 12 bình tam giác nhỏ trong đó có chứa 12 màng và 25 mg thuốc pha
trong 100ml dung dịch Methanol. Lắc các bình chứa màng trong máy lắc với tốc độ
150 vòng/ phút lần lượt trong các mốc thời gian: 0,5h ; 1h; 1,5h; 2h. Để xác định
được lượng thuốc còn lại trong dung dịch tại mốc thời gian lấy mẫu ta đem mẫu đi
đo quang phổ bằng máy đo UV- 2450. Từ việc xác định được lượng thuốc còn lại ta
xác định được lượng thuốc hấp thụ vào màng. Lặp lại thí nghiệm 3 lần để lấy giá trị
trung bình và tính toán.
Thay giá trị của OD đã đo được vào phương trình đường chuẩn đã được tính
toán từ trước ta được nồng độ diclofenac trong dung dịch, từ đó sẽ cho ra kết quả
khối lượng diclofenac trong dung :
�

��� (��)

�

��� (��)

C% ( ) =

x 100% (1)

Trong đó:
C%: Nồng độ phần trăm khối lượng – thể tích chỉ số mg chất tan có trong
100ml dung dịch.
Mct: khối lượng chất tan (mg)
Mdd/vdd : thể tích của dung dịch (ml)
11


Công thức tính khối lượng diclofenac được màng hấp thụ:
Mht = mtr – ms (2)
Trong đó:
mht: khối lượng diclofenac được màng hấp thụ (mg)
mtr: khối lượng diclofenac ban đầu có mặt trong dung dịch (mg)
ms: khối lượng diclofenac còn lại sau khi đã được hấp thụ vào màng
Tỉ lệ phần trăm diclofenac được hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn được
tính theo:
EE (%) =

(��−��)
��

x 100% (3)

Trong đó:
EE: phần trăm thuốc được hấp thụ vào màng (%)
Qt: lượng thuốc theo lý thuyết (mg)
Qd: lượng thuốc còn lại (mg)
2.2.2.6. Xử lý thống kê

Số liệu được xử lý qua phần mềm Excel 2010 và được biểu diễn dưới dạng số
trung bình ± độ lệch chuẩn. Giá trị trung bình được kiểm chứng sự chính xác thông
qua phần mềm test thống kê.

12


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tạo màng cellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus
3.1.1. Kết quả tạo chủng vi khuẩn Gluconacetobacter từ dịch trà
Sau 7 -10 ngày ở nhiệt độ 28ºC thu được dịch lên men và màng nổi trên bề
mặt [19,23]

Hình 3.1. Dịch giống lên men sau 7 -10 ngày
3.1.2. Kết quả tạo màng cellulose vi khuẩn từ 3 môi trường
Gluconacetobacter Xylinus sẽ lấy chất dinh dưỡng từ môi trường để tổng hợp
màng cellulose vi khuẩn. Màng sẽ được hình thành phía trên bề mặt môi trường sau
7 – 10 ngày và đến khi màng đạt được độ dày như ý muốn thì tiến hành thu màng.

13


Hình 3.2. Màng cellulose vi khuẩn
3.2. Kết quả thu màng thô từ 3 môi trường
Đợi đến khi màng có độ dày thích hợp thì tiến hành thu màng khỏi môi
trường. Màng thu từ môi trường rất dễ dàng, dẻo và mọng nước.

Hình 3.3. Màng dày 1cm

Hình 3.4. Màng dày 0,5cm

3.3. Kết quả xử lý màng trước khi hấp thụ
Để loại bỏ các độc tố trong màng cũng như phá vỡ tế bào vi khuẩn ta hấp
màng trong NaOH 3% trong nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA.
Sau đó, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy trong 24 giờ đến khi màng trắng
trong ta thu màng.

14


Hình 3.5. Xử lý màng
3.4. Kết quả quét phổ hấp thụ thuốc diclofenac
Sau khi đo ta thu được bước sóng hấp thụ tối đa là 283nm.
5.000

Abs.

4.000

2.000

-0.100
200.00

400.00

600.00

nm.

15

800.00


Hình 3.6. Phổ hấp thụ của thuốc
3.5. Kết quả dựng đường chuẩn thuốc diclofenac
Kết quả xây dựng đường chuẩn được thể hiện trong bảng sau với bước sóng
283nm
Bảng 3.1. Nồng độ diclofenac và giá trị OD tương ứng (n = 3)
Nồng độ

Lần thứ 1

Lần thứ 2

Lần thứ 3

10%
20%
40%
60%
80%
100%

0,105
0,288
0,587
0,769

1,052
1,312

0,106
0,29
0,589
0,765
1,053
1,313

0,103
0,291
0,583
0,768
1,058
1,314

Giá trị trung
bình
0.105 ±0,00153
0,289 ±0,00153
0,586 ±0,00306
0.767 ±0,00208
1,054 ±0,00321
1.313 ±0,001

Hình 3.7. Phương trình đường chuẩn của diclofenac
Phương trình: y= 0.2431x - 0.1655 (R=0.996)
Trong đó: x: nồng độ diclofenac (mg/ml)
y: Giá trị đo OD tương ứng với nồng độ x

16


R2: Bình phương hệ số tương quan
3.6. Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ thuốc của màng

Màng dừa khi cho hấp thụ

Màng gạo khi cho hấp thụ

Hình 3.8. Đưa màng vào hấp thụ

Hình 3.9. Thu mẫu đo OD sau thời gian hấp thụ

17


Kết quả đo quang phổ được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng
Thời gian hấp thụ của màng ( giờ)
Độ dày Loại
Đặc điểm
0,5h
1h
1,5h
2h
màng màng
của màng
0,5 cm Màng Màng giữ
1,064

0,985
0,893
0,586
chuẩn nguyên nước ±0,0028 ±0,0026 ±0,0018 ±0,0017
Màng ép 50% 1,073
0,784
0,635
0,579
nước
±0,0023 ±0,0023 ±0,0024 ±0,0025
Màng Màng giữ
1,098
0,992
0,876
0,543
dừa
nguyên nước ±0,0028 ±0,0031 ±0,0034 ±0,0025
Màng ép 50% 1,087
0,921
0,754
0,539
nước
±0,0016 ±0,0018 ±0,0027 ±0,0024
Màng Màng giữ
1,102
1,105
0,917
0,508
±0,0014
gạo

nguyên nước ±0,0021 ±0,0016 ±0,011
Màng ép 50% 1,094
0,983
0,089
0,498
nước
±0,0025 ±0,0024 ±0,0025 ±0,0026
1 cm
Màng Màng giữ
1,065
1,782
0,724
0,592
chuẩn nguyên nước ±0,0025 ±0,0022 ±0,0015 ±0,0029
Màng ép 50% 1,014
0,986
0,725
0,405
nước
±0,0023 ±0,0022 ±0,0013 ±0,0018
Màng Màng giữ
1,071
0,897
0,87
0,578
dừa
nguyên nước ±0,0019 ±0,0012 ±0,0015 ±0,0017
Màng ép 50% 1,028
0,789
0,886

0,532
nước
±0,0023 ±0,0031 ±0,0027 ±0,0021
Màng Màng giữ
1,087
0,529
0,925
0,598
gạo
nguyên nước ±0,0016 ±0,0025 ±0,0027 ±0,0026
Màng ép 50% 1,053
0,487
0,898
0,585
nước
±0,0013 ±0,0015 ±0,0027 ±0,0029
Từ bảng trên ta thấy OD giảm dần từ 0,5 giờ đến 2 giờ và đạt cực đại không
đổi ở 2 giờ từ đó có thể kết luận rằng lượng thuốc hấp thụ tăng dần qua các khoảng
thời gian và mốc thời gian là 2 giờ là mốc cao nhất với p < 0,05
Lấy kết quả OD thu được từ việc đo trên thay vào phương trình đường chuẩn
sẽ cho ta kết quả của nồng độ thuốc diclofenac có trong dung dịch. Để tìm khối
lượng diclofenac có trong dung dịch (mct) ta thay giá trị C% vào trong công thứ nhất
(1). Để tìm lượng diclofenac natri hấp thụ vào màng (mht) ta thay giá trị của mct vào
công thức thứ hai (2) . Sau đó thay mht vào công thức thứ ba (3) để tìm ra tỉ lệ thuốc
được hấp thụ vào màng.
18