Luận văn ngành Y dược: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (DH)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI IMIDACLOPRID VÀ
AZOXYSTROBIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Th.s. NGUYỄN PHƯỚC ĐỊNH

LÊ HỮU BẢO TRÂN
MSSV: 12D720401175
Lớp: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI IMIDACLOPRID VÀ
AZOXYSTROBIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Th.s. NGUYỄN PHƯỚC ĐỊNH

LÊ HỮU BẢO TRÂN
MSSV: 12D720401175
Lớp: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017


LỜI CÁM ƠN
Qua 5 năm học tập và rèn luyện tại trường ĐH Tây Đô, dưới sự chỉ bảo và giảng
dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy cô khoa Dược-Điều dưỡng đã
truyền đạt cho em những kiến thức về lý thuyết và thực hành để em có thể hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp. Chính vì thế, một trong những yếu tố không nhỏ tạo nên “sản
phẩm trí tuệ” này là sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của giáo viên hướng dẫn và các
thầy cô. Bên cạnh đó còn có sự ủng hộ của gia đình và bạn bè mà em mới có thể hoàn
thành khóa luận một cách thuận lợi nhất.
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Nguyễn Phước Định,
người trực tiếp hướng dẫn em trong quá trình làm luận văn. Không chỉ gợi ý và hướng
dẫn em trong quá trình tìm hiểu, đọc tài liệu và lựa chọn đề tài, thầy còn tận tình chỉ
bảo em những kĩ năng phân tích, khai thác tài liệu để có được những lập luận phù hợp
với nội dung của khóa luận. Hơn nữa, thầy còn rất nhiệt tình trong việc đốc thúc quá
trình viết khóa luận, đọc và đưa ra những nhận xét, góp ý để em có thể hoàn thành luận
văn một cách tốt nhất.

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi đến các thầy cô giáo đang hoạt động, giảng dạy tại
phòng Kiểm Nghiệm lòng biết ơn sâu sắc về những kiến thức và kĩ năng mà các thầy
cô đã truyền đạt, chỉ em thêm những kiến thức em còn thiếu sót, cũng như đóng góp
thêm ý kiến cho việc hoàn thành khóa luận.
Cần Thơ, tháng 6 năm 2017
Sinh viên

Lê Hữu Bảo Trân


TÓM TẮT
Hai hóa chất bảo vệ thực vật phổ biến nhất là imidacloprid và azoxystrobin được
nhiều nông dân tin dùng vì hai loại này có hiệu quả cao trong việc ngăn ngừa sâu bệnh
và nấm mốc gây hại, nên imidacloprid và azoxystrobin được chọn trong nghiên cứu
này. Điều này đặt ra yêu cầu cần có phuơng pháp phân tích chính xác và đơn giản xác
định hai hoạt chất trên. Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định
lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC). Kết quả nghiên đã lựa chọn được với điều kiện sắc ký trong đó cột
sắc ký RP- C18 (250 x 4,6mm, 5µm), pha động gồm acetonitril –nước với tỷ lệ (55%:
45%), tốc độ dòng 1ml/phút và phát hiện ở bước sóng 250 nm. Cả hai chất đã tách
được hoàn toàn trong thời gian 15 phút. Giới hạn định lượng của imidacloprid và
azoxystrobin lần lượt là 0,0048 ppm và 0,048 ppm. Diện tích pic và nồng độ có mối
tương quan tuyến tính với hệ số tương quan của imidacloprid là 0,9978 và của
azoxystrobin là 0,997. Phương pháp có độ đúng nằm trong khoảng 98-102% và độ lặp
lại tốt với RSD < 2%. Vì vậy quy trình có thể sử dụng để định lượng nhanh
imidacloprid và azoxystrobin từ đó xác định dư lượng của hai chất này trong dược
liệu.
Từ khóa: imidacloprid, azoxystrobin, định lượng, HPLC.

MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
TÓM TẮT
MỤC LỤC .......................................................................................................................i
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................1
1.2. MỤC TIÊU ...........................................................................................................1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................2
2.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU .................................................2
2.1.1. Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật ............................................................... 2
2.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật .................................................................2
2.1.3. Imidacloprid ...................................................................................................3
2.1.3.1. Khái niệm ................................................................................................ 3
2.1.3.2. Cấu tạo .....................................................................................................3
2.1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học .....................................................................3
2.1.3.4. Độc tính của Imidacloprid .......................................................................4
2.1.3.5. Cơ chế tác động của imidacloprid ...........................................................4
2.1.4. Azoxystrobin ..................................................................................................5
2.1.4.1. Khái niệm ................................................................................................ 5
2.1.4.2. Cấu tạo .....................................................................................................5
2.1.4.3. Tính chất vật lý và hóa học .....................................................................5
2.1.4.4. Độc tính của azoxystrobin .......................................................................5
2.1.4.5. Cơ chế tác động .......................................................................................6
2.1.5. Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin ..........6
2.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ....................................................6
2.1.6.1. Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp HPLC .... 6
2.1.6.2. Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC ...8
2.1.6.3. Phương pháp định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và
azoxystrobin. ........................................................................................................8
i

2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .......9
2.2.1. Khái niệm .......................................................................................................9
2.2.2. Phân loại .........................................................................................................9
2.2.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC ........................................................9
2.2.3.1. Bình đựng dung môi ..............................................................................10
2.2.3.2. Bộ phận khử khí ....................................................................................10
2.2.3.3. Bơm cao áp ............................................................................................ 11
2.2.3.4. Bộ phận tiêm mẫu..................................................................................11
2.2.3.5. Cột sắc ký .............................................................................................. 11
2.2.3.6. Đầu dò ...................................................................................................11
2.2.3.7. Bộ phận ghi tín hiệu ..............................................................................11
2.2.3.8. Thiết bị in dữ liệu ..................................................................................12
2.2.4. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột ....................................................12
2.2.5. Sắc ký phân bố hiệu năng cao ......................................................................12
2.2.6. Các thông số đặc trưng trong HPLC ............................................................ 13
2.2.6.1. Thời gian lưu tR ....................................................................................13
2.2.6.2. Hệ số phân bố K ....................................................................................14
2.2.6.3. Hệ số dung lượng K’ .............................................................................14
2.2.6.4. Hệ số tách α ........................................................................................... 15
2.2.6.5. Số đĩa lý thuyết ......................................................................................15
2.2.6.6. Độ phân giải RS ....................................................................................15
2.2.6.7. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký ...................................16
2.2.7. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký ............................................................. 16
2.2.7.1. Lựa chọn pha tĩnh ..................................................................................17
2.2.7.2. Lựa chọn pha động ................................................................................17
2.2.8. Các bước tiến hành sắc ký............................................................................19
2.2.8.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc .............................................................. 19
2.2.8.2. Chuẩn bị dung môi pha động ................................................................ 19

ii


2.2.8.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC ........................................................................19
2.2.8.4. Cách vận hành thiết bị ...........................................................................20
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................21
3.1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ ..............................................................................21
3.1.1. Hóa chất .......................................................................................................21
3.1.1.1. Chất chuẩn ............................................................................................. 21
3.1.1.2. Dung môi ............................................................................................... 21
3.1.2. Dụng cụ - Thiết bị ........................................................................................21
3.1.2.1 Thiết bị....................................................................................................21
3.1.2.2. Dụng cụ .................................................................................................22
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...............................................................................22
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................23
3.3.1. Chuẩn bị dung dịch ......................................................................................23
3.3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký.............................................23
3.3.2.1. Chọn cột.................................................................................................23
3.3.2.2. Chọn bước sóng cho detector ................................................................ 23
3.3.2.3. Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC.................................................23
3.3.2.4. Khảo sát thành phần pha động .............................................................. 24
3.3.2.5. Khảo sát tốc độ dòng .............................................................................25
3.3.3. Thẩm định phương pháp ..............................................................................25
3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống ...........................................................................25
3.3.3.2. Tính đặc hiệu .........................................................................................26
3.3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ...........27
3.3.3.4. Tính tuyến tính ......................................................................................27
3.3.3.5. Độ chính xác ..........................................................................................28
3.3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) ...................................................................28
3.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả .......................................................29

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................30
iii


4.1. CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ...30
4.1.1. Chuẩn bị dung dịch ......................................................................................30
4.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký .............................................................. 30
4.1.2.1. Đặt bước sóng cho detector ...................................................................30
4.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động .............................................................. 31
4.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng ..............................................................................35
4.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT
IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN ............................................................... 35
4.2.1. Thẩm định quy trình .....................................................................................35
4.2.1.1. Tính phù hơp hệ thống ..........................................................................35
4.2.1.2 Tính đặc hiệu ..........................................................................................38
4.2.1.3. Xác định LOD và LOQ của thiết bị ......................................................39
4.2.1.4. Tính tuyến tính ......................................................................................40
4.2.1.5. Độ chính xác ..........................................................................................43
4.2.1.6. Độ đúng .................................................................................................45
4.3. THẢO LUẬN .....................................................................................................47
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................48
5.1. KẾT LUẬN.........................................................................................................48
5.2. ĐỀ XUẤT ...........................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 50
PHỤ LỤC

iv


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu, chữ viết tắt

Từ nguyên (nghĩa tiếng Việt)

ACN

:

Acetonitrile

As

:

Hệ số đối xứng

DĐVN

:

Dược điển Việt Nam

HPLC

:

High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

LC50

:

Lethal concentration (Nồng độ gây chết 50% )

LD50

:

Lethal dose (Liều gây chết 50%)

LOD

:

Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)

LOQ

:

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

PDA

:

Photo Diode Array (Dãy diod quang)

ppm

:

Part per million (phần triệu)

Rs

:

Resolution (Độ phân giải)

RSD

:

Relative Standard Deviation
(Độ lệch chuẩn tương đối)

SD

:

Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)

Speak

:

Diện tích pic sắc kí

UV

:

Tử ngoại

Vis

:

Khả kiến

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid ...............................................................................3
Hình 2.2. Cấu trúc của azoxystrobin ...............................................................................5
Hình 2.3. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC .........................................................................9
Hình 2.4. Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B................................................14
Hình 4.1. Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile. ................31
Hình 4.2. Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%). .............................................................. 32
Hình 4.3. Sắc ký đồ ACN/ Nước (95%:5%). ................................................................ 32
Hình 4.4. Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%) ............................................................... 33
Hình 4.5. Sắc ký đồ ACN/ Nước (60%:40%). .............................................................. 33
Hình 4.6. Sắc ký đồ ACN/ Nước (55%:45%). .............................................................. 34
Hình 4.7. Sắc ký đồ ACN/ Nước (50%:50%). .............................................................. 34
Hình 4.8. Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống .........................................36
Hình 4.9. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin ................38
Hình 4.10. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm ....................39

Hình 4.11. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm ..................39
Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid...42
Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin ..42

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid....................................................4
Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin ...................................................6
Bảng 2.3. Lực rửa giải của một số dung môi ................................................................ 18
Bảng 3.1. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC .............................. 21
Bảng 3.2. Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu ......................21
Bảng 3.3. Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước ......................................24
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid............................ 36
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin ..................................37
Bảng 4.3. Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin
trước khi tiêm vào hệ thống HPLC ...............................................................................40
Bảng 4.4: Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn ...........41
Bảng 4.5: Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn ...........41
Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid .............................. 43
Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin ..................................43
Bảng 4.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid .............................. 44
Bảng 4.9. Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid ......................................44
Bảng 4.10. Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin ....................................45
Bảng 4.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid ...........45
Bảng 4.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin ...................46
Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và
azoxystrobin...................................................................................................................48

vii


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và
chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm... Vì vậy hóa chất bảo
vệ thực vật đóng vai trò quan trọng để phòng và loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản
phẩm nông nghiệp. Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng
hóa chất bảo vệ thực vật nhằm tăng năng suất và chất lượng dược liệu.
Gần đây một trong những phương pháp phổ biến nhất là việc sử dụng
imidacloprid và azoxystrobin là hai loại phổ biến nhất trong nông nghiệp để ngăn ngừa
sâu bệnh, côn trùng, nấm mốc ảnh hưởng đến cây trồng. Các công trình nghiên cứu
nước ngoài đã thành công trong việc định lượng imidacloprid hoặc azoxystrobin với
nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng các phương pháp như: quang phổ UVVIS, sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ, sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC)…Trong đó
HPLC là phương pháp thường được sử dụng nhất do phương pháp này rất phổ biến,
thuận lợi, đỡ tốn kém và cho độ chính xác cao hơn so với các phương pháp khác.
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích
mới và hiện đại đã được áp dụng vào việc phân tích, xác định hàm lượng của chúng
nhằm kiểm soát chất lượng của các sản phẩm, đảm bảo an toàn và sức khỏe của người
sử dụng. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những phương
pháp phân tích hiện đại, chính xác và nhanh chóng để phân tích hàm lượng của các
loại hóa chất bảo vệ thực vật đang được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế.
Trong nghiên cứu này định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và
azoxystrobin từ đó có thể xác định dư lượng của hai chất này trong lá, rễ từ dược liệu
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC). Vì vậy đề tài “Xây dựng quy
trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện với mong muốn tìm ra một phương
pháp nhanh, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm.
1.2. MỤC TIÊU

Nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu với hai mục tiêu sau:
 Xây dựng điều kiện phân tích đông thời imidacloprid và azoxystrobin bằng
phương pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS.
 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin.

1


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU
2.1.1. Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật
Hóa chất bảo vệ thực vật là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục
đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ trung
gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của
thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế biến,
bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn
chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay
các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. Hóa chất bảo vệ thực vật còn được
dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây,
tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm. Cũng có thể dùng hóa chất bảo
vệ thực vật cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không
bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển (Trần Cao Sơn, 2015).
2.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật
Các hóa chất bảo vệ thực vật được phân loại theo ba nhóm chính sau:

- Thuốc trừ sâu: là một loại chất được sử dụng để chống côn trùng. Chúng bao
gồm các thuốc diệt trứng và thuốc diệt ấu trùng để diệt trứng và ấu trùng của côn trùng
như: imidacloprid, dichlopropene, methyl isocyanate, chloropicrin, methyl bromide….
Một số chất khác như: aldicarb, dazomet và metham natri, hoạt động chủ yếu qua tiếp
xúc. Gần như tất cả các loại thuốc trừ sâu đều có nguy cơ làm thay đổi lớn các hệ sinh

thái; nhiều loại thuốc trừ sâu độc hại với con người; và các loại khác tích tụ trong
chuỗi thức ăn (Saed Mousa Diab Ali, 2012).
- Thuốc diệt cỏ: Thuốc diệt cỏ kiểu Hormon như 2,4,5-T; 2,4-D;…là những
chất không hiện diện trong đất nhưng có độc tính cao đối với thực vật và thấp đối với
động vật có vú. Các chất thuộc nhóm này ít ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường nhưng
lại hòa tan hoàn toàn trong nước và trong các mạch nước ngầm. Các loại thuốc diệt cỏ
ảnh hưởng trực tiếp trên thân, lá bao gồm: dintrophenols, xianophenols, pentachlorophenol
và Paraquat (Saed Mousa Diab Ali, 2012).
- Thuốc trừ nấm: là những chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng
hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản, chống lại sự phá hoại của nấm mốc,
vi khuẩn ảnh hưởng đến năng suất của cây trồng Nhiều loại thuốc trừ nấm khác nhau
được sử dụng, với các hóa chất có cấu trúc khác nhau. Hầu hết đều có độc tính tương
đối thấp, ngoại trừ các chất thuộc nhóm carbamat như benomyl. Độc tính của thuốc trừ
nấm ảnh hưởng lớn đến môi trường nhất là đối với hệ vi sinh vật trong đất nhưng ảnh
hưởng này chỉ trong thời gian ngắn (Saed Mousa Diab Ali, 2012).
2


Trong nghiên cứu này hai chất hóa chất bảo vệ thực vật khảo sát đó là
imidacloprid và azoxystrobin. Theo các tài liệu trong và ngoài nước đã phân loại
imidacloprid thuộc nhóm thuốc trừ sâu và azoxystrobin thuộc nhóm thuốc trừ nấm.
Dựa vào tính chất và đặc điểm của từng nhóm từ đó chọn ra phương pháp nghiên cứu
phù hợp.
2.1.3. Imidacloprid
2.1.3.1. Khái niệm
Imidacloprid là một trong những loại hoạt chất có phổ được sử dụng rộng rãi
nhất. Nó được dùng để trừ hầu hết các loại sâu hại trong nông nghiệp, lâm nghiệp, trừ
mối,….Do có độ độc bởi vòng Pyridin có gắn với nguyên tử Clo và dị vòng Azo 5
cạnh, có độ độc cao với côn trùng, diệt trừ sâu, bướm, rầy, rệp…(Sacramento, 2002).
2.1.3.2. Cấu tạo[31]

Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid
- Tên chung quốc tế: imidacloprid
- Công thức phân tử: C9H10ClN5O2
- Khối lượng phân tử: 255,662 g/mol
- Danh pháp IUPAC: N-[1-[(6-chloropyridin-3-yl)methyl]-4,5dihydroimidazol-2-yl]nitramide
- Loại HCBVTV: thuốc trừ sâu
- Nhóm: Neonicotinoid
2.1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học (Sprivastava, 2004)
Dạng bột tinh thể màu hoặc bột màu be, có mùi đặc trưng nhẹ
Tỷ trọng: 1.54 g/cm3
- Nhiệt độ nóng chảy ở 144oC
- Áp suất hơi: 1.00 x 10-7 mm Hg (20oC)
- Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo
- Độ tan trong nước: 0,61 g/l (20oC)
- Thời gian bán hủy: Trên 30 ngày (25oC ở pH 7)
- Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: nước, dchloromethane,
isopropanol, toluene ở nhiệt độ 20oC
-

3


-

0.Phân hủy ở pH khoảng 5-11, khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc

2.1.3.4. Độc tính của Imidacloprid (Raihanah, 2016)
Theo một số tài liệu nghiên cứu của các tác giả nước ngoài, imidacloprid gây
độc với động vật ở một liều nhất định, cụ thể trong bảng sau:

Bảng 2.1: Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid
Động vật thí nghiệm

Đường dùng
miệng

Kết quả
LD50 tương đương 130 mg/kg
LD50 > 5000 mg/kg và gây kích

da

ứng da nhẹ

hít

LC50 > 5,33 mg/l

Chuột

Nuốt một lượng lớn có thể gây
nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, lơ
mơ, trầm cảm, chuột rút, run rẩy
và rối loạn hô hấp.

tiêu hóa

mắt

Gây kích ứng mắt

Trong các trường hợp đã được khảo sát về độc tính của Imidacloprid ở người
ngộ độc cấp thường có các dấu hiệu bao gồm buồn ngủ, chóng mặt, nôn mửa, không
tỉnh táo và sốt. Các trường hợp ngộ độc này phụ thuộc vào hàm lượng imidacloprid có
trong chế độ ăn uống (Spivastava, 2004).
 Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người
có chứa imidacloprid là 0,06 mg/kg một ngày (Spivastava, 2004).
2.1.3.5. Cơ chế tác động của imidacloprid (Spivastava, 2004)
Imidacloprid thuộc nhóm Neonicotinoid là nhóm hóa chất bảo vệ thực vật gây
kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự nicotin. Cơ chế gây độc là do các sản phẩm
này này gắn với các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương.
Imidacloprid có độc tính cao với côn trùng vì nó gắn kết tốt hơn với các thụ thể của tế
bào thần kinh của côn trùng. Đường tiếp xúc qua da có độc tính thấp, có thể gây đỏ và
ngứa mắt nhẹ. Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc cấp tính trên người. Các
nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong đường tiêu hóa và loại
trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ.
4


2.1.4. Azoxystrobin (Bursic Vojislava and Lazic Sanja, 2012)
2.1.4.1. Khái niệm
Azoxystrobin là một loại thuốc diệt nấm phổ rộng có hoạt tính chống lại một số
bệnh trên nhiều cây ăn quả và cây cảnh nhằm mục đích ngăn ngừa các bệnh ở lúa, nấm
mốc, rụng lá …gây hại ảnh hưởng đến năng suất trồng trọt.
2.1.4.2. Cấu tạo

Hình 2.2. Cấu trúc của azoxystrobin
- Tên chung quốc tế: Azoxystrobin

- Công thức phân tử: C22H17N3O5

- Khối lượng phân tử: 403,4 g/mol
- Danh pháp IUPAC: Methyl (E)-2-[2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4yl]oxyphenyl]-3-methoxyprop-2-enoate.
- Loại HCBVTV: thuốc trừ nấm
- Nhóm: methoxyacrylates
2.1.4.3. Tính chất vật lý và hóa học (Rao Nageswara, 2012)
- Dạng bột tinh thể màu trắng
- Nhiệt độ nóng chảy ở 116 oC
- Tỷ trọng: 1.25 g/cm3 (ở 25 ºC)
- Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo
- Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: hexane, methanol, toluen, acetone,
ethyl acetat, acetonitril, dichloromethane, nước ở nhiệt độ 20oC.
- Phân hủy khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc nitrogen oxide (N2O)
2.1.4.4. Độc tính của azoxystrobin (Sh.A.Ashorkr, 2006)
Theo tác giả T.Nageswara Rao và cộng sự năm 2012 đã khảo sát độc tính của
azoxystrobin qua các thí nghiệm trên các động vật thí nghiệm như bảng sau:

5


Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin
Động vật thí nghiệm

Đường dùng

Kết quả

Chuột đực

uống

Chuột đực và cái

da

Chuột đực và cái

hít

Thỏ đực

da

Không gây kích ứng trên da

Thỏ đực và cái

mắt

Không gây kích ứng trên da

LD50 > 2000 mg / kg.
Không có tác dụng phụ
LD50 > 2000 mg / kg
Không có tác dụng phụ
LC50 tương đương 0,38 mg /l trong
không khí

 Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người có
chứa azoxystrobin khoảng 0-0,2 mg/ kg một ngày (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012).
2.1.4.5. Cơ chế tác động (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012).

Azoxystrobin là một chất diệt nấm phổ rộng thuộc nhóm methocyacrylate.
Được bắt nguồn từ các strobilurin tự nhiên xảy ra. Nó hoạt động với chất diệt nấm
bằng cách ức chế ty thể trong nấm. Chúng tạo thành một lớp bảo vệ trên bề mặt thực
vật và ức chế sự phát triển của bào tử nấm.
2.1.5. Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin
- Danh mục thuốc có chứa imidacloprid: Confidor 100 SL, Actador 100WP,
Javidan 100 WP, Anvado 100WP, Conphai 10WP, Kola 700WO, Abamix 1,45SP,
Aba- plus 100EC…[32]
- Danh mục thuốc có chứa azoxystrobin: Amistar Top 250 SC, Amistar Top
325 SC, Mi stop 350 SC, Ohho 3255SC, Neoamistagold 360SC, 400SC, 450SC,
500SC, Ammisdotop 400SC, Dovatop 400SC , Paramax 400SC[34].
Các loại thuốc trên được bán rộng rãi trên cả nước, trong các đại lý thuốc trừ
sâu, hóa chất bảo vệ thực vật.
2.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.1.6.1. Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp HPLC
Phương pháp 1(J.Serb, 2009)
6


- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril / 0,01 M dung dịch đệm phosphate (pH 3.0) với tỉ lệ
25%: 75%
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Nhiệt độ 25oC
- Bước sóng: 270 nm
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
Phương pháp 2 (Sacramento, 2002):
- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
-

Đầu dò UV-Vis
Pha động: acetonitril 30% : Nước 70%
Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Bước sóng 270 nm

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Thời gian lưu của imidacloprid: 5,5 phút
Phương pháp 3 (Sprivastava, 2004):
- Cột C18 (75 cm x 4,6 mm, 3,5 µm)
-

Đầu dò khối phổ QuEChERS
Pha động: acetonitril 20%: Nước 80%
Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Bước sóng: 270 nm
Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

Phương pháp 4 (Raihanah, 2004):
- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril 20% : nước 80%
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Bước sóng 270 nm
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
Các phương pháp này đã được thẩm định về độ tuyến tính, giới hạn phát hiện
(LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung
gian), và độ đúng (phục hồi). Phương pháp này cho kết quả phân tích tốt với độ tuyến
tính có hệ số tương quan cao, độ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép. Nên phương
pháp này có thể thực hiện trong phòng thí nghiệm.

7


2.1.6.2. Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC
Phương pháp 1 (Bursic Vojilava and Lazic Sanja, 2012):
- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril 80% : nước 20%
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Bước sóng 255 nm
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Thời gian lưu của azoxystrobin: 11,07 phút.
Phương pháp 2 (Burket and Sapiests, 2005):
-

Cột RP C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
Đầu dò UV-Vis
Pha động: acetonitril 55% : nước 45%
Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Bước sóng 207 nm
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Thời gian lưu của azoxystrobin: 8,3 phút
Phương pháp 3 (Rao Nageswara, 2012):
-

Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm)
Đầu dò UV-Vis
Pha động: acetonitril 70% : acid formic 30%
Tốc độ dòng: 1 ml/phút

Bước sóng 240 nm
Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

2.1.6.3. Phương pháp định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và
azoxystrobin.
Hiện chưa có nghiên cứu nào trong và ngoài nước định lượng đồng thời hai chất
imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC. Nhưng đã có nghiên cứu định
lượng đồng thời hai hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng phương pháp HPLC. Ví dụ
như định lượng đồng thời imidacloprid hoặc azoxystrobin với một hóa chất bảo vệ
thực vật khác thuộc nhóm thuốc trừ sâu, thuốc trừ nấm hay thuốc diệt cỏ bằng phương
pháp sắc ký lỏng nâng cao hay sắc ký khối phổ.
Năm 2015 tác giả Trần Cao Sơn đã nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất vảo
vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ. Trong
8


nghiên cứu này tác giả nêu ra một số phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật
trong đó có cả imidacloprid và azoxystrobin bao gồm phương pháp xử lý mẫu và các
kỹ thuật dùng để phân tích. Các kỹ thuật dùng để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật
như sắc ký khí và sắc ký lỏng. Nhưng trong nghiên cứu này tác giả chọn sắc ký lỏng vì
có khả năng ứng dụng rộng, phù hợp với các dung môi phân cực như methanol,
acetonitril, nước và được sử dụng phổ biến ở Việt Nam (Trần Cao Sơn, 2015).
2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
2.2.1. Khái niệm
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc
ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại pha tĩnh
sử dụng (Võ Thị Bạch Huệ, 2016)
2.2.2. Phân loại
Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc ký lớp mỏng áp suất cao

(HPTLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của quá trình sắc kí của pha tĩnh trong
cột tách mà người ta chia thành:
- Sắc kí phân bố của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau.
-

Sắc kí hấp phụ pha thường.
Sắc kí hấp phụ pha ngược hay pha đảo.
Sắc kí trao đổi ion và cặp ion.
Sắc kí rây phân tử.

2.2.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC (Thái Duy Thìn, 2013)

Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
9


Trong đó:
1 - Bình chứa dung môi pha động.
2 - Bộ phận khử khí.
3 - Bơm cao áp.
4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler).
5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt.
6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu).
7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và
điều khiển toàn bộ hệ thống.
8 - Thiết bị in dữ liệu
2.2.3.1. Bình đựng dung môi
Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho
phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong

muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%. Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì
chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa
là 3 hoặc 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động
đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định.
 Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết
và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích. Tất cả các
hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết
phân tích và phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng
cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích.
2.2.3.2. Bộ phận khử khí
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi
pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt
khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian
lưu của peak thay đổi.
- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có
thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ
ngừng hoạt động. Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.

10


2.2.3.3. Bơm cao áp
Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra
khỏi cột sắc kí. Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 – 200 bar) để tạo ra được những
tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độ
nằm trong vùng 0,5 – 2 ml/phút.
2.2.3.4. Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với
dung tích của loop là 5 – 100 µl. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ

công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler).
2.2.3.5. Cột sắc ký
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm,
đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ 5 - 10 µm. Ngoài ra còn có một số
trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt …
Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24
có tiêu chuẩn hóa các lọai cột). Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường)
hoặc là silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo),
ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao
đổi ion.
Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp
hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt.
 Lưu ý: Tuyệt đối không đánh siêu âm vì sẽ làm hư cột.
2.2.3.6. Đầu dò
Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi
cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo
tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và
phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp
để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng. Hiện
nay, detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ hay UV-Vis đang được dùng phổ biến
nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại ko quá đắt.
2.2.3.7. Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang.
11


+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,
thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao….

+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất
cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải...
trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của
người sử dụng như: nồng độ, RSD…
2.2.3.8. Thiết bị in dữ liệu
Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra
giấy để hoàn thiện hồ sơ.
2.2.4. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột (Võ Thị Bạch Huệ, 2016)
Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động. Pha này có thể là một chất
khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và
không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn. Các
chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác
nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di
chuyển khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho
phân tích định tính và định lượng.
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định và là yếu tố quyết
định bản chất của quá trình sắc ký.
Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, trao đổi ion và
sắc ký rây phân tử. Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất trong kiểm
nghiệm.
2.2.5. Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Trần Tử An và Thái Nguyễn Hùng Thu, 2007)
Sắc ký phân bố là phương pháp phân tách dựa trên độ khác biệt về phân bố của
các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động. Sắc ký phân bố được chia làm 2 loại tùy thuộc
vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết.
 Pha tĩnh:
Sắc ký lỏng - lỏng: Pha tĩnh gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề
mặt các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Các tiểu phân này thường
có đường kính từ 3 đến 10 µm (kích thước hạt có thể đến 50 µm hoặc lớn hơn trong
sắc ký điều chế). Pha tĩnh kiểu này có nhược điểm là: bị rửa trôi dần theo dòng pha
động, hiệu lực cột sẽ giảm dần trong quá trình sử dụng.

Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang nên khắc
12


phục được nhược điểm của sắc ký lỏng - lỏng. Trong pha tĩnh loại này, các nhóm chức
hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua nhóm silanol. Tính phân cực
của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết.
 Pha động
Pha động trong sắc ký phân bố có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung
môi. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ các
thành phần dung môi.
Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố
thành 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
- Sắc ký pha thuận: Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực
được gọi là sắc ký pha thuận. Dung môi pha động thường là các hydrocacbon mạch
thẳng như: pentan, hexan, heptan…Trong sắc ký pha thuận các chất không phân cực sẽ
được rửa giải sớm, thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều tăng của độ phân cực của
các thành phần trong mẫu thử.
- Sắc ký pha đảo: Hệ pha động phân cực và pha tĩnh không phân cực gọi là sắc
ký pha đảo. Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm. Chất
càng tan tốt trong dung môi phân cực thì càng được rửa giải sớm. Dung môi pha động
thường là: nước, methanol, acetonitril…Việc đuổi khí hòa tan trong pha động rất quan
trọng trong sắc ký pha đảo.
2.2.6. Các thông số đặc trưng trong HPLC (Trần Tử An, 2007)
2.2.6.1. Thời gian lưu tR
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các
chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn.
Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian lưu phụ
thuộc vào các yếu tố:






Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.

Trong một phép phân tích nếu tR’ nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR’ quá lớn
thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời
kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép
phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà tR phụ thuộc.
13


Hình 2.4. Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B
2.2.6.2. Hệ số phân bố K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:

K
Trong đó:

CS
CM

Cs là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/l)
CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/l)

Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan. Trị số K
càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn
hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn.
2.2.6.3. Hệ số dung lượng K’
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai
pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất
tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.

K'

t R  t0
t0

Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị doãng.
Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu.

14