Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens SH4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ
PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI
KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100520

: TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN

Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ
PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI
KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100520

: TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN

Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn
khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hương ( Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực

phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM).
Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của
mình.
TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện

TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ
con trong 23 năm qua, người đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong cuộc
sống và luôn qua tâm con, chăm sóc cho con. Người luôn bên con những lúc khó khăn
nhất. Em cũng xin cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hướng và ủng hộ em trên con
đường học tập.
Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi
trường đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm đại học.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài
Hương, người luôn nhiệt tình với học trò, luôn định hướng và cung cấp những kiến
thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em xuyên suốt quá trình thực
hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai người đã cho em lời khuyên
trong quá trình nuôi sâu tơ thí nghiệm và cung cấp cho em giống nấm thí nghiệm.
Em cũng xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh,
anh Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí
nghiệm.
Đồng thời, xin cảm ơn đến bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, Cao Thị Thanh Thúy đã hổ trợ

mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn cùng thực hiện đồ án
trong thời gian mình thực hiện đồ án ở phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt
quá trình làm thí nghiệm. Cảm ơn em Hồ Trung Lộc lớp 14DSH, em Trần Nguyễn
Tuấn Minh 14DSH, em Bùi Nhật Minh 14DSH đã phụ giúp anh trong quá trình thực
hiện đồ án tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn !
TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017

TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... 1
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... 4
DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... 5
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... 6
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 9
1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học ................................................................. 9
1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học .............................................................. 9
1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay ............ 9
1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học ........................... 10
1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin ...................................... 10
1.1.4.1 Ưu điểm ............................................................................................. 11
1.1.4.2 Nhược điểm ....................................................................................... 11
1.1.4.3 Cơ chế tác động ................................................................................ 12
1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens ........................................................ 12
1.2.1 Lịch sử phát hiện ...................................................................................... 12
1.2.2 Phân loại .................................................................................................. 13

1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens .......................................................... 13
1.2.4 Đặc điểm sinh lí ....................................................................................... 14
1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa ............................................................................. 15
1.1.3.2 Đặc điểm phân bố ............................................................................. 16
1.2 Giới thiệu về Prodigiosin ................................................................................ 17
1.3.1 Khái niệm về prodigiosin ......................................................................... 17
1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin ..................................................... 17
1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin .......................................................... 20
1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens ........................... 20
1.4 Enzyme ............................................................................................................ 25
1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens ......................................................... 25
1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới ...................................................................... 26
1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens .............................................. 26
1


Đồ án tốt nghiệp

1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin.......................................................... 27
1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh....................................................... 27
1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp.................................................................. 27
1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp...................................................................... 28
1.6.3.3 Nấm Trichoderma............................................................................ 28
1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus.................................................................... 29
1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella.......................................................... 29
1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học.................................................................. 29
1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại....................................................... 30
1.7.3 Biện pháp phòng trừ............................................................................... 30
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................32
2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu..................................................................... 32

2.1.1 Thời gian................................................................................................ 32
2.1.2 Địa điểm................................................................................................. 32
2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị.............................................................................. 32
2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens..................................................... 32
2.2.2 Nguồn nấm............................................................................................. 32
2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii............................................................. 32
2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia...................................................... 32
2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate.................................................... 32
2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất............................................................ 32
2.2.7 Dụng cụ, thiết bị..................................................................................... 33
2.3 Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 34
2.4 Nội dung nghiên cứu..................................................................................... 34
2.5 Phương pháp thí nghiệm................................................................................ 34
2.5.1 Phương pháp luận.................................................................................. 34
2.5.2 Bố trí thí nghiệm..................................................................................... 35
2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm................................................. 36
2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm...................................... 36
2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens.........................37
2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học............................................... 37
2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme........................................................... 37

2


Đồ án tốt nghiệp

2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm....................................... 42
2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá.........................44
2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii
45

2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica
integrifolia....................................................................................................... 47
2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu..................48
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN................................................................. 51
3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào.................................................................... 51
3.2 Hoạt tính kháng nấm..................................................................................... 52
3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm....................................................................... 55
3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii........57
3.5 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cải ngọt Brassica integrifolia...............58
3.6 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata.............61
1.Kết luận............................................................................................................ 65
2. Kiến nghị......................................................................................................... 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 67
PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG............................................. 71
PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH...................................................................................... 74
PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ.......................................................................................... 86
PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ...................................................................... 89

3


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Artemia nauplii : A.nauplii
Brassica integrifolia : B. integrifolia
Serratia mascescens : S.mascescens
Plutella xylostella : P.xylostella
Pepton glycerol : PG
QCVN : Quy chuẩn Việt Nam.

BNNVPTNT : Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn.

4


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và
Gibbs, 2011)............................................................................................................ 14
Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens.......14
Hình 1.3 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008)................................................ 18
Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)........................................ 18
Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ
Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001).................................21
Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin...........24
Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella.................................................... 30
Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế
phẩm........................................................................................................................ 36
Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein.........38
Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit.........................40
Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin..........41
Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA...........................43
Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét
lá (Maureen và cộng sự, 2012)................................................................................ 45
Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925)..................................................... 56
Hình 3.2 Tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin
(mg/ml)................................................................................................................... 58

Hình 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm chế phẩm........59
Hình 3.4. Tỉ lệ nảy chết của cải ngọt B. integrifolia sau khi phun chế phẩm..........60
Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia
marcescens SH4...................................................................................................... 63

5


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens................................. 15
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)
19
Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid.............52
Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1.............................................. 52
Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp................................................................. 53
Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp............................................................ 54
Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp........................................................... 54
Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3....................................................................... 56
Bảng 3.6 Độc tính của chế phẩm đối với cây cải ngọt sau 9 ngày thử nghiệm.......61
Bảng 3.7 Tỉ lệ chết của cá sau 5 ngày thử nghiệm.................................................. 62

6


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài

Theo thống kê của tổ chức Lương – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng
hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài

vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực lượng
hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết vấn đề
trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây
hại. Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh cho
cây trồng. Tuy nhiên, người nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lượng quá
mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình
sâu hại trở nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, sâu tơ Plutella
xylostella là loài sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng, chúng gây hại trên hầu
hết các loại rau cải, đặc biệt có nhiều trên cây cải ngọt . Chúng có khả năng kháng
thuốc hóa học nếu người dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học không
đúng cách. Vì vậy, xu hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đã và đang
trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, an toàn cho
sức khỏe con người, đồng thời không gây ô nhiễm môi trường.
Những năm gần đây, việc trích ly được hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn
Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo
chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam
hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chưa có nghiên
cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên cứu
nhưng vẫn chưa hoàn thiện được sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ sở đó
mà người thực hiện đề tài đã chọn hướng cho Đồ ÁN tốt nghiệp là: “Thử

nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcescens SH4”
2. Mục đích nghiên cứu

7

Đồ án tốt nghiệp

Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn Serratia marcescens SH4.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH4
Thử nghiệm tính an toàn sinh học của chế phẩm lên cây cải ngọt để đánh giá an toàn
sinh học của chế phẩm.
Thử nghiệm độc tính của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh đại
diện là cá bảy màu
4. Kết quả cần đạt được
Khảo sát được ảnh hưởng của việc xử lý acid lên enzyme ngoại bào của vi
khuẩn S.marcesscens trong dịch nuôi cấy.
Khảo sát được hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng nấm, kháng sâu
tơ.
Khảo sát được độc học của vi khuẩn tác động lên ấu trùng A.nauplii.
Khẳng định tính an toàn của chế phẩm trong việc ứng dụng chế phẩm ngoài
thực tế.

8


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học
1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học
Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học.
Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi

khuẩn, virus) và các hợp chất thứ cấp do vi sinh vật tiết ra ( thường là các chất
kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (chất độc hoặc dầu thực vật).
1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay
1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc
chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên
các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có
nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tương đối dễ dàng: chỉ cần
hoà thuốc vào bình và phun bình thường với liều lượng 1,0- 1,2 kg/ha.
2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000

IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu
thuộc họ Leptidopera.
3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae
1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên đạt hiệu quả
tới 86,5%. Dạng nấm xanh được dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả
đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dùng để
trị sâu róm thông và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%.
TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu
róm hại thông đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”.
4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá,

đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã được
đưa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ
hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hoá).

9


Đồ án tốt nghiệp

5. Chế phẩm hoá sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu
đạt 45- 50%.
6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây
ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004)
1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học
Ưu điểm
 Không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân
bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình
trạng bùng phát dịch côn trùng.
 Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dư lượng độc trên
nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông
sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè…
 Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thường có sẵn và rất
phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc như ớt, tỏi, hành, rừng... Chi phí sản xuất khi tự
làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, do vậy sẽ
tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao.
Hạn chế
 Các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so
với thuốc hóa học.
 Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu
điều kiện cũng chặt chẽ hơn.
1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin
Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin
B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) được phân lập từ quá trình lên men của vi
khuẩn Streptomycin avermitilis được sử dụng phổ biến để phòng trừ sâu hại trên
nhiều loại cây trồng đặc biệt là rau, hoa, chè, lúa.
Hoạt chất Abamectin được 97 công ty đăng ký với 534 loại thuốc thương phẩm,
gồm 294 thuốc thương phẩm đơn chất Abamectin (Abatin 1.8 EC; Alfatin 1.8 EC;
Binhtox 1.8 EC; Reasgant 1.8EC; Tervigo 020SC…) và 240 thuốc thương phẩm

10


Đồ án tốt nghiệp

dạng hỗn hợp với các hoạt chất khác như Emamectin benzoate (Sieufatoc 36EC),
Azadirachtin (Goldmectin 36EC), Alpha – cypermethrin (Shepatin 18EC),
Acetamiprid (Acelant 4EC) dầu khoáng (Đầu trâu Bihopper 24.5EC), Bacillus
thuringiensis var.kurstaki (Kuraba WP …)
1.1.4.1 Ưu điểm
-

Hoạt chất Abamectin có hiệu lực diệt sâu nhanh, mạnh, kéo dài và ít chịu tác
động của điều kiện thời tiết.

-

Thuốc ít hình thành tính kháng của dịch hại, ít gây độc cho người sử dụng.

-

Phổ tác động rộng, trừ được nhiều loài sâu miệng nhai, miệng chích hút
thuộc bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh đều như ruồi đục lá, sâu tơ, sâu
xanh, bọ trĩ, nhện ở liều lượng 5,4 -25gai/ha trên nhiều loại cây trồng như rau
họ thập tự, họ cà, cây ăn quả (cam, quýt, chè…), lúa.

1.1.4.2 Nhược điểm
-

Các loại thuốc hoạt chất Abamectin thuộc nhóm độc II, LD 50 qua miệng 300

mg/kg, LD50 qua da > 1800 mg/kg, dễ kích thích da và mắt. Thời gian cách ly
ngắn nhất là 3 ngày, phổ biến là 7 ngày.

-

Hoạt chất Abamectin có chỉ số tác động môi trường (EIQ 36,68) cao hơn so
với nhiều hoạt chất khác, kể cả một số thuốc thuộc nhóm lân hữu cơ như
Acephate (EIQ 24,88), Chlopyriphos( EIQ 26,85).

-

Thuốc thuộc nhóm độc II, thời gian cách ly tương đối dài (7 ngày), mức độ
ảnh hưởng của thuốc đối với người phun thuốc, người tiêu dùng không lớn
nhưng độc đối với cá và ong.

Vì vậy, mặc dù đã được đăng ký phòng trừ sâu hại trên cây rau nhưng
Abamectin không có trong Danh mục các hoạt chất thuốc BVTV khuyến cáo lựa
chọn để sử dụng trên rau an toàn khi cần thiết (Ban hành kèm theo văn bản số
580/BVTV-QLT ngày 17/4/2014 của Cục Bảo vệ thực vật).

11


Đồ án tốt nghiệp

1.1.4.3 Cơ chế tác động
Thuốc ngăn chặn chất truyền luồng thần kinh gamma aminobutyric acid
(GABA) tại chỗ nối cơ thần kinh của côn trùng. Thuốc làm côn trùng ngừng ăn
hoặc ngừng đẻ trứng ngay, chúng có thể chết sau vài ngày.
1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens

1.2.1 Lịch sử phát hiện
Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ
thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên
bánh mì. Sau đó, vào năm 332 trước công nguyên, những người lính trong quân đội
Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dường như có
“máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tượng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy
máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng.
Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện
kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969),
đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố như
vậy được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch.
Trong bóng tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh được
sử dụng trong Thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên,
điều này lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là
một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011).
Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya), là người đầu tiên phát hiện và đặt tên
Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang
màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để
ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều được bao phủ bởi một lớp vi
sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia,
theo tên nhà vật lý nổi tiếng người Italya đã phát minh ra tàu hơi nước là Serrati, tên
loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này
phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta.

12


Đồ án tốt nghiệp

Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens như một loại nấm, do ông nhìn thấy

những đốm đỏ dưới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà
khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.
1.2.2 Phân loại
Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan
với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là
Serratia marcescens.
Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Serratia
Loài: Serratia marcescens
1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia
marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 –
o

2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40 C và
có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).

13


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được
dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)

Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn
Serratia marcescens
1.2.4 Đặc điểm sinh lí
Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả
là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng
chính là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens
thường bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).
Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường
thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều
dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.
14


Đồ án tốt nghiệp

1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa
Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường hiếu khí và kỵ khí.
Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng và nhờ
có các enzyme như superoxide dismutase, calatas, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi
các phản ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác
trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và
gelatinase (Giri và cộng sự, 2004).
Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di
động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin
(Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của
Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản
xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease
ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein.
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens
STT

Đặc điểm sinh hóa

Kết quả

1

Di động

+

2

Indole

-

3

Methyl Red

-

4

Voges Proskauer

+

5

Citrate

+

6

Dnase

+

7

Catalase

+

8

Oxidase

-

9

Urease

-

10

Gelatinase

+

11

Chitinase

+

15


Đồ án tốt nghiệp

12

Triple sugar iron

Môi trường chuyển sang
không sinh khí và không
sinh H2S

13

Hydrogen sulphide

-

14

Lysine decarboxylase

+

15

Ornithine decarboxylase

+

16

Lên men glucose

+

17

Lên men sucrose

+

18

Lên men sorbitol

+

19

Lên men fructose

-

20

Lên men xylose

-

21

Lên men rhaminose

-

22

Lên men lactose

-

23

Lên men arabinose

-

1.1.3.2 Đặc điểm phân bố
Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông
và Serratia marcescens chiếm 75%.
Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn
trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế.
Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối
với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau
khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006).
Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm,
nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng
của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).
Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các
loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới

16


Đồ án tốt nghiệp

nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia
marcescens với Steinernema carpocapsae.
1.2 Giới thiệu về Prodigiosin
1.3.1 Khái niệm về prodigiosin
Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ
“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở dạng
túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào
(Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin được tổng hợp từ vi
khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao

gồm:

prodigiosin,

cycloprodigiosin

hydrochlodride

(cPrG–HCI),

uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả
năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và
cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI).
1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin
Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng
lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;
Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole
tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp
với nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và

17


Đồ án tốt nghiệp

Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được
miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

Hình 1.4 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008)

Hình 1.3 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã được phân lập là đặt tên là
“prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác
của prodigiosin tổng hợp bởi S. marcescens mới được biết đến (Rapoport và
Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ
trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một
loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế
alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thường gắn trở lại
để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles. Furstner (2003) cho rằng danh pháp
truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất
cả. Được phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902).
Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước.
Prodigiosin có thể tan tương đối trong alcohol và ether. Bên cạnh đó, nó dễ tan trong
chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar
và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bước sóng nhất
định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ.

18


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)
Loài

Tên sắc tố

Danh pháp
prodigiosin

Trọng
lượng phân
tử và công
thức

Serratia
marcescens

Prodigiosin

2-Methyl-3-amyl-6methoxy-prodigiosene

323,4 Da
C20H25N3O

Serratia
marcescens

Norprodigiosin

2-Methyl-3-amyl-6hydroxy-prodigiosene

309,4 Da
C10H23N3O

Serratia
marcescens

Dipyrrolyldipyrromelh

enr prodigiosin

2-(2-pyrryl)-4,6dimethoxypyprodigiosen

334,4 Da
C19H18N4O2

e
Nocardia
(Actinomadura)

Nonylprodigiosin

2-Nonly-6methoxyprodigiosene

363,5 Da
C23H31N3O

Nocardia
(Actinomadura)

Cyclononylprodigiosin

2,10-Nonano-6melhoxy-prodigiosene

265,5 Da
C23H33N3O

Nocardia
(Actinomadura)

Methylcyclode
cylprodigiosin

2,10-Nonano-6Methoxy-prodigiosene

391,5 Da
C25H33N3O

Streptomyces
Longisporusr

Undccyl- prodigiosin

2-Undecyl-6Rnethoxyprodigiosene

393,6
Da
C25H35N3

uber

Streplonlyces
longisporusr

O

Metacycloprodigiosin

2,4-(9-Ethylnonano) -6methoxyprodigiosene

uber

391,6
Da
C25H33N3
O

19


Đồ án tốt nghiệp

1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin
Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn
(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả
năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme như DNA
gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi
khuẩn (Ramina và Samira,2009).
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể
kháng một số loài vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,
Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus
mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni
và cộng sự, 2012).
Theo nghiên cứu của Chandni và cộng sự (2012) về khả năng kháng nấm của
hợp chất màu thu nhận từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens cho thấy hợp chất
màu có khả năng kháng một số loài nấm men như Candida albicans, Candida
parapsilosis và Cryptococcus sp.
Prodigiosin khi được đưa vào cơ thể sâu sẽ thấm vào tế bào và ức chế quá

trình phát triển của tế bào, từ đó, dẫn đến sự từ vong của sâu Spodoptera litura
(Nguyễn Hiếu Dân, 2013)
Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả năng chống ung thư (Pandey và
cộng sự 2009; Pérez – Tomás và Vi ̃as, 2010) vàức chế miễn dịch (Pandey và cộng
sự 2007)
1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens
Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn.
Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006
(Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã được
báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serratia marcescens sản xuất sắc tố
thông qua con đường ngưng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4methoxy-2, 2'-bipyrrole-5- carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole,

20


Đồ án tốt nghiệp

được gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams
và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập được một chủng
Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy
nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này được báo cáo.
Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện trong
Erwinia carotovora subsp. carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm).
Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định bởi nhiều yếu tố, bao
gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR
(Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất
prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào
sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã
được thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000).
Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và

Streptomyces coelicolor và được bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng
hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mô tả ở hình 2.18.

Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig)
từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp
undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3
(2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)
21