Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens HB

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI
KHUẨN Serratia marcescens HB
Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG
Sinh viên thực hiện

: HỒ TRUNG LỘC

MSSV: 1411100591

Lớp: 14DSH03

TP. Hồ Chí Minh, năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI

KHUẨN Serratia marcescens HB
Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG
Sinh viên thực hiện

: HỒ TRUNG LỘC

MSSV: 1411100591

Lớp: 14DSH03

TP. Hồ Chí Minh, năm 2018


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự hƣớng
dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hƣơng (Giảng viên Viện Khoa Học Ứng Dụng
HUTECH, trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM).
Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp
của mình.
TP.HCM, ngày 27 tháng 7 năm 2018
Sinh viên thực hiện

HỒ TRUNG LỘC


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng dạy
dỗ con trong 22 năm qua, ngƣời đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong
cuộc sống và luôn quan tâm con, chăm sóc con, luôn bên cạnh con lúc khó khăn
nhất. Con xin cảm ơn gia đình ông bà nội ngoại. Đặc biệt là bà nội, bà ngoại, ba, cô
bảy và cậu mợ mƣời trong suốt những năm qua đã tạo điều kiện thuận lợi tốt nhất
để con đƣợc bƣớc vào giảng đƣờng đại học với tâm thế thoải mái.
Em xin cảm ơn quý thấy cô trong Viện Khoa học Ứng Dụng HUTECH và
những thầy cô giảng viên của trƣờng đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho
em trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc
nhất đến cô Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đầy nhiệt huyết, luôn định hƣớng và
cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em
xuyên suốt quá trình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai, ngƣời đã cho em lời khuyên
trong quá trình nuôi sâu khoang thí nghiệm và cung cấp trứng sâu cho em. Em xin
chân thành cảm ơn thầy Phạm Minh Nhựt, chị Huỳnh Ngọc Nhi đã cho em vật liệu
thử nghiệm để em tiến hành các thí nghiệm khảo sát.
Em xin chân thành biết ơn anh Trƣơng Hoài Nguyên, anh Nguyễn Phƣớc
Sinh, anh Phạm Hoàng Nhân, chị Cao Thị Thanh Thúy đã truyền đạt cho em những
kinh nghiệm, lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Và em xin cảm
ơn tất cả các bạn đồng nghiệp Lê Đình Nhân, Nguyễn Mộng Trâm, Đặng Thị Kim
Tuyền, Đào Đặng Phƣơng Dung, Đinh Ngọc Phƣơng Trinh, Võ Lan Hƣơng, Võ
Thành Lâm cùng hai em Võ Đình Chiến và Nguyễn Đăng Thùy Dƣơng đã đồng
hành giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.

TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2018

HỒ TRUNG LỘC


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH..............................................................................vii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................i
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài..............................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu:................................................................................. 1
3. Nhiệm vụ nghiên cứu:.................................................................................1
4. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................2
5. Kết quả cần đạt đƣợc..................................................................................2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................... 3
1.1. Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học.......................................................... 3
1.1.1. Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học........................................................ 3
1.1.2. Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trƣờng hiện nay.
3
1.1.3. Những ƣu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học.......................4
1.2. Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens...................................................5
1.2.1. Lịch sử phát hiện..................................................................................5
1.2.2. Phân loại...............................................................................................6
1.2.3. Đặc điểm của Serratia marcescens......................................................6
1.2.3 .Đặc điểm sinh lí...................................................................................7

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4. Đặc điểm sinh hóa................................................................................7
1.2.5. Đặc điểm phân bố................................................................................ 9
1.3. Giới thiệu về Prodigiosin.........................................................................10
1.3.1

Khái niệm vê Prodigiosin................................................................10

1.3.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin................................................10
1.3.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin.................................................... 13
1.3.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens..............13
1.4. Enzyme.....................................................................................................17
1.5.Yếu tố độc lực của Serratia marcescens...................................................17
1.6. Khả năng diệt sâu của vi khuẩn Serratia marcescens..............................18
1.7. Một số nghiên cứu trên thế giới...............................................................20
1.7.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens....................................... 20
1.7.2. Tình hình nghiên cứu Prodigiosin................................................... 21
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................22
2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu............................................................... 22
2.1.1. Thời gian............................................................................................22
2.1.2. Địa điểm.............................................................................................22
2.2. Vật liệu, hóa chất, thiết bị........................................................................ 22
2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens................................................ 22
2.2.2. Nguồn nấm.........................................................................................22
2.2.3. Nguồn sâu khoang Spodoptera litura................................................ 22
2.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất......................................................22
2.2.5. Dụng cụ, thiết bị.................................................................................23
ii

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................ 24
2.4. Nội dung nghiên cứu................................................................................24
2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm..........................................................................24
2.5.1. Phƣơng pháp luận..............................................................................24
2.5.2. Bố trí thí nghiệm................................................................................27
2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm...........................................29
2.6.1. Phƣơng pháp chọn lọc chủng seratia marcescens có khả năng tổng
hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào Protease mạnh nhất.........................30
2.6.1.1. Phƣơng pháp định tính enzyme...................................................30
2.6.1.2. Phƣơng pháp trích ly thu Prodigiosin......................................... 31
2.6.2. Khảo sát phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu
quả................................................................................................................33
2.6.2.1. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng acid...........................................33
2.6.2.2. Phƣơng pháp xử lý nhiệt............................................................. 33
2.6.2.3. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng Formalin...................................34
2.6.3. Phƣơng pháp định tính enzyme của dịch nuôi cấy sau khi xử lý tế
bào...............................................................................................................34
2.6.4. Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời
đến hiêu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia......................37
2.6.4.1 Tỷ lệ các chất phụ gia trong chế phẩm......................................... 37
2.6.4.2. Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang bằng phƣơng pháp quét lá....38
2.6.6. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm.....................................40
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 43

iii

Đồ án tốt nghiệp

3.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme
ngoại bào và prodigiosin cao nhất...................................................................43
3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào........................................................43
3.1.2. Trích ly thu prodigiosin......................................................................45
3.1.3. So sánh hình thái của chủng SH1 và HB........................................... 47
3.2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia
marcescens hiệu quả nhất................................................................................50
3.2.1. Phƣơng pháp xử lý acid.....................................................................51
3.2.2. Phƣơng pháp xử lý nhiệt................................................................... 52
3.2.3. Phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào bằng dung dịch Formalin..........54
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi cấy Serratia
marcescens HB sau khi xử lý tế bào...............................................................57
3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính protease...........................................................57
3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính Chitinase.........................................................57
3.5. Khả năng ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt
sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia.....................................................59
3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm có lợi...........................................62
3.8. Quy trình sản xuất chế phẩm chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia
marcescens HB............................................................................................…64
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................66
4.1. Kết luận....................................................................................................66
4.2. Kiến nghị..................................................................................................66
Tài liệu tiếng Việt.........................................................................................67

iv

Đồ án tốt nghiệp

Tài liệu nƣớc ngoài.........................................................................................68
PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG....................................72
PHỤ LỤC B. HÌNH ẢNH.............................................................................. 75
PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ..................................................................................82
PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ.............................................................84

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
EPN

: Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh:

Entomopathogenic nematodes).
H-CP16

: Heterorhabditis indica CP16

A.nauplii

: Artemia nauplii

S.marcescens: Serratia marcescens.
SH1

: Serratia marcescens SH1

SH4

: Serratia marcescens SH4

SH5

: Serratia marcescens SH5

SB

:Serratia marcescens SB

HB

:Serratia marcescens HB

PG

:Môi trƣờng Peptone glycerol

PGA

:Môi trƣờng Peptone glycerol agar

CMC

:Carboxymethyl cellulose

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và
Gibbs, 2011
Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia
marcescens Hình 1.3 Các chất đại diện Prodigiosin (Fursttner, 2003)
Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp Prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp Undercylprodigiosin (cụm màu đỏ từ
Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)
Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp Prodigiosin
Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của enzyme serralysin metallprotease của S. marcescens
đối với ấu trùng tằm (K Ishi et al; 2014)
Hình 2.1 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật phù hợp
Hình 2.2 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học khả năng diệt sâu và độc tính của
chế phẩm
Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm khảo sát chọn ra phƣơng pháp tiêu diệt tế bào tối
ƣu.
Hình 2.4 Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men các chủng vi
khuẩn Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch gelatin agar
Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch Tween 80
agar Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch chitin
agar Hình 2.8 Bố trí nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA
Hình 3.1 Khả năng tiết enzyme Protease của 5 chủng Serratia marcescens SH1,
SH4, SH5, SB, HB tƣơng ứng với các ký hiệu A, B, C, D, E.
Hình 3.2 Khả năng tiết enzyme chitinase của chủng SB và HB.

vii


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện giá trị OD hiệu chỉnh của 5 chủng SH1, SH4, SH5, SB,
HB.
Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc và hình thái nhuộm Gram của hai chủng SH1 và HB
Hình 3.5 Kết quả quét phổ hấp thu dịch lên men hai chủng Serratia marcescens
SH1 và HB
Hình 3.6 Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v)
của chủng SH1
Hình 3.7 Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v)
của chủng HB.
Hình 3.8 Khuẩn lạc Serratia marcescens xuất hiện trên thạch PGA ở đĩa đối chứng
(A) và đĩa khảo sát (B) sau 48 giờ ủ.
Hình 3.9 Kết quả sau khi ria lại trên thạch PGA sau 24 giờ ủ ở hai nghiệm thức
0

0

100 C (A) và 65 C (B).
Hình 3.10 Kết quả sau khi cấy ria dịch canh trƣờng Serratia marcescens HB đã xử
lý Formalin ở các nồng độ.
Hình 3.11 Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm với các nồng
độ phụ gia theo thời gian theo công thức Abbott (1925).
Hình 3.12 Sâu khoang chết sau khi thử nghiệm chế phẩm.
Hình 3.13 Sơ đồ sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcescens HB đã xử lý tế bào.

viii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens.
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973).
Bảng 1.3 Tóm tắt những nghiên cứu liên quan đến chế phẩm diệt sâu từ
Serratia marcescens đã thực hiện.
Bảng 2.1 Bảng bố trí các nghiệm thức các nồng độ phụ gia.
Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescen SH1, SH4,
SH5, SB và HB.
Bảng

3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm), OD535nm sau khi trích ly sắc tố

của các chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB.

Bảng 3.3 Bảng so sánh lƣợng prodigiosin còn lại sau quá trình xử lý tế bào ở
các giá trị nồng độ Formalin .
Bảng 3.4 Các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng lên men sau xử lí
Formalin 0,5%.
Bảng 3.5 Hiệu lực diệt sâu khoang tuổi 3 của chế phẩm.
Bảng 3.6 Tỷ lệ ức chế nấm Trichoderma sp.
Bảng 3.7 Tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces lilacinus.

ix

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Theo thống kê của tổ chức Lƣơng – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng
hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200
loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực
lƣợng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết
vấn đề trên, con ngƣời đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác
nhân gây hại.Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm
bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, ngƣời nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều
lƣợng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho
tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng và diễn biến phức tạp hơn.
Những năm gần đây, việc trích ly đƣợc hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia
marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm
trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay
chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chƣa có nghiên cứu nào
về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên cứu nhƣng vẫn
chƣa hoàn thiện đƣợc sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ sở đó mà ngƣời
thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho Đồ án tốt nghiệp là:

“Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcescens HB.
2. Mục đích nghiên cứu:
Hoàn thiện quy trình tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcesces chứa hợp chất prodigiosin.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu:
Khảo sát chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens thích hợp có khả năng sinh
tổng hợp Prodigiosin với nồng độ cao và hoạt lực enzyme protease, chitinase mạnh

1


Đồ án tốt nghiệp

Khảo sát phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào vi khuẩn sau lên men thích hợp và để
đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học.
Khảo sát sự ảnh hƣởng của việc phơi nắng đối với hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở
các công thức phụ gia.
Đƣa ra quy trình hoàn thiện để tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcescens.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sử dụng công thức Abbott (1925) để tính toán hiệu lực diệt sâu.
Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để phân tích ANOVA từ số liệu kết quả thu đƣợc.
5. Kết quả cần đạt đƣợc
Chọn đƣợc chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng sinh tổng hợp
enzyme ngoại bào và nồng độ prodigiosin cao.
Chọn phƣơng pháp xử lý thích hợp đối với dịch nuôi cấy sau lên men để tiêu
diệt tế bào vừa đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học vừa giữ đƣợc hoạt tính, nồng độ
của hợp chất thứ cấp prodigiosin.
Khảo sát đƣợc hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: hoạt lực enzyme, khả năng
kháng nấm.
Khảo sát khả năng ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt
sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia.
Chọn ra đƣợc tỷ lệ phụ gia thích hợp cho việc tạo chế phẩm.
Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu từ dịch lên men vi
khuẩn Serratia marcescens HB.

2

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học
1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học
Thuốc trừ sâu sinh học là chất có khả năng kiểm soát dịch hại bằng cơ chế
không độc. Thuốc trừ sâu sinh học có thể là các sinh vật sống (thiên địch) hoặc chế
phẩm của chúng (hóa chất thực vật, chế phẩm vi sinh) hoặc hóa chất truyền tin
đƣợc sử dụng để quản lý dịch hại cho thực vật.
Thuốc trừ sâu sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng,
mặc dù hầu hết các loại thuốc này thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với các công cụ
khác (thuốc trừ sâu hóa học) nhƣ một phần của hoạt động quản lý dịch hại bằng
phƣơng pháp sinh học.
1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay
1. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox
16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các
loại sâu thuộc họ Lepidoptera.
2. Chế phẩm NPV: là chế phẩm trừ sâu hoạt lực mạnh và có tính chuyên hóa
cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dung để diệt trừ sâu xanh,
sâu xanh đốm trắng, sâu khoang, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây công
nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có nồng độ đặc hơn so với
các loại thuốc khác, sử dụng tƣơng đối dễ dàng: chỉ cần hòa thuốc vào bình
và phun bình thƣờng với liều lƣợng 1,0 – 1,2 kg/ha.
3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium
anisopliae (nấm xanh) đƣợc dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa va cây ăn quả
đạt 70-90%, dạng nấm trắng (Beauveria sp.) đạt 50-85%. Chế phẩm
Beauveria chuyên dung để trị sâu róm thong và sâu đo nâu hại bồ đề với
hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%.Tiến sĩ Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại

3


Đồ án tốt nghiệp

thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thong đang xảy ra tại
Nghệ An hiện nay”.
4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15-20 x106 IJs trừ sâu xám hại thuốc
lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã
đƣợc đƣa vào ứng dụng để trƣ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ
hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hóa).
5. Chế phẩm hóa sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trƣ các loại sâu hại rau
màu đạt 45-50%.
6

6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 10 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây
ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004).
1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học
Ƣu điểm:
-

Ít độc với ngƣời và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ đƣợc sự cân
bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu), ít gây
tình trạng bùng phát dịch côn trùng.

-

Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dƣ lƣợng
độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử

dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao nhƣ các loại rau, chè…

-

Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thƣờng có sẵn
và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc nhƣ ớt, tỏi, hành, gừng…Chi phí
sản xuất khi tự làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ
sâu hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho ngƣời dân mà vẫn mang lại
hiệu quả cao.

Hạn chế:
-

Các thuốc vi sinh thƣờng thể hiện hiệu quả diệt sâu tƣơng đối chậm
hơn so với thuốc hóa học.

-

Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thƣơng yêu
cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn.

4


Đồ án tốt nghiệp

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens
1.2.1 Lịch sử phát hiện
Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ

6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh
mì. Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội
Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có
“máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy
máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng.
Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất
hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran
(1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự
cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối
và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong
Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều này lại khiến
nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen
và Gibbs, 2011).
Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya) là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên
Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang
màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để
ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi
sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia,
theo nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên
loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này
phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta.
Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn
thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các
nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.

5


Đồ án tốt nghiệp

1.2.2 Phân loại
Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên
quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi
Serratia là Serratia marcescens.
Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Serratia
Loài: Serratia marcescens

1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có hình que,
đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia
0

marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40 C và có thể phát triển ở
pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).

Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển
vi (Gillen và Gibbs, 2011)
6


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc Serratia marcesens
1.2.3 Đặc điểm sinh lí

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng Nutrient agar đƣợc mô
tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng là
sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ
(David, 2012).
Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng
thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều
dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.
1.2.4 Đặc điểm sinh hóa
Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí.
Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ
có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, catalase, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi
các phản ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác
trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và
gelatinase (Giri và cộng sự, 2004).

7


Đồ án tốt nghiệp

Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di
động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và hemolysin
(Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của
Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản
xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease
ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein.
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens
STT

Đặc điêm sinh hóa

Kết quả

1

Di động

+

2

Indole

-

3

Methyl Red

-

4

Voges Proskauer

+

5

Citrate

+

6

Dnase

+

7

Catalase

+

8

Oxidase

-

9

Urease

-

10

Gelatinase

+

11

Chitinase

+

12

Triple sugar iron

Môi trƣờng chuyển
sang acid, không sinh
khí và không sinh H2S

13

Hydrogen sulphide

-

14

Lysine decarboxylase

+

8

Đồ án tốt nghiệp

15

Ornithine
decarboxylase

+

16

Lên men glucose

+

17

Lên men sucrose

+

18

Lên men sorbitol

+

19

Lên men fructose

-

20

Lên men xylose

-

21

Lên men rhaminose

-

22

Lên men lactose

-

23

Lên men arabinose

-

1.2.5 Đặc điểm phân bố

Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc
sông và Serratia marcescens chiếm 75%.
Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn
trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.
Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối
với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau
khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006).
Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm,
nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng
trƣởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).
Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các
loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo
mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia
marcescens với Steinernema carpocapsae.

9


Đồ án tốt nghiệp

1.3 Giới thiệu về Prodigiosin
1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin
Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ
“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng
túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào
(Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi
khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao
gồm:

prodigiosin,

cycloprodigiosin

hydrochlodride

(cPrG–HCI),

uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả
năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và
cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI).
1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin
Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng
lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự,
2006;Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole
tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp
với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và
Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc
miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

10


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã đƣợc phân lập là đặt tên là
“prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác

của prodigiosin tổng hợp bởi S. marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và
Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ
trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một
loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế
alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại
để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles. Furstner (2003) cho rằng danh pháp
truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất
cả. Đƣợc phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Prodigiosin nhạy
cảm với ánh sáng và không tan đƣợc trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối
trong alcohol và ether. Bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol,
acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu
hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện
sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ.

11


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)
Loài

Tên sắc tố

Danh pháp Prodigiosin

Trọng lƣợng
phân tử và
công thức

Serratia
marcescens

Prodigiosin

2-Methyl-3-amyl-6methoxy-prodigiosene

323,4 Da
C20H25N3O

Serratia
marcescens

Norprodigiosin

2-Methyl-3-amyl-6hydroxy-prodigiosene

309,4 Da
C10H23N3O

Serratia
marcescens

Dipyrrolyldipyrromelh 2-(2-pyrryl)-4,6334,4 Da
enr prodigiosin
dimethoxypyprodigiosen C19H18N4O2
e

Nocardia
Nonylprodigiosin

(Actinomadura)

2-Nonly-6methoxyprodigiosene

363,5 Da
C23H31N3O

Nocardia
Cyclononylprodigiosin 2,10-Nonano-6(Actinomadura)
melhoxy-prodigiosene

265,5 Da
C23H33N3O

Nocardia
Methylcyclode
(Actinomadura) cylprodigiosin

2,10-Nonano-6Methoxy-prodigiosene

391,5 Da
C25H33N3O

Streptomyces
Longisporusr

2-Undecyl-6Rnethoxyprodigiosene

393,6 Da
C25H35N3

Undecyl- prodigiosin

uber
Streplonlyces
longisporusr

O
Metacycloprodigiosin

2,4-(9-Ethylnonano) -6methoxyprodigiosene

uber

391,6 Da
C25H33N3
O

12