phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật phân giải cellulose để xử lý nước thải nhà máy giấy

PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1 HIỆN TRẠNG SẢN XUẤT GIẤY
1.1.1 Tình hình sản xuất
Giấy là một loại vật liệu được làm từ chất xơ dài từ vài mm cho đến vài cm,
thường có nguồn gốc thực vật và thường được tạo thành mạng lưới bởi lực liên
kết hidro không có chất kết dính. Thông thường giấy được sử dụng dưới dạng
những lớp mỏng nhưng cũng có thể dùng để tạo hình các vật lớn. Trên nguyên
tắc giấy được sản xuất từ bột gỗ hay bột giấy. Loại giấy quan trọng nhất về văn
hóa là giấy viết. Bên cạnh đó giấy được sử dụng làm vật liệu bao bì, trong nội
thất như giấy dán tường, giấy vệ sinh hay trong thủ công trang trí, đặc biệt là ở
Nhật và Trung Quốc. [ />Tùy theo mục đích sử dụng khác nhau sản phẩm giấy được chia thành 4
nhóm:
 Nhóm 1: Giấy dùng cho in viết (giấy in báo, giấy in và viết, ...)
 Nhóm 2: Giấy dùng trong công nghiệp (giấy bao bì, giấy chứa chất
lỏng, ...)
 Nhóm 3: Giấy dùng trong gia đình(giấy ăn, giấy vệ sinh,...)
 Nhóm 4: giấy dùng cho văn phòng (giấy fax, giấy in hóa đơn,...)
Hiện nay ở Việt Nam chỉ sản xuất được các loại sản phẩm như giấy in, giấy
in báo, giấy bao bì công nghiệp thông thường, giấy vàng mã, giấy vệ sinh chất
lượng thấp, giấy tissue chất lượng trung bình,... còn các loại giấy kỹ thuật điệnđiện tử, giấy sản xuất thuốc lá, giấy in tiền, giấy in tài liệu bảo mật vẫn chưa
được sản xuất. [báo cáo tóm tắt ngành giấy ]

1


1.1.2 Quy trình sản xuất giấy
Nguyên liệu thô được dùng trong sản xuất giấy và bột giấy ở Việt Nam gồm
hai nguồn căn bản là từ rừng (tre và gỗ mềm) và giấy tái chế. Bột giấy được dùng
để sản xuất các loại sản phẩm khác nhau như giấy viết, giấy bao bì, bìa
cactong, ... là khác nhau. Tuy ngiên có thể pha trộn bột giấy được tạo ra từ những
nguyên liệu thô khác nhau để có được những đặc tính mong muốn cho thành

phẩm.
 Quy trình sản xuất giấy:

Hình 1.1: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất giấy và bột giấy kèm theo các dòng
thải. [ ]
a. Chuẩn bị nguyên liệu thô
2


Nguyên liệu thô được sử dụng là tre, các loại gỗ mềm khác, giấy phế liệu
hoặc tái chế,... Trường hợp là gỗ thì sau khi đã cân trọng lượng, gỗ xếp thành
đống trong sân chứa và sau đó được mang đi cắt thành mảnh. Với loại tre mỏng
thì dùng máy cắt thành mảnh 3 lưỡi, còn với loại dày hơn thì dùng máy cắt có đĩa
dao 6 lưỡi. Kích cỡ của mảnh được tạo ra từ 15 – 35mm. Các mảnh quá to hay
quá nhỏ sẽ bị loại ra. Mảnh có khích cỡ phù hợp sau đó sẽ được chuyển đến khu
vực sản xuất bột giấy để nấu.
b. Sản xuất bột
 Nấu: Nhìn theo phương diện hóa học, gỗ bao gồm: [ Việt mỹ]
 40 – 50% cellulose
 10 – 55%hemicellulose
 20 – 30% lignin
 0,3 – 0,8% hợp chất vô cơ
Các xơ được tách ra khỏi lignin bằng cách nấu với hóa chất ở nhiệt độ và áp
suất cao trong nồi nấu. Quá trình nấu được thực hiện theo mẻ với kiềm NaOH và
hơi nước.
Sau nấu, các chất năm trong nồi nấu được xả ra nhờ áp suất đi vào tháp
phóng. Bột thường được chuyển qua các sàng để tách mấu trước khi rửa.
 Rửa: Trong quá trình rửa, bột từ tháp phóng và sàng mấu được rửa
bằng nước. Dịch đen loãng từ bột được loại bỏ trong quá trình rửa và được
chuyển đến quá trình thu hồi hóa chất. Bột tiếp tục rửa trong các bể rửa. Quá

trình rửa này kéo dài khoảng 5 – 6 giờ..
 Tẩy trắng: công đoạn này được thực hiện nhằm tạo độ sáng và độ
trắng cho bột giấy. Loại và lượng hẩy tra chất sử dụng phụ thuộc vào loại sản
phẩm sẽ được sản xuất từ bột giấy đó. Có 3 bước tẩy trắng bột truyền thống là:
Bước 1: Clo hóa bột giấy bằng khí clo, khí này sẽ phản ứng với lignin để tạo ra
các hợp chất tan trong nước hoặc tan trong môi trường kiềm.
Bước 2: Lignin đã oxi hóa được loại bỏ bằng cách hòa tan trong dung dịch kiềm.
Bước 3: Tẩy trắng bằng dung dịch hypochlorite.
c. Chuẩn bị bột
3


Bột giấy tẩy trắng sẽ được trộn với các loại bột khác nhau từ giấy phế liệu
hoặc bột nhập khẩu. Sự pha trộn phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu và loại giấy
cần sản xuất. Hỗn hợp bột được trộn với chất phụ gia và chất độn trong bồn trộn.
Thông thường, các hóa chất dùng để trộn là nhựa thông, phèn, bột đá, thuốc
nhuộm, chất tăng trắng quang học và chất kết dính, ..., gồm các bước sau:
 Trộn bột giấy và chất phụ gia để tạo ra dịch bột đồng nhất và liên tục.
 Nghiền đĩa để tạo ra được chất lượng mong muốn cho loại giấy cần
sản xuất.
 Hồ và tạo màu để đạt được thông số chất lượng như mong muốn.
d. Xeo giấy và hoàn thiện
Bột giấy đã trộn lại được làm sạch bằng phương pháp ly tâm để loại bỏ chất
phụ gia thừa và tạp chất, được cấp vào máy xeo thông qua hộp đầu. Về tách nước
và xeo giấy thì máy xeo có 3 bước phân biệt:
 Bước tách nước tọng lực và chân không (phần lưới)
 Bước tách nước cơ học (phần cuốn ép)
 Bước sấy bằng nhiệt (các máy sấy hơi gián tiếp)
Cuối cùng là giấy được làm khô bằng máy sấy hơi gián tiếp đạt khoảng 94%
độ cúng và được cuộn thành phẩm.

1.2 NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT GIẤY VÀ BỘT GIẤY
1.2.1 Nguồn gốc phát sinh
Các nhà máy giấy và bột giấy sinh ra một lượng lớn nước thải và nếu không
được xử lý thì có thể ảnh hưởng rất lớn đến môi trường. Bảng 1.2 cho thấy các
nguồn nước thải khác nhau trong một nhà máy giấy và bột giấy.
Bảng 1.1: Các nguồn nước thải từ các bộ phận và thiết bị khác nhau. [SXSH]

4


Phần lớn nước thải phát sinh là nước dùng trong quá trình tiếp xúc với
nguyên liệu thô, với các sản phẩm và sản phẩm phụ và chất dư thừa.

1.2.2 Thành phần và tình hình ô nhiễm của nước thải nhà máy giấy
Theo thống kê cả nước có gần 500 doanh nghiệp sản xuất giấy, trong đó chỉ
có khoảng 10% doanh nghiệp đạt tiêu chuẩn môi trường cho phép, còn hầu hết
các nhà máy đều không có hệ thống xử lý nước thải hoặc có nhưng chưa đạt yêu
cầu, vì thế tình trạng gây ô nhiễm môi trường do sản xuất giấy cũng đang là vấn
đề được nhiều người quan tâm.
So với nhiều ngành công nghiệp sản xuất khác, ngành giấy có mức độ ô
nhiễm cao và dễ gây ra tác động đến con người và môi trường xung quanh do ô
nhiễm từ nguồn nước thải xử lý không đạt yêu cầu.
Công nghệ sản xuất giấy ở Việt Nam còn rất lạc hậu. Để sản xuất ra 1 tấn
giấy thành phẩm, các nhà máy phải sử dụng từ 3-10 m3 nước, trong khi các nhà
máy giấy hiện đại của thế giới chỉ sử dụng 7-15 m3/tấn giấy. Sự lạc hậu này

5

không chỉ gây lãng phí nguồn nước ngọt, tăng chi phí xử lý nước thải mà còn đưa
ra sông, rạch lượng nước thải khổng lồ.
Trong các cơ sở công nghiệp giấy và bột giấy, nước thải thường có độ pH
trung bình 9-11, chỉ số nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), nhu cầu oxy hóa học (COD)
cao, có thể lên đến 700 mg/l và 2500 mg/l. Hàm lượng chất rắn lơ lửng cao gấp
nhiều lần giới hạn cho phép. Đặc biệt nước có chứa cả kim loại nặng, lignin (dịch
đen), phẩm màu, xút, các chất đa vòng thơm clo hóa là những hợp chất có độc
tính sinh thái cao và có nguy cơ gây ung thư, rất khó phân hủy trong môi trường.
Có những nhà máy giấy, lượng nước thải lên tới 4000-5000 m3/ngày, các chỉ tiêu
BOD, COD gấp 10-18 lần tiêu chuẩn cho phép; lượng nước thải này không được
xử lý mà đổ trực tiếp vào sông.
Ngoài ra trong công nghiệp xeo giấy, để tạo nên một sản phẩm đặc thù
hoặc những tính năng đặc thù cho sản phẩm, người ta còn sử dụng nhiều hóa chất
và chất xúc tác. Những chất này nếu không được thu hồi hoặc xử lý mà xả thẳng
ra sông ngòi thì vấn đề ô nhiễm là không tránh khỏi, làm mất cân bằng sinh thái
trong môi trường nước.
Hiện nay, ở các khu vực có cơ sở sản xuất giấy đang phải chịu sức ép nặng
nề về ô nhiễm môi trường, để sản xuất mỗi tấn bột giấy phải thải ra 10 tấn dịch
đen. Riêng khu vực sông Cầu, chỉ với 3500 m3 nước xả mỗi ngày, nhưng ngành
giấy đã là thủ phạm số một gây ô nhiễm nặng cho dòng sông này, trong đó nhà
máy giấy Hoàng Văn Thụ đứng đầu bảng.
Ở Bắc Ninh, mỗi ngày Phong Khê thải ra sông 4500 m3 nước thải và theo
thống kê của Sở Tài Nguyên và Môi Trường, các chỉ số BOD, COD, coliform
đều cao hơn mức cho phép 4-6 lần. Khói và bụi giấy đã làm cho bầu không khí ở
Phong Khê bị ô nhiễm trầm trọng. Chính lượng nước thải đã làm cho nhiều diện
tích sản xuất nông nghiệp thành đất chết.
Điều đặc biệt là việc đặt các nhà máy ở thượng nguồn sông Hậu như: Khu
công nghiệp Trà Nóc II hay Thốt Nốt, Ô Môn, đã gây ô nhiễm nguồn nước trầm
trọng, làm ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản.

6


Dưới đây là bảng thành phần nước thải của một số nhà máy sản xuất giấy và
bột giấy với nguyên liệu là gỗ và giấy thải theo cục Môi trường thống kê được.
Bảng 1.2: Thành phần nước thải của một số nhà máy sản xuất giấy và bột
giấy với nguyên liệu là gỗ và giấy thải

Dựa vào bảng 1.2 trên ta thấy nồng độ COD, BOD 5 khá cao, vượt nhiều lần
so với TCCP. Vậy nên cần có những biện pháp xử lý phù hợp để cải thiện chất
lượng môi trường nước trước khi thải ra sông, suối,...
1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT
GIẤY VÀ BỘT GIẤY

1.3.1 Phương pháp cơ học
Phương pháp này được dùng để loại bỏ các vật rắn kích thước lớn bao gồm
những chất lơ lửng và các chất lắng đọng có bản chất vô cơ hoặc hữu cơ. Để tách
các hạt lơ lửng ra khỏi nước thải, thường người ta sử dụng các quá trình thủy cơ
(gián đoạn hay liên tục), lọc qua song chắn hoặc lưới, lắng dưới tác dụng của lực
trọng trường hoặc lực li tâm hay lọc.
• Lọc: nước thải qua song chắn hoặc lưới chắn: đây là bước xử lí sơ bộ
nhằm khử tất cả các tạp chất có thể gây ra sự cố trong quá trình vận hành hệ
thống xử lí nước thải như làm tắc bơm, đường ống hay kênh dẫn.

7


• Lắng: quá trình này được dùng để loại bỏ các tạp chất dạng huyền phù thô
ra khỏi nước. Sự lắng của các hạt xảy ra dưới tác dụng của trọng lực. Để tiến
hành quá trình này người ta thường dùng các loại bể lắng khác nhau như: bể lắng

cát (cấp I) – có nhiệm vụ tách các chất rắn hữu cơ và các chất rắn khác và bể lắng
trong (cấp II) – có nhiệm vụ tách bùn sinh học ra khỏi nước thải.

1.3.2 Phương pháp hóa lí
Thường được dùng cho mục đích loại bớt các thành phần lơ lửng trong nước
thải bằng cách kết tủa chúng hoặc tạo đám trên bề mặt nước.
• Đông tụ và keo tụ: quá trình lắng chỉ có thể tách được các hạt rắn huyền
phù phù hợp nhưng không thể tách được các chất gây nhiễm bẩn ở dạng keo và
hòa tan vì chúng là những hạt rắn có kích thước quá nhỏ. Để tách các hạt rắn đó
một cách hiệu quả bằng phương pháp lắng cần tăng kích thước của chúng nhờ sự
tác động tương hỗ của các hạt phân tán liên kết thành tập hợp các hạt nhằm tăng
tốc độ lắng của chúng. Việc khử các hạt keo rắn bằng lắng trọng lượng đòi hỏi
trước hết cần trung hòa điện tích của chúng, sau đó liên kết chúng với nhau. Quá
trình trung hòa điện tích được gọi là quá trình đông tụ, khác với quá trình tạo
thành các bông lớn hơn từ các hạt nhỏ. Các chất keo tụ thường dùng là
Al2(SO4)3, FeCl3,…
• Tuyển nổi: phương pháp tuyển nổi được sử dụng để tách các tạp chất phân
tán không tan, sự lắng kém ra khỏi pha lỏng. Trong một số trường hợp, quá trình
này dùng để tách các chất hòa tan như các chất hoạt động bề mặt. Về nguyên tắc,
phương pháp tuyển nổi được sử dụng để khử các chất lơ lửng và làm đặc bùn
sinh học. Quá trình tuyển nổi được thực hiện bằng cách sục các bọt khí vào pha
lỏng. Các bọt khí đó dính bám với các hạt và khi lực nổi của tập hợp bóng khí và
hạt đủ lớn sẽ kéo hạt nổi lên trên bề mặt sau đó chúng tập hợp lại với nhau thành
lớp bọt chứa hàm lượng các hạt cao.

1.3.3 Phương pháp hóa học
Các phương pháp hóa học dùng trong xử lý nước thải gồm có: trung hòa, oxy
hóa và khử. Tất cả các phương pháp này đều dùng các tác nhân hóa học nên là
8

phương pháp đắt tiền. người ta sử dụng phương pháp này để khử các chất hòa tan
tròn các hệ thống cấp nước khép kín. Đôi khi các phương pháp này được dùng để
xử lý sơ bộ trước xử lý sinh học hay sau công đoạn này như là một phương pháp
xử lý nước thải lần cuối để thải vào nguồn nước.

1.3.4 Phương pháp sinh học
Trong nhiều biện pháp xử lý ô nhiễm, biện pháp sinh học được mọi người
đặc biệt quan tâm sử dụng. So với các biện pháp vật lý, hoá học, biện pháp sinh
học chiếm vai trò quan trọng về quy mô cũng như giá thành đâu tư, do chi phí
năng lượng cho một đơn vị khối lượng chất khử là ít nhất. Đặc biệt xử lý bằng
biện pháp sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trường - một nhược điểm mà
biện pháp hoá học hay mắc phải. Biện pháp sinh học sử dụng một đặc điểm rất
quý của vi sinh vật , đặc điểm đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu và các
nhà sản xuất là khả năng đồng hoá được rất nhiều nguồn cơ chất khác nhau của
vi sinh vật, từ tinh bột, cellulose, cả nguồn dầu mỏ và dẫn xuất của nó đến các
hợp chất cao phân tử khác như protein, lipid, cùng các kim loại nặng như chì,
thuỷ ngân ... Thực chất của phương pháp này là nhờ hoạt động sống của vi sinh
vật (sử dụng các hợp chất hữu cơ và một số chất khoáng có trong nước thải làm
nguồn dinh dưỡng và năng lượng) để biến đổi các hợp chất hữu cơ cao phân tử
có trong nước thải thành các hợp chất đơn giản hơn. Trong quá trình dinh dưỡng
này vi sinh vật sẽ nhận được các chất làm vật liệu để xây dựng tế bào, sinh
trưởng và sinh sản, nên sinh khối được tăng lên.
Hàm lượng các chất hữu cơ được phân rã bởi vi sinh vật được đánh giá theo
chỉ số "tiêu thụ sinh học oxy" BOD. Đấy là số lượng oxy cần cho vi sinh vật để
oxy-hoá vật liệu hữu cơ trong quá trình hô hấp. Thí dụ BOD5 có nghĩa là số
lượng oxy (mg) cần cho vi sinh vật trong quá trình phân rã các chất hữu cơ thời
gian 5 ngày. Chỉ số "tiêu thụ hóa học oxy" (COD) biểu thị số lượng oxy cần
trong quá trình oxy hóa hóa học hoàn toàn các chất nói trên đến CO2 và H2O.
Quá trình xử lý sinh học gồm các bước sau:

-

Chuyển hóa các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc cacbon ở dạng keo và
dạng hòa tan thành thể khí và thành các vỏ tế bào vi sinh.
9


-

Tạo ra các bông cặn sinh học gồm các tế bào vi sinh vật và các chất keo
vô cơ có trong nước thải.

-

Loại các bông cặn sinh học ra khỏi nước thải bằng phương pháp lắng
trọng lực.

Do vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trong quá trình xử lý sinh học nên tùy
thuộc vào tính chất hoạt động của chúng, phương pháp xử lý sinh học có thể chia
thành hai loại: phương pháp xử lý kị khí và phương pháp xử lý hiếu khí. Ngoài ra
trong một số trường hợp, người ta cũng sử dụng kết hợp cả hai quá trình khị khí
và hiếu khí.
-

Phương pháp xử lý kị khí: sử dụng nhóm vi sinh vật kị khí, quá trình xử lý
diễn ra trong điều kiện không có oxy.
Quá trình phân hủy kị khí các chất hữu cơ là các quá trình sinh học phức tạp

tạo ra hàng trăm sản phẩm trung gian và phản ứng trung gian. Tuy nhiên, phương
trình phản ứng sinh hóa trong điều kiện kị khí có thể biểu diễn đơn giản như sau:

Chất hữu cơ

CH4 + CO2 + H2 + NH3 + H2S + Tế bào mới

vi sinh vật

Một cách tổng quát, quá trình phân hủy kị khí xảy ra theo 4 giai đoạn:
-

Giai đoạn 1: thủy phân, cắt mạch các hợp chất cao phân tử

-

Giai đoạn 2: axit hóa

-

Giai đoạn 3: acetat hóa

-

Giai đoạn 4: methane hóa

Các hợp chất hữu cơ chứa nhiều hợp chất cao phân tử như: protein, chất béo,
cacbonhydrate, cellulose, lignin, ... trong giai đoạn thủy phân sẽ cắt chuyển hóa
thành các phân tử đơn giản, dễ thủy phân hơn. Các phản ứng thủy phân sẽ
chuyển hóa protein thành các amino acid, cacbonhydrate thành đường đơn và
chất béo thành acid béo. Trong giai đoạn acid hóa, các chất hữu cơ đơn giản lại
tiếp tục được chuyển hóa thành acid acetic, H 2, CO2. Vi khuẩn methane chỉ có thể
phân hủy một số loại cơ chất nhất định như là CO 2 + H2, formate, acetate,

methanol, methyl amine và CO. Các phương trình phản ứng diễn ra như sau:
4H2 + CO2
4HCOOH

CH4 + 2H2O
CH4 + 3CO2 + 2H2O

10


-

CH3COOH

CH4 + CO2

4CH3OH

3CH4 + CO2 + H2O

4(CH3)3N + H2O

9CH4 + 3CO2 + 6H2O + 4NH3

Phương pháp hiếu khí: sử dụng nhóm vi sinh vật hiếu khí, quá trình diễn ra
trong tình trạng có oxy.
Quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học hiếu khia gồm 3 giai

đoạn:
-

Oxy hóa các chất hữu cơ:
CxHyOz + O2

-

CO2 + H2O + Q

enzym

Tổng hợp tế bào mới:

CxHyOz + O2 + NH3 enzym
-

Tế bào vi khuẩn (C5H7O2N) + CO2 + H2O – Q

Phân hủy nội bào:
C5H7O2N + O2

5CO2 + H2O + NH3 + Q

Các quá trình xử lý sinh học bằng phương pháp kị khí và hiếu khí có thể xảy
ra ở điều kiện tự nhiên hoặc nhân tạo. Trong các công trình xử lý nhân tạo, người
ta ra điều kiện tối ưu cho quá trình oxy hóa nên quá trình xử lý có tốc độ và hiệu
suất cao hơn xử lý sinh học tự nhiên.
1.4 CELLULOSE VÀ CẤU TRÚC
Cellulose là thành phần chủ yếu của tổ chức thực vật (chiếm khoảng 3550% trọng lượng khô của xác thực vật) và đặc biệt là ở rễ. Ở tế bào thực vật và
một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Cellulose là một polymer hữu
cơ phổ biến nhất trong tự nhiên. Hằng năm một lượng lớn sinh khối cellulose

(1,5 x 1012tấn) được tạo thành chủ yếu từ quá trình quá trình quang hợp.

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của phân tử cellulose
11


Cellulose là 1 polysaccharide gồm nhiều polymer được cấu thành từ các tiểu
đơn vị monosaccharide glucose. Cellulose là hợp chất cao phân tử cấu tạo từ
các liên kết mắt xích β – D – Glucose, có công thức cấu tạo là
(C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000 –
14000. Đây là thành phần chủ yếu tạo nên vách tế bào thực vật, chúng liên kết
chặt chẽ với các thành phần khác như hemicellulose, lignin tạo nên các phức hệ
bền vững. Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer
mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β – D – glucose – pyranose. Các gốc
glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180 o và có dạng như một
chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu
tạo như hình 1.2.
Cellulose là chất màu trắng, không mùi, không vị, không tan trong nước và
các dung môi thông thường. Tan trong một số dung dịch axit vô cơ mạnh như
HCl, HNO3,.. và bị thủy phân bởi enzyme cellulase [9]. Cellulose cấu tạo dạng
sợi, có cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một
disaccharide gọi là cellubiose, cellubiose được cấu trúc từ hai phân tử D
-glucose. Cellulose có cấu trúc bâc 2 và bậc 3 rất phức tạp, tạo thành
cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết Hydro trùng hợp nhiều lần nên
rất bền vững, ngoài ra còn có lực Vander Wall tạo ta mạng lưới gồm các sợi song
song hoặc đan chéo nhau có độ bền cao.
Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có
khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các
sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác
thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi

khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy
nhờ enzyme cellulase [11].

12


1.5 ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP
CELLULASE

1.5.1 Giới thiệu về enzym cellulase
Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiều
enzyme khác nhau. Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D –
glucoside) tạo ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides.
Có 3 loại enzyme cellulose chính:
- Cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobioydrolase, EC
3.2.1.91): Enzym này cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành
cellobiose. Khối lượng phân tử của các enzyme thuộc nhóm này trong khoảng 53
- 75 kDa. Các enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh
mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng.
- Endo-β-1,4-cellulase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase,
EC 3.2.14) có khối lượng phân tử trong khoảng 42 – 49 kDa. Chúng hoạt động ở
nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose
trong lichenin và β-D-glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin,
cellobiose, và glucose.
- β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21): có khả năng hoạt động ở pH rất rộng
(pH 4,4 – 4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4 và có thể
hoạt động ở nhiệt độ cao. β-glucosidase tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành
glucose (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Enzyme thủy phân cellulose có thể được tách thành nhiều thành phần, chẳng
hạn như enzyme cellulase của vi sinh vật có thể bao gồm một hoặc nhiều CBH,

một hoặc nhiều EG và có thể có β-glucosidase. Hệ thống hoàn chỉnh bao gồm
CBH celulase, EG và BG phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose. Các
enzyme exo-cellobiohydrolases và endocellulases cùng hoạt động để thủy phân
cellulose thành các đoạn ngắn oligosaccharides. Các oligosaccharides (chủ yếu là
cellobiose) sau đó được thủy phân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase [14].

13


Hình 1.3: Mô hình enzyme cellulase
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các
axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-. Ngoài ra, trong
cấu trúc còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme
nhóm EG và CBH giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung
tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xác tác
và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với
cellulose (CBD: cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với
cellulose tinh thể.

Hình 1.4: Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulase
Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulase
như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Thiếu một trong ba loại
enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng. Từ những
nghiên cứu riêng rẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp
14


của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luận chung
là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo
thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ

chế tác động của cellulase, cụ thể cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulase
như sau: đầu tiên EG tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt
liên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do. Tiếp đó CBH tấn công cắt
ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành. Kết quả tác động của
EG và CBH tạo ra các celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose.
BG thủy phân tiếp và tạo thành glucose. Các loài vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác
động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài
lại phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến
hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy
cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ
chất, lượng enzyme…, một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ
của hệ enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Quá trình
thủy phân cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử
dụng đồng bộ ba loại enzyme cellulase. Cellulase có thể được tổng hợp từ rất
nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi
sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men. Do ưu điểm
về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật
thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme. Enzyme cellulase đã
được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới. Đây là enzyme được ứng dụng rất rộng
rãi, chỉ đứng sau protease và amylase.

1.5.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase chủ yếu là phân giải
carbohydrate thường không sử dụng protein hay lipid làm nguồn năng lượng cho
sự sinh trưởng [22]. Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật
sinh tổng hợp cellulase có chứa các nguồn cellulose khác nhau [15,16]. Trong
15

số các vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase đáng chú ý nhất là vi khuẩn,
Cellulomonas cytophaga (xạ khuẩn). Hầu hết các loại nấm có thể sử dụng
nhiều carbohydrate khác ngoài cellulose [25], trong khi ở các loài sống trong
điều kiện kỵ khí thì có sự lựa chọn về nguồn carbohydrate, cellulose. Khả
năng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loại nấm, đặc điểm này
được khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở quy mô lớn. Nấm
Trichoderma reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase ngoại
bào. Hầu hết các nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulose tập trung vào
các

loài

nấm

Actinomucor),

vi

(Trichoderma,
khuẩn

Humicola, Penicilium,

Pseudomonas,

Aspergillus,

Cellulomonas, Actinomycetes và

Streptomyces).
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme cellulase – một hệ enzyme phức tạp
được sinh ra bởi nhiều vi sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn [18]. Mặc dù
những loài nấm sợi thì tỏ ra phân hủy rất tốt các cellulose tự nhiên, thế nhưng
vi khuẩn lại có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có tiềm năng lớn để
được dùng trong việc sản xuất cellulase. Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả
năng sinh enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn nhìn chung vẫn còn khiêm
tốn so với nghiên cứu trên nấm. Dù vậy, đặc điểm phân giải cellulose của
vài

giống

vi khuẩn

như

Cellulomonas,

Cellovibrio,

Pseudomonas,

Sporosphytophaga, Bacillus và Micrococcus đã được nghiên cứu và báo cáo trên
thế giới [18].
Đặc biệt, với các chủng Bacillus được chú ý hơn cả về khả năng sinh tổng
hợp nhiều loại enzyme như cellulase, amylase , protease và PGA....có ứng dụng
rất nhiều trong đời sống của con người.
Theo Peter (1985), trong nhóm vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase thì các loài
thuộc chi Baccillus luôn chiếm ưu thế (đến 87%). Howard và cộng sự cũng chỉ ra
rằng có nhiều chủng vi sinh vật thuộc chi Baccillus đã được phân lập và định

tên đến loài, bao gồm

B.

subtilis,

B.

macerans, B.

licheniformis, B.

sphaericus [17]. Hiện nay các chủng vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu
và ứng dụng do vi khuẩn có nhiều ưu việt so với các nhóm nấm vì vi khuẩn có

16


tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo được nhiều sinh khối hơn so với nấm mốc hay
nấm sợi do đó giá thành khi sản xuất chế phẩm sẽ rẻ hơn [12;20].

17


PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu được lấy từ nước thải tại nhà máy sản xuất giấy.

2.1.2. Dụng cụ

Các dụng cụ, thiết bị của phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh – Hóa sinh –
Sinh học phân tử, khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Thiết bị bao gồm: tủ lạnh - SANYO, nồi hấp thanh trùng – HIRAYAMA
(Nhật Bản); máy đo pH, cân phân tích - Mettle Tolendo (Thụy Sỹ); lò vi sóng Sam Sung (Hàn Quốc); box cấy; tủ bảo ôn SHELLAB, máy lắc VBEG –
ML02; Máy vortex VELP (Đức),

Máy đo quang phổ Ultrospec 2000;

Micropipet 100 – 1000μL, 10 – 200μL, 0,1 – 10μL Genex Beta (Anh).

2.1.3. Hóa chất
Pepton, cao thịt, CMC, NaCl, NaOH, HCl (Trung Quốc), Agar (Việt
Nam), côngo red (Đức), axit citric (Trung Quốc),...

2.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
2.2.1. Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose
Môi trường NA + 1%CMC:
-

Pepton 1%

-

Cao thịt 0,3%

-

NaCl 0,5%

-

CMC 1%

2.2.2. Môi trường thử hoạt tính enzym cellulase
Thành phần bao gồm: CMC 1%, Agar 2%.
18


Thuốc thử congo đỏ
Tất cả các môi trường được điều chỉnh về pH= 7, thanh trùng ở thanh trùng
121°C trong 15 phút
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase
Mục đích: Tách riêng từng tế bào vi khuẩn trong dịch nước thải để được dòng
thuần.
Các bước tiến hành:
-

Lấy 50ml mẫu nước thải cho vào bình tam giác điều chỉnh pH (3 – 4),
đem nuôi ở tủ lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 37oC trong 2 ngày, sau
đó đem ổn nhiệt ở 70oC trong 10 phút.

-

Tiến hành pha loãng: Chuẩn bị một dãy các ống nghiệm có chứa sẵn
9ml nước cất đã vô trùng dùng để pha loãng mẫu. Lấy 1ml dịch mẫu
cho vào ống nghiệm đầu có chứa 9ml nước thanh trùng và lắc đều.
Lặp lại bước trên đến khi đạt nồng độ pha loãng 10-6÷ 10-7.

-

Với các nồng độ pha loãng khác nhau, ta dùng pipet hút 100µL dịch
pha loãng chuyển vào đĩa petri chứa môi trường phân lập đã vô trùng’

-

Dùng que trang, dàn đều giọt dịch lên bề mặt đĩa petri đến khi mặt đĩa
khô ráo.

-

Nuôi trong tủ ấm tại 35 - 37°C trong thời gian 24 giờ.

Sau thời gian nuôi cấy thu được các khuẩn lạc riêng rẽ, ta tiến hành cấy từng
khuẩn lạc trên hộp petri môi trường phân lập. Nhuộm đĩa thạch đã nuôi cấy bằng
thuốc thử congo đỏ, khuẩn lạc nào cho vòng phân giải chứng tỏ có hoạt
tính cellulase. Ta tiếp tục sử dụng phương pháp vết cấy cạn dần để cấy khuẩn
lạc có hoạt tính trên hộp petri môi trường phân lập 2 – 3 lần nữa để thu được
khuẩn lạc thuần khiết. Giữ giống trong ống thạch nghiêng, bảo quản trong tủ
lạnh.

19


2.3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
cellulase cao
Mục đích: Tìm chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase cao
nhất. Từ các chủng đã phân lập được tiến hành thử hoạt tính và tuyển chọn

chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase cao nhất.
2.3.2.1. Phương pháp cấy chấm điểm
Nguyên tắc phương pháp: enzym cellulase thuỷ phân CMC trong môi
trường sẽ tạo vòng thủy phân không màu khi nhỏ thuốc thử congo đỏ. Từ
các khuẩn lạc riêng rẽ thu được tiến hành kiểm tra khả năng sinh enzym
cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch. Chủng có khả năng
sinh cellulase sẽ tạo ra xung quanh khuẩn lạc vòng không màu với thuốc thử
congo đỏ. Tuyển chọn chủng có tỉ lệ giữa đường kính vòng phân giải (D) và
đường kính khuẩn lạc (d) lớn nhất.
Các bước tiến hành:
- Pha môi trường thử hoạt tính CMC đặc, thanh trùng
- Đổ môi trường vào các hộp peptri có độ dày như nhau 3 – 5 mm
- Dùng que cấy đầu nhọn vô trùng, lấy một ít khuẩn lạc chấm một điểm lên
đĩa thạch
- Cho vào tủ ấm nuôi ở 35 – 37°C trong ba ngày
- Nhuộm đĩa thạch bằng congo đỏ, đo kích thước vòng thủy phân và khuẩn
lạc
Hoạt tính thủy phân CMC được hiển thị bằng tỉ số giữa đường kính vòng
phân giải D và đường kính khuẩn lạc d.
2.3.2.2. Phương pháp đục lỗ thạch
Nuôi lỏng các chủng cần tuyển chọn ở cùng một điều kiện, sau đó lấy canh
trường ly tâm loại sinh khối thu được dịch trong. Đĩa thạch có chứa CMC được
đục các giếng có cùng kích thước đường kính 8 mm. Tiếp đó nhỏ dịch trong của
mỗi chủng với thể tích bằng nhau vào mỗi giếng 100µl. Giữ trong tủ lạnh 2 –
4h để enzym có thể khuếch tán đều vào thạch. Ủ đĩa thạch ở 37°C trong vòng

20


20 –24h. Sau đó tiến hành nhỏ thuốc thử congo đỏ so sánh kích thước vòng phân

giải.
2.3.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase
Hoạt độ cellulase được xác định chính xác dựa vào lượng đường khử tạo
thành sau phản ứng bằng phương pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [23].
Xây dựng đồ thị đường chuẩn:
Bảng 2.1: Xây dựng đồ thị chuẩn

STT

0

1

2

3

4

5

6

7

8

V glucose 0
2 mg/ml (

50

75

100

150

250

350

500

1000

V
(ul)

950

925

900

850

750

650

500

0

0,1

0,15

0,2

0,3

0,5

0,7

1

2

nước 1000

Nồng độ 0
đường
(mg/ml)
OD
540
nm

Sau đó lấy mỗi ống 300 ul glucose trên đem phản ứng với 600 ul DNS ở 95 –
100oC trong 5 phút. Đo quang phổ ở bước sóng 540 nm. Từ giá trị đo được ta
xây dựng đường chuẩn, trong đó trục tung là giá trị OD540, trục hoành là hàm
lượng glucose (ul).
Xác định hoạt độ:
Ống thí nghiệm:
Mẫu thí nghiệm

Mẫu kiểm chứng

CMC 1,25%

270 ul

270 ul

Dịch enzym thô

30 ul

0 ul

Ổn nhiệt ở 50oC trong 30 phút
21


DNS

600 ul

600 ul

0 ul

30 ul

Đem đun cách thủy ở 95 – 100oC trong 5 phút, mang làm lạnh và đo ở bước
sóng 540 nm.

2.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH LÝ, SINH HÓA
CỦA CHỦNG
2.4.1. Phương pháp nhuộm Gram
Mục đích: quan sát hình thái khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường đặc bằng mắt
thường, bao gồm các đặc điểm: hình dạng, kích thước khuẩn lạc, màu sắc, bề
mặt, mép khuẩn lạc, cấu trúc khuẩn lạc, đặc tính quang học
Nguyên tắc: sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình
hấp phụ. Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững. Vì thành phần tế bào của mỗi vi
sinh vật khác nhau nên khả năng bắt màu cũng khác nhau. Dựa vào sự bắt màu
khác nhau này mà chia vi khuân ra làm 2 nhóm Gram + bắt màu tím và Gram –
bắt màu hồng.
Cách tiến hành: chủng vi khuẩn cần quan sát được nuôi lắc 120 vòng/phút ở
30 – 32oC trong 36h trong môi trường cơ sở.
-

Dùng que cấy đầu tròn lấy một giọt canh trường lỏng dàn đều lên lam kính

sạch. Cố định các vết bôi bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn.
-

Nhỏ một giọt tím gential lên trên vết bôi, để từ 1 – 2 phút rồi rửa nhẹ bằng

nước cất trong vòng vài giây.
-

Sau đó nhỏ một giọt dung dịch lugol lên vết bôi để từ 1 – 2 phút rồi đổ đi

và rửa lại bằng cồn trong vòng 30 giây.
-

Rồi tiếp tục nhỏ một giọt dung dịch fuchsin 0,1% lên vết bôi và giữa trong

vòng 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng. Hơ khô vết bôi trên ngọn lửa đèn
cồn rồi nhỏ một giọt dầu soi kính lên trên vết bôi đem quan sát dưới kính hiển vi
có độ phóng đại 100X.
-

Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím xanh còn vi khuẩn Gram âm bắt màu

hồng
22


2.4.2. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử
Để xác định sự hình thành bào tử ta sử dụng phương pháp sốc nhiệt: vi khuẩn
sau khi nuôi trong môi trường lỏng 24h đem sốc nhiệt ở 70 oC trong 10 phút, sau
đó đem pha loãng và trang trên môi trường thạch petri, nuôi ở 37 oC trong 24h rồi
đem kiểm tra xem nếu có khuẩn lạc mọc chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng hình
thành bào tử. Hay đem nhuộm đơn giản rồi quan sát qua kính hiển vi có độ
phóng đị 100X để xem hình dạng bào tử.

2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính catalase [1, 7]
Mục đích: phát hiện vi sinh vật có hệ enzyme catalase.
Tiến hành: Đối với canh trường lỏng thì lấy một giọt huyền phù tế bào nhỏ
lên đĩa sứ có sẵn một giọt H 2O2, nếu thấy sủi bọt thì vi khuẩn có khả năng phản
ứng catalase dương tính, ngược lại là âm tính với phản ứng catalase.
Đối với khuẩn lạc thì ta nhỏ một giọt H2O2 lên khuẩn lạc rồi quan sát tương tự
như trên.

2.5. ĐỊNH TÊN THEO PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN
TỬ
2.5.1. Tách chiết DNA tổng số
Nguyên tắc: Tách chiết được DNA cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ liên kết
của các protein với DNA. Khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzyme phân
hủy DNA.
Tiến hành: Nuôi tăng sinh vi khuẩn đã tuyển chọn được trên môi trường NA
trong 24h ở 37oC, thu dịch nuôi ly tâm ở 5000 x g, 10 phút, thu sinh khối, hòa tan
sinh khối trong 0,5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS). Ủ phản ứng ở nhiệt
độ phòng trong 10 phút. Bổ sung lysozym 50µg/ml ủ 650C trong 1h. Bổ sung
0,15 ml CH3COOK. Ly tâm 10000 x g trong 15 min ở 40C. Chuyển dịch nổi
sang ống eppendorf mới và bổ sung một lượng tương đương isopropanol. Ly tâm

23


ở 13 000 x g trong 10 phút ở 40C thu tủa. Rửa tủa bằng EtOH 70%. Làm khô tủa,
hòa tan lại DNA với 30 µl trong H2O dd.

2.5.2. Phương pháp điện di gel agarose
Nguyên tắc: Việc phân tách DNA dựa trên độ lớn và hình thái của DNA trong
điện trường. Do tích điện âm nên các phân tử DNA dịch chuyển về phía anode

(cực dương) với tốc độ tỉ lệ nghịch với khối lượng phân tử. Vì vậy, các đoạn
DNA càng lớn thì dịch chuyển càng chậm và sau một khoảng thời gian di
chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân tử có kích thước (trọng lượng) khác
nhau sẽ tách xa vị trí ban đầu di chuyển những khoảng khác nhau. Do đó, chúng
được tách nhau ra và có thể được phát hiện nhờ kĩ thuật nhuộm EtBr.
Tiến hành: (cho gel agarose 1%)
-

Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn

toàn. Để nguội 45oC - 50oC rồi đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn. Sau 2030 phút, gel đã trùng hợp hoàn toàn thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện
di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng
1-2 mm.
-

Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn với đệm mẫu 6X và tra vào các giếng trên

gel.
-

Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với

bộ nguồn với chế độ chạy 100V và 90mA.
-

Nhuộm gel: Bản gel sau khi chạy điện di xong được nhuộm trong dung

dịch EtBr 0,5g/ml trong 5-10 phút, rửa lại bằng nước trước khi soi gel.
-

Quan sát: Gel được soi dưới đèn tử ngoại, DNA sẽ được phát sáng nhờ

liên kết với EtBr.

2.5.3. Phản ứng PCR
Nguyên tắc: Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary
Mullis và cộng sự (Mỹ) phát sinh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động
to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên thế giới. Đây là phương pháp in vitro
sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA
24


đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng
hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi,
là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch
khuôn. Đoạn mồi này sau đó sẽ được kéo dài ra nhờ hoạt động của DNA
polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Một phản ứng PCR là một
chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:
-

Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch khuôn thành dạng mạch đơn

-

Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung

-

Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc.

Thành phần PCR :
5 mM dNTPs (Fermentas)

: 1,5 µl

10X Taq Buffer (Sigma)

: 2,5 µl

5 µM 27F(mồi xuôi)

: 1 µl

5 µM 1492R (mồi ngược)

: 1µl

DNA template

: 1 µl

Taq DNA pol (Sigma) : 0,3 µl
H2O

: 17,5

Tổng thể tích phản ứng : 25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chuẩn:
1. Biến tính ở chu kỳ đầu ở 95oC trong 5 phút.
2. 95oC trong 45 giây

3. Bắt cặp mồi ở nhiệt độ khoảng 52oC trong 1 phút
4. Kéo dài ở 72oC trong 1,5 phút
Lặp lại từ bước 2 đến 4: 35 chu kỳ
5. Chu kỳ cuối thực hiện ở 72oC trong 5 phút. Kết thúc phản ứng hạ
nhiệt độ xuống 4oC.
 Trình tự mồi xuôi và mồi ngược như sau:
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã được sử dụng quốc tế: 27F/1492R
27F:

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492R: TACGGYTACCTTGTTACGACTT
25