Điều tra, nghiên cứu ký sinh trùng giáp xác chân tơ (cirripedia) trên cua biển (scylla sp) trong nuôi ao đất tại vùng ven biển nam định

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
------   ------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
Bước đầu xác định khả năng sinh enzyme xylanase
từ một số chủng nấm, ứng dụng để sản xuất prebiotic
xylooligosaccharide.

Sinh viên thực hiện : Lê Thị Huế
Lớp

: BQCBB

Khóa

: K54

Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoàng Anh
Bộ môn Hóa sinh - Công nghệ sinh học thực phẩm

HÀ NỘI, 5/2013


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận
này là trung thực.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa luận này
đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã được
ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 23 tháng 6 năm 2013

i


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học
thực phẩm, khoa Công Nghệ Thực Phẩm và phòng Công nghệ vi sinh, khoa
Công nghệ Sinh Học được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy
cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực
của bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hoàng
Anh đã tận tình hướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như
nghiên cứu.
Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Phòng, Ban của
khoa Công Nghệ Thực Phẩm và khoa Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể bạn
bè đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá
trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp.
Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời
cảm ơn tới Bố, Mẹ, Ông, Bà và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động
viên và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 23 tháng 6 năm 2013

i


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN..............................................................................................................................................i

MỤC LỤC...................................................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU.................................................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.........................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................................................................vii
PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU................................................................................................................1

1.1. Đặt vấn đề..........................................................................................................................1
1.2. Mục đích – Yêu cầu...........................................................................................................2
1.2.1. Mục đích.................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu...................................................................................................................2
PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................................3

2.1. Xylan..................................................................................................................................3
2.1.1. Giới thiệu về xylan.................................................................................................3
2.1.2. Nguồn cung cấp xylan............................................................................................3
2.1.3. Tính chất của xylan................................................................................................5
2.1.4. Ứng dụng của xylan trong sản xuất XOS...............................................................7
2.2. Enzyme xylanase...............................................................................................................7
2.2.1. Giới thiệu về hệ enzyme xylanase..........................................................................7
2.2.2. Nguồn enzyme xylanase trong tự nhiên và ứng dụng............................................9
2.2.3. Tình hình nghiên cứu về enzyme xylanase...........................................................11
2.3. Giới thiệu chung về một số chủng nấm sợi......................................................................12
2.4. Prebiotic Xylooligosaccharide (XOS).............................................................................14
PHẦN THỨ BA........................................................................................................................................16
ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................................................16

3.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu...................................................................................16
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................................16
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu............................................................................................16
3.1.3. Dụng cụ hóa chất nghiên cứu...............................................................................16

3.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................................18
3.2.1. Xác định hoạt tính của enzyme xylanse ở một số chủng nấm mốc nuôi trong môi
trường có xylan từ lõi ngô..............................................................................................19
3.2.2. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh enzyme của các
chủng nấm mốc...............................................................................................................19
3.2.3. Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất xylan từ lõi ngô tới khả năng sinh
enzyme xylanase của các chủng nấm mốc.....................................................................19
3.2.4. Tinh sạch và xác định hoạt độ riêng của enzyme xylanase ở các chủng nấm mốc
có khả năng sinh enzyme................................................................................................19
3.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................................20
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy nấm mốc..........................................................................20
3.3.2. Phương pháp sản xuất xylan từ lõi ngô................................................................20
3.3.3. Phương pháp chuẩn bị dịch huyền phù xylan.......................................................20

ii


3.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính xylanase theo phương pháp định lượng đường
khử với thuốc thử DNS...................................................................................................21
3.3.5.Xác định hàm lượng protein bằng thiết bị so màu Eppendorf Biophotometer plus
........................................................................................................................................23
3.3.6.Tinh sạch enzyme bằng (NH4)2SO4.....................................................................24
PHẦN THỨ TƯ........................................................................................................................................25
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................................................................25

4.1. Hình thái đại thể của các chủng nấm mốc.......................................................................25
4.2. Xác định hoạt tính của enzyme xylanase ở một số chủng nấm mốc nuôi trong môi trường
có xylan từ lõi ngô...................................................................................................................27
4.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh enzyme của chủng A.oryzae và
Trichoderma.............................................................................................................................29

4.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng sinh enzyme của chủng A.oryzae và
Trichoderma.............................................................................................................................31
4.5. Tinh sạch và xác định hoạt độ riêng của enzyme xylanase ở chủng nấm mốc có khả năng
sinh enzyme cao nhất...............................................................................................................34
PHẨN THỨ NĂM....................................................................................................................................36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................................................................36

5.1. Kết luận............................................................................................................................36
5.2. Đề nghị.............................................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................................37
Tài liệu tiếng Việt......................................................................................................................................37
PHỤ LỤC

iii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
A.oryzae

:

Aspergillus oryzae

A.niger

:

Aspergillus niger

A.flavus

:

Aspergillus flavus

Abs

:

Absorbance (Độ hấp thụ quang)

DNS

:

2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid

PDA

:

Potato dextrose agar

XOS

:

Xylooligosaccharide

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần các hợp chất của lõi ngô.........................................................................................4
Bảng 2.2. Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật..................................................................5
Bảng 3.1. Dụng cụ sử dụng nghiên cứu...................................................................................................17
Bảng 3.2: Phản ứng DNS với các nồng độ xylose khác nhau.................................................................22
Bảng 4.2. Hoạt tính của enzyme xylanase ở một số chủng nấm mốc nuôi trong môi trường có xylan từ
lõi ngô........................................................................................................................................................28
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh enzyme của..........................................................29
chủng A.oryzae.........................................................................................................................................29
Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh enzyme của chủng Trichoderma được thể hiện trong
bảng 4.4 và hình 4.7:.................................................................................................................................30
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh enzyme của..........................................................30
chủng Trichoderma..................................................................................................................................30
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng sinh enzyme của chủng A.oryzae..................32
U/l 32
2% 32
4% 32
6% 32
8% 32
10% 32
24h 32
21,06±0,043...............................................................................................................................................32
28,76±0,031...............................................................................................................................................32
38,88±0,073...............................................................................................................................................32
9,47±0,034.................................................................................................................................................32
4,75±0,033.................................................................................................................................................32
48h 32

48,60±0,046...............................................................................................................................................32
61,45±0,035...............................................................................................................................................32
66,98±0,022...............................................................................................................................................32
18,26±0,042...............................................................................................................................................32
6,06±0,045.................................................................................................................................................32
72h 32
65,77±0,035...............................................................................................................................................32

v


81,26±0,067...............................................................................................................................................32
113,91±0,096.............................................................................................................................................32
21,67±0,031...............................................................................................................................................32
7,84±0,022.................................................................................................................................................32
96h 32
88,05±0,075...............................................................................................................................................32
12,95±0,008...............................................................................................................................................32
177,72±0,046.............................................................................................................................................32
32,90±0,041...............................................................................................................................................32
8,89±0,022.................................................................................................................................................32
120h 32
41,59±0,045...............................................................................................................................................32
68,05±0,045...............................................................................................................................................32
81,43±0,061...............................................................................................................................................32
23,45±0,046...............................................................................................................................................32
4,65±0,067.................................................................................................................................................32
144h 32
20,81±0,021...............................................................................................................................................32
37,23±0,041...............................................................................................................................................32

56,04±0,024...............................................................................................................................................32
18,09±0,008...............................................................................................................................................32
3,07±0,072.................................................................................................................................................32
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng sinh enzyme của chủng Trichoderma............33
Bảng 4.7. Hoạt tính enzyme xylanase tính theo 1 lít dịch nuôi cấy........................................................34

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của xylan [29]..............................................................................................................3
Hình 2.2. Cơ chế cắt xylan của enzyme endoxylanase [27]......................................................................7
Hình 2.3. Cấu trúc không gian của Endo-1,4-β Xylanase [26]..................................................................8
Xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955. Đó là enzyme thủy phân xylan, phá vỡ liên kết ß1,4-xylanosidic của xylan thành nhiều xylo-oligosaccharide có độ dài khác nhau [16]...........................8
Cho đến nay, đã có 87 xylanase được xác định cấu trúc lập thể. Hầu hết xylanase của vi sinh vật là
protein đơn phân tử. Tuy nhiên, xylanase đa phân tử ngày càng được miêu tả nhiều hơn. Những
enzyme này chứa những cấu trúc được coi là vị trí xúc tác (catalytic domain – CD) hoặc là một hoặc
vài vị trí gắn với carbohydrate (carbohydrate-binding domain-CBDs). Những xylanase chứa CBDs có
hiệu quả thủy phân cao trong trường hợp cơ chất kết tinh và nồng độ cao trên bề mặt của cơ chất lỏng
[14]. 8
Hình 3.1. Đường chuẩn Xylose................................................................................................................23
Hình 4.1. Hình thái của nấm mốc Aspergillus niger................................................................................25
Hình 4.2. Hình thái của nấm mốc Aspergillus oryaze..............................................................................26
Hình 4.3. Hình thái của nấm mốc Trichoderma.......................................................................................26
Hình 4.4. Hình thái của nấm mốc Aspergillus flavus..............................................................................27
Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn hoạt độ của enzyme xylanase ở một số chủng nấm mốc nuôi trong môi
trường có xylan từ lõi ngô.........................................................................................................................28
Hình 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh enzyme của..........................................................30
chủng A.oryzae.........................................................................................................................................30
Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh enzyme của..........................................................31

chủng Trichoderma..................................................................................................................................31
Hình 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng sinh enzyme của chủng A.oryzae...................32

Hình 4.10. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng sinh enzyme của chủng
Trichoderma…………………………………………………………………………….32

vii


PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, khi điều kiện sống của con người ngày càng được nâng cao thì
nhu cầu sử dụng thực phẩm tốt cho sức khỏe ngày càng tăng. Một trong những
xu hướng thực phẩm đã, đang và sẽ hướng tới trong tương lai là những thực
phẩm chức năng, kích thích sự phát triển của hệ vi sinh vật có lợi (probiotic)
trong hệ tiêu hóa người sử dụng [2].
Để đạt được điều đó, ngày nay các nhà sản xuất thực phẩm đang sử dụng
hai phương thức là bổ sung trực tiếp chủng vi khuẩn có lợi hoặc bổ sung các cơ
chất (prebiotic) vào thực phẩm nhằm hỗ trợ sự phát triển của các vi khuẩn trong
đường ruột. Tuy nhiên, việc phân lập các vi khuẩn probiotic sao cho phù hợp và
tồn tại được trong môi trường axit của dịch vị dạ dày là điều không hề dễ dàng
[25]. Vì thế, xu hướng bổ sung prebiotic vào trong thực phẩm đang được tập
trung hơn, bởi vì prebiotic không bị phân hủy bởi hệ tiêu hóa của người và còn
nguyên vẹn khi vào đến ruột già [11]. Ngoài ra, prebiotic đã được chứng minh
có nhiều tác dụng tốt cho người tiêu dùng ở mọi lứa tuổi như cải thiện hệ miễn
dịch; giúp hấp thụ canxi; ngăn ngừa một số loại ung thư [25].
Xylooligosaccharide (XOS) là một trong số các prebiotic đang được
quan tâm nghiên cứu bởi những lợi ích mà nó mang lại. XOS có thể thu nhận từ
nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, rơm rạ, lõi ngô. Tuy nhiên công
nghệ tách chiết XOS từ những nguồn này cho hiệu suất không cao, đắt tiền,

không thể áp dụng ở quy mô công nghiệp. Công nghệ enzyme hiện nay đang
được nghiên cứu và sử dụng nhiều trong sản xuất các prebiotic nói chung và
XOS nói riêng bởi cho hiệu suất cao và là công nghệ thân thiện với môi trường.
Để sản xuất XOS thì enzyme cần sử dụng là endoxylanase. Enzyme này có ở thể
tìm thấy ở nhiều đối tượng khác nhau, tuy nhiên enzyme từ vi sinh vật đang
được quan tâm hơn cả do khả năng phát triển nhanh, hiệu suất thu hồi lớn [5].
Trong tự nhiên, có rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc tiết ra xylanase,
trong đó xylanase do nấm mốc tiết ra xylanase được quan tâm hơn cả bởi chúng
có hoạt tính và ổn định [7].Vì những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Bước

1


đầu xác định khả năng sinh enzyme xylanase từ một số chủng nấm, ứng dụng
để sản xuất prebiotic xylooligosaccharide”.
1.2. Mục đích – Yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Bước đầu xác định khả năng sinh enzyme xylanase ở một số chủng nấm mốc.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định hoạt tính của enzyme xylanase ở một số chủng nấm mốc được nuôi
cấy trong môi trường có xylan từ lõi ngô.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất xylan từ lõi ngô trong môi trường tới
khả năng sinh enzyme xylanase của các chủng nấm mốc.
- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh enzyme của các
chủng nấm mốc.
- Tinh sạch và xác định hoạt độ riêng của enzyme xylanase ở các chủng nấm
mốc có khả năng sinh enzyme.

2

PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Xylan
2.1.1. Giới thiệu về xylan
Xylan là một polysaccharide mạch thẳng, gồm các đơn phân D-xylose
liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside [19]. Trong tự nhiên, một phần
D-xylose trong xylan được thay thế bằng acetyl 4-O-methyl-D-glucuronate và
arabinosyl. Xylan là polysacchride phong phú nhất trong tự nhiên chỉ đứng sau
cellulose chúng khu trú trong thành tế bào thực vật bậc cao, đặc biệt trong gỗ
mộc và cỏ [24].

Hình 2.1. Cấu trúc của xylan [29].
2.1.2. Nguồn cung cấp xylan
Xylan là polysaccharide phổ biến trong các loài thực vật, có thể chiếm
đến 15-30% trọng lượng khô ở gỗ cứng từ thực vật hạt kín, 7-10% trong gỗ
mềm từ thực vật hạt trần và dưới 30% trong cây hàng năm [24].
Trong đó, cây ngô (Zea Mays L.) với vai trò là cây lương thực cho con
người và cũng là nguồn cung cấp xylan. Ngô góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số
thế giới và là nguồn lương thực không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày đối với
một số nước như Peru, Kenia, Mexico… Ngô chiếm 17% tổng sản lượng lương
thực, là nguồn thức ăn chăn nuôi (66,8%), nguyên liệu cho ngành công nghiệp
(5%), và phục vụ cho xuất khẩu (hơn 10%). Cây ngô hiện nay đã trở thành cây
trồng góp phần đảm bảo an ninh lương thực, góp phần chuyển đổi cơ cấu nông
3


nghiệp từ trồng trọt sang chăn nuôi, cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp và
sản phẩm hàng hóa xuất khẩu ở nhiều nước trên thế giới [6].
Trong những năm qua, cây ngô ở nước ta đã có những bước tiến dài cả
về diện tích, năng suất và sản lượng nhờ ứng dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến

trong sản xuất, chuyển đổi cơ cấu giống, thâm canh [6]. Vào thập kỷ 60 của thế
kỷ trước, diện tích ngô Việt Nam chưa đến 300 nghìn hecta, năng suất chỉ đạt
trên 1 tấn/ha, đến đầu những năm 1980 cũng không cao hơn nhiều, chỉ ở mức 1,1
tấn/ha, sản lượng đạt khoảng hơn 400.000 tấn do vẫn trồng các giống ngô địa
phương với kỹ thuật canh tác lạc hậu. Từ năm 2006, năng suất và sản lượng ngô của
Việt Nam đã có những bước tiến nhảy vọt cao nhất từ trước đến nay. Tốc độ tăng
trưởng diện tích, năng suất và sản lượng ngô của Việt Nam cao hơn nhiều lần của thế
giới, lợi nhuận trồng ngô lai cao hơn hẳn các loại cây trồng khác. Năm 2008, diện
tích trồng ngô của cả nước (trong đó 90% diện tích là ngô lai) đạt 1.126.000 ha, tổng
sản lượng trên 4.531.200 tấn. Năm 2009, diện tích đạt 1.170.900 ha, tổng sản lượng
lên tới trên 5.031000 tấn, cao nhất từ trước tới nay. Các giống ngô lai của Việt
Nam bước đầu cũng đã xuất bán sang các nước Bangladesh, Cam-pu-chia, Lào,
Quảng Tây -Trung Quốc, Pakistan, Indonesia, Ấn Độ… [31]. Thành phần các
hợp chất trong lõi ngô được thể hiện qua bảng 2.1 [4].
Bảng 2.1. Thành phần các hợp chất của lõi ngô
STT

Thành phần các hợp chất

Hàm lượng chất khô %

1

Tro

1,13

2

Các chất hoà tan trong rượu

0,27

Các chất hoà tan trong nước ở 50oC

2,41

Các chất hoà tan trong nước ở 90oC

0,97

4

Các polysaccharide dễ thuỷ phân

38,13

5

Các polysaccharide khó thuỷ phân

34,03

6

Cellulose

31,07

7

Pentosan

35,11

8

Đường

7,91

3

4


Nguồn lõi ngô hiện nay được sử dụng trong một số lĩnh vực như tạo điện
năng, tạo bê tông chống thấm, làm phân bón, làm cơ chất để nuôi trồng một số
loại nấm. Tuy nhiên, hiệu quả từ các ngành nghề này đem lại chưa cao. Vì vậy
không những chưa tận dụng được nguồn phế phụ phẩm này để mang lại hiệu quả
kinh tế mà còn gây ảnh hưởng không ít đến môi trường nếu lõi ngô không được
xử lý (nhất là đối với các vùng trồng ngô tập trung có diện tích lớn).
Hiện nay có một số nghiên cứu tận dụng lõi ngô làm giá thể để trồng
nấm, nhưng kết quả rất hạn chế và hầu như không được ứng dụng trong sản xuất
thực tiễn. Sản lượng ngô ngày càng lớn thì lượng lõi ngô thải ra ngày càng cao.
Việc nghiên cứu và áp dụng sản xuất XOS từ lõi ngô không chỉ giúp tận dụng tốt
hơn nguồn phế thải này mà còn góp phần cải thiện kinh tế cho người trồng ngô,
phát triển ngành công nghiệp thực phẩm trong nước, đồng thời làm giảm thiểu ô
nhiễm môi trường [4].
Theo các nghiên cứu thì lõi ngô chính là nguồn xylan phong phú. Lõi

ngô có hàm lượng xylan khá lớn (khoảng 19 - 23% khối lượng chất khô). Hàm
lượng xylan trong một số loại thực vật được thể hiện qua bảng 2.2 [12].
Bảng 2.2. Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật
Thành phần hemicellulose (% khối lượng khô)
Loại thực vật

Galactan

Xylan

Arabino

Mannan

Thân ngô, lõi ngô khô

1,0 - 1,2

19,0 - 23,0

1,8 - 3,4

0,3 - 0,7

Cỏ Switchgass khô

1,0 - 1,1

23,0 - 25,0

3,0 - 3,4

0,1 - 0,8

Cây gỗ ngắn ngày

0,7 - 1,2

13,0 – 17,0

0,4 - 1,1

0,9 - 1,3

Sợi khô

3,8

25,0

18,0

-

Như vậy, lõi ngô không chỉ là nguồn nguyên liệu chứa nhiều xylan mà
đây còn là nguồn nguyên liệu tương đối sẵn có, dễ thu gom và rẻ tiền.
2.1.3. Tính chất của xylan
Xylan không mùi, không vị. Nhiệt độ hòa tan của xylan phụ thuộc vào
nguồn gốc. Xylan có nguồn gốc từ gỗ cứng có nhiệt độ hòa tan là 150 - 200 0C;

5


còn đối với gỗ mềm, nhiệt độ hòa tan của nó là 70 - 130 0C. Trong gỗ cứng, cấu
trúc của xylan có chứa các nhóm acetyl, còn trong gỗ mềm không chứa nhóm
acetyl. Do đó, xylan trong gỗ cứng tan trong nước tốt hơn [19].

(a)

(b)

Hình 2.3. Cấu trúc xylan trong cây gỗ (a) gỗ mềm; (b) gỗ cứng

6


2.1.4. Ứng dụng của xylan trong sản xuất XOS
Một số sản phẩm có giá trị kinh tế như xylose và xylitol đã được sản xuất từ
xylan. Tuy nhiên, việc ứng dụng của xylan trong sản xuất XOS đang rất được quan
tâm [22]. XOS đã được chứng minh có chức năng như prebiotic trong cơ thể con
người [15]. Prebiotic oligosaccharides thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn có lợi
trong đường ruột của người như Bifidobacterium và Lactobacillus… Những vi
khuẩn này có tác dụng hỗ trợ việc tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh dưỡng cần thiết
[14]. Ngoài ra, XOS còn có rất nhiều lợi ích khác cho người tiêu dùng như: ngăn cản
quá trình gây bệnh của vi khuẩn và các tác nhân gây tiêu chảy, tăng khả năng miễn
dịch của cơ thể, phòng ngừa lại một số bệnh ung thư, cải thiện sự hấp thu canxi
và có vai trò như chất chống oxy hóa [19, 23].
2.2. Enzyme xylanase
2.2.1. Giới thiệu về hệ enzyme xylanase
Để phân cắt hoàn toàn xylan cần có nhiều loại enzyme phân cắt chuỗi chính và

các nhóm bên của chúng. Những enzyme cắt nhóm glycosyl bao gồm Endo-1,4β-xylanase (1,4-D-xylan xylanohydrolase: E.C.3.2.1.8) và exoxylosidase (β-1,4D-xylan xylohydrolase) [6]. Endoxylanase thủy phân xylan bằng cách cắt đứt
các liên kết β-1,4-glycoside một cách ngẫu nhiên trong nội phân tử để tạo thành
các xylo-oligosaccharide (XOS). Tuy nhiên, do cấu trúc của xylan rất phức tạp,
để cắt nó hoàn toàn cần một lượng lớn enzyme xylanase.

Hình 2.2. Cơ chế cắt xylan của enzyme endoxylanase [27].

7


Trong đó Endo-1,4-β-xylanase là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy
phân xylan. Enzyme được tạo thành từ những chuỗi polysacchride có trọng
lượng phân tử nhỏ và cuộn lại tạo nên những tấm β. Cấu trúc tấm β xoắn lại và
hình thành nên các khe, đây là nơi định vị của các nhóm xúc tác (trung tâm hoạt
động của enzyme). Hai đầu glutamic acid ở khe chức năng này hoạt động như
các nhóm xúc tác (được kí hiệu bằng thanh ngang nhỏ và các dấu chấm), 1 đầu
glutamic acid cho proton và đầu còn lại là 1 base nucleophile. Cấu trúc xoắn bao
xung quanh khe tạo nên sự thay đổi thích ứng trên cơ chất mà nó gắn bó vào
[24].

Hình 2.3. Cấu trúc không gian của Endo-1,4-β Xylanase [26].
Xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955. Đó là enzyme thủy
phân xylan, phá vỡ liên kết ß-1,4-xylanosidic của xylan thành nhiều xylooligosaccharide có độ dài khác nhau [16].
Cho đến nay, đã có 87 xylanase được xác định cấu trúc lập thể. Hầu hết
xylanase của vi sinh vật là protein đơn phân tử. Tuy nhiên, xylanase đa phân tử
ngày càng được miêu tả nhiều hơn. Những enzyme này chứa những cấu trúc
được coi là vị trí xúc tác (catalytic domain – CD) hoặc là một hoặc vài vị trí gắn
với carbohydrate (carbohydrate-binding domain-CBDs). Những xylanase chứa
8

CBDs có hiệu quả thủy phân cao trong trường hợp cơ chất kết tinh và nồng độ
cao trên bề mặt của cơ chất lỏng [14].
2.2.2. Nguồn enzyme xylanase trong tự nhiên và ứng dụng
2.2.2.1. Nguồn enzyme xylanase trong tự nhiên
Xylanase có mặt ở nhiều loài sinh vật trong tự nhiên, ở sinh vật nhân sơ
và nhân chuẩn và đã tìm thấy cả trong vi khuẩn, nấm, tảo biển. Cho đến nay, hầu
hết xylanase được chiết xuất từ vi khuẩn và nấm [10].
Trong đó, enzyme xylanase được sản xuất từ nấm đặc biệt là các loại
nấm sợi đang rất được quan tâm, bởi vì chúng có khả năng sinh enzyme
xylanase cao hơn nhiều so với vi khuẩn và nấm men. Ngoài ra, nấm sợi thường
sản sinh một hệ enzyme phân giải xylan bao gồm endoxylanase, β-xylosidase và
các enzyme phân cắt nhóm thế khác. Các enzyme xylanase của nấm sợi thường
là các enzyme ngoại bào. Với những ưu thế về khả năng sinh enzyme xylanase
như vậy nên hiện nay trên thị trường các chế phẩm enzyme xylanase chủ yếu
sản xuất từ nấm sợi. Đặc tính chung của đa số các xylanase từ nấm là hoạt động
hiệu quả nhất ở nhiệt độ 35 - 50 oC, pH 3,0 - 5,5 và bền ở dải pH từ 4,0 - 8,0
[21].
Trong số các chi nấm sợi thì các chi Aspergillus và Trichoderma là hai
chi sinh enzyme xylanase được nghiên cứu nhiều nhất. Đặc biệt Aspergillus là
một chi nấm sợi có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả năng sinh nhiều loại
enzyme thủy phân ngoại bào. Chính vì khả năng sinh đồng thời nhiều loại
enzyme thủy phân ngoại bào nên đa số các loài của các chi nấm này đều có khả
năng sinh ra nhiều enzyme xylanase trên các cơ chất tự nhiên, phế phụ phẩm
nông nghiệp chứa lignocellulose như bã dầu cọ, lõi ngô, vỏ lúa mì…[16].
Christov và cộng sự khi cấy các chủng A. foetidus, A. Oryzae và A. niger
trên môi trường chứa lõi ngô đã thu được hoạt tính xylanase tương ứng là 82,3
IU/g; 547,4 IU/g; 99,9 IU/g và 225,6 IU/g [17].
2.2.2.2. Ứng dụng của xylanase
a. Trong nông nghiệp

9


Xylanase tham gia vào quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp ví dụ
lõi ngô, rơm rạ, cỏ khô… [12].
b. Trong công nghiệp
Xylanase hỗ trợ quá trình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay
vì phải sử dụng các hóa chất độc hại. Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ
lignin khỏi bột giấy. Lignin nằm trong tổ hợp lignocellulose bao gồm lignin,
cellulose và hemicellulose. Để tách được lignin từ tổ hợp này, phương pháp xử
lý truyền thống thường dùng là bổ sung nước clo. Tuy nhiên phương pháp này
tốn kém và thường gây ô nhiễm môi trường do thành phần clo trong nước thải.
Ngày nay người ta đã thay thế dùng enzyme xylanase để xử lý bột giấy. Xử lý
bột giấy bằng chế phẩm enzyme xylanase sẽ tạo ra loại bột giấy có chất lượng
tốt hơn, đặc biệt không gây ô nhiễm môi trường [1].
Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ
sung vào công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi. Việc sử dụng enzyme
xylanase cho thức ăn của động vật đã thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà
khoa học. Bổ sung enzyme xylanase vào thức ăn của gà con làm giảm độ nhớt
trong ruột gà, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn của gà con và kết quả là cải thiện
đáng kể trọng lượng của chúng [11]. Theo Feoli và cộng sự thì việc bổ sung
enzyme xylanase vào bột mì và bột đậu tương trong thức ăn gia súc với một tỷ lệ
nhất định cải thiện được năng suất và khả năng tiêu thụ thức ăn của lợn [9]. Các
nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng việc bổ sung enzyme xylanase vào thức ăn
chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏ linh lăng, ngũ cốc...) đã làm tăng hiệu
quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất trong chăn nuôi [16].
Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi bao gồm: mananase, β – glucanase và cellulase, α – amylase, protease
và phytase. Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua

trên toàn thế giới từ châu Âu, châu Á và châu Mỹ [9].
Trong công nghiệp sản xuất bánh, xylanase được dùng để làm tăng độ
phồng và giảm độ dính của của bánh. Các enzyme xylanase có khả năng cải
thiện chất lượng của bánh mì bởi vì nó làm tăng thể tích của bánh. Chất lượng
của bánh được cải thiện tốt hơn khi sử dụng enzyme xylanase kết hợp với
enzyme amylase. Enzyme xylanase có tính axit từ nấm Aspergillus oryzae được
10


sử dụng để sản xuất các sản phẩm thương mại truyền thống của Nhật như sake
và shoyu koji. Hiện nay một số enzyme xylanase được thương mại hoá và sử
dụng trong công nghệ làm bánh với các tên như Multifect và Enzeko...
Novozyme đưa ra một số các enzyme xylanase mới, có thể là kết hợp với các
enzym khác, để cải thiện tính chất của bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy
bánh mỳ [16].
Xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống. Enzyme
xylanase có tác dụng làm mềm rau quả, gạn lọc chất xơ trong công nghiệp nước
hoa quả và rượu vang từ đó làm trong nước trái cây và rượu vang, tách chiết
hương liệu và chất màu, dầu thực vật và tinh bột, làm nhiên liệu [1, 28].
2.2.3. Tình hình nghiên cứu về enzyme xylanase
2.2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Những thành tựu nổi bật trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng
xylanase trong sản xuất ngày càng được thấy rõ. Trên thế giới có khoảng 10
công ty sản xuất lớn và hàng loạt các công ty nhỏ sản xuất enzyme công nghiệp,
nhưng công ty của Novo- Nordisk của Đan Mạch là công ty sản xuất enzyme
lớn nhất trên thế giới. Chỉ tính đến năm 1994 họ đã sản xuất đến 32% enzyme
tẩy rửa, chế biến các sản phẩm từ sữa 14%, dệt 10%, thuỷ phân tinh bột 15% và
các enzyme khác khoảng 29%. Nhưng thành tựu nổi bật nhất trong quá trình
nghiên cứu và ứng dụng xylanase chính là các chế phẩm xylanase phục vụ cho
công nghiệp giấy, dược phẩm đã được sản xuất và ngày càng được sử dụng rộng

rãi. Hiện nay đã có một số sản phẩm đang lưu hành trên thị trường như: enzyme
xylanase X2753-50G từ Thermomyces lanuginosus của hãng Sigma, enzyme
xylanase X400 OL từ Trichoderma longibrachiatum của hãng Gramma Chemie
GMbH (Đức), Novoenzyme 431 từ Trichoderma longibrachiatum của hãng
Novo Nordisk và Grydazym GP 5000 (Đan Mạch)...[16, 21].
Trung Quốc đã sản xuất một số enzyme thương mại trong đó có xylanase
như: DKN xylanase10000 dry của hãng Qingdao Continent Industry Co., sản
phẩm có hoạt tính xylanase không dưới 10000 IU/g; xylanaseXCB của hãng
Hunan New Century BioChemical Co., sản phẩm có hoạt tính xylanase 5000
IU/g; Green enzyme có tổ hợp enzyme gồm: β-glucanase (50000 U/g); protease

11


(1000 U/g), xylanase (60000 U/g); pectinase (6000 U/g); cellulase (12000 U/g)
[16].
Các nước Đông Nam Á như Singapore cũng có hàng loạt các sản phẩm
enzyme xylanase như: Kemzyme dry KM-24-10/99 được sản xuất bởi công ty
Kemin Industries (Asia) Pte Limited; Rovabio Excel AP AA-54-2/01 được sản
xuất bởi công ty Adisseo[1].
2.2.3.2. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzyme xylanase ở Việt Nam
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ vi sinh
vật. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ tìm hiểu
hoạt tính enzyme xylanase ở quy mô phòng thí nghiệm. Chúng ta chưa tự sản
xuất được enzyme xylanase để phục vụ cho nhu cầu sản xuất trong nước. Các
enzyme hầu hết đều được nhập khẩu về nước ở dạng thành phẩm và bán thành
phẩm [1].
2.3. Giới thiệu chung về một số chủng nấm sợi
Trong các chủng nấm sợi, Aspergillus oryzae là chủng vi sinh vật đã
được sử dụng trong nhiều thế kỷ trong ngành công nghiệp lên men thực phẩm

[18]. A.oryzae còn được gọi là mốc vàng, là một loại nấm vi thể thuộc bộ
Plectascales lớp Ascomycetes (Nang khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một
hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, cuống sinh bào tử ráp, chiều dài có khi lên
tới 200µm. Phần cuối cuống phình thành bọng, kích thước 20 – 55 µm. Thể bình
2 tầng, bao phủ 2/3 đến toàn bộ bề mặt bọng, kích thước thể bình sơ cấp: 2 – 2,5
x 5 – 8 µm. Kích thước thể bình thứ cấp: 1,5 – 2 x 2 – 5 µm. Bào tử tương đối
nhẵn, thay đổi về hình dạng và kích thước. Từ hình cầu, đến gần cầu, hình ovan,
hay hình hạt chanh. Kích thước từ 3 – 5 – 6 µm thậm chí lên tới 9 µm [3]. Khi
mới phát triển, hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển dần sang màu vàng lục và khi
già chuyển hẳn sang màu vàng đậm hoặc xanh rêu. Phát triển trong khoảng nhiệt
độ rất rộng 15- 40°C, nhiệt độ tối ưu là 30-32°C[5]. Đặc điểm của A.oryzae là
giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, mantase,
invectase, catalase). Trong quá trình lên men rượu, A. oryzae phân giải tinh bột
thành đường và protein thành peptide và các amino acid và sau đó được lên men
rượu bởi nấm men và tạo thành acid lactic nhờ vi khuẩn. Quá trình này cũng

12


tương tự với các loài nấm và vi khuẩn khác, được ứng dụng để sản xuất đồ uống
có cồn và bánh ngọt [13].
Loài nấm mốc Aspergillus quan trọng thứ 2 là Aspergillus niger, thường
gọi là mốc đen. Khi mới phát triển sợi nấm màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng
không hoàn toàn đen. Bào tử của chúng là có màu đen tuyền. Từ một sợi đầu
tiên chúng phân nhánh tạo ra 2- 4 nhánh sợi nhỏ. Từ các nhánh này sẽ phát triển
thành những đính bào tử và từ đó sẽ phát triển thành những bào tử màu đen.
Nấm sợi này có khả năng tạo ra nhiều enzyme khác nhau như: amylase,
invertase, maltase, protease, pectinase, cellullase, glucozoxydase, v.v. Protease
do mốc này hoạt động ở pH 2,5- 3,5, còn của A. oryzae không hoạt động ở vùng
pH này [5]. Aspergillus niger có hoạt tính amylase đường hóa khác nhau ở

những chủng khác nhau. Một số chủng được sử dụng để đường hóa tinh bột
trong sản xuất rượu hoặc mật bột (xiro glucose). Mốc này có thể chịu được pH
thấp, nhiệt độ thích hợp là 30 - 33°C và dễ dàng phát triển trên môi trường tinh
bột [5].
Aspergillus flavus cũng là một loài nấm thuộc chi Aspergillus, cũng
thường được gọi với tên mốc vàng rất giống A. oryzae, chỉ khác là kích thước
nhỏ hơn, các tầng cuống hình chùy mang đính bào tử và khuẩn lạc có màu trội
về xanh lục hơn. Lúc đầu khuẩn lạc mốc có màu vàng sáng, sau chuyển thành
màu nâu oliu. Chiều cao của cuống sinh bào tử là 0.4 – 1 mm. A. flavus sinh ra
hệ enzyme giống A. oryzae. Ở một số môi trường có chất béo (trên lạc), chúng
có thể sinh ra độc tố aflatoxin. Bằng các phương pháp phân loại thông thường
như dựa vào hình thái, quan sát vi thể, đại thể rất khó có thể phân biệt loài A.
flavus và A. oryzae. Hiện nay các phương pháp phân biệt chủ yếu dựa và
phương pháp hóa sinh căn cứ hệ enzyme, các hợp chất thứ cấp đặc trưng khác
nhau giữa chúng. Trong chi phụ Flavi, người ta thường sử dụng phân tích khả
năng sinh các hợp chất như: Kojic acid, aflatoxin type A, aflatoxin type B,
aspergillic acid, ochratoxin v.v. [5].
Trichoderma là loại nấm mốc, sợi nấm có vách ngăn, tế bào hữu tính ít
khi thấy rõ. Bào tử có vách ngăn. Đính bào tử (conidi) là một tế bào hình cầu,
hình trứng hoặc hình trụ ngắn. Conidi không có chất nhầy bao bọc. Cuống
conidi và các nhánh bên cuống dài và mảnh, không có đoạn sợi vô sinh kéo dài,

13


thể hình chai không chụm lại, có phần mỏng manh. Khuẩn lạc nấm có màu trắng
hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng
Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc
từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20 0C. Trichoderma được tìm thấy rất nhiều
trong môi trường tự nhiên, đặc biệt trong môi trường đất. Chúng phát triển trên

nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác). Hầu hết các loài
Trichoderma là sống hoại sinh, thường gặp trên bã thực vật, ở những nơi ẩm ướt,
trên phân thú vật… Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau
từ cacbohydrate, amino acid đến ammonia [24].
2.4. Prebiotic Xylooligosaccharide (XOS)
XOS là oligosaccharide được cấu tạo bởi các phân tử đường xylose liên
kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside. XOS không bị phân giải bởi hệ tiêu
hóa của người, tuy nhiên chúng bị phân giải và là nguồn cacbon cho các vi
khuẩn đường ruột như Bifidobacteria và Lactobacilli [25].
XOS được cho rằng có hiệu quả hơn Fructooligosacchride trong việc gia
tăng khuẩn probiotic và làm giảm khuẩn gây hại trong đường ruột. XOS không
tiêu hóa trên ruột non, dạ dày, chỉ hấp thụ ở ruột già, vì vậy XOS được coi như
một dưỡng chất nuôi và phát triển vi sinh vật có lợi trong ruột già, hạn chế sự
phát triển các vi sinh vật gây hại, qua đó hạn chế các bệnh về đường ruột, tăng
khả năng miễn dịch cho cơ thể, giúp tiêu hóa tốt thức ăn. Nhiều kết quả nghiên
cứu còn cho thấy, đường XOS có tác dụng chống sâu răng vì cản trở được sự
phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng, chống bệnh tiểu đường,
không gây béo phì. Thế nên, nhiều nơi trên thế giới ứng dụng loại đường này
làm nguyên liệu cho các sản phẩm bánh kẹo, sữa, bột dinh dưỡng, đồng thời sử
dụng loại đường chức năng như một sản phẩm dinh dưỡng cho người mắc bệnh
tiểu đường. [30]
XOS còn có vai trò cải thiện hàm lượng đường trong máu; sự trao đổi
chất chất béo; phục hồi sự rối loạn của hệ vi sinh vật trong đường ruột do dùng
kháng sinh, liệu pháp hóa trị hay xạ trị; gia tăng sự hấp thu khoáng và sự hình
thành vitamin nhóm B và làm giảm sự hình thành các chất gây hại trong ruột.
Trong tự nhiên, XOS được tìm thấy ở măng tre, trái cây, rau, sữa và mật ong. Sử

14

dụng enzym thủy phân, XOS có thể được sản xuất từ xylan có trong gỗ cứng, lõi
ngô, rơm, bã mía, vỏ trấu, mạch nha và cám [2].
Trên thế giới, các nước thường sản xuất đường chức năng từ các loại rau
quả như chuối, mận, đào, quất, cây atiso, cà chua, hành, tỏi… hoặc từ một số
phế thải nông nghiệp như bã mía, vỏ hạt bông. Tuy nhiên, các nhà khoa học của
Viện Công nghiệp thực phẩm lựa chọn lõi ngô làm nguyên liệu cho sản xuất
đường chức năng. Bởi lõi ngô dễ kiếm, hàm lượng hemicellulose cao (35 –
40%) và việc tận dụng nguồn nguyên liệu này sẽ góp phần giảm ô nhiễm môi
trường [30].
Từ kết quả nghiên cứu này, ứng dụng thành tựu của công nghệ sinh học,
các nhà khoa học của Viện Công nghiệp thực phẩm tiến hành nghiền nhỏ lõi
ngô, vắt nước xử lý axit, xử lý nhiệt, hấp áp lực nhiệt độ cao (khoảng 140 0C) để
thu dung dịch đường XOS. Sau đó, qua công đoạn tinh chế để thu được đường
XOS khô. Theo TS. Trịnh Thị Kim Vân, một kilogam lõi ngô có thể sản xuất
được 0,25 lít dung dịch đường XOS, còn nếu tiếp tục tinh chế sẽ tạo ra 90-130g
đường XOS khô. Giá của sản phẩm cùng loại nếu nhập ngoại khoảng 100.000
đồng đến 120.000 một kilogam [30].

15


PHẦN THỨ BA
ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng bốn loài nấm mốc là
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Trichoderma để nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung cơ chất xylan từ lõi ngô nhằm tạo ra enzyme
xylanase.
Nguồn gốc của bốn loài nấm mốc trên là từ kho giống của bộ môn Thực

phẩm dinh dưỡng, khoa Công Nghệ Thực Phẩm.
Lý do sử dụng bốn loài nấm mốc là do chúng có khả năng tiết enzyme
xylnase cao và ổn định. Đặc biệt, A.oryzae và Trichoderma có khả năng ứng
dụng vào thực phẩm do không chứa độc tố aflatoxin.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực
phẩm, bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công Nghệ
Thực Phẩm và phòng Công nghệ vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại
học Nông Nghiệp Hà Nội.
3.1.3. Dụng cụ hóa chất nghiên cứu
3.1.3.1. Dụng cụ nghiên cứu

16