ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH học TRONG bảo tồn và PHÁT TRIỂN LOÀI LAN hài đặc hữu KHU vực MIỀN núi PHÍA bắc có NGUY cơ TUYỆT CHỦNG

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

.

BÁO CÁO
TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO TỒN VÀ
PHÁT TRIỂN LOÀI LAN HÀI ĐẶC HỮU KHU VỰC MIỀN NÚI
PHÍA BẮC CÓ NGUY CƠ TUYỆT CHỦNG

Mã số: B2013-11-33

Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Đơn vị thực hiện: Viện Sinh học Nông nghiệp

Hà Nội – 2015


BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
Ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo tồn và phát triển loài Lan Hài đặc
hữu khu vực miền núi phía Bắc có nguy cơ tuyệt chủng.
Mã số: B2013-11-33
DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
TT

Họ và tên

Chức vụ

1.

TS. Hoàng Thị Nga

Chủ nhiệm đề Viện sinh học Nông nghiệp- Học
tài
viện Nông nghiệp Việt Nam

2.

ThS. Nguyễn Thị Sơn

Thư ký đề tài

3.

Đỗ Thị Hương Loan

Kế toán đề tài Viện sinh học Nông nghiệp- Học
viện Nông nghiệp Việt Nam

4.

GS.TS. Nguyễn Quang
Thạch

Thành viên
tham gia

Viện sinh học Nông nghiệp- Học
viện Nông nghiệp Việt Nam

5.

PGS.TS. Nguyễn Thị Lý
Anh

Thành viên
tham gia

Viện sinh học Nông nghiệp- Học
viện Nông nghiệp Việt Nam

6.

ThS. Trần Thế Mai

Thành viên
tham gia

Viện sinh học Nông nghiệp- Học
viện Nông nghiệp Việt Nam

7.

KS. Nguyễn Thị Hân

Thành viên
tham gia

Viện sinh học Nông nghiệp- Học
viện Nông nghiệp Việt Nam

8.

ThS. Nguyễn Thị Thanh
Phương

Thành viên
tham gia

Viện sinh học Nông nghiệp- Học
viện Nông nghiệp Việt Nam

9.

Ks. Lê Văn Vy

Thành viên
tham gia

Vườn Quốc gia Hoàng Liên

i

Địa chỉ công tác

Viện sinh học Nông nghiệp- Học
viện Nông nghiệp Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:
- Tên đề tài:Ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo tồn và phát triển
loài Lan Hài đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc có nguy cơ tuyệt chủng.
- Mã số: B2013-11-33
- Chủ nhiệm:

TS. Hoàng Thị Nga

- Cơ quan chủ trì: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 01 năm 2013 đến tháng 12 năm 2015
2. Tóm tắt đề tài
2.1. Mục đích nghiên cứu của đề tài
+ Thu thập được 02 loài lan Hài P.dianthum và P.purpuratum có trong
sách đỏ của Việt Nam
+ Xây dựng quy trình nhân nhanh (01 quy trình)
+ Xây dựng quy trình lưu giữ in vitro cho 2 loài lan Hài P.dianthum và
P.purpuratum và 200 bình mẫu giống lưu giữ trong phòng.
+ Xây dựng vườn mô hình trồng (300 m 2) và bảo tồn ở vườn mô hình là 5
chậu mỗi loài (mỗi chậu có 3-5 đơn vị cây).

ii

2.2. Kết quả nghiên cứu đã thực hiện được
2.2.1 Nội dung cần thực hiện
STT
1

Các nội dung công việc cần thực hiện
Thiết kế thí nghiệm, chuẩn bị vật liệu

Sản phẩm
Đánh giá
Đề cương chi tiết cho Hoàn thành

nghiên cứu

việc triển khai các thí
nghiệm, nguyên vật

2

liệu cần thiết
Nội dung 1. Tổng hợp thông tin về phân 01 báo cáo kết quả

Hoàn thành

bố nguồn gen; điều tra, thu thập 02 loài chuyên đề
Lan Hài thuộc một số tỉnh miền núi phía
3

Bắc có trong sách đỏ của Việt Nam.

Nội dung 2. Đánh giá, phân loại các mẫu 01 báo cáo kết quả

Hoàn thành

giống 02 loài Lan Hài P. dianthum và chuyển đề
P.purpuratum thu thập được theo một số
3

đặc điểm nông sinh học quan trọng.
Nội dung 3. Nghiên cứu nhân giống 02

Hoàn thành

loài Lan Hài P.dianthum và P.

06 báo cáo kết quả

purpuratum bằng công nghệ nuôi cấy mô

chuyên đề

tế bào
Nội dung 4. Ứng dụng các phương pháp

01 báo cáo kết quả

4

lưu giữ nguồn gen của 02 loài Lan Hài

chuyên đề

5

P.dianthum và P. purpuratum.
200 bình mẫu lưu giữ
Nội dung 5. Xây dựng mô hình trồng 02
Hoàn thành
loài

Lan

Hài

P.dianthum

và

Hoàn thành

P. 01báo cáo kết quả

purpuratum tại vùng đệm khu bảo tồn chuyên đề
6

vườn Quốc gia Hoàng Liên, 300m2
Nội dung 6: Tổng hợp kết quả, viết báo 02 quy trình, báo cáo

Hoàn thành

cáo khoa học tổng kết đề tài, báo cáo tài tổng kết, báo cáo tài
chính
2.2.2. Sản phẩm
STT

Tên sản phẩm

chính
Số lượng theo
thuyết minh

Số lượng
thực tế đã

iii

Yêu cầu khoa học

Đánh
giá


1

Bộ mẫu giống.

thực hiện
02 loài Lan Hài Đã thu thập
lưu giữ an toàn
được 08

tại vườn tiêu bản loài, mỗi
của Viện SHNN loài 8 – 10
và ở vườn mô
chậu, mỗi
hình là 05
chậu 4 – 5
chậu/loài.
đơn vị cây

2
Quy trình nhân
01 Quy trình
giống Lan Hài bằng
công nghệ nuôi cấy
mô tế bào.

3
Quy trình lưu giữ
02 loài Lan Hài P.
dianthum và
P. Purpuratum
in vitro

01 quy trình
Lưu giữ trong
ống nghiệm:
200 bình

4

Mô hình phát triển 01 mô hình
02 loài Lan hài tại
vùng đệm khu bảo
tồn của vườn Quốc
gia Hoàng Liên quy
mô 300m2

01 mô hình

5

Đào tạo

02 thạc sỹ

6

Công bố bài báo

02 bài báo

02 thạc sỹ
01 kỹ sư
02 bài báo

chung
Bộ mẫu giống có lý lịch
trích ngang rõ ràng cho
từng loài.

Đảm bảo hệ số nhân cây
cao, cây đồng đều, cây
đạt tiêu chuẩn kỹ thuật
(cao 4 - 5cm, có 3 - 4 lá,
2 - 4 rễ/cây).
Có tính ứng dụng cao,
các bước qui trình, rõ
ràng, chi tiết, dễ hiểu, dễ
ứng dụng.
Đảm bảo lưu giữ, bảo
quản các mẫu giống Lan
Hài có hiệu quả, tiết
kiệm tối đa các chi phí
về công lao động, điện,
nước, hóa chấtvà các chi
phí khác.
Các mẫu giống duy trì
được các đặc tính giống.
Xây dựng mô trồng trọt
có hiệu quả cao, . Cây
ngoài vườn ươm cao 5 6cm có 3 - 5 lá, 3 - 4 rễ.

Đã bảo vệ
Đã được đăng

Hoàn
thành
vượt
mức

Hoàn
thành

Hoàn
thành

Hoàn
thành

Hoàn
thành
HT

2.3. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng

2.31. Hiệu quả giáo dục và đào tạo, kinh tế - xã hội
Hiện nay, các loài lan Hài trong tự nhiên đang bị thu hái cạn kiệt và được

iv


đưa vào “Sách đỏ Việt Nam” vì vậy sản phẩm của đề tài sẽ là nguồn mẫu giống rất
có giá trị góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen cây lan Hài và cung cấp cây giống
cho thị trường.
Kết quả nghiên cứu của đề tài mở ra một hướng đi mới trong công cuộc xây
dựng phát triển kinh tế hộ gia đình cho các đồng bào dân tộc miền núi, góp phần xóa
đói giảm nghèo. Ngoài ra sẽ hạn chế việc khai thác lan rừng, công việc vốn đầy rủi
ro và nguy hiểm với người dân.
Nguồn nhân lực thực hiện đề tài chủ yếu được đào tạo sau đại học chuyên
ngành trồng trọt, Công nghệ sinh học nên đã được trang bị rất tốt về kiến thức,

sau khi thực hiện đề tài được trau dồi tay nghề về lý thuyết và cả thực hành vững
vàng.
Sản phẩm của đề tài mang lại ý nghĩa kinh tế cũng như xã hội vô cùng
quan trọng là tạo ra nguồn lợi kinh tế cũng như tạo công ăn việc làm cho người
dân các tỉnh miền núi phía Bắc vốn chỉ quen sống dựa vào việc khai thác các
nguồn lợi sẵn có của thiên nhiên, giáo dục cho người dân nâng cao hơn nữa sự
hiểu biết về sự da dạng di truyền cần được bảo vệ và phát triển.
2.3.2. Phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và địa chỉ ứng dụng
02 loài Lan hài P. dianthum và P. purpuratumcủa đề tài nhân lên sẽ được đưa
trở lại các vùng phân bố đặc hữu để phát triển nguồn gen phục vụ cho việc làm
phong phú nguồn gen đặc hữu cũng như phát triển nguồn gen này theo hướng
thương mại hóa.
Đề tài sẽ phối hợp các đơn vị, các sở khoa học và công nghệ của các tỉnh
để phát triển các loài bản địa là ưu thế của địa phương.
Các hình thức chuyển giao kết quả nghiên cứu là:
- Bán quy trình công nghệ, đào tạo kỹ thuật, tổ chức liên doanh, liên kết với các
doanh nghiệp sản xuất cây giống hoa theo quy trình đã nghiên cứu
- Sản phẩm của đề tài được sử dụng để phát triển vào sản xuất chủ yếu thông
qua các chương trình bảo tồn và phát triển giống hoa đặc hữu của các Sở Nông
nghiệp và PTNT.
- Các chương trình ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật mới của các

v


sở khoa học công nghệ các tỉnh, các chương trình dự án của liên hiệp các hội khoa
học và kỹ thuật Việt Nam để chuyển giao các tiến bộ kỹ thuật mới vào sản xuất.
- Các chương trình chuyển đổi cơ cấu kinh tế ở nông thôn nhằm phát triển
các giống hoa đặc hữu chất lượng cao cho giá trị kinh tế triển vọng vào sản xuất.
Hà Nội, ngày

Cơ quan chủ trì

tháng

năm 2015

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ và tên, đóng dấu)

(ký, họ và tên)

Hoàng Thị Nga

vi


MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU..............................................................................................1
1.1.

Đặt vấn đề...................................................................................................1

1.2.

Mục tiêu của đề tài.....................................................................................2

1.3.

Cách tiếp cận..............................................................................................3

1.4.

Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu.........................................3

1.4.1. Vật liệu nghiên cứu....................................................................................3
1.4.2. Nội dung:....................................................................................................5
1.4.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................5
PHẦN II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................15
2.1.

Tổng hợp thông tin về phân bố nguồn gen lan Hài, điều tra, thu thập 02
loài Lan Hài thuộc một số tỉnh miền núi phía Bắc có trong sách đỏ của
Việt Nam..................................................................................................15

2.1.1. Nguồn gốc và phân bố chi Paphiopedilum...............................................15
2.1.2. Một số đặc điểm hình thái cơ bản của chi Paphiopedilum...........................15
2.1.3. Tình hình khai thác, sử dụng các loại lan Hài ở Việt Nam.......................23
2.2.

Đánh giá, phân loại các mẫu giống 02 loài Lan Hài P.dianthum và P.
purpuratum thu thập được theo một số đặc điểm nông sinh học quan trọng. 24

2.2.1. Phân loại lan Hài......................................................................................24
2.2.2. Nghiên cứu đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của 02 loài P.
dianthum và P. purpuratum trong điều khiện nuôi trồng ở Hà Nội.........27
2.2.3. Nghiên cứu đánh giá khả năng ra hoa, tạo quả của 02 giống P. purpuratum
và P. dianthum trong điều khiện nuôi trồng ở Hà Nội.............................28
2.3.

Nghiên cứu nhân giống 02 loài Lan Hài P.dianthum và P. purpuratum
bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào.........................................................29

2.3.1. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu.....................................................................29

vii


2.3.2. Quá trình nhân nhanh...............................................................................40
2.3.3. Quá trình tạo cây hoàn chỉnh....................................................................49
2.3.4. Ra cây ngoài vườn ươm...........................................................................58
2.4.

Lưu giữ in vitro 02 loài lan Hài................................................................63

2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của agar đến khả năng sinh trưởng của cây Lan
Hài in vitro................................................................................................64
2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của đường manitol bổ sung vào môi trường nuôi
cấy đến sinh trưởng của cây Lan Hài in vitro..........................................67
2.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến thời gian lưu giữ mẫu 2
loài Lan Hài trong in vitro..........................................................................69
2.5.

Các kết quả của quá trình xây dựng mô hình...........................................70

PHẦN III. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................74
3.1.

Kết luận....................................................................................................74

3.2.

Đề nghị.....................................................................................................76

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................80
PHỤ LỤC

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Bảng thống kê sơ lược về tên loài, phân bố, đặc điểm sinh học, vùng
sinh thái, trữ lượng của các loài Lan thuộc chi Paphiopedilum..........19
Bảng 2: Sự sinh trưởng, phát triển của cây lan hài P.dianthum và P.purpuratum
trong điều kiện nuôi trồng ở Hà Nội (sau 04 tháng)............................28
Bảng 3: Sự ra hoa và tạo quả nhân tạo của 02 loài lan hài thu thập trong điều
kiện nuôi trồng ở Hà Nội (sau 04 tháng).............................................29
Bảng 4: Tỷ lệ nảy mầm của hạt 02 loài Lan Hài P.dianthum và P.purpuratum.31
(sau 12 tuần theo dõi)..........................................................................31
Bảng 5: Tỷ lệ nảy mầm của 02 loài lan Hài P. dianthum và P. purpuratum trên
các nền môi trường (sau 12 tuần nuôi cấy)..........................................33
Bảng 6: Ảnh hưởng của 2,4-D tới sự phát sinh hình thái của hạt lan Hài
P.dianthum sau nảy mầm (sau 12 tuần)...............................................35
Bảng 7: Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự phát sinh hình thái của hạt
lan Hài P.diathum sau nảy mầm (sau 12 tuần).....................................36
Bảng 8: Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái của callus loài
P.dianthum(sau 12 tuần nuôi cấy)........................................................37
Bảng 9: Ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh hình thái của callus loài
P.dianthum (sau 12 tuần nuôi cấy).......................................................38

Bảng 10: Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh hai loài lan Hài (sau 12
tuần nuôi cấy)......................................................................................41
Bảng 11: Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân nhanh P.dianthum và
P.purpuratum (sau 12 tuần nuôi cấy)...................................................42
Bảng 12: Ảnh hưởng của BA kết hợp với α-NAA đến quá trình nhân nhanh của
02 loài lan Hài (sau 12 tuần nuôi cấy).................................................43
Bảng 13: Ảnh hưởng của TDZ kết hợp với α-NAA đến quá trình nhân nhanh của
(sau 12 tuần nuôi cấy)..........................................................................44
Bảng 14: Ảnh hưởng của dịch chuối bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá
trình nhân nhanh (sau 12 tuần nuôi cấy)..............................................46
Bảng 15: Ảnh hưởng của dịch chuối và khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy
đến khả năng nhân nhanh (sau 12 tuần theo dõi)...................................48

ix


Bảng 16: Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của
chồi (sau 10 tuần nuôi cấy)..................................................................49
Bảng 17: Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng của cây
Lan Hài trong nuôi cấy in vitro (sau 12 tuần nuôi cấy).......................53
Bảng 18: Ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) đến sự sinh trưởng và ra rễ của
chồi lan P.dianthum (sau 10 tuần nuôi cấy).........................................55
Bảng 19: Ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) đến sự sinh trưởng và ra rễ của
chồi lan Hài P.purpuratum (sau 10 tuần nuôi cấy)...............................55
Bảng 20: Ảnh hưởng của αNAA đến sự sinh trưởng và ra rễ của chồi
P.dianthum (sau 10 tuần nuôi cấy).......................................................56
Bảng 21: Ảnh hưởng của α-NAA đến sự ra rễ của chồi lan Hài
P.purpuratum(sau 10 tuần nuôi cấy)....................................................57
Bảng 22: Ảnh hưởng của giá thể trồng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng của cây Lan
Hài ngoài vườn ươm (sau trồng 3 tháng).............................................60

Bảng 23: Ảnh hưởng của một số loại dinh dưỡng đến sinh trưởng của cây Lan
Hài ngoài vườn ươm (sau trồng 3 tháng).............................................62
Bảng 24: Ảnh hưởng của bón phân luân phiên đến sinh trưởng của cây Lan Hài
ngoài vườn ươm (sau trồng 3 tháng)...................................................63
Bảng 25: Ảnh hưởng của hàm lượng agar đến khả năng sinh trưởng của 02 loài
lan Hài (sau 12 tuần nuôi cấy).............................................................67
Bảng 26: Ảnh hưởng của manitol bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả
năng sinh trưởng của cây (sau 12 tuần nuôi cấy)...............................69
Bảng 27: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến thời gian lưu giữ trong in vitro của
cây lan Hài............................................................................................70
Bảng 28: Bảng thống kê các cây lan Hài được trồng tại vườn mô hình (số liệu
tổng kết ngày 25/10/2015)...................................................................71
Bảng 29: Tình hình sinh trưởng của cây Lan Hài P.dianthum ở các vùng sinh
thái khác nhau (sau 3 tháng theo dõi)..................................................72
Bảng 30: Tình hình sinh trưởng của cây Lan Hài P.purpuratum ở các vùng sinh
thái khác nhau (sau 3 tháng theo dõi)..................................................72

x


DANH MỤC HÌNH
Hình 1:

Hoa và quả của 2 loài lan Hài thí nghiệm............................................4

Hình 2.1: Cấu tạo chung của hoa lan Hài...........................................................24
Hình 2.2: Sự nảy mầm của hạt lan hài...............................................................34
Hình 2.3: Một số hình ảnh về sự phát sinh hình thái của callus loài lan Hài
P.diathum............................................................................................40
Hình 2.4: Ảnh hưởng của BA và α – NAA đến khả năng nhân nhanh của loài

lan Hài P.purpuratum..........................................................................44
Hình 2.5: Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng
của chồi loài lan Hài (sau 10 tuần nuôi cấy)......................................51
Hình 2.6: Cây lan Hài P.dianthum được nuôi ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau....71
Hình 2.7: Cây Lan Hài ở vườn mô hình.............................................................74

xi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Tên thông thường

VW

Vacin và Went, 1949

MS

Murashige và Skoog, 1962

RE

Robert Ernst, 1979

VW

Vacin and Went,

2,4-D

acid 2,4 Dichlorophenoxy acetic

TDZ

thidiaruzone

BA

6-Benzylaminopurine

K

Kinetin

α-NAA

α Naphtalenacetic acid

ĐC

Đối chứng

CT

Công thức

CTTD

Chỉ tiêu theo dõi

TGTD

Thời gian theo dõi

CTTN

Công thức thí nghiệm

PLB

Protocorm like body: Thể sinh chồi

HSN

Hệ số nhân

ND

Nước dừa

THT

Than hoạt tính

xii

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Lan Hài là một nhánh nhỏ nhưng rất nổi bật trong quá trình tiến hóa của
họ Lan. Họ Lan (Orchidaceae) là một trong những dòng chuyên hóa nhất của
thực vật có hoa. Là nhóm rất khác biệt bởi cấu trúc hoa khác thường với một
cánh hoa giữa (còn gọi là cánh môi) hình túi sâu trông giống như một chiếc hài
nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, do đó trở thành tên chung của nhóm Lan này
(Averyanov et al., 2001).
Các kết quả của quá trình nghiên cứu thực vật của Viện Sinh thái và Tài
nguyên Sinh vật thuộc trung tâm khoa học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia
Việt Nam và nghiên cứu các mẫu thu mua để buôn bán thì có 18 loài lan Hài và
4 dạng lai tự nhiên đã được biết đến một cách chắc chắn ở Việt Nam. Trong số
18 loài lan Hài đã được biết đến tại Việt Nam thì có tới 15 loài phân bố ở các
tỉnh miền núi phía Bắc chủ yếu tập chung ở các tỉnh như: Thái Nguyên, Tuyên
Quang, Lai Châu, Sơn La, Cao Bằng chỉ có 3 loài có khu vực phân bố là: Đắc
Lắc, Khánh Hòa, Quảng trị. Mặc dù tình trạng của các loài Lan Hài hoang dại ở
Việt Nam đang hay sắp có nguy cơ tuyệt chủng nhưng chỉ có 3 loài được đưa
vào sách đỏ Việt Nam đó là P. appletonianum, P. delanatii, và P. hirsutissimum
(Averyanov et al., 2008).
Việt Nam là một trung tâm đa dạng và đặc hữu rất quan trọng về các loài
Lan ở vùng Đông Nam Á trong đó tính đa dạng của lan Hài cao hơn bất cứ nơi
nào trên thế giới. Nhiều loài lan Hài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn có
những loài đặc hữu hẹp, là báu vật quốc gia có tầm quan trọng quốc tế. Tuy
nhiên tình hình thực tế hiện nay do việc khai thác rừng bừa bãi, nạn cháy rừng
thường xuyên, xuất bán tràn lan sang Trung Quốc xảy ra trên diện rộng đã làm
trữ lượng của cây bị giảm sút, không gian sống của các loài lan Hài đang bị thu
hẹp, sự đa dạng sinh học đang bị suy giảm nghiêm trọng dẫn tới nguồn tài
nguyên quý mà thiên nhiên ban tặng này đang có nguy cơ tuyệt chủng.

1


Lan Hài P.dianthum và P.purpuratum đã được liệt kê vào phụ lục 1 của
công ước CITES và danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng, quý hiếm (nhóm
1) của Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/3/2006 để nghiêm cấm khai thác,
sử dụng vì mục đích thương mại. Bảo vệ phần quần thể nhỏ nhoi còn sót lại ở
các khu bảo tồn thiên nhiên Pà Cò- Hang Kia, Phong Quang và Bát Đại Sơn, Na
Hang. Cần nhân rộng việc gieo ươm loài lan Hài P.dianthum và P.purpuratum để
vừa tạo nguồn cây làm cảnh, đồng thời bảo vệ nguồn gen.
Lan Hài còn tồn tại rất ít trong vùng phân bố tự nhiên, phần lớn ở những
vách núi hiểm trở, khó tiếp cận. Vì vậy việc bảo tồn và phát triển các loài lan
Hài của Việt Nam nói chung đặc biệt là các loài đặc hữu khu vực miền núi phía
Bắc là nhiệm vụ vô cùng cấp thiết vì nó có vai trò cực kỳ quan trọng đối với đời
sống vật chất, tinh thần của con người cũng như duy trì cân bằng sinh thái tự
nhiên. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng công nghệ sinh học
trong bảo tồn và phát triển loài lan Hài (Paphiopedilum) đặc hữu khu vực
miền núi phía Bắc có nguy cơ tuyệt chủng” nhằm đưa ra quy trình kỹ thuật
nhân giống và lưu giữ một số loài lan Hài đặc hữu thu thập được ở khu vực miền
núi phía bắc Việt Nam, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm này.
1.2. Mục tiêu của đề tài
- Mục tiêu chung: Bảo tồn và phát triển được loài lan Hài đặc hữu khu vực
miền núi phía Bắc có nguy cơ tuyệt chủng bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào.
- Mục tiêu cụ thể:
+ Thu thập được 02 loài lan Hài P.dianthum và P.purpuratum có trong
sách đỏ của Việt Nam
+ Xây dựng quy trình nhân nhanh (01 quy trình)
+ Xây dựng quy trình lưu giữ in vitro cho 2 loài lan Hài P.dianthum và
P.purpuratum (01 quy trình và lưu giữ 200 bình trong phòng thí nghiệm)
+ Xây dựng vườn mô hình trồng (300 m 2) và bảo tồn ở vườn mô hình là 5

chậu mỗi loài (mỗi chậu có 3-5 đơn vị cây).

2


1.3. Cách tiếp cận
+ Công nghệ nuôi cấy mô tế bào là biện pháp nhanh nhất và có hiệu quả
nhất trong việc phát triển các giống cây trồng quý nói chung đặc biệt là đối
tượng các cây hoa lan nói riêng.
+ Xây dựng chương trình, đề cương nghiên cứu dựa trên các quy trình
công nghệ hiện có trong nước kết hợp với tham khảo thông tin từ các sách , báo,
công bố trên mạng trong và ngoài nước.
+ Trên cơ sở những kinh nghiệm và thành tựu đã có được của đơn vị
trong các lĩnh vực: nhân nhanh in vitro, lưu giữ bảo quản ngoàivườn, trong
phòng thí nghiệm.
+ Dựa trên đội ngũ cán bộ của các cơ quan phối hợp nghiên cứu đã có
nhiều kinh nghiệm và nhiều năm triển khai hoạt động trong nhân giống bằng
công nghệ nuôi cấy mô tế bào, thu thập, điều tra, trồng trọt các loại cây trồng nói
chung và đặc biệt là cây hoa Lan.
+ Tiếp cận kết hợp các phương pháp truyền thống và hiện đại trong
nghiên cứu: Ngoài việc sử dụng các phương pháp truyền thống trong điều tra,
đánh giá, thu thập, đề tài dựa vào mối quan hệ hợp tác hiện có của Viện sinh học
Nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam tiến hành hợp tác nghiên cứu,
đào tạo trong lĩnh vực nhân nhanh in vitro các loài lan Hài.
+ Ưu thế của phương pháp nhân giống, bảo quản lưu giữ bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp có tính khả thi cho kết quả, ưu thế lớn
hơn các phương pháp khác
1.4. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Vật liệu nghiên cứu
* Đối tượng: Loài lan hài

TT

Tên la tinh

Tên Việt Nam

1

P. dianthum

Hài xoắn

2

P. purpuratum

Hài tía

3


P. purpuratum

P. dianthum

Hình 1: Hoa và quả của 2 loài lan Hài thí nghiệm
- Quả lan Hài ở các độ tuổi từ 5 – 10 tháng sau thụ phấn

- Các chồi có chiều cao 2 – 2,5 cm và thể tiền chồi (PLB -protocorm like
body).

- Môi trường nuôi cấy mẫu là: MS, ½ MS, VW, ½ VW, RE, ½ RE
- Chất hữu cơ:
+ dịch nghiền của chuối tiêu chín được bóc vỏ, xay nhuyễn
+ dịch nghiền khoai tây: Khoai tây được rửa sạch, gọt vỏ. Sau đó đem
luộc chín và được xay nhuyễn.
- Chất điều tiết sinh trưởng: BA, TDZ, 2,4D, Ki, NAA
- Rễ cây dương xỉ, bột dừa, xơ dừa chỉ có kích thước 2 – 3 cm, xỉ than,

4


than hoa có đường kính 1-2 cm.
- Phân bón:Growmore loại 30:10:10 , 20:20:20, Yogen 30:10:10, Đầu
Trâu 502, liều lượng sử dụng 1gam/lít nước tưới
- Komix, dung dịch hữu cơ Fish Emulsion, vitamin tổng hợp liều lượng
sử dụng 3ml/lít nước tưới
* Địa điểm: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
Vùng đệm vườn Quốc gia Hoàng Liên- Thị trấn Sapa – Lào Cai
*Thời gian: từ tháng 1 năm 2013 đến tháng 11 năm 2015
1.4.2. Nội dung:
Nội dung 1. Tổng hợp thông tin về phân bố nguồn gen lan Hài, điều tra, thu thập
02 loài Lan Hài thuộc một số tỉnh miền núi phía Bắc có trong sách đỏ của Việt Nam
Nội dung 2. Đánh giá, phân loại các mẫu giống 02 loài lan Hài P. dianthum
và P.purpuratum thu thập được theo một số đặc điểm nông sinh học quan trọng
Nội dung 3. Nghiên cứu nhân giống 02 loài lan Hài P. dianthum và
P.purpuratum bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào
Nội dung 4. Ứng dụng các phương pháp lưu giữ nguồn gen cho 02 loài Lan
Hài P. dianthum và P.purpuratum
Nội dung 5. Xây dựng mô hình trồng 02 loài Lan Hài P. dianthum và
P.purpuratum tại vùng đệm khu bảo tồn vườn Quốc gia Hoàng Liên.

1.4.3. Phương pháp nghiên cứu
1.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1:
Tổng hợp thông tin về phân bố nguồn gen lan Hài, điều tra, thu thập 02
loài Lan Hài thuộc một số tỉnh miền núi phía Bắc có trong sách đỏ của Việt Nam
Theo phương pháp thu thập thông tin thứ cấp: Được cung cấp qua các
tài liệu tổng hợp từ nhiều nguồn (Bài báo, sách, internet…) về đặc tính sinh
trưởng phát triển, hiện trạng phân bố, tình hình khai thác sử dụng cây lan Hài
(Paphiopedilum) có trong sách đỏ ở một số tỉnh miền núi phía Bắc và thu thập
02 loài lan Hài P. dianthum và P.purpuratum làm nguyên liệu để nhân giống và
bảo tồn in vitro

5


1.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2:
Đánh giá, phân loại các mẫu giống 02 loài lan Hài P. dianthum và P.
purpuratum thu thập được theo một số đặc điểm nông sinh học quan trọng
Nghiên cứu phân loại các mẫu giống lan Hài thu thập được theo một số
đặc điểm nông sinh học quan trọng
Thí nghiệm 1. Nghiên cứu đánh giá khả năng sinh trưởng của 02 giống P.
purpuratum và P. dianthum thu thập trong điều khiện nuôi trồng ở Hà Nội thông
qua các chỉ tiêu nông sinh học: chiều cao, số lá, số chồi mới.
Thí nghiệm 2. Nghiên cứu đánh giá khả năng ra hoa đậu quả của 02 loài
P. purpuratum và P. dianthum trong điều khiện nuôi trồng ở Hà Nội thông qua
các chỉ tiêu số hoa/cây, tỷ lệ tạo quả.
1.4.3.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3.
Nghiên cứu nhân giống 02 loài Lan Hài P. dianthum và P. purpuratum
bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi quả đến khả năng nảy
mầm của hạt 02 loài lan Hài

Quả lan Hài được thu thập về ở các độ tuổi từ 5 - 10 tháng tuổi tính từ sau
khi thụ phấn được đem vào nuôi cấy trên nền môi trường cơ bản là VW (Vacin
and Went)
Công thức thí nghiệm
Tuổi quả (tháng)
CT1
5
CT2
6
CT3
7
CT4
8
CT5
9
CT6
10
(Tuổi của quả được tính từ khi sau khi thụ phấn đến lúc thu quả)
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến
khả năngnảy mầm của hạt 02 loài lan Hài
Quả lan Hài 9 tháng tuổi sẽ được dùng làm vật liệu gieo trên các nền môi
trường khác nhau (MS, ½MS, VW, ½VW, RE, ½RE)

6


Công thức thí nghiệm
Môi trường
CT1
MS

CT2
½ MS
CT3
VW
CT4
½ VW
CT5
RE
CT6
½ RE
Hạt gieo ở thí nghiệm 3 và 4 mỗi công thức là 5 bình, lặp lại 3 lần theo
dõi chỉ tiêu nảy mầm của hạt sau 8, 10 và 12 tuần nuôi cấy
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của 2,4-D tới sự phát sinh hình thái của hạt lan
P.diathum
CT
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5

Nồng độ 2,4D (mg/l)
½ VW + 15 g saccarose + 100mlND+ 5 g agar (ĐC)
ĐC + 1 mg/l 2,4-D
ĐC + 3 mg/l 2,4-D
ĐC + 5 mg/l 2,4-D
ĐC + 7 mg/l 2,4-D

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D kết hợp với BA tới sự
phát sinh hình thái của hạt lan Hài P.diathum sau nảy mầm

CT
CT1
2
3
4

Nồng độ 2,4D và BA (mg/l)
½ VW + 15 g saccarose + 100mlND+ 5 g agar (ĐC)
ĐC+5mg/l 2,4D+0,5 mg/l BA
ĐC+5 mg/l 2,4D+1,0mg/l BA
ĐC+5mg/l 2,4D +1,5mg/l BA

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái
callus loài lan Hài P.dianthum
CT
1
2
3
4
5

Nồng độ BA (mg/l)
½ VW + 15 g saccarose + 100mlND+ 5 g agar (ĐC)
ĐC + 1,0 mg/l BA
ĐC + 2,0 mg/l BA
ĐC + 3,0 mg/l BA
ĐC + 4,0 mg/l BA

7

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh hình thái
callus loài lan Hài P. dianthum
CT
Nồng độ TDZ (mg/l)
1
½ VW + 15 g saccarose + 100mlND+ 5 g agar (ĐC)
2
ĐC + 1,0 mg/l TDZ
3
ĐC + 2,0 mg/l TDZ
4
ĐC + 3,0 mg/l TDZ
Thí nghiệm 5,6,7, 8 mỗi công thức cấy 5 bình, lặp lại 3 lần theo dõi các
chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu hình thành callus (%), tỷ lệ mẫu hình thành chồi (%), tỷ lệ
mẫu chết/không phản ứng (%) sau 12 tuần nuôi cấy
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA bổ sung vào môi trường
nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của 02 loài lan Hài
CT
Nồng độ BA (mg/lít)
CT1
ĐC (0 mg/l BA)
CT2
ĐC + 0,5 mg/l BA
CT3
ĐC + 1,0 mg/l BA
CT4
ĐC + 1,5 mg/l BA
CT5
ĐC + 2,0 mg/l BA

CT6
ĐC + 3,0 mg/l BA
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ bổ sung vào môi trường
nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của 02 loài Lan Hài
CT
Nồng độ TDZ (mg/lít)
CT1
ĐC
CT2
ĐC + 0,5 mg/l TDZ
CT3
ĐC + 1,0 mg/l TDZ
CT4
ĐC + 1,5 mg/l TDZ
CT5
ĐC + 2,0 mg/l TDZ
CT6
ĐC + 3,0 mg/l TDZ
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp BA và α-NAA đến
khả năng nhân nhanh của 02 loài Lan Hài
CT
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5

Nồng độ BA (mg/lít)
Nền môi trường + 2 mg BA (ĐC)
ĐC + 0,1 mg/l α- NAA

ĐC + 0,3 mg/l α- NAA
ĐC + 0,5 mg/l α- NAA
ĐC + 1,0 mg/l α- NAA

8


Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp TDZ và α-NAA
đến khả năng nhân nhanh của 02 loài lan Hài
CT
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5

Nồng độ TDZ (mg/lít)
Nền môi trường + 2 mg TDZ (ĐC)
ĐC + 0,1 mg/l α- NAA
ĐC + 0,3 mg/l α- NAA
ĐC + 0,5 mg/l α- NAA
ĐC + 1,0 mg/l α- NAA

Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả
năng nhân nhanh chồi, protocorm của loài lan Hài P.dianthum và P.purpuratum
Công thức
CT1 ĐC
CT2
CT3
CT4

CT5

Dịch chuối bổ sung (g)
0
50
100
150
200

Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền chuối và
khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh chồi,
protocorm của 02 loài lan Hài.
Công thức
CT1: ĐC
CT2
CT3
CT4
CT5

Dịch nghiền chuối (g)
0
50
50
100
100

Dịch nghiền khoai tây (g)
0
50
100

50
100

Ghi chú:từ thí nghiệm 8 - 14
Nền MT: ½VW + 15g saccarose+ 5,0g agar+100mlND + 0,5g THT (P.dianthum)
½RE + 15g saccarose + 5,0g agar +100mlND+ 0,5g THT (P.purpuratum)

Thí nghiệm 9, 10, 11, 12, 13, 14 sử dụng thể protocorm và chồi đối với loài
P.dianthum, chồi đối với loài P.purpuratum. Mỗi công thức cấy 5 bình , lặp lại 3
lần, theo dõi các chỉ tiêu hệ số nhân PLBs, hệ số nhân chồi sau 12 tuần nuôi cấy.

9


Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường khác
nhau đếnsự sinh trưởng của loài lan Hài P.dianthum và P.purpuratum
CTTN
Môi trường
CT1
½ VW + 15 g/l saccarose + 5,0 g/l agar + 100 ml ND
CT2
VW + 15 g/l saccarose+ 5,0 g/l agar + 100 ml ND
CT3
½ MS + 15 g/l saccarose + 5,0 g/l agar + 100 ml ND
CT4
MS + 15 g/l saccarose + 5,0 g/l agar + 100 ml ND
CT5
½ RE + 15 g/l saccarose + 5,0 g/l agar + 100 ml ND
CT6
RE + 15 g/l saccarose + 5,0 g/l agar + 100 ml ND

Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến
khả năng sinh trưởng của cây Lan Hài
Công thức
CT1
CT2(ĐC)
CT3
CT4

Cường độ chiếu sáng (lux)
2500
2000
1500
1000

Nền môi trường nuôi cấy:
½VW + 15g saccarose+ 5,0g agar+100mlND + 0,5g THT (P.dianthum)
½RE + 15g saccarose + 5,0g agar +100mlND+ 0,5g THT (P.purpuratum)

Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng
hình thành rễ của loài lan Hài P.dianthum và P.purpuratum.
CTTN

Môi trường

CT1
CT2
CT3
CT4

ĐC

ĐC + 0,3 g/l THT
ĐC + 0,5 g/l THT
ĐC + 0,7 g/l THT

CT5

ĐC + 1,0 g/l THT

Thí nghiệm 18: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng hình
thành rễ của loài lan Hài P.dianthum và P.purpuratum.
CTTN

Môi trường

1
2
3

ĐC
ĐC + 0,3 mg/l α-NAA
ĐC + 0,5 mg/l α-NAA

10


4
5

ĐC + 0,7 mg/l α-NAA
ĐC + 1,0 mg/l α-NAA

Ghi chú: thí nghiệm 16 và 17:
ĐC: ½ MS + 15 g/l saccarose + 5,0 g/l agar + 100 ml ND - cho loài P.dianthum
½ RE + 15 g/l saccarose + 5,0 g/l agar + 100 ml ND - cho loài P.purpuratum

Thí nghiệm 15, 16, 17, 18 sử dụng mẫu chồi có chiều cao 2 - 2,5 cm, 2 - 3 lá cấy
5 bình/công thức, 6 cây/bình Mỗi công thức lặp lại 3 lần . Các chỉ tiêu theo dõi là chiều
cao trung bình chồi, số lá trung bình, tỷ lệ ra rễ , số rễ trung bình sau 10 tuần nuôi cấy
Thí nghiệm 19: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả
năng sống, sinh trưởng của 02 loài Lan Hài P. dianthum và P. purpuratum
Công thức
Giá thể
CT1
Xỉ than
CT2
Dương xỉ
CT3
Bột dừa
CT4
1 Dương xỉ + 1 xỉ than
CT5
1 Dương xỉ + 1 bột dừa
CT6
1 Xỉ than + 1 bột dừa
(Sau trồng 10 ngày cung cấp dinh dưỡng cho cây bằng cách phun ướt lá
với phân bón đầu trâu 502 liều lượng 1 gam/lít, 10 ngày phun 1 lần)
Thí nghiệm 20: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại dinh dưỡng đến
sinh trưởng của cây Lan Hài ở vườn ươm.
Công thức
Dinh dưỡng

CT1
Đầu trâu 502
CT2
Growmore 30:10:10
CT3
Yogen 30:10:10
CT4
Komix
Giá thể trồng cây cho thí nghiệm này là dương xỉ, dinh dưỡng Đầu trâu
Growmore Yogen sử dụng 1gam/lít, komix 3ml/lít, 10 ngày phun 1 lần.
Thí nghiệm 21: Nghiên cứu ảnh hưởng của bón phân luân phiên đến sinh
trưởng của cây lan Hài ngoài vườn ươm.
Công thức
CT1
CT2
CT3

Dinh dưỡng
Đầu trâu 502 (I)
3 lần(I) + 1 lần Growmore 20:20:20 (II)
3 lần(I) + 1 lần (II) + 1 lần dung dịch hữu cơ (Fish Emulsion)

11


(III)
CT4
3 lần(I) + 1 lần (II) + 1 lần (III) + 1 lần vitamin tổng hợp
1.4.3.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4.
Ứng dụng các phương pháp lưu giữ nguồn gen của 02 loài Lan Hài P.

dianthum và P. purpuratum
Thí nghiệm 22: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng agar đến khả
năng sinh trưởng của cây lan Hài trong in vitro.
Công thức
Môi trường nền
CT1(ĐC)
RE+ 15g saccarose +5 g agar+ 0,5gTHT
CT2
ĐC + 6 g agar
CT3
ĐC + 7 g agar
Thí nghiệm 23: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng manitol bổ
sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của cây Lan Hài
Công thức
Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường (g/l)
CT1(ĐC)
15g saccarose
CT2
20 gam manitol
CT3
30 gam manitol
CT4
40 gam manitol
CT5
50 gam manitol
Nền môi trường nuôi cấy: RE+ 5 g agar+ 0,5gTHT
Thí nghiệm 24: Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ phòng nuôi đến thời gian
lưu giữu mẫu.
Trong thí nghiệm 22, 23, 24 chồi cao 2- 2,5 cm, 2-3 lá, mỗi thí nghiệm
cấy 3 bình, mỗi bình 8 cây, lặp lại 3 lần.

Thí nghiệm 24 cây được cấy trên môi trường: RE + 6 gam agar + 40 gam
manitol, dung tích môi trường trong bình nuôi cấy (bình tam giác) là 150
ml/bình. Các bình mẫu được nuôi trong điều kiện chiếu sáng là 1500 lux ở 3
điều kiện nhiệt độ là: 250C, 200C và 150C để theo dõi thời gian chồi bắt đầu xuất
hiện vàng lá, thời gian bảo quản chồi và tình trạng sinh trưởng của chồi.
1.4.3.5. Phương pháp nghiên cứu nội dung 5.
Xây dựng mô hình trồng 02 loài Lan Hài P. dianthum và P. purpuratum
tại vùng đệm khu bảo tồn vườn Quốc gia Hoàng Liên.

12