Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến quá trình tạo màng biocellulose trên môi trường dịch dưa chuột (cucumis sativus l 1753)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
==  ==

NGUYỄN THỊ MỸ LINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA NGUỒN
DINH DƢỠNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG
BIOCELLULOSE TRÊN MÔI TRƢỜNG DỊCH
DƢA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.1753)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

HÀ NỘI – 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
==  ==

NGUYỄN THỊ MỸ LINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA NGUỒN
DINH DƢỠNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG
BIOCELLULOSE TRÊN MÔI TRƢỜNG DỊCH
DƢA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.1753)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

ThS. NGUYỄN THỊ KIM NGOAN

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, ThS.
Nguyễn Thị Kim Ngoan, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời
gian học tập và nghiên cứu đề tài này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
em thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơnBan Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh -KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh
vật Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân,
những ngƣời luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập, tiến hành và hoàn thiện đề tài.
Hà Nội, Ngày Tháng

Năm 2018

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Linh


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất cả
những số liệu đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn
toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không trùng
với công trình nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác, em
xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Hà Nội, Ngày

Tháng

Năm 2018

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Linh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
5. Đóng góp của đề tài....................................................................................... 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới ............... 4
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới .......................... 4

1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter ............................................ 4
1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter ............................. 6
1.2.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon................................................................. 6
1.2.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật .................................................................... 7
1.3. Điều kiện nuôi cấy ..................................................................................... 7
1.3.1. Độ pH ...................................................................................................... 7
1.3.2. Nhiệt độ ................................................................................................... 7
1.3.3. Độ thông khí ............................................................................................ 8
1.4. Bacterial cellulose (BC) ............................................................................. 8
1.4.1. Cấu trúc ................................................................................................... 8
1.4.2. Một số tính chất ....................................................................................... 9
1.4.3. Cơ chế tổng hợp ...................................................................................... 9
1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay ....................................... 10
1.5.1. Trên thế giới .......................................................................................... 10
1.5.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 11


1.6. Dƣa chuột Cucumis sativus ...................................................................... 11
1.6.1. Lịch sử và phân loại .............................................................................. 11
1.6.2. Thành phần dinh dƣỡng ........................................................................ 12
1.6.3. Ứng dụng ............................................................................................... 12
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất ........................................................... 14
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 14
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu............................................................. 14
2.1.3. Các loại môi trƣờng............................................................................... 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 15
2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh .............................................................................. 15
2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh ........................................................................... 18
2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng đến quá

trình lên men.................................................................................................... 18
2.2.4. Phƣơng pháp cảm quan ......................................................................... 19
2.2.5. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trƣờng đã chọn
(MT4) .............................................................................................................. 20
2.2.6. Phƣơng pháp xác định trọng lƣợng tƣơi của màng Biocellulose .......... 20
2.2.7. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả ................................................ 20
2.3. Địa điểm tiến hành thí nghiệm ................................................................. 21
2.4. Thời gian thực hiện đề tài ........................................................................ 21
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 22
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Biocellulose
trên môi trƣờng dịch dƣa chuột Cucumis sativus ........................................... 22
3.1.1. Phân lập Gluconacetobacter có khả năng sinh màng Biocellulose....... 22
3.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose dai,
mỏng ................................................................................................................ 25
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng G. xylinus .................... 29
3.2.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn G. xylinus .............................. 29


3.2.2. Sinh trƣởng trên môi trƣờng thạch đĩa .................................................. 30
3.2.3. Sinh trƣởng trên môi trƣờng lỏng ......................................................... 31
3.2.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn G. xylinus ........................................... 31
3.3. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng tới khả năng tạo màng Biocellulose
trong môi trƣờng có bổ sung dịch dƣa chuột Cucumis sativus. ...................... 32
3.3.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng cacbon tới khả năng lên men tạo màng
Biocellulose ..................................................................................................... 32
3.3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng nitơ tới khả năng lên men tạo màng
Biocellulose ..................................................................................................... 35
3.3.3. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trƣờng đã chọn
(MT4) .............................................................................................................. 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 39

1. Kết luận ....................................................................................................... 39
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 40
A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ............................................................................ 40
B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH ............................................................................. 42
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC HÌNH
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo
Frateur ............................................................................................................... 6
Hình 1.1. Sợi cellulose của màng Biocellulose ................................................ 8
Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter .............. 10
Hình 1.3. Dƣa chuột Cucumis sativus............................................................. 11
Hình 3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter ............................ 22
Hình 3.2. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter .......................................... 25
Hình 3.3. Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter khi nhuộm Gram ở độ
phóng đại 1000 trên kính hiển vi quang học ................................................... 26
Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng Biocellulose .......................................... 27
Hình 3.4. Màng Biocellulose sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter ............ 27
Hình 3.5. Màng Biocellulose do chủng vi khuẩn D1 và D2 tạo ra ................. 28
Hình 3.6. Chủng giống vi khuẩn G. xylinus ................................................... 29
Hình 3.7. Kết quả nhuộm Gram của G. xylinus ở độ phóng đại 1000 trên .... 30
kính hiển vi quang học .................................................................................... 30
Hình 3.8. G. xylinus trên môi trƣờng thạch đĩa .............................................. 30
Hình 3.9. G. xylinus trên môi trƣờng lỏng ...................................................... 31
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến khả năng tạo màng
Biocellulose ..................................................................................................... 33
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose tới độ dày của màng
Biocellulose ..................................................................................................... 34

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khả năng tạo màng
Biocellulose ..................................................................................................... 35
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 tới độ dày của màng Biocellulose ..... 36
Hình 3.12. Màng Biocellulosethu đƣợc ở môi trƣờng MT3 và môi trƣờng
chọn lọc MT4 .................................................................................................. 38


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo
Frateur ............................................................................................................... 6
Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng Biocellulose .......................................... 27
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến khả năng tạo màng
Biocellulose ..................................................................................................... 33
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khả năng tạo màng
Biocellulose ..................................................................................................... 35

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến khả
năng tạo màng Biocellulose ............................................................................ 33
Biểu đồ 3.2.Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khả
năng tạo màng Biocellulose ............................................................................ 36


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nhƣ chúng ta đã biết thế kỉ XX là thế kỉ của ngành công nghệ thông tin
thì thế kỉ XXI là thế kỉ của ngành công nghệ sinh học. Ngày nay công nghệ
sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo và chiếm giữ một vị
trí cao của nhiều quốc gia trên thế giới. Là một bộ phận của ngành công nghệ

sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang phát triển mạnh mẽ với những thành
tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành nhƣ: công nghiệp, nông
nghiệp, y học,... Cho đến ngày nay một trong những nguồn nguyên liệu đã và
đang đƣợc quan tâm gần đây đó là cellulose vi khuẩn hay Biocellulose. Hiện
nay màng Biocellulose đƣợc xem là nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng
đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ công nghiệp thực
phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin... đặc biệt trong lĩnh vực y học,
màng Biocellulose đã đƣợc một số nƣớc trên thế giới nghiên cứu ứng dụng
làm màng trị bỏng, mặt nạ dƣỡng da, mạch máu nhân tạo... Trên thế giới việc
nghiên cứu Gluconacetobacter và quá trình sinh tổng hợp Biocellulose cũng
nhƣ ứng dụng của Biocellulose bắt đầu từ rất sớm. Những nghiên cứu đầu tiên
là của Brown A.J và cộng sự năm (1886). Trải qua hơn 1 thế kỷ nhƣng cho
đến nay Gluconacetobacter và màng Biocellulose vẫn đang thu hút đƣợc sự
chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Ở Việt Nam, nghiên cứu về Gluconacetobacter, màng Biocellulose và
ứng dụng của nó còn là vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới đƣợc quan tâm gần đây.
Các nghiên cứu và công bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn. Các nghiên cứu
hiện mới dừng ở nghiên cứu quá trình tạo màng Biocellulose ứng dụng trong
sản xuất thạch dừa, làm giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng.
Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh 1


KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng
Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) có khả năng tạo màng Biocellulose với
năng suất và chất lƣợng tốt trên các nguồn nguyên liệu nhƣ: dịch tảo, nƣớc
dừa, nƣớc vo gạo... Hiện nay, đang tiến hành lên men tạo màng Biocellulose
trên môi trƣờng dịch dƣa chuột Cucumis Sativus để ứng dụng vào việc làm
mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Việc đắp mặt nạ tự nhiên và mặt nạ từ trái
cây là cách dƣỡng da khá đơn giản, ít tốn kém mà lại rất hiệu quả. Trong đó
đắp mặt nạ bằng dƣa chuột Cucumis sativus là một công thức dƣỡng trắng

đƣợc khá nhiều bạn gái yêu thích và áp dụng với nhiều lí do, dƣa chuột khá dễ
tìm và giá thành rẻ, dƣa chuột Cucumis sativus có chứa vitamin A, B1, B2, C,
và các chất vi lƣợng nhƣ sắt, mangan, iod cung cấp chất dinh dƣỡng cho da
khá nhiều khi dùng làm mặt nạ đắp mặt. Tuy nhiên, nguồn dinh dƣỡng thích
hợp cho quá trình tạo màng Biocellulose trên môi trƣờng dịch dƣa chuột còn
chƣa đƣợc nghiên cứu. Nhằm tìm ra nguồn dinh dƣỡng phù hợp nhất cho quá
trình tạo màng Biocellulose của vi khuẩn G. xylinus trong môi trƣờng dịch dƣa
chuột Cucumis sativus, tôi quyết định lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng
của nguồn dinh dưỡng đến quá trình tạo màng biocellulose trên môi trường
dịch dưa chuột (Cucumis sativus L.1753)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm ra nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho quá trình tạo màng Biocellulose
trên môi trƣờng dịch dƣa chuột Cucumis sativus.
3. Phạm vi nghiên cứu
Ảnh hƣởng của nguồn cacbon, nitơ đến khả năng tạo màng Biocellulose
của chủng vi sinh vật đã phân lập, ứng dụng làm mặt nạ dƣỡng da.

2


4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu nhằm lựa chọn môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp cho quá
trình tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu góp phần tìm hiểu quá trình làm mặt nạ dƣỡng da, từ đó đƣa
các chủng vi sinh vật có đặc tính cho màng Biocellulose dai, mỏng tuyển chọn
đƣợc vào sản xuất mặt nạ dƣỡng da, đáp ứng nhu cầu làm đẹp của con ngƣời.
5. Đóng góp của đề tài
Nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho quá trình lên men tạo màng

Biocellulose trên môi trƣờng dịch dƣa chuột, gồm nguồn cacbon, nguồn nitơ.

3


NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Đã có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic nhƣ Rothenback
1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Fraterur
1950... Thuật ngữ “Gluconacetobacte” đƣợc dùng đầu tiên cho cấp độ phân
loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận
thấy các thành phần ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi khuẩn
sinh acetic khác nhau. Gluconacetobacter thuộc chi Acetobacter, họ
Pseudomonasdaceae, bộ Pseudomonasdales, lớp Schizomycetes. Ngày nay,
việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn Gluconacetobacter nói
riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy, đòi hỏi cần nhiều nghiên
cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này.
1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter
Đặc điểm hình thái - tế bào học
Chủng Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích
thƣớc khoảng 2 μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có
khả năng di động, không sinh bào tử.Các tế bào đƣợc bao bọc bởi chất nhày
tạo váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và
thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có
thể tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trƣờng. Khi nồng độ acid acetic cao
vƣợt giới hạn cho phép, nó ức chế hoạt động của vi khuẩn.
Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trƣờng thạch đĩa, vi khuẩn Gluconabacter hình thành khuẩn

lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng
4


hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trƣờng.
Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể ở điều
kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose, đó là tập
hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra
quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao
đổi oxy và các chất dinh dƣỡng [5], [20].
Ngƣợc lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng nhỏ với
kích thƣớc không đều nhau và phân tán trong môi trƣờng dinh dƣỡng tạo ra
những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.
Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 – 350C, pH = 4 6. Nhiệt độ và pH tối ƣu tùy thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái
hoàn toàn ngay cả trong môi trƣờng tối ƣu. Gluconacetobacter có khả năng
chịu đƣợc pH thấp, vì thế thƣờng bổ sung thêm acid acetic và môi trƣờng nuôi
cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
Đặc điểm sinh hóa
Năm 1950, Fruteur đã chính thức đƣa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt
tính catalase; Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter,

họ

Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadaceae, lớp Schizomycetes. Đặc điểm
phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi đƣợc trình bảng dƣới đây:

5

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
theo Frateur
Đặc điểm

Hiện tƣợng

Oxy hóa ethanol thành acid

Chuyển hóa môi trƣờng chứa

acetic

Bromphenol Blue 0,04% từ

TT

1

Kết quả

+

màu xanh sang màu vàng
2
3

4

5

Hoạt tính catalase

Hiện tƣợng sủi bọt khí

Sinh trƣởng trên môi trƣờng Sinh khối không phát triển
Hoyer
Chuyển hóa glycerol thành

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch

dihydroxyaceton

sau lên men

Chuyển hóa glucose thành

Vòng sáng xuất hiện xung

acid

quanh khuẩn lạc trên môi

+
-

+

+

trƣờng chứa CaCO3
6

7

Kiểm tra khả năng sinh sắc

Không hình thành sắc tố nâu

tố nâu
Kiểm tra khả năng tổng hợp

Váng vi khuẩn xuất kiện màu

cellulose

lam

-

+

1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter
Để đảm bảo hoạt động sống bình thƣờng của vi khuẩn, môi trƣờng thức
ăn ngoài rƣợu, nƣớc còn phải cung cấp thêm muối khoáng, nguồn cacbon,
nguồn nitơ dễ hấp thụ nhƣ: CaHPO4, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, MgSO4. 7H2O,
KH2PO4… tùy thuộc nhu cầu cụ thể của từng loài [26].
1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong các phân tử enzim,

acid nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy, hợp chất hữu cơ chứa cacbon
6


có ý nghĩa quan trọng trong đời sống vi sinh vật. Ngƣời ta dùng đƣờng làm
nguồn cung cấp cacbon chủ yếu cho phần lớn vi sinh vật dị dƣỡng. Để tránh
hiện tƣợng ở nhiệt độ cao và trong môi trƣờng kiềm đƣờng bị chuyển hóa khi
khử trùng môi trƣờng có chứa đƣờng ngƣời ta thƣờng chỉ hấp ở áp lực 0,5
atm 1100 trong 30 phút. Để nuôi cấy vi khuẩn thƣờng dùng 0,2 – 0,5% đƣờng.
Hầu hết các vi khuẩn chỉ đồng hoá đƣợc các loại đƣờng ở dạng đồng phân D.
1.2.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho cơ thể sinh vật nguyên
liệu để hình thành các nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử
aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên
sinh chất [25].
Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Vi sinh
vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Do đó
khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter ngƣời ta thƣờng sử dụng nguồn
nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao
nấm men [25].
1.3. Điều kiện nuôi cấy
1.3.1. Độ pH
Vi khuẩn Gluconacectobacter phát triển thuận lợi trên môi trƣờng có
pH thấp. Do đó trong môi trƣờng nuôi cấy cần bổ sung axit axetic, nhằm axit
hóa môi trƣờng, đồng thời axit axetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn
chặn sự phát triển của các vi khuẩn có hại.
1.3.2. Nhiệt độ
Theo Beyger nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Gluconacectobacter vào
khoảng 25-350C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến một mức nào đó
sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm.

7


1.3.3. Độ thông khí
Vi khuẩn Gluconacectobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do đó,
điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong
thực tế độ thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp Biocellulose.
1.4. Bacterial cellulose (BC)
1.4.1. Cấu trúc
Màng Biocellulose đƣợc cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4
glucopyranose mạch thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose
thực vật, nhƣng cấu trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.
Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thƣớc 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc vandesvan tạo thành
dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thƣớc bên của màng tăng lên khi
quần thể vi khuẩn sinh trƣởng [8], [9], [23].
Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở
chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần
phụ khác mà đƣợc cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song
song cấu thành mạng lƣới cellulose [1].

Hình 1.1. Sợi cellulose của màng Biocellulose

8

1.4.2. Một số tính chất
Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu tính chất của Biocellulose nhƣ độ
cứng, độ dính, độ dai và ảnh hƣởng của dung dịch đƣờng, muối... lên tính chất
của Biocellulose [20]. Các mảnh Biocellulose có độ cứng là 3,68 kg/cm2. Độ
cứng của các miếng Biocellulose giảm khi chúng đƣợc nhúng vào dung dịch
đƣờng và độ cứng tăng lên khi đƣợc nhúng bằng dung dịch muối. Sản phẩm
của cellulose vi khuẩn có một số tính chất sau:
Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
Khả năng giữ nƣớc và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp.
Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của
cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.
Kiểm soát đƣợc kích thƣớc, cấu trúc và chất lƣợng của cellulose (kiểm
soát đƣợc cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose.
Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng hợp mà
không gắn lygnin, có thể dễ dàng phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì
vậy, cellulose vi khuẩn đƣợc xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ƣu thế trong
tƣơng lai [8], [12].
1.4.3. Cơ chế tổng hợp
Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bƣớc
đƣợc điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa
nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [15], [17].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 ennzyme tham gia
xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter: Glucokinase,
Phosphoglucomutase, Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (UDPG
pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó UGP là
enzyme có vai trò quan trọng nhất.

9

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter
1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay
1.5.1. Trên thế giới
Vi khuẩn G. xylinus và màng Biocellulose đã thu hút đƣợc sự chú ý của
nhiều nhà khoa học trên thế giới và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
Trong công nghệ thực phẩm, sử dụng chủng G. xylinus tạo màng Biocellulose
dày để sản xuất thạch dừa, màng Biocellulose để bảo quản thực phẩm. Trong
công nghiệp giấy, màng Biocellulose đƣợc dùng để sản xuất giấy chất lƣợng
cao, dùng để làm màng lọc nƣớc trong công nghệ môi trƣờng, làm chất mang
đặc biệt cho các pin và tế bào năng lƣợng. Trong lĩnh vực mỹ phẩm, màng
Biocellulose đƣợc dùng làm mặt nạ dƣỡng da. Trong lịnh vực y học, màng
Biocellulose bƣớc đầu đƣợc nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay
thế tạm thời, mạch máu nhân tạo… Các nghiên cứu hiện nay về màng
Biocellulose trên thế giới đã tập trung vào vấn đề sản xuất và ứng dụng các
sản phẩm từ màng Biocellulose vào các lĩnh vực khác nhau.
10


1.5.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về G. xylinus và màng
Biocellulose ngày càng đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các
nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng G. xylinus sự hình thành màng
Biocellulose và ứng dụng màng Biocellulose. Các công trình nghiên cứu mới
chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng. Về ứng
dụng thực tiễn, mới chỉ đƣợc ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng
trong trị bỏng, và đƣợc ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [6], [8], [13], [17].
Hiện nay, chƣa có một nghiên cứu nào đi sâu vào tìm ra một công thức môi
trƣờng tối ƣu hóa cho quá trình tạo màng của vi khuẩn G. xylinus trong môi
trƣờng dịch dƣa chuột Cucumis sativus.
1.6. Dƣa chuột Cucumis sativus

1.6.1. Lịch sử và phân loại

Hình 1.3. Dưa chuột Cucumis sativus
Tên tiếng anh: Cucumber
Tên khoa học: Cucumis sativus
Danh pháp hai phần: Cucumis sativus
Họ bầu bí: Cucurbitaceae
Bộ: Cucurbitales
11


Dƣa leo (dƣa chuột) là một loại cây trồng phổ biến ở nhiều nƣớc. Là loại
rau ăn quả thƣơng mại quan trọng. Dƣa chuột thuộc họ bầu bí, thân dây leo và
đƣợc sử dụng trong bữa ăn của các gia đình nhƣ một loại rau ăn mát và giòn.
Dƣa chuột có nguồn gốc từ Nam Á, hiện tại đã phát triển trên hầu hết các
châu lục: Trung Quốc, Nga, Nhật Bản, Mỹ, Hà Lan, Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Ai
Cập và Tây Ban Nha... Có nhiều giống dƣa chuột khác nhau đƣợc giao dịch
trên toàn cầu.
1.6.2. Thành phần dinh dưỡng
Giá trị dinh dƣỡng trong 100g dƣa leo: Đạm 0,6g, chất béo 0,1g, năng
lƣợng 10kcal, 95g nƣớc, đƣờng 1,2g, 0,8g protit, 3g glucit, 0,7g xenlulo,
tƣơng đƣơng với nhiều loại rau tƣơi khác nhƣ cải sen, cải cúc, cải xoong, cải
thìa…Ngoài ra trong dƣa leo còn có nhiều loại vitamin và muối khoáng cần
thiết cho cơ thể nhƣ caroten 0,3 mg trong 100g, vitamin B1 0,03 mg, vitamin
B2 0,04mg, vitamin PP 0,1 mg, can xi 23 mg, photpho 27 mg, sắt 1 mg, kali
(150mg/100g),

phốt

pho

(23mg/100g),

canxi

(19mg/100g),

natri

(13mg/100g), sắt (1mg/100g), vitamin B, C, tiền vitamin A (có trong vỏ
dƣa), vitamin E (có trong vỏ dƣa)…Là một trong những loại rau rất ít calo,
100g dƣa leo chỉ cung cấp 15 calo. Dƣa chuột không chứa chất béo no hoặc
cholesterol. Vỏ dƣa chuột là nguồn chất xơ tốt giúp giảm béo, giảm táo bón
và có tác dụng bảo vệ chống ung thƣ đại tràng nhờ loại bỏ những hợp chất
độc trong ruột.
Nƣớc chiếm đến 90% thành phần trong một trái dƣa leo. Bên cạnh đó,
các vitamin và khoáng tố trong dƣa leo cũng mang lại những lợi ích sức khỏe
mà không phải bất cứ loại củ quả hay trái cây nào cũng có.
1.6.3. Ứng dụng
Dƣa chuột có thể chế biến ra rất nhiều món ăn hấp dẫn khác nhau nhƣ:
Dƣa leo muối, kim chi dƣa leo, dƣa leo chua ngọt, dƣa leo bóp xổi, nộm dƣa
12


leo, thịt xào dƣa leo, canh dƣa leo, salad dƣa leo...Do đó, thƣờng xuyên ăn
dƣa chuột có thể giảm béo. Trong quả dƣa chuột tƣơi còn chứa một số loại
men (enzym) hoạt tính sinh lý cao, có tác dụng xúc tiến quá trình trao đổi
chất. Ngoài ra nƣớc ép dƣa chuột có tác dụng da ẩm nhuận, làm cho các nếp
nhăn nhỏ giãn rộng ra và làm các vết đen trên mặt mờ dần, nên dƣa chuột còn
đƣợc sử dụng để chế ra một số mỹ phẩm.

Nhƣ chúng ta đã biết, trong nghệ có chất curcumin là chất chống oxy hóa
cực mạnh, mạnh gấp 8 lần vitamin E thì trong dƣa leo cũng có vitamin E.
Vitamin này chính là chất chống oxy hóa, dù không mạnh bằng curcumin
trong nghệ thì nó cũng có tác dụng tốt trong việc loại bỏ gốc tự do (nguyên
nhân gây ra lão hóa). Bốn chất chống oxy hóa rõ nhất là beta-caroten, vitamin
E, C và selen đƣợc chứng minh chắc chắn có tác dụng khử gốc tự do bằng
thực nghiệm trên ngƣời. Trong dƣa leo ngoài vitamin E còn có beta – caroten,
một chất chống oxy hóa mạnh. Nhƣ vậy dƣa leo là một loại rau củ rất tốt cho
các bạn sử dụng để làm đẹp. Làm mặt nạ dƣa leo, chăm sóc da mặt bằng mặt
nạ dƣa leo có 5 loại: dƣa leo với mật ong, dƣa leo với sữa chua, dƣa leo với
sữa tƣơi, dƣa leo với chanh và dƣa leo – lòng trắng trứng.

13


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose phân lập từ
môi trƣờng dịch dƣa chuột Cucumis sativus.
Nguồn vi sinh vật nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh- KTNN, Trƣờng
Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc khoa Sinh – KTNN,
trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
* Thiết bị nghiên cứu
- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)
- Nồi hấp Tommy (Nhật)
- Box vô trùng (Haraeus)
- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

- Máy li tâm Sorvall (Mỹ)
- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml
- Cân (Precisa XT 320M - Thụy Sĩ)
- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)
- Tủ lạnh Daewoo tủ lạnh sau, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que
trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
* Hóa chất
- Nguồn cacbon: Glucose, fluctose, maltose, acid lactic...
- Nguồn nitơ: Nấm men, pepton, (NH4)2SO4, dd NH3..
- Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4...
- Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol...
14


- H2SO4, CaCO3, thạch Agar.
2.1.3. Các loại môi trường
2.1.3.1. Môi trường giữ giống (MT1)
Glucose: 20 (g)
Pepton: 5 (g)
MgSO4.7H2O: 2(g)

(NH4)2SO4 : 3 (g)
Thạch agar: 20 (g)
KH2PO4:

2 (g)

Nƣớc máy : 1000 ml
2.1.3.2. Môi trường nhân giống (MT2)
Glucose: 20 (g)

(NH4)2SO4: 3 (g)

KH2PO4: 2 (g)

MgSO4.7H2O: 2 (g)

pH: 5,0 - 6,0

Acid acetic : 2 %

Nƣớc dừa: 1000 ml
2.1.3.3. Môi trường lên men (MT3)
Glucose: 20 (g)

(NH4)2SO4: 3 (g)

KH2PO4: 2 (g)

MgSO4.7H2O: 2 (g)

pH: 5,0 - 6,0

Acid acetic : 2%

Dịch dƣa chuột Cucumis sativus: 1000 ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phân lập tuyển chọn chủng G. xylinus theo phương pháp truyền thống
(Phương pháp Vinogradski và Beijerinck)

Nguồn vật liệu: từ dịch dƣa chuột Cucumis sativus cho lên men tự
nhiên từ 10 đến 12 ngày tạo thành một lớp màng trắng, mỏng trên bề mặt dịch
nuôi cấy.
Từ các màng thu đƣợc, dùng đũa thuỷ tinh vô trùng vớt màng, lấy một
lƣợng nhỏ màng, rửa qua bằng nƣớc cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa
nƣớc cất thanh trùng, vontex đều, thu đƣợc ống nghiệm chứa mẫu màng gốc.
15


Chuẩn bị 10 ống nghiệm có đậy nút bông, sấy vô trùng, cho vào mỗi
ống nghiệm 9 ml nƣớc cất, đậy nút bông, hấp thanh trùng trong nồi hấp giữ ở
1210C, 1atm trong thời gian 15 phút. Chuyển vào bốc cấy vô trùng, dùng
pipet vô trùng hút 1 ml dịch từ ống nghiệm chứa mẫu màng gốc cho vào ống
nghiệm thứ nhất, đậy nút bông, vontex trong 5 phút, thu đƣợc ống nghiệm
chứa dịch pha loãng mức 10-1. Tiếp tục hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng
10-1 cho vào ống nghiệm thứ hai, thu đƣợc dịch pha loãng ở mức 10-2. Tiếp
tục pha loãng ở các độ pha loãng 10-3; 10-4…;10-7. Căn cứ vào số lƣợng vi
khuẩn có ở trong mẫu, chúng tôi chọn các mẫu ở độ pha loãng 10-4 - 10-7 để
tiến hành các bƣớc tiếp theo.
Phƣơng pháp phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa: chuẩn bị môi trƣờng
1 đã hấp khử trùng, đổ môi trƣờng thạch đĩa. Dùng pipet vô trùng hút 100ml
dịch màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10-4 - 10-7) nhỏ vào các
hộp lồng đã chứa môi trƣờng thạch, dùng que trang thủy tinh trang đều trên
khắp bề mặt thạch. Đặt ngƣợc các hộp lồng, bao gói cẩn thận, để trong tủ ấm
300C, sau 3 – 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thƣớc, màu sắc,
độ trơn bóng, viền mép khuẩn lạc, vòng phân giải CaCO3).
Chuẩn bị môi trƣờng thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), tách các
khuẩn lạc riêng rẽ từ hộp lồng, cấy chuyển vào các ống nghiệm chứa môi
trƣờng thạch nghiêng đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C. Sau 3 – 4 ngày,
quan sát, làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phƣơng pháp nhuộm gram [16].

2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào
trên tiêu bản nhuộm kép
Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam
kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào
bằng phƣơng pháp nhuộm Gram [16]:

16