Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC DICLOFENAC CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận này, tôi

nhận ƣợc sự hƣớng dẫn

nhiệt tình và chu áo về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè. Đặc biệt là sự giúp
ỡ tận tình của TS. Nguy n Th

ch Ngọc, các thầy cô của viện Nghiên cứu

khoa học và Ứng dụng Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. Qua ây tôi cũng
xin gửi lời cảm ơn tới phòng Đào tạo Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, các thầy cô
giáo trong khoa Sinh -KTNN

tạo mọi iều kiện giúp ỡ tôi hoàn thành

khóa luận.
Tôi xin cảm ơn gia ình và bạn bè

ộng viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá

trình học tập và thực hiện khóa luận này.
Lần ầu tiên nghiên cứu khoa học, hơn nữa thời gian còn hạn chế, nên tôi
không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi r t mong nhận ƣợc sự góp
của qu thầy cô và các bạn sinh viên

qu báu

khóa luận của tôi hoàn ch nh hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 23 tháng 4 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Hà


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam oan những gì viết trong khóa luận “Nghiên cứu khả
năng hấp thụ thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trƣờng nƣớc dừa già” là công trình nghiên cứu của tôi và hoàn thành

trên cơ sở kế thừa và phát huy những công trình nghiên cứu có liên quan của
các tác giả khác, dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguy n Th

ch Ngọc. T t cả

những số liệu ều ƣợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử l thống kê, hoàn
toàn không có số liệu sao chép và không trùng lặp với b t cứ tài liệu nào.
Trong ề tài của tôi có tr ch dẫn một số dữ liệu của một số tác giả. Tôi xin
phép tác giả ƣợc tr ch dẫn

bổ sung cho khóa luận của mình. Nếu sai tôi

xin hoàn toàn ch u trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 23 tháng 4 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Hà


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1

A. xylinum

Acetobacter xylinum

2

CVK

Cellulose vi khuẩn

3

ĐHSP

Đại học Sƣ phạm

4

OD

Mật ộ quang phổ

5

cs

cộng sự


MỤC LỤC
Mở ầu .............................................................................................................. 1
1. L do chọn ề tài ........................................................................................... 1
2. Mục

ch nghiên cứu ..................................................................................... 2

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và nghĩa thực ti n.......................................................... 3

Nội dung ............................................................................................................ 4
Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu............................................................................ 4
1.1. Đặc i m của Acetobacter xylinum............................................................ 4
1.1.1. Phân loại .................................................................................................. 4
1.1.2. Đặc i m hình thái .................................................................................. 4
1.1.3. Đặc i m sinh l và sinh hóa .................................................................. 4
1.2. C u trúc ặc t nh của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum ............... 5
1.2.1. C u trúc ................................................................................................... 5
1.2.2. Đặc t nh của màng CVK ......................................................................... 6
1.2.3. T nh ch t ộc áo của màng CVK .......................................................... 6
1.2.4. Các phƣơng pháp sản xu t CVK từ A. xylinum ...................................... 7
1.2.5. Ứng dụng của màng CVK ....................................................................... 8
1.3. Tổng quan về Diclofenac ........................................................................... 9
1.3.1. Công thức ................................................................................................ 9
1.3.2. Dạng thuốc và hàm lƣợng ..................................................................... 10
1.3.3. Tác dụng ................................................................................................ 10
1.3.4. Ch

nh ................................................................................................. 11

1.3.5. Chống ch

nh ...................................................................................... 11

1.3.6. Tác dụng phụ ......................................................................................... 12
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .............................................. 12
1.4.1. Tình hình nghiên cứu về màng CVK .................................................... 12


1.4.1.1.Tình hình nghiên cứu về màng CVK trong nƣớc ............................... 12

1.4.1.2. Tình hình nghiên cứu về màng CVK trên thế giới ............................ 13
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 14
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 14
2.1.2 Thiết b

ƣợc sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 14

2.2. Môi trƣờng nghiên cứu............................................................................. 15
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 16
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 17
2.3.1. Tạo màng CVK lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già .......................... 17
2.3.2

Xử l màng CVK trƣớc khi h p thụ thuốc ......................................... 17

2.3.3. Đánh giá ộ tinh khiết của màng CVK ................................................. 18
2.3.4. Phƣơng pháp xây dựng ƣờng chuẩn của thuốc Diclofenac trong dung
d ch metanol .................................................................................................... 19
2.3.5. Phƣơng pháp xác

nh lƣợng thuốc ƣợc h p thụ qua màng CVK ...... 20

2.3.6. Phƣơng pháp xử l thống kê ................................................................. 21
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 23
3.1. Tạo màng CVK từ môi trƣờng nƣớc dừa già ........................................... 23
3.2. Thu màng CVK từ môi trƣờng nƣớc dừa già........................................... 23
3.3. Quá trình xử l màng CVK trƣớc khi h p thụ thuốc ............................... 24
3.5. Khả năng h p thụ thuốc Diclofenac trên các màng CVK khác nhau ...... 26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 32
1. Kết luận ....................................................................................................... 32

2. Kiến ngh ..................................................................................................... 32
Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 33


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các ứng dụng của CVK .................................................................... 9
Bảng 2.1. Thành phần của nƣớc dừa già ......................................................... 15
ảng 2.2 Môi trƣờng lên men tạo màng CVK ................................................ 17
Bảng 2.3. Giá tr mật ộ quang (OD) của dung d ch Diclofenac ở các nồng ộ
(mg/ml) khác nhau (n = 3) .............................................................................. 19
Bảng 3.1. Giá tr OD h p thụ thuốc của màng CVK (n = 3) .......................... 28
(OD - 278 nm) ................................................................................................. 28
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc h p thụ vào màng CVK với ộ dày khác nhau tại thời
i m 2 giờ ........................................................................................................ 29


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2. Công thức c u tạo của thuốc Diclofenac ........................................ 10
Hình 2.1. Phƣơng trình ƣờng chuẩn của Diclofenac .................................... 20
Hình 3.1. Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già ........... 23
Hình 3.2: Màng CVK thu ƣợc có ộ dày 1cm và 0,5cm .............................. 24
Hình 3.3 Màng CVK sau khi ngâm NAOH .................................................... 25
Hình 3.4 Màng CVK tinh chế ......................................................................... 25
Hình 3.5 Màng CVK tinh khiết loại d 1,5 - 1 cm ........................................... 26
Hình 3.6. Chuẩn b h p thụ thuốc Diclofenac ................................................. 26
Hình 3.7: Màng CVK ang h p thụ thuốc ...................................................... 27
Hình 3.8: Chuẩn b d ch o quang phổ ........................................................... 27
Hình 3.9. T lệ thuốc h p thụ vào các màng có ộ dày khác nhau ................. 30
Hình 3.10. T lệ thuốc h p thụ trong cùng ộ dày màng ................................ 30

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Diclofenac là thuốc chống viêm không steroid. Thuốc có tác dụng chống
viêm, giảm au và hạ sốt mạnh, do nó ức chế mạnh hoạt t nh của cyclogenase.
Do

ó, làm giảm

áng k

sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và

thromboxan là những ch t trung gian của quá trình viêm. Ngoài ra,
Diclofenac cũng iều hòa con ƣờng lipoxygenase và sự kết tụ ti u cầu.
Giống nhƣ các thuốc chống viêm không steroid khác, diclofenac gây hại
ƣờng tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn ến ức chế tạo mucin
(ch t có tác dụng bảo vệ ƣờng tiêu hóa). Prostaglandin có vai trò duy trì tƣới
máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin
nên có th gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hƣ
ặc biệt ở những ngƣời b bệnh thận hoặc suy tim mạn t nh. Với những ngƣời
bệnh này, các thuốc chống viêm không steroid có th làm tăng suy thận c p
và suy tim c p.
Trong tự nhiên có một số vi khuẩn có khả năng sinh ra màng cellulose.
Khi nuôi c y những vi khuẩn này trong môi trƣờng có chứa glucose, glycerol
hoặc một số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng hình thành
trên bề mặt một số lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và ƣợc gọi là
màng sinh học bacterial cellulose (viết tắt là CVK).
Màng CVK là sản phẩm của một loài vi khuẩn, ặc biệt là chủng

Acetobacter xylinum. Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tƣơng tự nhau
về mặt hóa học, cellulose vi khuẩn bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhƣng
mức ộ polymer hóa khác nhau. CVK có ộ tinh sạch cao so với các loại
cellulose khác, không chứa các hợp ch t cao phân tử nhƣ ligin, hemicellulose.
Do vậy, chúng có những ặc t nh vƣợt trội và dẻo dai, bền chắc. Trên thế giới,
Cellulose vi khuẩn ngày càng ƣợc quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng

1


dụng rộng r i trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ
phẩm, khoa học vật liệu, xử l nƣớc thải, bảo vệ môi trƣờng... Đặc biệt trong
lĩnh vực y học, màng CVK

ƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da

trong quá trình iều tr bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo iếu tr các
bệnh tim mạch; làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Ở Việt Nam, việc
nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức ộ khiêm tốn, các nghiên cứu
ứng dụng mới ch dừng lại ở bƣớc ầu nghiên cứu.
Kết quả cho th y màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm
lại, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc và khắc phục ƣợc nhƣợc i m của
thuốc ở dạng thông thƣờng.
Từ các nghiên cứu về màng CVK và một số hạn chế của diclofenac
trong quá trình iều tr . Với mục

ch làm tăng khả năng h p thụ thuốc dựa

trên màng CVK giúp diclofenac có th khắc phục t nh khả dụng sinh học, xét
th y ây là hƣớng nghiên cứu mới và tri n vọng. Đó là l do tôi

chọn ề

tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng cellulose vi
khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”.
2. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế hệ thống màng CVK ƣợc lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa
già.
Nghiên cứu khả năng h p thụ thuốc diclofenac của màng CVK lên men
từ môi trƣờng nƣớc dừa già.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: khả năng h p thụ thuốc diclofenac của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già.
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu trong phòng th nghiệm

2


Đ a i m nghiên cứu: Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng Trƣờng
Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Phòng th nghiệm Sinh l ngƣời và ộng vật khoa
Sinh-KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.
 Ý nghĩa khoa học:
Tăng thêm hi u biết về ứng dụng của màng CVK, trên cơ sở ó ứng
dụng màng CVK

thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc nhằm hạn

chế ƣợc các tác dụng phụ của thuốc diclofenac. Đồng thời sẽ mở ra một
hƣớng nghiên cứu mới không ch dừng lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc

này mà còn có th ứng dụng trên nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho
ngành y học ngày một phát tri n hơn.
ên cạnh ó ta cũng có th tìm ra ƣợc những ƣu, nhƣợc i m của
màng CVK lên men từ một số môi trƣờng

từ ó có những hƣớng nghiên

cứu làm tăng các ặc t nh cuả màng CVK, hạn chế các yếu i m của màng
ứng dụng màng trên các lĩnh vực khác nhau.
 Ý nghĩa thực tiễn:
Xây dựng ƣợc quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum
lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già.
Từ màng CVK

ƣợc tạo ra ở môi trƣờng nƣớc dừa già

nghiên cứu

khả năng h p thụ của thuốc diclofenac và làm giảm tác dụng phụ có hại của
thuốc.
Từ kết quả nghiên cứu ƣợc có th áp dụng vào thực ti n.

3


Nội dung
Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Đặc điểm của Acetobacter xylinum
1.1.1. Phân loại
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ

Pseudomonadaceae, là loại hiếu kh bắt buộc, có chu mao và sản xu t
cellulose ngoại bào [4].
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
1.1.2. Đặc điểm hình thái
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, k ch thƣớc ngang
khoảng 0,6 - 0,8µm, dài khoảng 2 - 3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di ộng, xếp riêng rẽ ôi khi xếp thành chuỗi, nhƣng khi tế bào già
hay do iều kiện môi trƣờng nuôi c y hình dạng có th b biến ổi, tế bào dài
hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [4].
1.1.3. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
A. xylinum thƣờng sống chung với n m chè trong một loại nƣớc giải
khát dân gian làm từ chè lo ng gọi là “Thủy hoài sâm”, ngƣời Trung Quốc gọi
là “Hải bảo” hay “V bảo”, ngƣời Nga gọi là “N m chè”, ngƣời Pháp gọi là
“Champignon De Longue Vie – n m trƣờng sinh”, ngƣời Nhật gọi chúng là
“Kombucha” [5].
A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu kh . Nhiệt ộ tố ƣu cho vi khuẩn phát
tri n là từ 25 - 30ºC. Ở nhiệt ộ 37ºC tế bào sẽ b suy thoái hoàn toàn. Nhiệt
ộ th ch hợp là 25ºC. Vi khuẩn tăng trƣởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối

4


ƣu

sản xu t cellulose là 5,5 [4]. Trên môi trƣờng rắn sau khoảng 3 - 7 ngày

nuôi c y, khuẩn lạc A. xylinum có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong
nhƣng sau 1 tuần thì khuẩn lạc to, ục, màu cà phê sữa, khô dần. Trong môi
trƣờng nuôi c y lỏng, vi khuẩn sử dụng ƣờng

chuy n hóa thành cellulose

tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trƣờng. Sau 36 - 48h lớp màng dày,
trong và ạt ộ dày nh t

nh sau 7 - 10 ngày.

Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng
catalase dƣơng t nh, không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer, không tạo sắc
tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose, chuy n hóa glucose thành acid acetic,
chuy n hóa glycerol thành dihydroxyaceton.
1.2. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum
1.2.1. Cấu trúc
Cellulose vi khuẩn (CVK) c u tạo bởi những chuỗi polymer β - 1,4glucopyranose không phân nhánh. Các nghiên cứu

cho th y c u trúc hóa

học cơ bản của CVK giống cellulose của thực vật (plant cellulose - PC), tuy
nhiên chúng khác nhau về c u trúc ại th [13].
Theo AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản ch t là
hemicellulose, ƣờng k nh 1,5nm, kết hợp với nhau. Những sợi này kết hợp
với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành d y, mỗi d y dài khoảng 100nm, rộng
khoảng 3 - 8nm.
Đặc t nh c u trúc của CVK phụ thuộc r t nhiều vào iều kiện nuôi c y.
Khi nuôi c y theo phƣơng pháp tĩnh (S - CVK: Static - Cellulose vi
khuẩn), A. xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày trên bề

mặt môi trƣờng. Màng CVK thu ƣợc dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi
ngả màu vàng.
Khi nuôi c y ộng (A - CVK: Agitated - Cellulose vi khuẩn), một lƣợng
nhỏ cellulose hình thành dƣới dạng huyền phù phân tán trong ó chuỗi β-1,4-

5


glucan xếp một cách ngẫu nhiên. CVK ƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp nuôi
c y ộng dƣới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự do sự
dao ộng của môi trƣờng nuôi c y. Lƣợng CVK ƣợc sinh ra giữa hai phƣơng
pháp nuôi c y ộng và tĩnh cũng khác nhau: khối lƣợng màng khô của
phƣơng pháp nuôi c y ộng nhỏ hơn so với nuôi c y tĩnh [7], [13].
1.2.2. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi c y tĩnh, CVK t ch lũy trên bề mặt môi trƣờng dinh dƣỡng
lỏng thành lớp màng mỏng nhƣ da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tƣơng tự nhƣ gi y da với ộ dày 0,01 - 0,5mm. Màng CVK sản xu t bởi
các chủng A. xylinum có ộ tinh sạch cao so với màng PC nhƣ hemicellulose,
pectin và lignin (Kurosumi et al. 2009) [15]. Sản phẩm này có những t nh ch t
ặc biệt nhƣ: ộ tinh sạch cao, có khả năng àn hồi tốt, ộ kết tinh và ộ bền
cơ học cao, có th b phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ bình
thƣờng, không ộc và không gây d ứng, có khả năng ch u nhiệt tốt (khoảng
100ºC không gây ảnh hƣởng lớn ến t nh ch t của CVK nhƣng nhiệt ộ th p
có 8 th làm tăng t nh mềm dẻo của nó) ặc biệt là có khả năng cản khuẩn.
Với ặc t nh này, CVK

ƣợc ứng dụng làm màng lọc vô khuẩn. Ngoài ra,

CVK còn có khả năng giữ nƣớc tốt hơn nhiều so với cellulose thực vật...
1.2.3. Tính chất độc đáo của màng CVK

Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nh t ƣợc tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do ó CVK có th b vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có ộ bền dai cao, ch u lực kéo cao,
trọng lƣợng nhẹ, ộ bền áng k .
Khả năng hút nƣớc cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nƣớc áng
k , lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nƣớc r t lớn, nó có th hút
khoảng 200 lần trọng lƣợng của nó.

6


Màng CVK ƣợc hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp vì
vậy việc sản xu t gi y, sợi không cần qua các bƣớc trung gian.
Màng CVK ƣợc

nh hƣớng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng

hình thành các sợi biến ộng, tạo các bền theo một trục. Theo

rown và

White (1989) có th hình thành một gang tay cellulose không cần khâu bằng
cách sử dụng một khối

t xốp mà không kh th m qua ƣợc và dìm xuống

không kh bên trong môi trƣờng lỏng nuôi c y A. xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ
tập hợp xung quanh

t xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong

muốn.
Màng CVK ƣợc biến ổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: khi thêm
ch t phụ gia hay cơ ch t nh t

nh vào trong quá trình tổng hợp CVK thì có

th làm thay ổi những thuộc t nh của CVK. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi
trƣờng nuôi c y có th ki m soát các t nh ch t vật l của cellulose trong quá
trình tổng hợp.
Tổng hợp trực tiếp các dẫn xu t của cellulose nhờ vào sự tác ộng gen
liên quan ến quá trình tổng hợp cellulose từ ó giúp ki m soát hình dạng
cellulose, ki m soát trọng lƣợng phân tử cellulose.
1.2.4. Các phƣơng pháp sản xuất CVK từ A. xylinum
* Lên men tĩnh
Môi trƣờng dinh dƣỡng

lên men A. xylinum ƣợc cho vào các khay

lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay ƣợc ậy
bằng gi y báo có ộ xốp, giúp tạo ộ thông kh giữa môi trƣờng lên men và
môi trƣờng bên ngoài nhƣng vẫn tránh ƣợc khả năng nhi m khuẩn. Nhiệt ộ
th ch hợp cho quá trình lên men là 28 – 30ºC. Sợi cellulose mới ƣợc tổng
hợp sẽ di chuy n lên bền mặt của môi trƣờng nuôi c y tạo thành lớp màng
cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trƣờng lỏng và không kh . Cellulose

7

tiếp tục ƣợc tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7 - 10 ngày có
th thu CVK [9].
* Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thƣờng ƣợc nuôi c y trong môi trƣờng nuôi c y
lắc. C y d ch huyền phù vi khuẩn

ƣợc hoạt hóa vào môi trƣờng nuôi c y

chuẩn b sẵn trong các bình tam giác erlen rồi em i lắc trong các máy lắc
ổn nhiệt ở 28 – 30ºC, 180 – 200 vòng/phút [10]. CVK ƣợc tạo ra từ môi
trƣờng lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán r t tốt
trong môi trƣờng. Lƣợng

hòa tan trong môi trƣờng ảnh hƣởng lớn ến sự

sinh trƣởng và khả năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do ó, quá
trình lên men ạt hiệu quả cao, các receptor có sục kh thƣờng xuyên ƣợc sử
dụng lên men.
1.2.5. Ứng dụng của màng CVK
Trên thế giới màng CVK ƣợc dùng trong ngành dƣợc phẩm và mỹ
phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs, Cienchanska, Legeza và cs, Wan và 11
Million, Czaja và cs sử dụng màng CVK ắp lên các vết thƣơng hở, vết bỏng
thu ƣợc kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada)

ƣợc ăng k bản

quyền về làm màng CVK từ A. xylinum dùng tr bỏng. Các tác giả Jonas và
Farad, Czaja và cs

dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dƣỡng da

cho phụ nữ. ên cạnh ó, CVK còn ƣợc ứng dụng trong r t nhiều lĩnh vực
khác nhau nhƣ: trong công nghiệp gi y màu CVK ƣợc dùng
iện tử ch t lƣợng cao, trong công nghiệp môi trƣờng
làm màng phân tách

sản xu t gi y

sử dụng màng CVK

xử l nƣớc và biến ổi ộ nhớt của nƣớc (Brown,

1989, Jonas và Fonah, 1998), dùng làm ch t màng ặc biệt cho các sợi pin và
tế bào năng lƣợng ( rown, 1989), làm các sợi truyền quang, là môi trƣờng cơ
ch t trong sinh học sử dụng

cố

nh protein.

8


Với những ƣu i m nổi bật, CVK ngày càng ƣợc nghiên cứu nhiều và có
nhiều ứng dụng [2], [3] rộng r i ƣợc th hiện cụ th trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các ứng dụng của CVK
Lĩnh vực ứng dụng
Thực phẩm

Sản phẩm

Tráng miệng (thạch dừa), ăn kiêng (kem, salad) Th t
nhân tạo, vỏ bao xúc x ch Nƣớc uống siro không có
cholesterol

Y dƣợc

Lớp màng tr bỏng, da nhân tạo Hệ thống phân phối
thuốc Phẫu thuật ghép mô, cơ quan

Mĩ phẩm

Móng nhân tạo

Môi trƣờng

H p thu ch t ộc

Dầu mỏ

Miếng xốp là sạch vết dầu tràn, thu hồi dầu

Trang phục

Sản xu t sợi nhân tạo, quần áo, giày dép tự phân hủy
Y phục quân ội

Th thao

Lều lắp ráp

Sản phẩm rừng

Gỗ nhân tạo
Gi y, gi y ặc biệt

lƣu giữ hồ sơ

Thùng hàng có ộ bền cao
Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

1.3. Tổng quan về Diclofenac
- Tên quốc tế: Diclofenac.
- Loại thuốc: Thuốc chống viêm không steroid.
1.3.1. Công thức
Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2
Công thức c u tạo: theo hình 1.2

9


Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac
Tên IUPAC hệ thống: 2-[2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl]acetic acid
1.3.2. Dạng thuốc và hàm lƣợng
Diclofenac ƣợc dùng chủ yếu dƣới dạng muối natri. Muối diethylamoni
và muối hydroxyethylpyrolidin ƣợc dung bôi ngoài. Dạng base và muối kali
cũng có ƣợc dùng làm thuốc uống. Liều lƣợng diclofenac ƣợc t nh theo
diclofenac natri.
Viên nén: 25mg; 50mg; 100mg.

Ống tiêm: 75mg/2ml; 75mg/3ml.
Viên ạn: 25mg; 100mg.
Thuốc nƣớc nhỏ mắt: 0,01%.
Thuốc gel

xoa ngoài 10mg/g.

1.3.3. Tác dụng
ởi là biệt dƣợc thuộc dẫn ch t của acid phenylacetic, nên thuốc
diclofenac có khả năng chống viêm không steroid với tác dụng chống viêm,
giảm au và giảm sốt mạnh.
Thuốc diclofenac ƣợc h p thụ d dàng qua ƣờng tiêu hóa sau khi
uống, ƣợc h p thụ nhanh hơn nếu uống lúc ói.
Nồng ộ thuốc tối a trong huyết tƣơng xu t hiện 2 giờ sau khi uống,
nồng ộ trong d ch bao hoạt d ch ạt mức cao nh t sau khi uống từ 4-6 giờ.

10


Tác dụng của thuốc xu t hiện 20-30 phút sau tiêm bắp, 30-60 phút sau
khi ặt thuốc vào trực tràng, 60-120 phút sau khi uống.
Quá trình h p thụ của thuốc diclofenac cụ th nhƣ sau: Nửa ời trong huyết
tƣơng khoảng 1-2 giờ. Nửa ời thải trừ khỏi d ch bao hoạt d ch 3-6 giờ.
Thuốc diclofenac có ến gần 60% liều dùng ƣợc thải qua thận dƣới dạng các
ch t chuy n hóa còn một phần hoạt t nh và dƣới 1% ở dạng thuốc nguyên
vẹn; phần còn lại thải qua thận và phân.
1.3.4. Chỉ định
Điều tr dài ngày viêm khớp mạn, thoái hóa khớp.
Thống kinh nguyên phát.
Đau c p (viêm sau ch n thƣơng, sƣng nề) và au mạn.

Viêm a khớp dạng th p thiếu niên.
Điều tr

au sau phẫu thuật, au sau ch n thƣơng.

1.3.5. Chống chỉ định
ệnh nhân mẫn cảm với diclofenac, aspirin hay thuốc chống viêm
không steroid khác (hen, viêm mũi, mày ay sau khi dùng aspirin).
Loét dạ dày tiến tri n.
Ngƣời b hen hay co thắt phế quản, chảy máu, bệnh tim mạch, suy thận
nặng hoặc suy gan nặng.
Ngƣời ang dùng thuốc chống ông coumarin.
Ngƣời b suy tim ứ máu, giảm th t ch tuần hoàn do thuốc lợi niệu hay
do suy thận.
Ngƣời b bệnh ch t tạo keo (nguy cơ xu t hiện viêm màng n o vô
khuẩn).
viêm màng n o vô khuẩn ều có trong tiền sử một bệnh tự mi n nào
ó
Ngƣời mang k nh sát tròng.

11


1.3.6. Tác dụng phụ
Thƣờng gặp: buồn nôn, a chảy, táo bón, au thƣợng v -Hiếm gây loét,
xu t huyết, thủng ƣờng tiêu hóa (thƣờng là dung thuốc kéo dài).
Hiếm gây giảm bạch cầu, giảm ti u cầu, thiếu máu, suy tủy- Phát ban
da mày ay, ngứa chàm. Hiếm th y ban ỏ a dạng. Phù Quincke, suy n,
hiếm gặp phản vệ. Nhức ầu, buồn ngủ, chóng mặt, choáng váng, ù tai, hiếm
gây giảm th nh lực, nhìn mờ, song th . Hiếm gây bệnh da mụn nƣớc (StevensJohnson và hội chứng Lyell). Hiếm gây phản ứng nhạy cảm ánh sáng. Suy

thận c p viêm thận kẽ, hiếm b hội chứng thận nhi m mỡ, ái ra máu, protein
niệu tăng transaminase, hiếm gây viêm gan-M t ngủ. Co giật-k ch th ch-Viêm
ại tràng, hạ huyết áp, phù, tăng kali huyết, rụng tóc.
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.4.1. Tình hình nghiên cứu về màng CVK
1.4.1.1.Tình hình nghiên cứu về màng CVK trong nƣớc
CVK là ối tƣợng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong nƣớc òi
hỏi sản xu t CVK với quy mô công nghiệp, tạo CVK với ộ bền chắc hơn,
phát tri n nhanh trong các loại môi trƣờng khác nhau.
Trong y học CVK ƣợc các nhà nghiên cứu ứng dụng trong iều tr
bỏng ở ngƣời nhƣ ề tài của thầy Nguy n Văn Thanh ĐH y dƣợc TP. Hồ Ch
Minh, ...
Năm 2012, Đinh Th Kim Nhung, Nguy n Th Thùy Vân, Trần Nhƣ
Quỳnh [5]

công bố công 12 trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn

Acetobacter xylinum tạo màng

acterial cellulose ứng dụng trong iều tr

bỏng”, kết quả cho th y màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai, ộ bền kéo, ộ th u kh cao, ộ hút nƣớc tốt có tri n vọng
ứng dụng làm màng tr bỏng.
.

12


1.4.1.2. Tình hình nghiên cứu về màng CVK trên thế giới

Trên thế giới

có r t nhiều các nghiên cứu ứng dụng màng CVK

trong nhiều các lĩnh vực khác nhau nhƣ: lĩnh vực thực phẩm (màng bảo quản
trái cây, ch t ổn

nh thực phẩm...) lĩnh vực y học (tạo ruột giả, màng tr

bỏng, mạch máu nhân tạo trong iều tr các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng
da...). Tác giả rown (1989), dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho
quá trình xử l nƣớc, dùng làm ch t mang ặc biệt cho các pin và năng lƣợng
cho tế bào. rown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng nhƣ là một ch t
biến ổi ộ nhớt,

làm ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ ch t

trong sinh học, thực phẩm [3]. Các tác giả Hamlyn và cs (1997), Cienchanska
(2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử
dụng màng CVK ắp lên các vết thƣơng hở, vết bỏng
Đặc biệt tác giả Wan (Canada)

thu ƣợc kết quả tốt.

ƣợc ăng k bản quyền về làm màng CVK

từ A. xylinum dùng tr bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs
(2006)

dùng màng CVK làm da nhân tạo, mặt nạ dƣỡng da cho phụ nữ [3].

13


Chƣơng 2. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Khả năng h p thụ thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên
men từ môi trƣờng nƣớc dừa già.
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
*Giống vi khuẩn:
Giống vi khuẩn A. xylinum dùng lên men thu nhận màng CVK ƣợc cung c p
từ Phòng th nghiệm Vi sinh, khoa Sinh –KTNN, Trƣờng ại học Sƣ phạm Hà
Nội 2.
*Nguyên liệu và hóa chất:
 Nguyên liệu: nƣớc dừa già, nƣớc c t 2 lần, gạc vô trùng.
 Hóa ch t: Sử dụng các hóa ch t ặc biệt và các hóa ch t thông thƣờng có
nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam:
+ Diclofenac.
+ Pepton.
+ Đƣờng glucose.
+ Diamonium hydrogen phosphate
+ Amoni sunfat

.

.

+ NAOH.
+ Nƣớc c t.
+

COOH.

2.1.2 Thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
- Máy o quang phổ UV -2450 (Shimadzu -Nhật ản).
-Cân phân t ch (Sartorius -Đức).
-Cân kĩ thuật TE 412.
-Nồi h p khử trùng HV -110/HIRAIAMA.
- uồng c y vô trùng (Haraeus).

14


-Máy lắc tròn tốc ộ chậm (Orbital Shakergallenkump Anh).
-Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu.
-

rung siêu âm S60/H.

* Dụng cụ:
- ình tam giác có chia vạch, ống nghiệm, cốc ong thủy tinh có chia vạch,
bình thủy tinh 500ml, kẹp gỗ, thƣớc, gi y lọc, gi y bạc, gi y th m, kéo và
nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.2. Môi trƣờng nghiên cứu
Môi trƣờng nuôi c y A. xylinum là môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn
dinh dƣỡng cần thiết nhƣ nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng. Đ tạo iều kiện tốt cho quá trình
sinh trƣởng của vi khuẩn và quá trình lên men tạo màng chúng tôi sử dụng
nƣớc dừa già làm nguyên liệu ch nh cho quá trình lên men.
Nƣớc dừa già là môi trƣờng th ch hợp

nuôi c y vi khuẩn vì trong

nƣớc dừa chứa nhiều ch t dinh dƣỡng và ch t k ch th ch tố tăng trƣởng nhƣ
1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol… Vì vậy, A.
xylinum th ch hợp phát tri n trong môi trƣờng này [4].
Nƣớc dừa sau khi thu hoạch ƣợc sử dụng không quá 3 ngày, tránh
lâu làm cho ƣờng và các ch t dinh dƣỡng khác giảm i dẫn ến cho hiệu su t
kém [4], [7]. Thành phần môi trƣờng của nƣớc dừa già ƣợc trình bày trong
bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần của nƣớc dừa già
Nƣớc (%)

94,99

Kẽm (mg/100g)

0,1

Protein (%)

0,72

Đồng (mg/100g)

0,04

Ch t béo toàn phần

0,2

Mangan (mg/100g)

0,142

3,17

Selenium (µg/100g)

1

(%)
Carbonhydrat (%)

15


Đƣờng (%)

2,16

Vitamin C (mg/100g)

2,4

24

Thiamin (mg/100g)

0,03

0,29

Riboflavin (mg/100g)

0,057

Magie (mg/100g)

25

Niacin (mg/100g)

0,08

Phosphorus

20

Acid Pathenic

0,043

Calcium (mg/100g)
Sắt (mg/100g)

(mg/100g)

(mg/100g)

Kali (mg/100g)

250

Vitamin B₆

0,032

(mg/100g)
Natri (mg/100g)

105

Folate (mg/100g)

3

2.3. Nội dung nghiên cứu
 Nghiên cứu quy trình nuôi c y Acetobacter xylinum với các nguyên liệu có
sẵn.
 Thu sản phẩm CVK từ d ch nuôi c y xử l .
 Chế tạo màng sinh học từ CVK thu ƣợc, ki m tra các ặc t nh l hóa của
màng.
Trong quá trình tạo màng CVK có ộ dày mỏng khác nhau phụ thuộc vào
môi trƣờng và thời gian nuôi c y. Từ màng CVK với ộ dày mỏng khác nhau
ó cho h p thụ thuốc

so sánh khả năng h p thụ thuốc trong iều kiện ộ

dày màng khác nhau và ƣa ra kết luận trong iều kiện màng nhƣ thế nào thì

lƣợng thuốc h p thụ là lớn nh t.
Trong thời gian nuối c y chúng ta cũng có th tạo ra màng với k ch thƣớc
to nhỏ khác nhau, trong iều kiện k ch thƣớc khác nhau nhƣ vậy cùng cho h p
thụ thuốc

so sánh khả năng h p thụ thuốc của chúng có khác nhau không.

Nhằm chọn ra k ch thƣớc màng phù hợp nh t.
 Thử nghiệm tác dụng của màng trong quá trình phân phối thuốc.
Đầu tiên cho màng CVK h p thụ thuốc ở iều kiện thƣờng (trong khoảng thời
gian khác nhau 0,5h, 1h, 1,5h và 2h) l y ra o lƣợng h p thụ và em so sánh

16


với iều kiện h p thụ khác nhƣ em màng CVK i ép 50% nƣớc nhƣ vậy cho
h p thụ thuốc và l y ra o lƣợng h p thụ cùng thời gian tƣơng ứng với màng
CVK cho h p thụ thuốc ở iều kiện thƣờng, em so sánh chúng với nhau
nhằm tìm ra môi trƣờng, thời gian tốt nh t giúp CVK h p thụ lƣợng thuốc tối
a.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Tạo màng CVK lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già
A. xylinum ƣợc nuôi c y trong môi trƣờng cải biến từ môi trƣờng chuẩn
Hestrin- Schamm bằng cách thay cao n m men bằng nƣớc dừa già ƣợc trình
bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2 Môi trƣờng lên men tạo màng CVK
Thành phần

Khối lƣợng

Glucose

20 gam

(NH4)2PO4

0,3 gam

(NH4)2SO4

0,5 gam

Pepton

10 gam

Nƣớc dừa già

1000ml

Acid axetic

2%

D ch giống A. xylinum

10%

Pha môi trƣờng với t lệ nhƣ bảng 2.1, h p khử trùng ở 113oC trong 15 phút
sau ó môi trƣờng ƣợc khử trùng bằng tia UV trong 30 phút

nguội môi

trƣờng. Bổ sung 10% d ch giống và 2% acid axetic Cuối cùng ủ tĩnh trong 614 ngày ở 26o C thu ƣợc sản phẩm màng CVK thô.
2.3.2 Xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ thuốc
Mục

ch: Loại bỏ ƣợc các tạp ch t trong môi trƣờng nuôi c y, ồng

thời phá hủy và trung hòa ộc tố của vi khuẩn.

17