Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
SINH
KTNN HÀ NỘI 2
TRƯỜNGKHOA
ĐẠI HỌC
SƯ– PHẠM
KHOA SINH – KTNN
--------------------

NGÔ DIỆU LINH
NGÔ DIỆU LINH

NGHIÊN
CỨU
NĂNGHẤP
HẤP
THỤ
NGHIÊN
CỨUKHẢ
KHẢ NĂNG
THỤ
THUỐC
DICLOFENAC
CỦACELLULOSE
MÀNG
THUỐC
DICLOFENAC
CỦA MÀNG
CELLULOSE
VI KHUẨN
LÊN

MEN TỪ
VI KHUẨN LÊN
MEN TỪ MÔI
TRƯỜNG
MÔI TRƯỜNG
NƯỚC
NƯỚC VO
GẠOVO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Người hướng dẫn khoa học
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

TS. NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

HÀ NỘI - 2018
HÀ NỘI, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

NGÔ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC DICLOFENAC CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ
MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học

TS. NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN

Trong thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với sự
hỗ trợ của người khác. Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp của mình, do
bước đầu còn nhiều bỡ ngỡ nên em đã gặp không ít những khó khăn. Tuy nhiên
dưới sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô hướng dẫn nên em đã hoàn thành tốt
khóa luận tốt nghiệp của mình.
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường ĐHSP
Hà Nội 2; các thầy, cô trong khoa Sinh-KTNN; các thầy, cô ở Viện NCKH &
ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn thành tốt
khóa luận tốt nghiệp của mình.
Đặc biệt, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc
là người đã theo sát và hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của
mình.
Do là lần đầu tiên đi vào làm nghiên cứu khoa học, về mặt kiến thức
của em còn nhiều hạn chế. Do vậy, sự thiếu sót là điều không thể tránh khỏi, vì
vậy em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để
đề tài khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn nữa. Em xin chân thành
cảm ơn quý thầy cô.
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Ngô Diệu Linh


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc. Những số liệu kết quả
trong khóa luận này là trung thực, không có sự trùng lặp hoặc sao chép của một
đề tài khác. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, Ngày 18 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Ngô Diệu Linh


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A. xylinum:

Acetobacter xylynum

CVk:

Bacterial cellulose

CMN:

Cao nấm men

ĐHSP:

Đại học sư phạm

KTNN:

Kỹ thuật nông nghiệp

PBS:

Phosphate buffered saline

NCKH&ƯD:

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

Nxb:

Nhà xuất bản

mht:

Khối lượng thuốc hấp thụ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................... 3
3. Phạm vi nghiên cứu...................................................................................................... 3

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .................................................................... 3
5. Kết quả nghiên cứu ..................................................................................................... 4
NỘI DUNG ......................................................................................................................... 5
Chương 1. Tổng quan tài liệu......................................................................................... 5
1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu....................................................... 5
1.1 Tổng quan về CVK .................................................................................................... 5
1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum......................................................... 5
1.1.2 Đặc điểm của A. Xylinum ................................................................................... 5
1.1.3 Môi trường nuôi cấy A. xylinum ........................................................................ 6
1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng CVK tạo bởi A. xylinum....................................... 6
1.1.5 Tính chất độc đáo của màng CVK ..................................................................... 7
1.1.6 Các phương pháp sản màng CVK từ A. xylinum........................................... 8
1.1.7 Ứng dụng của màng CVK ................................................................................... 9
1.2 Tổng quan về Diclofenac ...................................................................................... 10
1.2.1 Sơ lược về thuốc Diclofenac .............................................................................. 10
2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...................................... 11
2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước: ....................................................................... 11
2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước :....................................................................... 12
Chương 2. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu................................................... 13
1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 13
2.Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................................... 14


2.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................................. 14
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu........................................................ 14
2.2.2. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu.. .................................................... 14
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 15
4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 15
4.2 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK...................................... 17
4.3 Đo bề dày màng CVK ............................................................................................. 17

4.4. Xây dựng đường chuẩn Diclofenac .................................................................... 17
4.5 Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thu vào màng CVK. ............ 18
4.6. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................................ 19
5. Địa điểm tiến hành nghiên cứu ............................................................................... 19
Chương 3. Kết quả và thảo luận .................................................................................. 19
3.1. Màng CVk được nuôi cấy từ môi trường chuẩn ............................................. 19
3.2. Phương trình đường chuẩn Diclofenac.............................................................. 23
3.3. Khối lượng Diclofenac hấp thu vào màng CVk .............................................. 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 30


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học cơ bản của CVk................................................. 7
Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK .................................................... 16
Hình 3.1. Màng CVk dày 0,5cm ................................................................ 20
Hình 3.2. Màng CVk được nuôi cấy trong môi trường gạo.......................... 21
Hình 3.3. Màng CVk dày 1cm ................................................................... 21
Hình 3.4.Màng CVk tinh chế..................................................................... 22
Hình 3.5: Màng gạo tinh khiết 0,5cm, d= 1,5cm......................................... 23
Hình 3.6: Đường chuẩn diclofenac ............................................................ 24
Hình 3.7. Rút mẫu đo 1 giờ ....................................................................... 25


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK .................................................................... 15
Bảng 3.1. Bảng nồng độ Diclofenac và giá trị OD278 nm (n = 3) ...................................... 23
Bảng 3.2 : Bảng đo giá trị OD sau các khoảng thời gian..................................................... 26
Bảng 3.3: Lượng thuốc hấp thụ vào màng gạo sau 2 giờ..................................................... 27
Bảng 3.4: Hiệu suất hấp thụ vào màng gạo trong 2 giờ ....................................................... 27

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Bacterial cellulose (viết tắt là CVk) là sản phẩm của một loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Màng sinh học (CVk) có đặc tính và
cấu trúc rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit), cellulose vi khuẩn khác với cellulose
thực vật ở chỗ: cellulose vi khuẩn không chứa các hợp chất cao phân tử như
ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt
trội hơn về độ dẻo dai, bền chắc [1]. Trên thế giới, màng CVk đã được ứng
dụng trong nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK
làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết
kế hệ thống vận tải phân phối thuốc và nhiều ứng dụng khác [9].
Trong lĩnh vực y học, màng CVk đã được ứng dụng làm da tạm thời thay
thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị
các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da trong thẩm mĩ. [5, 9].
Amin et al. [8] đã báo cáo việc sử dụng màng CVk làm màng bọc cho
paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy màng CVk
có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu quả sử dụng
của thuốc. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVk mới được quan
tâm gần đây và đã đạt được kết quả bước đầu. Đề tài của Nguyễn Văn Thanh –
Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2006 [2] đã “Nghiên cứu chế tạo màng
cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy
màng CVk được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất
trên quy mô công nghiệp.
Về mặt tính chất, CVk có độ tinh sạch lớn hơn nhiều so với các loại
cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài

1

ra CVk còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, khả năng
thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ, ... Đồng thời chất ở trong tế bào và ngăn cản
tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng, màng CVk còn có ý nghĩa
giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo dài [7, 11], … Bên cạnh đó, các sợi cellulose
có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh
khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường
acid.
Diclofenac là thuốc chống viêm không steroid. Thuốc có tác dụng chống
viêm, giảm đau và hạ sốt mạnh, do nó ức chế mạnh hoạt tính của cyclogenase,
do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan
là những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con
đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu.
Giống như các thuốc chống viêm không steroid khác, diclofenac gây hại
đường tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo mucin (chất
có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa). Prostaglandin có vai trò duy trì tưới máu
thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin nên
có thể gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hư đặc
biệt ở những người bị bệnh thận hoặc suy tim mạn tính. Với những người bệnh
này, các thuốc chống viêm không steroid có thể làm tăng suy thận cấp và suy
tim cấp.
Từ các nghiên cứu về màng CVK và một số hạn chế của diclofenac
trong quá trình điều trị, xét thấy cần có hướng nghiên cứu mới với mục đích
tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng Acetobacter xylium, từ
đó chế tạo màng sinh học để khắc phục được những tác dụng phụ của thuốc
diclofenac, đồng thời để khảo sát sự hấp thụ thuốc qua màng , hạn chế tác dụng
phụ và khả dụng sinh học của CVK trong việc điều trị bệnh. Đó là lý do chúng

2

tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi và thu sản phẩm màng CVK từ chủng
Acetobacter xylium.
-. Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng cellulose vi
khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo.
3. Phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo
- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK làm từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật khoa
Sinh học-Trường ĐHSP Hà Nội. Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1 Ý nghĩa khoa học
+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
+ Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc phục hạn chế của
thuốc diclofenac sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không chỉ dừng lại ở việc
khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên nhiều các loại
thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn.
+ Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của
màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả màng
CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh
vực khác nhau.

3


4.2 Ý nghĩa thực tiễn
+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter
xylinum.
+ Từ màng CVK đã được tạo ra ở môi trường nước vo gạo để nghiên cứu
khả năng hấp thụ của thuốc diclofenac và làm giảm tác dụng phụ có hại của
thuốc.
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.
5. Kết quả nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ vi khuẩn A.xylinum.
- Xử lý màng thô, thu được CVK tinh chế.
- Nạp thuốc vào màng CVK.
- Màng CVK được nuôi dưỡng trong môi trường nước vo gạo.

4


NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1 Tổng quan về CVK
1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
- Acetobacter xylinum (A. xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi
Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu mao và
sản xuất cellulose ngoại bào.
- Theo khóa phân loại của Bergey thì A.xylinum thuộc:
+ Lớp: Schizomycetes.
+ Bộ: Pseudomonadales.

+ Bộ phụ :Pseudomonadieae.
+ Họ: Pseudomonadaceae.
1.1.2 Đặc điểm của A. Xylinum
- Đặc điểm hình thái: A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong,
kích thước ngang khoảng 0,6–0,8 µm, dài khoảng 2–3 µm, vi khuẩn không sinh
bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi,
nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị
biển đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh.
- Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum: Vi khuẩn có khả năng oxy
hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng catalase dương tính, không tăng trưởng
trên môi trường Hoyer, không tạo sắc tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose,
chuyển hóa glucose thành acid, chuyển hóa glycerol thành dihydroaceton. A.
xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào chủng
mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát
triển là từ 25 - 30°C; vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 – 8, pH tối ưu
để sản xuất cellulose là 5,5.

5


1.1.3 Môi trường nuôi cấy A. xylinum
- Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu
tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng. A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp
cellulose từ nguồn cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng
là glucose, fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose,
sucrose cho hiệu suất thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose,
erythriol, acetate. Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại
đường trong môi trường còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau.
Nhu cầu sử dụng đường ở A. xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong

quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng
- Các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai tây
và pho mát, nước dừa già và nước mía... để làm nguyên liêu nuôi cấy A.
xylinum.
Trong đó môi trường chuẩn trong nuôi cấy A. xylinum gồm: 2% (wt)
glucose, 0,5% (wt) cao nấm men, 0,5% (wt) peptone, 0,27% (wt) disodium
phosphate, và 0,15% (wt ) axit citric.
1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng CVK tạo bởi A. xylinum
- Cellulose vi khuẩn (màng CVK) là một chuỗi polymer không phân
nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β-1,4glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành thớ
sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5nm . Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so
sánh với sợi cellulose sơ cấp trong thượng tầng ở một vài loài thực vật. Các sợi
thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi
tạo thành dải. Dải có chiều dày 3-4nm, chiều dài 130-177nm (Yamanaka et al.,
2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi khuẩn có chiều dài từ 1µm -9 µm tạo

6


thành cấu trúc mắt lưới dày dặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp
màng film (Bielecki et al., 2001) 1.
- Cho đến nay, Acetobacter xylium đưc đánh giá là loài vi khuẩn có khả
năng sinh màng CV hiệu quả nhất trong tự nhiên
Cấu trúc hóa học cơ bản của CVk giống với cellulose có nguồn gốc thực
vật (plant cellulose - PC ), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể. Các
sợi mới sinh ra của CVk kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp
(subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5nm. Các sợi sơ cấp này kết lại thành các
vi sợi, các vi sợi nằm trong các bó, cuối cùng hình thành các dải. Các dải có
chiều dày 3 - 4nm, chiều rộng 70 - 80nm; 3,2x133nm. Cấu trúc của CVk phụ
thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy [12]. Cấu trúc hóa học trình bày trên hình

1.1:

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học cơ bản của CVk
1.1.5 Tính chất độc đáo của màng CVK
- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn.
- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.
- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc. Có độ
tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và hemicellulose.

7


- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên
có thể phục hồi.
- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt. Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt
tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ,
tính bền rất cao.
- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản
xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian.
- Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng
hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ.
1.1.6 Các phương pháp sản màng CVK từ A. xylinum
- Lên men tĩnh : Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được
cho vào các khay lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các
khay được đậy bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường
lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn.
Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC. Sợi cellulose mới được
tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng
cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose
tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7-10 ngày có thể

thu CVK.
- Lên men động: Vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi
trường nuôi cấy lắc. Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi
trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các
máy lắc ổn nhiệt ở 28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút. CVK được tạo ra từ môi
trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt
trong môi trường. Lượng O 2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự
sinh trưởng và khả năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá

8


trình lên men đạt hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử
dụng để lên men.
1.1.7 Ứng dụng của màng CVK
Với những ưu điểm nổi bật, CVK ngày càng được nghiên cứu nhiều và
có nhiều ứng dụng rộng rãi trong đời sống xã hội ở nhiều lĩnh vực như: thực
phẩm, y dược, mỹ phẩm, môi trường, dầu mỏ, thời trang, thể thao, sản phẩm
rừng ,…và trên nhiều lĩnh vực khác.
Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm

Thực phẩm

Tráng miệng ( thạch dừa)
Ăn kiêng ( kem, salad)
Thịt nhân tạo
Vỏ bao xúc xích
Nước uống siro không có cholesterol

Trà Kobucha hay manchurian

Y dược

Lớp màng trị bỏng
Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo
Chất làm co mạch

Mỹ phẩm

Móng nhân tạo
Đánh mỏng dày và mỏng hơn

Môi trường

Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn
Hấp thu chất độc
Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ

Thu hồi dầu

Trang phục

Sản xuất sợi nhân tạo
Y phục quân đội

Thể thao

Lều lắp ráp
9


Sản phẩm rừng

Gỗ nhân tạo
Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

1.2 Tổng quan về Diclofenac
1.2.1 Sơ lược về thuốc Diclofenac
1.2.1.1 Công thức
- Tên IUPAC: - 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid
- Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2
- Phân tử khối: 296.148 g / mol.
1.2.1.2 Nguồn gốc và tính chất
- Nguồn gốc: thảo dược.
1.2.1.3 Dược động học và tác dụng
- Dược động học :
Diclofenac được hấp thụ dễ dàng qua đường tiêu hóa sau khi uống.
Thuốc được hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói. Diclofenac gắn rất nhieuf với
protein huyết tương, chủ yếu với albumin. Khoảng 50% liều uống được chuyển
hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% sinh khả
dung trong mũi tiêm tĩnh mạch. Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương xuất

hiện 2 giờ sau khi uống, nồng độ trong dịch bao hoạt dịch xuất hiện mức tối đa
khoảng 4-6 giờ sau khi uống. Tác dụng của thuốc xuất hiện sau khi tiêm bắp từ
20-30 phút, 30-60 phút sau khi đặt thuốc vào trực tràng và 60-120 phút sau khi
uống.
Nửa đời trong huyết tương khoảng 1-2 giờ. Nửa đời thải trừ khỏi dịch
bao hoạt dịch là 3-6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dung được thải qua thận dưới dạng
các chất chuyển hóa còn một phần dưới dạng hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc

10


nguyên vẹn, phần còn lại thải qua mật và phân. Hấp thụ, chuyển hóa và đào
thải hình như không phụ thuộc vào tuổi. Nếu liều lượng và khoảng cách giữa
các lần dung thuốc được tuân thủ theo chỉ dẫn thì thuốc không bị tích lũy ngay
cả khi chức năng thận và gan bị giảm.
2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:
- Nghiên cứu màng CVK:
+ Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown 1989, dùng
màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất
mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989) và cộng sự,
dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang,
làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm.
Đặc biệt Brown (1989), đã dùng CVK làm vải đặc biệt, để sản xuất giấy chất
lượng cao, làm cơ chất để cố định protein hay cho sắc kí.
+ Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm màng
CVK từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czafa và
cộng sự(2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho
phụ nữ.

- Nghiên cứu về Diclofenac: Diclofenac, thuốc có trong danh mục thuốc
thiết yếu của 74 quốc gia, gia tăng nguy cơ biến cố tim mạch từ 38% - 63%
trong các nghiên cứu khác. Nguy cơ gia tăng với diclofenac tương tự chất ức
chế COX-2 rofecoxib (Vioxx, Mecrk), một thuốc bị rút khỏi thị trường thế giới
do độc đối với tim mạch.
Nói với Heartwire, Tiến sĩ David Henry (Viện Khoa học Thẩm định Lâm
sàng, Toronto, ON), người tiến hành đánh giá cùng với tiến sĩ Patricia
McGettigan (Trường Y Nha Luân Đôn, Anh), nói rằng ở Bắc Mỹ sử dụng

11


diclofenac thấp – khoảng 5 – 6% thị trường NSAID ở Mỹ và 17% ở Canada –
trong khi đó, nó được sử dụng phổ biến hơn ở các quốc gia ngoài phương Tây.
NSAIDs được sử dụng nhiều (chiếm 30% đến 40% thị phần) ở các quốc
gia như Việt Nam, Pakistan, nhiều phần của Trung Quốc, và các quốc gia khác.
Các quốc gia này đang trải qua đại dịch thật sự về bệnh tim mạch cùng lúc với
việc giảm tỷ lệ ở các nước phương Tây. Họ thật sự là những người sử dụng rất
nhiều các thuốc này, đặc biệt là diclofenac.
Theo tác giả, diclofenac thậm chí ở liều nhỏ cũng gia tăng nguy cơ biến
cố tim mạch.
Trong đánh giá, xuất bản trên Plos Medicine ngày 12 tháng 2, năm 2013,
Henry và McGettigan cho thấy rằng ở 15 quốc gia, một danh sách bao gồm các
quốc gia thu nhập cao, trung bình, và thấp, diclofenac là NSAID được sử dụng
nhiều nhất. Nó có một thị phần tương đương với tổng thị phần của ibuprofen,
naproxen, acid mefenamic. Các NSAIDs nguy cơ cao như diclofenac và
etoricoxib chiếm 1 phần 3 thị phần ở 15 quốc gia.
2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
- Nghiên cứu màng CVK:
+ Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ

khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Các kết quả ứng dụng của màng CVK hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí
nghiệm.
+ Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum BHN
có khả năng tạo màng CVK và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng
CVK từ chủng A. xylinum BHN có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là
cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người.
+ Hiện nay, ở Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng
được cải tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra
12


một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử
dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng,…Từ năm
2000 nhóm nghiên cứu các tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có một số
công trình nghiên cứu về màng CVK thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh
học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam .

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
Khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men
từ môi trường nước vo gạo.

13


2.Vật liệu nghiên cứu
2.1 Nguyên liệu:
Nước vo gạo, gạc vô trùng.

Hóa chất: Sử dụng các hóa chất đặc biệt và các hóa chất thông thường
có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam:
+ Diclofenac dạng tinh khiết > 99%
+ Đường glucose
+ Pepton
+ (NH4)2SO4
+ Acid acetic
+ NaOH, HCl
+ Nước cất
+ (NH4)2HPO4
+ Methanol
2.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu.
- Bể ổn nhiệt 1013
- Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh)
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Cân kĩ thuật TE412
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ)
- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)
- Máy lắc
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/ HIRAIAMA
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.2.2. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu.

14


Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh,

đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có nút xoáy, lọ penicilin, đèn cồn, kẹp gỗ,
bình hút ẩm, giấy lọc, giấy quỳ tím, bình định mức loại 100ml, 500ml, 1000ml,
pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml, thước kẹp panme... và nhiều dụng cụ hóa sinh
khác.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo và thu màng CVK lên men từ môi trường chuẩn.
- Nạp diclofenac vào màng CVK.
- Thử nghiệm khả năng hấp thụ Diclofenac của màng CVK.
4. Phương pháp nghiên cứu
Tạo màng CVK có cải tiến từ môi trường chuẩn Hestrin - Schramm [24] bằng
cách thay cao nấm men bằng nước vo gạo như được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK
Thành phần

Hàm lượng

Đường glucozo

30g

Pepton

10g

(NH4)2HPO4

0.3g

(NH4)2SO4

0.5g

Acid acetic

2%

Nước vo gạo

1000ml

Dịch giống A. xylium

10%

- Bước 1: Chuẩn bị môi trường như bảng 4.1.
- Bước 2: Hấp khử trùng môi trường đó ở 113oC trong 15 phút.
- Bước 3: Lấy môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trường.

15


- Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 4 - 14
ngày ở 26oC.
- Bước 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
- Sau khi ủ tĩnh cho 4 ~ 14 ngày ở 260, màng CVK được nhúng vào nước
cất trong 2 ngày, và sau đó các màng CVK được tinh chế bằng cách rửa nhiều
lần theo quy trình được trình bày trong hình 4.1 dưới đây:

Tách màng CVK thô
Ép lo ại nước

Ngâm trong NaOH 3%

48 giờ, rửa và
ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước

48 giờ, kiểm tra tạp
chất
Thu CV tinh chế

Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK
- Tách CVK: Trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.

16