Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậu tƣơng (glycine max (l ) merr 1917)

````````

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH–KTNN

----------

LÊ MINH TUẤN

PHÂN TÍCH VAI TRÒ CỦA GỐC METHIONINE
TRONG CẤU TRÚC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở CÂY
ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merr.1917)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Tin sinh học

HÀ NỘI, 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

----------

LÊ MINH TUẤN

PHÂN TÍCH VAI TRÒ CỦA GỐC METHIONINE
TRONG CẤU TRÚC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở CÂY
ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merr.1917)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Tin sinh học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

TS. Chu Đức Hà

HÀ NỘI, 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi đƣợc thực hiện dƣới
sự hƣớng dẫn của TS. Chu Đức Hà. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong
đề tài này là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố dƣới bất kỳ hình thức
nào.
Khóa luận sử dụng thông tin, số liệu, hình ảnh từ các bài báo và nguồn
tài liệu của các tác giả khác đều đƣợc chú thích và trích dẫn đầy đủ.
Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung của khóa luận.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Sinh viên

Lê Minh Tuấn


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới TS. Chu Đức Hà - Viện Di
truyền Nông nghiệp đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi,
giúp đỡ tôi trong suốt quá học tập, làm việc và hoàn thành khóa luận.
Xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ phòng Sinh học phân tử, Viện Di
truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận tại đây.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. La Việt Hồng, Khoa Sinh - Kỹ

thuật Nông nghiệp, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ,
hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho tôi đƣợc tham gia vào nhóm nghiêm cứu khoa
học từ rất sớm.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và
chia sẻ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Sinh viên

Lê Minh Tuấn


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1: Diện tích và sản lƣợng đậu tƣơng của 5 nƣớc dẫn đầu và toàn
thế giới (FAO, 2016) ........................................................................................ 8
Bảng 2. 1: Th ng tin về c c TF giàu Met đƣợc hai th c trong nghi n
cứu................................................................................................................... 15
Bảng 3. 1: Đặc tính của nhóm protein họ bHLH ở đậu tƣơng ................. 20
Bảng 3. 2: Đặc điểm protein nhóm bZIP ở cây đậu tƣơng ....................... 22


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1: Đặc điểm Hình th i cây đậu tƣơng .............................................. 5
Hình 1. 2: Diện tích và sản lƣợng đậu tƣơng trong ni n vụ 2010 - 2016 . 10
Hình 2. 1: Giao diện trang web ExPASy protparam tool ......................... 16
Hình 2. 2: Cơ sở dữ liệu TargetP ................................................................. 16
Hình 3. 1: Tỉ lệ phân bố Methionine ngoài vùng bảo thủ c c họ TF........ 27
Hình 3. 2: Sự biểu hiện của c c gene bHLH, bZIP, SRF của cây đậu
tƣơng trong c c m ở điều iện thƣờng.................................... 28
Hình 3. 3: Sự biểu hiện của c c gene bHLH, bZIP, SRF của cây đậu
tƣơng trong c c m ở điều iện mặn ........................................ 30

DANH MỤC VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Ký hiệu

Thuật ngữ Tiếng Anh

Thuật ngữ Tiếng Việt

bHLH

Basic Helix Loop Helix

Basic Helix Loop Helix

bZIP

Basic Leucine Zipper

Basic Leucine Zipper

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axít đêôxyribônuclêic

FAO

Food and Agriclture

Tổ chức lƣơng thực thế

organization

giới

Grand average of

Độ ƣa nƣớc trung bình

GRAVY

hydropathicity
Gene expression

Cơ sở dữ liệu của dữ liệu

omnibus

biểu hiện gen

kDa

Kilo dalton

Kilô daltơn

II

Instability Index

Chỉ số bất ổn định

Met

Methionine

Methionin

MYB

Myeloblastosis

Myeloblastosis

NAC

NAM/ATAF1/CUC2

NAM/ATAF1/CUC2

pI

Isoelectric point

Điểm đẳng điện

RNA

Ribonucleic Acid

Axít Ribônuclêic

SRF

Serum - Response Factor

Yếu tố phiên mã đáp ứng

GEO

serum
TF

Transcription factor

Nhân tố phiên mã


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ..................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 2
4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. Tổng quan về cây đậu tƣơng ...................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây đậu tương ........................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tương .................................................... 4
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái học của cây đậu tương ......................................... 4
1.1.2.2. Đặc điểm di truyền của cây đậu tương ................................................ 6
1.1.3. Vai trò của cây đậu tương ....................................................................... 6
1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam ........................ 8
1.1.4.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới.......................................... 8
1.1.4.2. Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam ......................................... 9
1.2. Tổng quan về các nhân tố phiên mã trong nghiên cứu ............................ 10
1.2.1. Nhân tố phiên mã bHLH (Basic Helix-Loop-Helix) ............................. 10
1.2.2. Nhân tố phiên mã bZIP (Basic Leucine Zipper) ................................... 11
1.2.3 Nhân tố phiên mã SRF (Serum-Response Factor) ................................. 11
1.3. Met và vai trò của Met trong đáp ứng điều kiện bất lợi........................... 12
1.4. Lịch sử nghiên cứu ................................................................................... 13
1.4.1. Lịch sử nghiên cứu thế giới ................................................................... 13
1.4.2. Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................... 14


Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 15
2.1.Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp phân tích đặc tính protein ở đậu tương.......................... 15
2.2.3. Phương pháp tính %Met ở ngoài vùng bảo thủ .................................... 16
2.2.4. Phương pháp xác định vị trí phân bố của protein trong tế bào ........... 16
2.2.5. Phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen mã hóa trong điều
kiện thường và điều kiện mặn ......................................................................... 17
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 18
3.1. Phân tích đặc tính protein của ba nh m TF giàu Met ở đậu tƣơng.......... 18
3.1.1. Nhóm bHLH ở đậu tương...................................................................... 18

3.1.2.Nhóm bZIP ở đậu tương......................................................................... 22
3.1.3. Nhóm SRF ở đậu tương ......................................................................... 23
3.2. Phân tích mật độ phân bố Met ở ngoài vùng bảo thủ của các nhóm TF
giàu Met ở đậu tƣơng ...................................................................................... 26
3.3. Phân tích dữ liệu biểu hiện của gene mã h a TF giàu Met ở đậu tƣơng
trong các điều kiện .......................................................................................... 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 32
1. Kết luận ..................................................................................................... 32
2. Đề xuất ...................................................................................................... 32
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN
VĂN ................................................................................................................ 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 34
PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây đậu tƣơng (Glycine max) là một trong những đối tƣợng cây trồng
quan trọng trên thế giới. Đây là nguồn nguyên liệu quan trọng đối với các
ngành công nghiệp, đặc biệt là đối với sản xuất chế biến, sử dụng làm thức ăn
cho gia súc [6]. Tuy nhiên, tác động của biến đổi khí hậu diễn ra liên tục và
kéo dài đã ảnh hƣởng đến năng suất và sản lƣợng của đậu tƣơng [1]. Chính vì
vậy, các nghiên cứu về đậu tƣơng thƣờng hƣớng đến mục tiêu cải thiện tính
chống chịu bất lợi và nâng cao năng suất của giống nh m đáp ứng với biến
đổi khí hậu.
Trong genome của thực vật có khoảng 7% gene mã hóa cho các yếu tố
phiên mã (transcription factor, TF) [47], phần nhiều trong số đ đã đƣợc
chứng minh c đáp ứng với các bất lợi môi trƣờng [26]. Các TF là những
phân tử protein nhận biết trình tự đặc hiệu trên v ng promoter (yếu tố điều
h a cis- , từ đ điều h a sự biểu hiện của gene đích khi c tác động của điều

kiện bất lợi [26], vì vậy chúng tham gia vào đáp ứng các bất lợi môi trƣờng
[12,43]. Các họ TF lớn ở thực vật c thể đƣợc liệt kê nhƣ bZIP [51], NAC
[30], WRKY [50] và bHLH [20]. Trong nội dung kh a luận này, 3 họ TF lớn
ở thực vật gồm bHLH, bZIP và SRF đã đƣợc tập trung nghiên cứu.
Methionine (Met) là một gốc amino acid đ ng một vai trò vô cùng quan
trọng đối với đời sống của sinh giới [42]. Met là đơn vị cấu thành nên cấu trúc
của chuỗi protein, tham gia vào chu trình Yang, liên quan đến hàng loạt các
chu trình nội bào quan trọng nhƣ hình thành nên màng tế bào, tổng hợp diệp
lục và củng cố thành tế bào [9]. Tuy nhiên, cấu tạo mạch có chứa lƣu huỳnh
nên các gốc Met rất dễ bị ôxi h a, làm thay đổi cấu trúc hoặc dẫn đến thay đổi
hoặc mất chức năng của phân tử protein trong tế bào. Điều đáng chú ý nhất là
khoảng 68% phân tử bị ôxi hóa trong tế bào chính là protein [44], vì vậy đây
1


đƣợc xem là một đối tƣợng rất dễ bị tác động trong điều kiện bất lợi [27].
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phân tích vai
trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậu tƣơng
(Glycine max (L.) Merr.1917)”.
2. Mục ti u nghi n cứu của đề tài
Mục đích của nghiên cứu này nh m làm r giả thuyết về vai tr bảo vệ
của các gốc Met trên các phân tử protein đ ng vai tr TF ở cây đậu tƣơng.
3. Nội dung nghi n cứu
 Phân tích đặc tính của 3 nh m TF giàu Met ở đậu tƣơng.
 Xác định mật độ phân bố Met ở ngoài vùng bảo thủ của 3 nhóm TF giàu
Met ở đậu tƣơng.
 Phân tích mức độ biểu hiện của các gene mã h a TF giàu ở đậu tƣơng trong
điều kiện thƣờng và điều kiện xử lí mặn.
4. Ý nghĩa hoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học

 Nghiên cứu này nh m cung cấp những dẫn liệu quan trọng cho những
nghiên cứu tiếp theo nh m phân tích rõ vai trò của các gene mã hóa giàu
Met liên quan đến tính chống chịu bất lợi ở thực vật.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
 Kết quả của nghiên cứu này s cung cấp những gene ứng viên mã h a
bHLH, bZIP và SRF c đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nh m
phục vụ công tác chọn tạo giống nh m nâng cao tính chống chịu ở cây đậu
tƣơng.

2


NỘI DUNG
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây đậu tƣơng
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây đậu tương
Cây đậu tƣơng là một trong những cây trồng có lịch sử rất lâu đời và đ ng
vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp cũng nhƣ công nghiệp của thế giới.
Theo những nghiên cứu gần đây các nhà khoa học đã chỉ ra r ng cây đậu
tƣơng c nguồn gốc từ châu Á và đƣợc trồng tại Trung Quốc vào khoảng
5000 năm trƣớc công nguyên [19]. Nghiên cứu khác của Hymowitz cho r ng
cây đậu tƣơng đã đƣợc thuần hóa và gieo trồng ở một phần phía đông và bắc
Trung Quốc vào thế kỉ XI trƣớc công nguyên, sau đ n đã đƣợc du nhập vào
Hàn Quốc, Nhật Bản và các nƣớc Đông Nam Á vào khoảng thế kỉ XI đến thế
kỉ XIII trƣớc công nguyên [18]. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, cây đậu
tƣơng đƣợc trồng và phát triển mạnh ở Hoa Kỳ, Brazil và Canada. Theo sách
“Vân Đài loại ngữ” của Lê Quý Đôn, Việt Nam có lịch sử canh tác cây đậu
tƣơng vào khoảng thế kỉ thứ VI [4]. Trong một số ghi chép cho r ng cây đậu
tƣơng đã đƣợc canh tác ở nƣớc ta vào thời vua H ng trƣớc cả cây đậu xanh và

đậu đen [2]. Đậu tƣơng đƣợc trồng chủ yếu để lấy hạt, là loại cây thực phẩm
quan trọng sau lúa mì, lúa nƣớc và ngô. Ở Châu Mỹ là nơi c diện tích canh
tác đậu tƣơng lớn nhất lên tới 70% và tiếp ngay sau đ là Châu Á. Theo số
liệu năm 1993 Việt Nam đã hình thành 6 vùng sản xuất đậu tƣơng trọng điểm
trên cả nƣớc với diện tích lớn bao gồm: v ng Đông Nam Bộ (26,2%), miền
núi Bắc Bộ (24,7% , đồng b ng sông Cửu Long (12,4% , đồng b ng sông
Hồng (17,5%), hai vùng còn lại là đồng b ng ven biển miền Trung và Tây
Nguyên với diện tích canh tác thấp hơn [2].
Đậu tƣơng hay một số nơi c n gọi là đỗ tƣơng, đậu nành hoặc hoàng đậu
miêu thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bƣớm
3


Papilionoideae, chi Glycine với tên khoa học là Glycine max. Dựa vào các
đặc điểm về hình thái, sự phân bố địa lý và số lƣợng nhiễm sắc thể do
Hymowit và Newell (1984) xây dựng thì ngoài chi Glycine còn có thêm chi
phụ Soja. Chi Glycine đƣợc chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi phụ
Soja đƣợc chia ra làm 2 loài: loài đậu tƣơng trồng Glycine (L.) Merr và loài
hoang dại hàng năm G.Soja Sieb và Zucc. [6].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tương
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái học của cây đậu tương
Đậu tƣơng là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có hình tròn, trên thân
có nhiều lông nhỏ, màu trắng. Thân cây lúc còn non có màu xanh hoặc màu
tím, khi về già chuyển sang màu nâu nhạt. Màu sắc của thân non có thể cho ta
biết màu sắc của hoa sau này, nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu
trắng và nếu khi c n non thân c màu tím thì hoa c màu tím đỏ. Thân cây
đậu tƣơng thƣờng có chiều cao từ 0,3 - 1m tùy theo từng giống [6].
Cây đậu tƣơng c lá kép, mọc so le, gồm 3 lá chét có dạng hình bầu dục
hoặc hình trái xoan. Gốc lá tr n, đầu nhọn, dài từ 3 - 12cm, rộng từ 2 - 8cm.
Lá chét bên lệch, hai mặt có lông bao phủ, gân chính có 3 cuống chung dài từ

7 - 10cm, có lông bao phủ (Hình 1.1) [5]. Lá đa dạng về hình dạng phụ thuộc
vào giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt nhƣng thƣờng cho năng
suất kém, những giống lá to thì thƣờng cho năng suất cao hơn nhƣng tính
chống chịu kém hơn. Số lƣợng lá nhiều, to và khỏe nhất vào thời kì đang ra
hoa rộ. Khi phiến lá phát triển to, rộng, mỏng phẳng và lá c màu xanh tƣơi
chứng tỏ cây đang sinh trƣởng khỏe và có khả năng cho năng suất cao [6].
Hoa thƣờng nhỏ, có màu tím hoặc màu trắng, hình chuông, phủ lông mềm.
Tràng hoa có cánh cờ mở rộng, không có tai, nhị một bó, bầu có lông (Hình
1.1)[5]. Hoa thƣờng mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 3 - 5 hoa. Hoa
đậu tƣơng là hoa lƣỡng tính nên đây là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất
thấp chỉ chiếm khoảng 0,5 - 1% [6].
4


Quả đậu tƣơng thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thƣờng có từ
2 - 3 hạt. Lúc quả còn non quả có màu xan, khi quả chín có màu nâu. Hạt có
hình tròn, hình bầu dục. Những giống có hạt màu vàng thƣơng c giá trị
thƣơng phẩm cao. Trong hạt, phôi thƣờng chiếm 2%, hai lá tử điệp chiếm
90% và 8% còn lại là vỏ hạt trên tổng khối lƣợng của hạt. Hình dạng và màu
sắc của rốn hạt đặc trƣng cho mỗi giống (Hình 1.1)[6].
Bộ rễ của đậu tƣơng gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần,
đ là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium jabonicum với rễ. Nốt
sần có thể dài tới 1cm, đƣờng kính từ 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu
trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều
nhất ở tầng đất c độ sâu từ 0 - 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định
từ nitơ trong không khí với lƣợng đạm cung cấp cho cây khoảng 30 - 60kg/ha
(Hình 1.1) [6].

Hình 1.1: Đặc điểm Hình thái cây đậu tƣơng
(Nguồn tài liệu tham khảo: )

A: Hoa đậu tƣơng; B: Quả đậu tƣơng; C: Lá cây đậu tƣơng; D: Rễ cây đậu tƣơng.

5


1.1.2.2. Đặc điểm di truyền của cây đậu tương
Đậu tƣơng thuộc chi Glycine có tổ tiên là loài hoang dại Glycine soja.
Glycine là chi duy nhất trong bộ Phaseoleae mà các loài của nó có số nhiễm
sắc thể nhị bội 2n = 40 và 80 không phải là 20 [2]. Trong nghiên cứu của
Lackey số nhiễm sắc thể của Glycine có thể bắt nguồn từ loài nhị bội với số
nhiễm sắc thể gốc x = 11 trải qua quá trình đa bội lệch khuyết có gốc x = 10
và đa bội thể đã cho bộ nhiễm sắc thể lên đến 40 và 80 [29]. Theo Gurley, đậu
tƣơng là dạng tứ bội bền vững của bộ nhiễm nhị bội [15].
Cây đậu tƣơng có bộ nhiễm sắc thể lƣỡng bội 2n = 40 với kích thƣớc vào
khoảng 1115Mb bao gồm 1,115 triệu cặp bazơ trên mỗi nhiễm sắc thể đơn bội
[8]. Trong toàn bộ genome có khoảng 40 - 60% trình tự gen lặp lại [15,16].
Đậu tƣơng c bộ nhiễm sắc thể 2n = 40 với tỷ lệ G/C trung bình là 34,8%, số
lƣợng protein trung bình là 89 597 và số lƣợng gen trung bình là 56 680
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5).
1.1.3. Vai trò của cây đậu tương
Đậu tƣơng là cây trồng ngắn ngày đem lại giá trị kinh tế cao và có tác
dụng về nhiều mặt nhƣ: làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu trong
nhiều ngành công nghiệp, cải tạo đất. Vì thế cây đậu tƣơng đƣợc mệnh danh
là “ Ông hoàng trong các loại cây họ đậu” [6].
Đậu tƣơng đƣợc biết tới là một loại ngũ cốc c hàm lƣợng dinh dƣỡng rất
cao nhất là hàm lƣợng protein trung bình khoảng 35,5 - 40%. So với hàm
lƣợng protein trong gạo (6,2 - 12%), ngô (9,8 - 13,2%) hay các loại thịt nhƣ
thịt bò (21%), thịt gà (20%), cá (17 - 20% thì hàm lƣợng protein trong đậu
tƣơng ở mức cao, lipit khoảng 15 - 20%, carbohydrate khoảng 15 - 16% và
một số các khoáng chất khác cần cho sự sống [3]. Protein trong đậu tƣơng

đƣợc coi là loại protein thực vật có phẩm chất tốt, dễ tiêu h a hơn protein
trong thịt và đặc biệt là không có các thành phần tạo cholesterol. Hàm lƣợng
lipid trong đậu tƣơng cũng rất cao, chứa khoảng 60 - 70% các acid béo không
6


no rất tốt cho sức khỏe. Bên cạnh đ , trong hạt đậu tƣơng c chứa rất nhiều
các vitamin và khoáng chất nhƣ vitamin B1, vitamin B2, vitamin C, Ca, Fe, P
[6].
Ngoài đƣợc sử dụng để chế biến thành các loại thực phẩm cho con ngƣời,
đậu tƣơng c n đƣợc sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Khoảng 1kg hạt đậu
tƣơng khô tƣơng đƣơng với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn bộ cây đậu
tƣơng c chứa hàm lƣợng đạm khá cao có thể sử dụng làm thức ăn cho gia
súc hoặc nghiền khô để chế biến thức ăn tổng hợp rất tốt. Sản phẩm phụ công
nghiệp nhƣ khô dầu có thành phần dinh dƣỡng khá cao: N:
6,2%, P2O5: 0,7%, K2O: 2,4% có thế làm thức ăn bổ sung cho gia súc rất tốt
[2].
Hiện nay, những nguồn năng lƣợng hóa thạch nhƣ than đá, dầu mỏ có trữ
lƣợng ngày càng giảm kèm theo là hiện tƣợng biến đổi khí hậu và các vấn đề
môi trƣờng nên nhiên liệu sinh học là giải pháp thay thế tốt nhất. Biodiesel là
nhiên liệu sạch và tái tạo đƣợc coi là sự thay thế tốt nhất cho nhiên liệu diesel.
Trong đ dầu đƣợc chiết xuất từ hạt đậu tƣơng đƣợc coi là nguồn nguyên liệu
chính để sản xuất dầu diezel sinh học. Ngoài là nguyên liệu sản xuất dầu
diezel sinh học, dầu đậu tƣơng c thể sử dụng để sản xuất một dạng nhiên liệu
sinh học khác là bioethanol. Vỏ đậu tƣơng chứa lƣợng lớn carbohydrate sử
dụng để tạo ra bioethanol và có thể làm thức ăn cho động vật vì có chứa hàm
lƣợng protein cao. Kết quả kiểm tra khí thải động cơ cho thấy r ng chỉ sử
dụng dầu diesel sinh học đã tạo ra khí thải CO, HC, NOx và kh i ít hơn so với
petro-diesel [25].
Toàn bộ cây đậu tƣơng (thân, lá, quả, hạt) cả khi tƣơi và khô đều có thể

làm thức ăn cho gia súc. Đặc biệt cây đậu tƣơng c vai tr quan trọng trong
việc cải tạo đất do trên rễ có rất nhiều nốt sần (là kết quả của sự cộng sinh
giữa vi khuẩn Rhizobium jabonicum với rễ) c năng cố định đạm. Vậy cứ
trồng khoảng 1 ha đậu tƣơng sinh trƣởng tốt s tạo ra khoảng 30 - 60 kg nitơ
7


trong đất. Đối với thân và lá đậu tƣơng c chứa lƣợng lớn nitơ nên sau khi thu
hoạch có thể sử dụng nhƣ phân hữu cơ để b n cho đất hoặc các cây trồng
khác. Việc luân canh cây đậu tƣơng với một loại cây trồng khác đƣợc xem là
biện pháp cải tạo đất trồng rất tốt [6].
1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
1.1.4.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Đậu tƣơng là cây trồng có giá trị kinh tế và dinh dƣỡng cao, đƣợc xem là
một trong những loại cây thực phẩm quan trọng bậc nhất thế giới sau cây lúa
mì, lúa nƣớc và ngô. Do có khả năng thích ứng rộng với các điều kiện khí hậu
khác nhau nên đậu tƣơng đƣợc canh trồng rộng rãi trên toàn thế giới, nhƣng
tập trung chủ yếu ở tại Hoa Kỳ, tiếp đến là Châu Á. Theo số liệu từ bảng 1.1
cho thấy tổng diện tích canh tác đậu tƣơng trên toàn thế giới khoảng 121,5
triệu ha, trong đ : Hoa Kỳ là 33,5 triệu ha (28% , Brazil đạt 33,2 triệu ha
(27,2%), Argentina là 19,5 triệu ha (16%), Ấn Độ là 11,5 triệu ha (9%) và
Trung Quốc là 6,6 triệu ha (5,5%). Số liệu từ bảng 1.1 cho thấy tổng sản
lƣợng của thế giới là 334,9 triệu tấn tăng khoảng 11,7 triệu tấn so với năm
2015. Tổng sản lƣợng thu hoạch của Hoa Kỳ năm 2016 khoảng hơn 117,2
triệu tấn chiếm gần 35% sản lƣợng của thế giới (FAO, 2016).
Bảng 1. 1: Diện tích và sản lƣợng đậu tƣơng của 5 nƣớc dẫn đầu và toàn thế
giới (FAO, 2016)
T n quốc gia

Diện tích canh t c

Sản lƣợng thu hoạch

(triệu ha)

(triệu tấn)

Hoa Kỳ

33,5

117,2

Brazil

33,2

96,3

Argentina

19,5

58,8

Ấn Độ

11,5

14

Trung Quốc

6,6

11,9

Thế giới

121,5

334,9
8


1.1.4.2. Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam
Việt Nam là một đất nƣớc có nền nông nghiệp rất lâu đời, bên cạnh các
cây lƣơng thực nhƣ lúa, ngô và một số cây công nghiệp khác thì đậu tƣơng
cũng đ ng vai tr quan trọng đối với đối với đời sống của ngƣời dân Việt
Nam. Cả nƣớc có 28 tỉnh thành canh tác đậu tƣơng trong đ 70% là ở miền
Bắc và 30% ở các tỉnh phía Nam [6].
Theo số liệu chính thức của FAO thì diện tích và sản lƣợng trồng đậu
tƣơng ở nƣớc ta thì từ năm 2010 trở về các năm trƣớc thì phát triển rất mạnh
cả về diện tích gieo trồng cũng nhƣ là năng suất thu hoạch. Tuy nhiên với
những phƣơng thức canh tác truyền thống, bộ giống năng suất thấp, sản xuất
nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tƣơng trong nƣớc không có
khả năng cạnh tranh với đậu tƣơng nhập khẩu cộng thêm sự bất lợi về điều
kiện khí hậu trong một vài năm gần đây là nguyên nhân dẫn đến việc nông
dân không còn mặn mà với cây đậu tƣơng đã dẫn đến diện tích và sản lƣợng
đậu tƣơng giảm mạnh trong 6 năm gần đây. Quan sát biểu đồ hình 1.2 có thể

thấy năm 2012 sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc ta đã giảm 34,3% so với cùng kỳ
năm trƣớc xuống còn khoảng 175,2 nghìn tấn do điều kiện khí hậu bất lợi.
Diện tích trông đậu tƣơng năm 2016 ở nƣớc ta giảm mạnh chỉ b ng khoảng
50% diện tích của năm 2010 là 99,6 nghìn ha và sản lƣợng đạt ở mức 161
nghìn tấn giảm gần 138 nghìn tấn so với cùng kỳ năm 2010 (FAO, 2016).

9


Hình 1.2: Diện tích và sản lƣợng đậu tƣơng trong niên vụ 2010 - 2016
( FAO, 2010-2016)
1.2. Tổng quan về c c nhân tố phi n mã trong nghi n cứu
TF là một protein gắn đặc hiệu với trình tự DNA trong v ng điều khiển và
tham gia điều khiển quá trình phiên mã của gene [10][31]. Trong nghiên cứu
này, chúng tôi s tiến hành phân tích 3 nhóm TF phổ biến nhất ở thực vật là
bHLH, bZIP và SRF.
1.2.1. Nhân tố phiên mã bHLH (Basic Helix-Loop-Helix)
TF basic/helix-loop-helix (bHLH) và nhân tố tƣơng đồngcủa chúng đã tạo
thành một họ lớn trong genome của cả thực vật và động vật [36]. Từ khi tìm
ra TF bHLH có khả năng liên kết với DNA và khả năng nhị trùng hóa [36]
các thành viên trong siêu họ protein bHLH ngày càng phát hiện thêm nhiều
chức năng quan trọng trong quá trình sinh lí và sinh trƣởng ở động vật ở mức
độ thấp hơn so với thực vật [35][40]. bHLH chứa khoảng 60 acid amin với
hai vùng chức năng đ là v ng cơ bản (basic) và vùng chức năng (helix-loophelix . V ng cơ bản n m ở đầu amin (N-terminal) của miền bHLH và có chức
năng nhƣ một dạng gắn kết DNA, bao gồm khoảng 15 amino acid thƣờng
10


gồm sáu dƣ lƣợng cơ bản. Vùng HLH gồm hai phân tử α-helices phân cực với
một sự liên kết vòng lặp với chiều dài biến thiên. Các α-helices lƣỡng cực của

hai protein bHLH có thể tƣơng tác và hình thành hai cấu phần giống nhau
(homodimer) hoặc hai cấu phần khác nhau (heterodimer) [13][36][38]. Trong
các nghiên cứu gần đây đã cho thấy một số protein bHLH ở thực vật có khả
năng tƣơng tác với các protein bị thiếu đi một miền bHLH, đặc biệt là đối với
các phức hợp protein với protein MYB (Myeloblastosis), bHLH và WD40
đƣợc đƣa ra để bảo vệ tế bào và rễ tơ khác nhau [39].
1.2.2. Nhân tố phiên mã bZIP (Basic Leucine Zipper)
Protein bZIP (basic leucine zipper) là một họ lớn có khả năng điều chỉnh
quá trình phiên mã [46], đặc biệt là đối với thực vật nói chung và sinh vật
nhân thực n i riêng. Các protein bZIP thƣờng gồm một miền bZIP có hai
vùng là: vùng basic và vùng nhị trùng hóa. Vùng basic liên kết với DNA và
vùng nhị trùng hóa có dạng homo giống nhƣ các dị thể. Ở tại v ng cơ bản có
vùng tín hiệu bên trong dựa trên một dạng N-x7-R/K không đổi để liên kết
với DNA. Ngoài ra, sự lặp lại của một đoạn leucine tại vị trí chín amino acid
n m dọc theo v ng đầu cacboxyl (C-terminus) đã tạo ra một phân tử helix
phân cực. Các yếu tố phiên mã bZIP ở thực vật thì liên kết chặt ch với chuỗi
DNA của -ACGT- nhƣ G-box (-CACGTG-), C-box (-GACGTC-), A-box (TACGTA-) [23].
Các TF bZIP thƣờng phổ biến nhất ở thực vật nh m điều chỉnh các hiện
tƣợng nhƣ: nảy mầm, quang hóa, hình thành hoa, phát triển hoa và cũng c
vai trò quan trọng đối với cây trồng trong việc báo hiệu bất lợi và hormone.
Các protein bZIP ở thực vật đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi và các chức năng
của chúng phức tạp hơn đối với các TF khác [49].
1.2.3 Nhân tố phiên mã SRF (Serum-Response Factor)
Họ TF SRF gồm khoảng 56 amino acid và đƣợc tìm thấy trong vùng liên
kết DNA của phần đông các TF ở sinh vật nhân thực. Vùng ở đầu amin (N11


terminal) của MADS-box gồm chủ yếu là đuôi kỵ nƣớc với tỷ lệ base cao
trong khi vùng ở đầu cacboxyl (C-terminal) chủ yếu là đuôi kỵ nƣớc. Ở phần
lớn các MADS-box, MADS-box n m ở phần cuối vùng N-terminal. Tuy

nhiên trong một số protein khác thì MADS-box n m ở gần vùng trung tâm
hoặc n m ở phía cuối vùng ở đầu cacboxyl (C-terminal). Trong trƣờng hợp
của SRF sự có mặt của một N-terminal mở rộng đến MADS-box có ảnh
hƣởng lớn đến tính đặc hiệu của liên kết DNA [45].
1.3. Met và vai trò của Met trong đ p ứng điều iện bất lợi
Methionine (Met) là một gốc amino acid có vai trò vô cùng quan trọng đối
với đời sống của sinh giới. Về cấu trúc, phân tử Met có chứa một gốc lƣu
huỳnh. Met là một phân tử kỵ nƣớc, hầu hết dƣ lƣợng Met trong protein có
hình cầu và đƣợc tìm thấy bên trong lõi kỵ nƣớc. Ở khoảng gian màng tế bào
thì Met thƣờng đƣợc tìm thấy trong trạng thái tƣơng tác với lớp lipit kép. Đối
với một số protein thì một phần dƣ lƣợng Met s đƣợc phân bố trên bề mặt.
Dƣ lƣợng Met dễ bị ôxi hóa thành methionine sulfoxide. Theo Levine cho
r ng dƣ lƣợng Met giống nhƣ là những chất chống ôxi hóa nội sinh trong
protein [32].
Vai trò của Met thƣờng đƣợc biết đến là chất chống ôxi hóa, chất xúc tác,
cấu trúc nên protein, có khả năng ôxi hóa-khử và điều chỉnh phù hợp. Trong
nghiên cứu gần đây của Vally đã xác định đƣợc r ng dƣ lƣợng Met trong
protein thƣờng đƣợc định vị để hình thành nên các liên kết kỵ nƣớc giữa các
nguyên tử lƣu huỳnh với các v ng thơm, bao gồm tryptophan, phenylalanine
và tyrosine [48]. Những liên kết kỵ nƣớc giữa lƣu huỳnh với v ng thơm rất
phổ biến và đ ng g p vào sự ổn định của cấu trúc protein với năng lƣợng liên
kết từ 1,0-1,5 kcal/mol. Những amino acid chứa v ng thơm là một trong
những chất dễ bị ôxi hóa nhất bởi các phản ứng, để tƣơng tác với Met thì cần
thiết lập vị trí tối ƣu để bảo vệ protein chống lại sự ôxi hóa. Quá trình chuyển
đổi Met thành MetO (methionine sulfoxide) s loại bỏ liên kết kỵ nƣớc và có
12


khả năng ảnh hƣởng đến cấu trúc không gian của phân tử protein (Kim et al.
,2014). Rinalducci đã chỉ ra r ng khoảng 68% phân tử bị ôxi hóa trong tế bào

là chính là protein [44], vì vậy đây đƣợc coi là một đối tƣợng rất dễ bị tác
động bởi các điều kiện bất lợi.
1.4. Lịch sử nghi n cứu
1.4.1. Lịch sử nghiên cứu thế giới
Trên thế giới tính đến nay đã c rất nhiều công trình nghiên cứu về vai trò
của các họ TF trong đáp ứng các điều kiện bất lợi trên đối tƣợng thực vật. Cụ
thể, 319 gene thuộc họ bHLH đã đƣợc xác định ở đậu tƣơng [20]. Đáng chú ý,
47% số gene đƣợc biểu hiện ở mô rễ, lá và các mô hạt, trong khi các gene còn
lại đƣợc biểu hiện mạnh ở mô cụ thể (một hoặc nhiều loại mô) [20]. Đối với
họ bZIP, đã tìm và xác định đƣợc 160 gene chia thành 12 phân họ và phân bố
đều trên 20 nhiễm sắc thể của đậu tƣơng [51]. Phân tích mức độ biểu hiện của
các gene mã h a họ bZIP ở đậu tƣơng đã chỉ ra r ng có 83,44% biểu hiện
mạnh ở các mô và 75,6% c mức độ phiên mã đáp ứng với xử lí hạn [51].
Tuy nhiên, chƣa c nhiều nghiên cứu đã ghi nhận về các gene mã h a họ TF
SRF ở thực vật.
Trong genome của cây đậu tƣơng, đã xác định đƣợc 152 thành viên của
họ NAC TF với 58 gene đáp ứng các điều kiện bất lợi [30]. Một nghiên cứu
khác đã xác định đƣợc 21 gene GmNFYA, 32 GmNF-YB và 15 gene GmNFYC trong genome đậu tƣơng c vai tr trong đáp ứng hạn [39]. Đối với TF
WRKY là một họ lớn tham gia vào quá trình sinh lí và đặc biệt là quá trình
đáp ứng điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Trong nghiên cứu này, họ đã xác
định đƣợc 188 gene WRKY, chia thành 3 nhóm chính (I,II,III) [50]. Tuy
nhiên, chƣa c nghiên cứu nào ghi nhận về vai tr của các amino acid c thể
liên quan đến đáp ứng bất lợi ở các nh m TF ở thực vật.

13


1.4.2. Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam
Gần đây, 121 và 213 gene mã h a protein giàu Met đã đƣợc xác định một
cách c hệ thống trên cây mô hình Arabidopsis và đậu tƣơng [21]. Trong đ ,

phần lớn các gene đều tham gia vào những quá trình sinh học quan trọng diễn
ra trong tế bào nhƣ phiên mã RNA, protein sửa đổi và tín hiệu Ca2+ [21]. Nhƣ
đã trình bày, Met là một amino acid rất dễ bị ôxi h a dƣới tác động của bất lợi
ngoại cảnh [27]. Chính vì vậy, câu hỏi đƣợc đặt ra là liệu r ng các phân tử
protein giàu Met này tham gia vào quá trình đáp ứng bất lợi ra sao Cụ thể
hơn, các gốc Met liệu c thể bảo vệ phân tử protein khi bị bất lợi tấn công hay
không?

14


Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu nghi n cứu
Trình tự protein và mã định danh của 21 TF giàu Met, bao gồm 11 TF
nh m bHLH, 3 TF nh m bZIP và 7 TF nh m SRF đƣợc khai thác từ nghiên
cứu trƣớc đây [21] (Bảng 2.1)..
Bảng 2. 1: Thông tin về các TF giàu Met đƣợc khai thác trong nghiên cứu.
TF TT Mã định danh

TF TT Mã định danh

08

Glyma10g04890

15

Glyma10g40080

02

Glyma02g00980

09

Glyma11g17120

16

Glyma11g26260

03

Glyma03g04000

10

Glyma13g19250

17

Glyma11g30490

04

Glyma03g32740

11

Glyma20g22280

18

Glyma11g30620

05

Glyma04g04190

12

Glyma02g01600

19

Glyma18g05930

06

Glyma05g19920

13

Glyma05g28960

20

Glyma18g05960

07

Glyma06g04380

14

Glyma08g12170

21

Glyma20g27320

bZIP

bHLH

Glyma01g15930

bHLH

01

TF

SRF

TT Mã định danh

2.2. Phƣơng ph p nghi n cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích đặc tính protein ở đậu tương

 Lấy trình tự của chuỗi protein cần từ cơ sở dữ liệu SOYBASE
( dƣới định dạng FASTA.
 Một số đặc tính, bao gồm số lƣợng amino acid (L), trọng lƣợng phân tử
(molecular weight, mW , điểm đẳng điện (isoelectric point, pI), chỉ số bất ổn
định (Instability index), chỉ số béo (Aliphatic index), độ ƣa nƣớc (grand
average of hydropathicity, GRAVY đƣợc xác định b ng cách đƣa trình tự
amino acid của các protein thuộc 3 họ TF là bHLH, bZIP và SRF vào công cụ
Expasy [17].

15


Hình 2.1: Giao diện trang web ExPASy protparam tool
2.2.2. Phương pháp xây dựng cây phát sinh
Cây phân loại đƣợc xây dựng b ng phần mềm MEGA 7.0 dựa trên
thuật toán Neighbor-Joining [28].
2.2.3. Phương pháp tính %Met ở ngoài vùng bảo thủ
Các nh m TF đƣợc kiểm tra v ng bảo thủ b ng phần mềm MEGA (v.
7.0) [28]. Trình tự ngoại biên từ đầu 3 và 5 đến vị trí tiếp giáp v ng bảo thủ
đƣợc tách biệt để xác định sự phân bố các gốc Met b ng công cụ BioEDIT
[22].
2.2.4. Phương pháp xác định vị trí phân bố của protein trong tế bào

Hình 2.2: Cơ sở dữ liệu TargetP

16