Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm a h7n9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRONG CÂY THUỐC LÁ
(Nicotiana benthamiana) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành:

Sinh lý thực vật

Mã số:

9 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Hà Nội, 2019


Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:
1.PGS.TS Phạm Bích Ngọc
2. PGS.TS Chu Hoàng Hà
Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ phiên chính thức họp tại:
Viện Công nghệ sinh học
Vào hồi giờ ngày tháng

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc Gia Việt Nam
- Trang web: http: luanvan.moet.gov.vn
- Viện Công nghệ sinh học

năm 2019


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mới được phát hiện tại Trung Quốc vào năm
2013. Virus cúm A/H7N9 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây
chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh. Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm virus cúm A
thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên bề mặt
capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên
HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1 đến N9).
Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với
thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm. HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên sự
khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt là điểm cắt của enzym protease ở vị trí có sự
glycosyl hóa đã được xác định bao gồm Asn30, Asn46, Asn249 trên tiểu phần HA 1 và Asn421,
Asn493 trên tiểu phần HA2. Cả 5 vị trí này đều có tính bảo thủ cao trên kháng nguyên H7 của các
chủng virus H7N9 gây bệnh trên người và gia cầm chuỗi nối giữa HA1 và HA), hoặc tái tổ hợp

biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch.
Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân
giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (N-acetylneuramic acid) giải
phóng virus trong quá trình lây nhiễm. Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một
protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử
acid sialic (N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm.
Trong đợt dịch cúm đầu tiên từ ngày 31/03/2013 có ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm
A/H7N9 trên người được phát hiện và công bố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc. Chỉ trong
một thời gian ngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virus nguy hiểm này đã lây lan ra 11 tỉnh thành
của Trung Quốc, gây ra 131 trường hợp nhiễm bệnh, đa phần bị suy hô hấp nặng, trong đó 39
người đã tử vong (WHO, 2013). Trong đợt dịch cúm A/H7N9 thứ 5 trên người tại Trung Quốc
diễn ra từ 19/1/2017 đến 14/2/2017 đã khiến 36 người chết trên tổng số 304 người mắc bệnh
(WHO, 2017). Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định đây là một tỷ lệ cao bất thường cho một
sự lây nhiễm mới và xác định H7N9 là chủng virus rất nguy hiểm đối với con người.
Các nghiên cứu về hệ gen, xác định các vùng biến đổi của virus cúm A/H7N9 đã cho thấy virus
A/H7N9 tỏ ra thích ứng nhanh hơn và có độc lực cao hơn với tế bào của loài có vú (người, heo, ...) so với
các chủng virus cúm gia cầm khác. Cho đến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây
truyền từ người sang người - yếu tố cơ bản để A/H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm. Tuy
nhiên, vì sự lan truyền giữa người và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003)
nên cũng cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền người-người của virus H7N9 hiện nay.
Ở Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp cúm A/H7N9 trên người cũng như trên gia cầm; tuy
nhiên, nguy cơ xâm nhập, lan truyền và gây bùng phát dịch rất cao do Việt Nam có đường biên
giới trải dài với Trung Quốc. Vấn đề cấp bách hiện nay ngoài việc triển khai các biện pháp phòng
bệnh chủ động như sử dụng trang thiết bị cho việc giám sát như máy đo thân nhiệt từ xa, các hệ
thống xét nghiệm xác định virus… cần thiết nghiên cứu chủ động sản xuất vacxin phòng bệnh.
Trong những năm gần đây một hướng mới đã được ứng dụng để phát triển các loại vacxin cúm
khác nhau, trong đó có hướng nghiên cứu tạo vacxin thực vật. Hệ thống biểu hiện ở thực vật rất hữu
dụng vì vacxin được tạo ra hứa hẹn sẽ có giá thành thấp hơn từ 10-20 lần so với phương pháp truyền
thống. Tuy nhiên, protein tái tổ hợp được tích luỹ trong cây trồng chuyển gen lại không cao và thiếu
một phương thức tinh sạch protein tái tổ hợp hiệu quả. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay hệ

thống biểu hiện tạm thời là phương pháp hữu ích để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp ở thực vật. Phương
pháp này có ưu điểm nhanh, hàm lượng protein tái tổ hợp cao, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích
trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá.
Nhận thấy việc nghiên cứu biểu hiện các kháng nguyên của virus cúm A/H7N9 trong tế bào thực
vật là rất cấp thiết. Hơn nữa mô hình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện
tạm thời ở thực vật có thể sản xuất vacxin với số lượng lớn và nhanh chóng (1-2 tháng) đáp ứng kịp
1


thời khi dịch bệnh xảy ra. Việc kết hợp kháng nguyên tái tổ hợp với vật liệu nano (ND) nhằm sản xuất
vacxin dạng như virus nhằm tăng cường hoạt tính kháng nguyên. Với cơ sở khoa học và ứng dụng như
trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm
A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana.) thông qua
vi khuẩn Agrobacterium”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
 Biểu hiện và xác định được đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA trimeric và phức hệ
kháng nguyên HA trimeric:ND
 Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật thí
nghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND
3. Nội dung nghiên cứu
(1):Thu thập thông tin, tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên và thiết kế vector biểu hiện
mang gen mã hóa kháng nguyên HA; (2) :Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA
của virus H7N9 ở thuốc lá ;(3): Nghiên cứu tạo phức hệ và khả năng gây ngưng kết hồng cầu của
kháng nguyên HA và HA trimeric:ND (1:12); (4): Nghiên cứu khả năng kích thích đáp ứng miễn
dịch của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND trên động vật thí nghiệm.
4. Đóng góp mới của luận án
- Đã thiết kế thành công 4 cấu trúc vector biểu hiện pCB301/HA mono_ELP pCB301/HA
trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc mang gen HA được tổng hợp nhân
tạo từ gen HA của chủng virus cúm H7N9 và tạo chủng Agrobacterium mang vector tương ứng.
- Biểu hiện và tinh sạch thành công protein HA tái tổ hợp pCB301/HA mono_ELP,

pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc trong cây thuốc
lá bằng phương pháp mITC và IMAC.
- Đã xác định được cấu trúc trimeric của kháng nguyên HA và khả năng gây ngưng kết hồng
cầu của protein HA với hiệu giá ngưng kết của HA trimeric_ELP và HA trimeric bằng 2 HAU,
HA trimeric:ND (1:12) bằng 1024 HAU với lượng 5 µg tại giếng đầu tiên.
- Các kháng nguyên HA dạng HA trimeric và HAtrimeric:ND (1:12) đều gây đáp ứng miễn dịch
ở chuột trong đó HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh hơn HA trimeric.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
5.1. Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen
mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc mã hóa cho các
kháng nguyên HA tái tổ hợp; biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp
biểu hiện tạm thời; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của
các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa
học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm trong thực vật.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp
HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc của chủng virus cúm đang
lưu hành tai Trung Quốc và các chủng A. tumefaciens mang các vector này có thể được sử dụng
để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm.
Quy trình biểu hiện gen HA trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp biểu hiện tạm thời với các
điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp HA
mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc hoặc các protein tái tổ hợp khác.
Kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric : ND được tạo ra trong đề tài luận án là ứng viên tiềm
năng cho sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam.

CHƯƠNG 1
2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo và tổng kết 19 tài liệu trong nước, 140 tài liệu nước ngoài với các nội dung liên
quan bao gồm: (1) Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9 như: nguồn gốc virus cúm A/H7N9, đặc
điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9, đa hợp tạo nên phân type A/H7N9, đặc điểm kháng nguyên bề mặt của
virus cúm A/H7N9, tình hình dịch cúm A/H7N9; (2) Vacxin phòng chống bệnh cúm A như: Một số loại
vacxin phòng bệnh cúm A hiện nay, vacxin tái tổ hợp từ thực vật, các nghiên cứu về vacxin cúm A/H7N9
trên thế giới, một số nghiên cứu vacxin cúm gia cầm ở Việt Nam hiện nay; (3) Biểu hiện tạm thời protein
tái tổ hợp ở thực vật như: Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât, quá trình biểu hiện tạm
thời thông qua Agrobacterium tumefaciens, các chiến lược tăng cường biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực
vật, sản xuất protein tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời, tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật;
(4) Nano kim cương (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học như: giới thiệu chung
về vật liệu nano kim cương, Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ sinh học.
Với các tài liệu thu thập được cũng như kết quả phân tích cho thấy chủng virus cúm H7N9
trước đây đã từng xuất hiện nhưng chỉ gây ra dịch bệnh trên chim tại Hà Lan, Nhật Bản và Hoa
Kỳ. Ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm A/H7N9 đầu tiên trên người được phát hiện và công
bố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc vào ngày 31/03/2013 (WHO, 2013). Đặc biệt, sự bùng
phát dịch cúm H7N9 trên người gần đây nhất được ghi nhận tại Trung Quốc diễn ra từ 19/1/2017
đến 14/2/2017 được xem là đợt dịch thứ 5 đã khiến 36 người chết trên tổng số 304 người mắc
bệnh (WHO, 2017). Dữ liệu theo dõi về mặt virus học đã phân tích trình tự genome của 83 chủng
phân lập từ môi trường (2 trường hợp) và người bệnh (81 trường hợp) cho thấy các chủng gây
bệnh trên người vẫn tương tự những chủng đã được phân tích năm 2013.
Phân tích hiện đang được tiến hành để xác định xem các virus vacxin hiện có liên quan kháng
nguyên với virus ở đợt dịch thứ năm hay không. Theo Tổ chức Y tế thế giới không loại trừ khả năng
cúm gia cầm A/H7N9 lây từ người sang người trong những ổ dịch mới đây tại Trung Quốc. Mặc dù,
cho đến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ người sang người - yếu
tố cơ bản để H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm. Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa người
và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cũng cần phải cảnh giác về
khả năng lây truyền người-người của virus H7N9 hiện nay. Điều này gây ra nhiều khó khắn cho việc
nghiên cứu sản xuất vacxin phòng chống virus cúm A. Các vacxin được sản xuất từ các chủng virus
dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ yếu là vaccine sống – nhược độc và vacxin vô hoạt.

Vacxin vô hoạt thường an toàn, có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sang nhưng hiệu quả bảo
hộ không cao. Vacxin nhược độc tạo ra miễn dịch nhược độc tốt hơn với các chủng tương đồng nhưng
mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng mới, có nguy cơ phát triển độc
tính trở lại, bản thân của virus vacxin sau nhiều lần truyền nhiễm có thể đột biết trở thành cường độc.
Để nâng cao hiệu quả phòng chống virus cúm A, việc nghiên cứu sản xuất các loại vacxin thế hệ
mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới hiện nay là rất cần thiết. Vacxin tiểu đơn vị được sản xuất
trong thực vật phòng chống virus cúm là hướng nghiên cứu mới đã được đánh giá là có triển vọng và
ưu điểm như ổn định và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi
phí sản xuất thấp. Protein HA là những protein kháng nguyên mang gen của chủng virus H7N9 được
lựa chọn là những ứng viên có tiềm năng để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng chống virus cúm A.
Hiện này có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein HA của virus cúm đã được thử nghiệm, trong những
hệ thống đó chúng tôi đã sử dụng hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương pháp biểu
hiện tạm thời nhờ Agrobacterrium là phương pháp để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm đã
được chứng minh như: Hàm lượng kháng nguyên cao, thời gian biểu hiện nhanh, không bị ảnh hưởng
của vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn
toàn như mô lá. Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen và tính kháng nguyên của virus cúm A gây
bệnh trên gia cầm và các thành tựu đạt được về biểu hiện, sản xuất vacxin tiểu đơn vị trong thực vật
phòng chống bệnh cúm là căn cứ để chúng tôi thực hiện đề tài luận án này.
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3


2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng Escherichia coli DH5α; Chủng A. tumefaciens C58C1; Chủng A. tumefaciens
C58C1 mang vector pIBT-35S-HC-Pro PVY chứa gen mã hóa protein HcPro PVY.
2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật
Vector pUC/HA mang gen mã hóa cho kháng nguyên nhân tạo được tổng hợp bởi công ty SGIDNA
của Thụy Điển; Vector tách dòng pBT (Phan và cs., 2005); Vector pRTRA35S-HA-histag-cmyc100xELP-KDEL

và
vector
pRTRA-35S-H5pII-histag-cmyc-ELP-KDEL
và
Vector
pRTRA_35S_SP_His_ H5_pII_IgMFc _cmyc_KDEL đã được thiết kế (Phan và cs., 2013); Các
vector chuyển gen pCB301-Kan (dựa vào pCB301 của Xiang và cs., 1999) và pBT/Hcpro PRSV;
Cây thuốc lá N. benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C .
2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Các mồi sử dụng để khuếch đại vùng mang các gen mã hóa H7: cặp mồi nhân gen HA
mono_ELP là H7-BamHI_F, H7-BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric TrH7-PspOMI_R,
H7-BamHI_F và H7-BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric-IgMFc là M-BamHI-trimer_R,
H7-BamHI_F; cặp Mồi giải trình tự gen H7 35S-SQF và 35STerm.
2.1.4 Hóa chất
Kit tách chiết RNA từ thực vật GenElute TM Total RNA Miniprep (Sigma), kit tách chiết
plasmid QIAprep Spin Miniprep , kit thôi gel QIAquick Gel Extraction và kit tinh sạch DNA
QIAamp DNA mini của hãng QIAGEN, thang DNA 1 Kb, protein (Fermentas), các loại enzyme hạn
chế của Fermentas. Các hoá chất khác như: Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Trypton, KCl, Tris
HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, nước khử ion; các loại kháng
sinh kanamycin, rifamycine, spectinomycin và các hóa chất thông dụng khác của các hãng
Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech… Kháng thể kháng cmyc được
tổng hợp từ khuẩn bởi phòng thí nghiệm trọng điểm-Viện Công nghệ sinh học, kháng thể anti-mouse
IgG cộng hợp HRP (Promega - USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl) có trình tự cmyc được tổng
hợp bởi phòng thí nghiệm trọng điểm-Viện Công nghệ sinh học, hóa chất hiện màu TMB (3,3’,5,5’
tetramethylbenzidine), DAB (Diaminobenzidine). Kit hiện phim Super Signal West Pico Trial
(Thermo Scientific).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo chủng A. tumefaciens
cho biểu hiện tạm thời.
Phân tích và tổng hợp thông tin về trình tự gen HA mã hóa cho kháng nguyên hemagglutinin

của virus cúm A/H7N9 đang gây bệnh ở Trung Quốc trên Ngân hàng GenBank. Thu thập thông tin
về các bộ mã phổ biến được ưu tiên sử dụng trong bộ máy sản xuất protein của thực vật. Lựa chọn
các bộ mã ưu tiên tương thích để cải biến trình tự gen HA sao cho phù hợp với hệ biểu hiện thực vật,
đồng thời bổ sung trình tự nhận biết của một số enzyme cắt hạn chế cho mục đích thiết kế vector
chuyển gen. Đặt hàng công ty để tổng hợp nhân tạo đoạn gen HA đã đổi mã.
Thành phần phản ứng PCR bao gồm : DNA khuôn 50 ng, Mồi xuôi 0,1 µM, Mồi ngược
0,1 µM, dNTPs 0,2 µM, Pfu DNA polymerase 2,5 U, 10X đệm Pfu DNA polymerase 5 µl, Tổng
thể tích 50 µl. Chu trình nhiệt như sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ lặp lại các bước 94 oC/30 giây,
58oC/30 giây, 72oC/1 phút 30 giây; 72oC/5 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose
0,8% sau đó đưuọc tinh sahj và xử lý với enzyme cắt giới hạn đã được thiết kế để ghép nối vào
plasmid pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP và biến nạp vào E.coli theo phương pháp sốc nhiệt
của Sambrook và cộng sự (2012).

4


Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung kháng
sinh 50 mg/l kanamycin. Vector tái tổ hợp được tách chiết từ các khuẩn lạc cho kết quả PCR
dương tính (Colony-PCR) được giải trình tự, sử dụng các cặp mồi như trình bày trong Bảng
2.1 và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7
(DNAstarinc, Madison, WI, USA).
2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen
Vector nhân dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng HA mono_ELP, HA
trimeric_ELP, HA trimeric, HA trimeric-IgFMc và vector chuyển gen thực vật pCB301 cùng
được phân cắt bằng enzyme HindIII. Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao pCB301 35S-HA
mono_ELP, pCB301 35S-HA trimeric_ELP, pCB301 35S-HA trimeric – KDE và pCB301 35SHA trimeric_ELP–KDE và được ghép nối vào khung vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase và
được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt (Sambrook và cs.,
2012). Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được thực hiện trên môi trường LB
đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng phản ứng Colony-PCR. Các vector tái tổ hợp mang gen
đích pCB301 35S-HA mono_ELP, pCB301 35S-HA trimeric_ELP, pCB301 35S-HA trimeric –

KDE và pCB301 35S-HA trimeric_ELP–KDE, được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính
và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn HindIII và NcoI. Các vector chuyển gen sau
đó được biến nạp vào chủng A. tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện. Tách chiết và
tinh sạch plasmid: Plasmid được tinh sạch theo phương pháp của Sambrook và cộng sự (2012).
Sử dụng bộ kít do hãng Fermentas cung cấp để tinh sạch plasmid. Phương pháp xử lý AND bằng
enzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản
xuất bọ Kit sử dụng enzyme.
2.2.3. Các phương pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái
tổ hợp trong lá thuốc lá.
2.2.3.1. Chuẩn bị dịch khuẩn
Các dòng khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1 mang vector đích chứa
đoạn gen mã hóa protein HA và Agrobacterium tumefaciens C58C1 mang vector chứa gen mã hóa
protein HcPro PRSV cũng được nuôi trong 5 ml môi trường YEB có bổ sung 50 µg/ml Rif và 100
µg/ml Spectinomycin (Spec) qua đêm. Sau đó 1 ml dịch nuôi được nuôi tiếp trong 50 ml YEB chứa
50 µg/ml Rif và 100µg/ml Spec qua đêm. Toàn bộ dịch nuôi này được dùng để nuôi chuyển tiếp
trong 500 ml YEB bổ sung 50 µg/ml Rif và 100 µg/ml Spec qua đêm. Khuẩn được thu nhận bằng
cách ly tâm 4000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Cặn khuẩn của 2 chủng được hòa tan trong đệm MES (10
mM MgCl2; 10 mM MES; pH 5,6) tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp. Dịch khuẩn có thể dùng
riêng rẽ hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích của thí nghiệm.
2.2.3.2. Phương pháp xâm nhiễm khuẩn vào cây thuốc lá
Cây Nicotiana benthamiana từ 4-8 tuần tuổi được dùng để biến nạp. Trước khi biến nạp, bọc giấy
quanh bầu đất sau đó mới úp ngược cây xuống. Toàn bộ lá cây bị nhấn dìm trong bình chứa vi khuẩn
bên trong bình hút chân không. Hút chân không ở 27 inches Hg, 2 phút. Xả không khí ra từ từ, mở
nắp. Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục nuôi và chăm sóc trong buồng sinh trưởng có
điều kiện ánh sáng 5.000 – 7.000 Lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 - 70%.
2.2.3.3. Tách chiết protein tổng số
Protein tổng số từ mẫu lá được tách bằng dịch chiết: PBS (Phosphate-buffered saline) 0,05% Tween
theo tỉ lệ 1:2 (Trọng lượng mẫu lá - g) : Thể tích dịch chiết - ml) và bảo quản -20 oC. Hàm lượng
protein tổng số được đo ở bước sóng 595 nm theo phương pháp của Bradford năm (1976) với đường
chuẩn được dựng bằng BSA (Bovine Serum Albumin)

2.2.3.4. Điện di SDS-PAGE và lai miễn dịch Western blot
Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong mẫu protein tách chiết từ lá xâm nhiễm khuẩn
được đánh giá bằng lai miễn dịch Western Blot theo phương pháp của Burnette và cs, 1981.
Điện di SDS-PAGE: Bản gel được chuẩn bị theo công thức của Laemmli, 1970.
5


Western blot : Sau khi điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS, protein được
chuyển qua màng bằng máy Pierce G2 Fast Blotter ở chế độ 25 V và 1,3 mA trong 20 phút. Màng
chứa kháng nguyên được phủ bằng 5% sữa tách bơ pha trong dung dịch PBS 0,05% Tween trong 5
giờ. Rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5 phút.
2.2.4. Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp
2.2.4.1. Phương pháp tinh sạch protein dựa vào sắc ký ion cố định kim loại IMAC (Immobilized
Metal ion Chromatography)
Lá thuốc lá biểu hiện protein tái tổ hợp được làm lạnh trong nitơ lỏng và nghiền thành dạng
đồng nhất trong máy xay sinh tố. Protein tổng số được tách chiết trong đệm 50 mM Tris (pH 8,0).
Dịch chiết được phân tách bằng ly tâm 2 lần (25,000 v/p, 30 phút, 4oC) và được trộn với agarose gắn
Ni-NTA. Hỗn hợp được trộn đều trong 30 phút, 4 oC và được đưa vào cột sắc ký. Rửa cột chứa hỗn
hợp trên 2 lần với đệm rửa (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazole, pH 8,0).
2.2.4.2. Phương pháp tinh sạch protein gắn ELP bằng mITC (membrane-based Inverse Transition Cycling)
Nghiền 100 g lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bổ sung 200 ml Tris-HCl 50 mM (pH 8.0)
lạnh. Ly tâm 13000 v/p trong 30 phút ở 4oC. Bổ sung NaCl đến nồng độ 2 M. Ly tâm 13000 v/p trong
30 phút ở 4oC. Dung dịch được đưa qua màng polyethersulfone (PES) 0,22 µm ở 4oC để thu dịch
chiết trước xử lý. Dịch chiết được làm ấm đến nhiệt độ phòng và lọc qua màng cellulose acetate 0,2
µm sử dụng máy bơm. Rửa màng 2 lần bằng NaCl 2M để loại protein lẫn. Nước Milipore-Q lạnh
được chuyển qua màng lọc để thu hồi protein gắn ELP.
2.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein kháng nguyên tinh sạch
2.2.5.1. Phương pháp đánh giá khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric bằng
phản ứng liên kết ngang (crosslinking reaction)
Để kiểm tra khả năng hình thành trạng thái oligomer của protein gắn cấu trúc tạo trimer,

phản ứng crosslinking được thực hiện theo Weldon và cs, 2010. Cụ thể, 1 µg protein tái tổ hợp
tinh sạch được trộn với Bis [sulfosuccinimidyl] suberate (BS3) đến nồng độ 5 mM và ủ trong 30
phút ở nhiệt độ phòng. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 1M Tris-HCl pH 8.0 đến nồng độ 50
mM và ủ trong 15 phút. Sau phản ứng, protein được điện di biến tính trên gel SDS-PAGE 4-10%
và chuyển lên màng cho phân tích Western blot .
2.2.5.2. Phản ứng ngưng kết hồng cầu
Chuẩn bị tế bào hồng cầu: Thu 8 ml mẫu máu từ tĩnh mạch ở cánh gà khỏe mạnh, chưa từng tiêm
chủng với loại vacxin nào và được hòa trong dung dịch Alserver với tỷ lệ 1: 1. Dung dịch sau đó
được đi ly tâm với thể tích tương đương của PBS với tốc độ 1500 vòng/10 phút để hồng cầu lắng
xuống đáy. Quá trình được lặp lại hai lần với PBS. Sau đó hút 2 ml hồng cầu cho vào 198 ml PBS để
thu được tế bào hồng cầu gà 1% và được bảo quản ở tủ 4°C.
Phản ứng ngưng kết hồng cầu: Phản ứng ngưng kết hồng cầu được thực hiện theo OIC (OIC, 2014). Bổ
sung thêm 50 µl kháng nguyên vào giếng đầu tiên của một tấm nhựa vi chuẩn độ có đáy hình chữ V chứa 50
µl PBS. Pha loãng 2 lần trên toàn bộ hàng, sau đó bổ sung thêm 50 µl 1% tế bào hồng cầu vào mỗi giếng. Kết
quả đã được đọc sau khi ủ đĩa ở 25°C trong 30 min. Nồng độ pha loãng đến điểm cuối cùng cho phản ứng
ngưng kết hồng cầu được xách định là một đơn vị ngưng kết (HAU) (Phan và cs., 2014).
2.2.5.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein HA trimeric tinh sạch khi kết hợp
với hạt Nano kim cương
Phương pháp sản xuất hạt Nano kim cương (NDs)
Bột kim cương (Diamond Innovations, USA) đã được chức năng hóa bề mặt với các nhóm có
chứa oxy bằng phương pháp xử lý trong hỗn hợp axit oxy hóa mạnh (3 thể tích H 2SO4: 1 thể tích HNO3)
trong lò vi sóng làm nóng (~ 100 °C) như mô tả trong nghiên cứu trước đó của Pham Dinh Minh và cộng
sự (2013). Việc xử lý được thực hiện trong lò vi sóng lò phản ứng (100W, Model Discover, CEM) trong 3
giờ. Vào cuối giai đoạn làm nóng trong lò vi sóng, chúng tôi cũng đã có biện pháp phòng ngừa để đảm
bảo rằng axit dư còn lại được pha loãng trước khi thu thập NDs. Lưu ý rằng, để an toàn, lò phản ứng vi
sóng được đặt trong một hộp hơi hóa học để bảo vệ người thực hiện khỏi sự tiếp xúc NO2.
Tổng hợp phức hệ H7 trimeric-ND
6

Hạt Nano kim cương có nồng độ 10 mg hạt/ ml được siêu âm trong 1 giờ trước khi trộn với kháng
nguyên tinh sạch theo tỷ lệ 1:1 (g protein:g hạt), 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 1:12 và 1:15 trong 2 loại đệm khác
nhau PBS và nước deion nhằm tìm ra điều kiện thích hợp cho hoạt tính của protein cũng như đạt được độ
tan của hỗn hợp HApII-NDs tốt nhất. Hỗn hợp hạt và protein tiếp tục được siêu âm trong 1 giờ.
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm HA trimeric-ND
Phương pháp đo kích thước và Zeta potential: Sự phân bố kích thước và Zeta potential của
ND trước và sau khi gắn protein được đo bằng máy phân tích hạt (Delsa @ NanoC, Backman
Coulter, USA). Để phân tích kích thước và Zeta potential, ND và ND gắn protein được hòa lại
trong DI-H2O ở nồng độ 50 μg / mL. Để đánh giá xu hướng kết tủa của các phức hợp ND protein trong đệm muối, các mẫu được hòa tan lại trong 1X PBS trước khi đo kích thước hạt.
Phương pháp phân tích ảnh hiển vi điện tử (Transmission Electron Microscopy -TEM): Đặc điểm bề
mặt và hình dạng của ND và phức hệ HApII-ND được kiểm tra bằng ảnh TEM. ND và H7:ND được
hòa tan bằng nước deion đến nồng độ 1 mg/mL. Hạt trong dung dịch được đặt trên đĩa TEM quan sát.
ND và H7:ND được đánh giá hoạt tính sinh học bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (theo 2.2.5.1). Tỷ
lệ trộn hạt cho kết quả hiệu giá ngưng kết cao nhất được dùng để chuẩn bị cho gây miễn dịch ở chuột.
Khả năng bám của protein với hạt cũng được kiểm tra bằng lai miễn dịch.
2.2.5.4. Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thể trên chuột
Protein tái tổ hợp sau khi tinh sạch, được chuẩn về nồng độ 50 µg/ml và hỗn hợp protein tái tổ
hợp trộn với hạt Nano kim cương theo tỷ lệ tốt nhất (gam protein:gam hạt) sử dụng để gây đáp ứng
miễn dịch trên chuột. Chuột được chia làm 3 nhóm mỗi nhóm 5 con : Nhóm tiêm PBS trộn hạt;
Nhóm tiêm HApII trộn hạt và Nhóm tiêm HA trimeric. Chuột được tiêm dưới da ba lần vào ngày
1, 14 và 28 với liều lượng 200 µl. Huyết thanh từ máu chuột được thu vào ngày thứ 7 sau lần tiêm
thứ 2 và thứ 3. Huyết thanh được chiết từ máu chuột được sử dụng để phát hiện kháng thể IgG
đặc hiệu bằng kỹ thuật ELISA và lai Western blot.
2.2.5.5. Kiểm tra khả năng tạo đáp ứng kháng thể bằng lai miễn dịch và ELISA
Phản ứng lai miễn dịch: Protein từ gel được chuyển sang sang màng nitrocellulose (4oC qua đêm, ở
20 mA). Màng được phủ trong dung dịch PBS1X chứa 5% sữa không béo trong 2 giờ. Tiếp đến,
màng được rửa 3 lần với PBS 1X. Sau đó, màng được phủ với huyết thanh (pha loãng 500 lần) hoặc
kháng thể Anti-mouse H7N9 hemagglutinin/HA antibody (SinoBiological InC.) trong 2 giờ. Màng
được rửa 3 lần với PBS 1X. Màng được phủ với kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (horseradish
Peroxidase) với độ pha loãng 500 lần trong 2 giờ. Tiếp đến, màng được rửa bằng dung dịch PBS 1X

3 lần. Cuối cùng protein trên màng được hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất DAB
(Diaminobenzidine) trong 15 phút đến khi hiện băng màu nâu.
Phản ứng ELISA: Để kiểm tra huyết thanh chuột, các giếng trong đĩa microtiter (ImmunoPlate
Maxisorp, Nalgen Nunc International, Roskilde, Denmark) được phủ với 50 ng kháng nguyên trong
đệm PBS1X và ủ qua đêm ở 40C. Sau đó, đĩa được phủ trong dung dịch PBS1X chứa 5% sữa không
béo trong 2 giờ. Tiếp đến, đĩa được rửa 5 lần với PBS 1X. Đĩa được phủ với huyết thanh (pha loãng
5000 lần) trong 2 giờ. Đĩa được rửa 5 lần với PBS 1X. Sau đó, đĩa được phủ với kháng thể anti-mouse
IgG có gắn HRP (Horseradish Peroxidase) với độ pha loãng 500 lần trong 2 giờ. được rửa bằng dung
dịch PBS 1X 5 lần. Cuối cùng, đĩa được hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất 3,3',5,5'Tetramethylbenzidine (TMB) trong 15 phút, sản phẩm phản ứng cho màu xanh, sau đó cố định màu
bằng HCl 1N, màu vàng của phản ứng được đo ở bước sóng 450nm.
2.2.6. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm
Xử lý và phân tích thống kê kết quả thực nghiệm: phân tích thống kê được thực hiện trên
chương trình Xcxel sử dụng phương pháp Student, t-test 0,05 ≥ p có ý nghĩa thống kê.
2.3. Địa điểm nghiên cứu: Phòng công nghệ tế bào thực vật, phòng thử nghiệm sinh học thuộc
Viện Công nghệ sinh học.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
7


3.1. Tổng hợp nhân tạo và thiết kết vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa
kháng nguyên HA
3.1.1. Tổng hợp nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA
3.1.1.1. Phân tích trình tự gen HA
Tìm kiếm và khai thác thông tin trên ngân hàng gen quốc tế, chúng tôi đã thu thập được trình
tự nucleotide của gen HA mã hóa cho kháng nguyên hemagglutinin của chủng virus cúm A/H7N9
đang gây bệnh trên gia cầm ở Trung Quốc năm 2013 và 2014 với mã số KF918659.1 và KJ411975.1.
Theo đó, gen H7 hoàn chỉnh của chủng này bao gồm 1683 nucleotide mã hóa cho 559 axit amin,
trong đó 18 axit amin dẫn đầu là đoạn peptide tín hiệu đóng vai trò quyết định tham gia vào việc vận
chuyển chuỗi polypeptide xuyên qua màng tế bào, tiểu phần HA1 gồm 321 axit amin và tiểu phần

HA2 gồm 220 axit amin. Khi biểu hiện trong tế bào thực vật, với mục đích giữ lại protein kháng
nguyên hemagglutinin ở mạng lưới nội chất, chúng tôi đã loại bỏ chuỗi peptide tín hiệu gồm 18 axit
amin dẫn đầu (được ký hiệu màu đen trong Hình 3.1), đồng thời, trong quá trình thiết kế vector
chuyển gen sau này, chúng tôi sẽ sử dụng đoạn trình tự gồm 75 nucleotide (được gạch chân ở Hình
3.1) mã hóa cho LeB4 ER-signal peptide là đoạn peptide tín hiệu của gen LeB4 (mã hóa cho protein
legumin type B ở cây đậu răng ngựa Vicia faba) để nối ghép với đoạn gen HA đã được tối ưu hóa.
Trên cơ sở trình tự axit amin suy diễn, chúng tôi đã xác định các vị trí axit amin quy định đặc tính
quan trọng của kháng nguyên HA chủng A/Shanghai/2/2013 đang nghiên cứu bao gồm vị trí glycosyl
hóa, điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể và vị trí epitope, đồng thời so sánh với kháng nguyên
HA của một số chủng virus H7N9 được phát hiện và phân lập trên người và gia cầm tại các vùng dịch
ở Trung Quốc trong các giai đoạn từ 2013-2016.
3.1.1.2. Cải biến trình tự gen mã hóa kháng nguyên HA
Để cải biến mã theo hướng phù hợp với bộ máy sản xuất protein của thực vật, căn cứ vào
bảng tần suất sử dụng các codon ở thực vật trên ngân hàng dữ liệu mã di truyền Codon Usage
Database ( kết hợp với việc sử dụng phần mềm Codon
Optimization 2.0, chúng tôi đã loại bỏ và thay thế các codon hiếm (khoảng 10%) trong gen H7.
Ngoài ra, trình tự ATTTA được cho là gây bất ổn cho quá trình phiên mã (Gutierrez và đtg., 1999)
cũng được loại bỏ. Thêm vào đó, sự hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp được giảm thiểu nhờ sử dụng
phần mềm gốc của Invitrogen. Mặc khác, để thuận tiện cho việc cắt và nối ghép gen trong quá
trình thiết kế vector chuyển gen vào thực vật, hai vị trí nhận biết của enzyme hạn chế BamHI và
PspOMI được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gen H7. Việc đổi mã được chúng tôi thực hiện dựa trên
cơ sở các bộ mã thay đổi sao cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở thực vật nhưng không làm
thay đổi trình tự của axit amin. Trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của các đoạn
gen trước và sau khi đổi mã được kiểm tra và so sánh bằng phần mềm BioEdit. Kết quả cho thấy,
gen HA gốc và gen HA đã cải biến mã có trình tự nucleotide tương đồng 76%, tuy nhiên các vị trí
sai khác không làm ảnh hưởng đến quá trình dịch mã, trình tự axit amin suy diễn từ các gen vẫn
đạt độ tương đồng là 100% ở hình 3.2.
3.1.2. Kết quả tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA mono_ ELP
3.1.2.1. Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_HA mono_ ELP
Gen HA có kích thước 1644 bp được tổng hợp nhân tạo bởi công ty SGI-DNA (USA) nằm

trong vector pUC/HA. Hai đầu đoạn gen này đều chứa trình tự nhận biết của cặp enzyme cắt giới hạn
BamHI và PspOMI. Do đó, chúng tôi đã sử dụng chính cặp enzyme này để thu đoạn gen HA từ
vector ban đầu. Sản phẩm cắt được điện di thu đoạn có kích thước tương ứng với HA khoảng 1,7 kb.
Sản phẩm được thôi gel, tinh sạch và được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 % với thang DNA 1
kb. Kết quả thể hiện (Hình 3.3.A.) đồng thời vectoeer tách dòng trung gian pRTRA35S_H5-histagcmycELP-KDEL cũng được xử lý bằng cặp enzyme BamHI và PspOMI để loại bỏ đoạn gen H5 thu
đoạn khu có kích thước 5,05kb. Các phân đoạn ADN có kích thước khoảng 1,7kb và 5,05kb được thu
nhận và tinh sạch phục vụ cho phản ứng ghép nối tạo vector tách dòng tương ứng pRTRA_HA
mono_ELP.
8


Theo lý thuyết khi cắt vector pRTRA_HA mono_ELP, bằng enzyme BamHI/ và PspOMI thì
plasmid pRTRA tái tổ hợp sẽ cho 2 vạch băng khi kiểm tra trên gel agrose 0,8 %. Ở Hình 3.3.B cho
thấy, khuẩn lạc được tách plasmid được kiểm tra cắt bằng BamHI và PspOMI cho các vạch trùng với
kích thước tính toán lý thuyết của pRTRA_35S_100ELP là 5,05 kb và HA là 1,7 kb.

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector pRTRA_HA mono_ELP , bằng enzyme cắt giới
hạn BamHI/PspOMI
3.1.1.2. Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_HA mono_ ELP
Vector tách dòng trung gian pRTRA35S_HA mono_ELP, cùng được xử lý bằng enzyme
HindIII nhằm thu được đoạn gen mục tiêu bao gồm promoter 35S_ HA mono_ELP và vector mở
vòng. Đối với vector pCB301, để tránh hiện tượng đóng vòng, sản phẩm cắt sau khi tinh sạch được
xử lý tiếp với enzyme SAP. Kết quả điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng
nằm ở kích thước khoảng 5,6 kb theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.5A.2); sản phẩm cắt vector
pRTRA35S_ HA mono_ELP, cho 2 băng, 1 băng có kích thước khoảng 4,1 kb tương ứng với cassette
35S_ HA mono_ELP và băng còn lại có kích thước khoảng 2,6 kb là đoạn khung vector còn lại (Hình
3.5A.1). Các phân đoạn DNA có kích thước 5,6 kb và 4,1 kb sau đó được thu nhận và tinh sạch để
phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tương ứng pCB301_35S_ HA mono_ELP. Để
biết chắc chắn plasmid đã được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α bằng phương pháp sốc
nhiệt, chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến nạp vector tái tổ hợp (các plasmid cho kết

quả dương tính với colony-PCR), sau đó cắt kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn HindIII (Hình 3.5.B).
Các kết quả kiểm tra đã chứng minh vector pCB301_35S_ HA mono_ELP đã được thiết kế thành
công. Vector tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens C58C1, đồng thời chủng
E.Coli mang vector này được giữ dòng bằng glycerol 100% bảo quản ở -80 oC để phục vụ cho các
nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.5. Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP
(A): Xử lý vector pCB301-Kan và vector pRTRA_35S_HA mono_ELP bằng HindIII
(B): Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII
3.1.3. Kết quả tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric_ELP
3.1.3.1. Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_ HA trimeric_ELP
9


Vector tách dòng pRTRA_H5pII_ Histag-Cmyc-100xELP cũng được xử lý bằng cặp
enzyme BamHI và PspOMI để loại bỏ đoạn gen H5 thu đoạn khu có kích thước 5,15 kb. Các
phân đoạn ADN có kích thước khoảng 1,7kb và 5,15kb được thu nhận và tinh sạch phục vụ cho
phản ứng ghép nối tạo vector tách dòng tương ứng pRTRA_HApII_ Histag-Cmyc-100xELP và
được dòng hóa trong tế bào E.coli DH5α. Ở (Hình 3.6) cho thấy, khuẩn lạc được tách plasmid và
kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn BamHI và PspOMI cho các vạch trùng với kích thước tính
toán lý thuyết của pRTRA_35S_pII_ Histag-Cmyc-100xELP là 5,15 kb và HA là 1,7 kb.

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn
BamHI/PspOMI . M: Marker DNA, (1) pRTRA_35S_ HA trimeric_ELP.
3.1.3.2. Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric_ELP.
Kết quả cắt vector pRTRA35S_ HA trimeric_ELP và pBC301cùng được xử lý bằng enzyme
HindIII điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng nằm ở kích thước khoảng 5,6
kb theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.7.A); sản phẩm cắt vector pRTRA35S_ HA trimeric_ELP,
cho 2 băng, 1 băng có kích thước khoảng 4,2 kb tương ứng với cassette 35S_ HA trimeric_ELP và
băng còn lại có kích thước khoảng 2,6 kb là đoạn khung vector còn lại (Hình 3.7.A).

Các phân đoạn DNA có kích thước 5,6 kb và 4,2 kb sau đó được thu nhận và tinh sạch để
phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tương ứng pCB301_35S_ HA trimeric_ELP.
Để biết chắc chắn plasmid đã được biến nạp vào chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến
nạp vector tái tổ hợp, sau đó kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn HindIII (Hình 3.7.B) Các kết quả
kiểm tra đã chứng minh vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP đã được thiết kế thành công. Vector
tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens C58C1.

Hình 3.7. Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric_ELP
3.1.4. Kết quả tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric
3.1.4.1. Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_ HA trimeric
Vector tách dòng pRTRA_H5pII sau khi được xử lý bằng enzyme BamHI/PspOMI được
gắn với gen HA và được dòng hóa trong tế bào E.coli DH5α. Kết quả cho thấy ở (Hình 3.8)
khuẩn lạc được tách plasmid và kiểm tra bằng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI cho các vạch
trùng với kích thước tính toán lý
thuyết của pRTRA_35S_pII_ là 3,6 kb và
HA là 1,7 kb.

10


Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn
BamHI/PspOMI . M: Marker DNA, (1) pRTRA_35S_ HA trimeric.
3.1.4.2. Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric.
Vector tách dòng trung gian pRTRA_35S_ HA trimeric và pBC301cùng được xử lý bằng
enzyme HindIII nhằm thu được đoạn gen mục tiêu bao gồm promoter 35S_ HA trimeric. Kết quả
điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng nằm ở kích thước khoảng 5,6 kb theo
đúng tính toán lý thuyết, sản phẩm cắt vector pRTRA 35S_ HA trimeric cho 3 vạch băng: 1 vạch có
kích thước khoảng 2,5 kb tương ứng với cassette 35S_ HA trimeric, 2 băng còn lại có kích thước
khoảng 1,7 kb và 0,9 kb là đoạn khung vector còn lại (Hình 3.9.A).
Các phân đoạn DNA có kích thước 5,6 kb và 2,6 kb sau đó được thu nhận và tinh sạch để phục vụ

cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tương ứng pCB301_35S_ HA trimeric. Để biết chắc
chắn plasmid đã được biến nạp vào chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến nạp vector
tái tổ hợp, sau đó kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn HindIII (Hình 3.9.B) các kết quả kiểm tra đã
chứng minh vector pCB301_35S_ HA trimeric đã được thiết kế thành công. Vector tái tổ hợp sau
đó được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens C58C1.

Hình 3.9. Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric. bằng HindIII.
3.1.5. Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric-IgMFc
3.1.5.1. Tạo vector tách dòng mang gen mã hóa protein HA trimeric-IgMFc
Thiết kế vector tách dòng pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc. Xử lý đồng thời
đoạn gen HA trimeric-IgMFc đã khuếch đại và vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc
bằng cặp enzyme BamHI và PspOMI. Gen HA đã xử lý enzyme và đoạn khung vector sau khi
loại bỏ gen mã hóa kháng
nguyên H5 (khoảng 1,5 kb)
còn lại có chiều dài gần 4,3
kb được thu nhận và tinh
sạch (Hình 3.10 A, B) phục
vụ cho phản ứng nối
ghép bằng T4-DNA ligase để
tạo vector tái tổ hợp
pRTRA_35S_SP_His_
HA
trimeric-IgMFc. Kết quả điện
di sản phẩm cắt cho 2 băng
vạch khoảng 1,5 kb và 4,3 kb
theo đúng tính toán lý thuyết
(Hình 3.10.D). Như vậy đã
thiết kế thành công vector
pRTRA_35S_SP_His_
HA

trimeric-IgMFc

11


Hình 3.10. Kết quả thiết kế vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc xử lý vector bằng
BamHI và PspOMI B): sản phẩm tinh sạch đoạn gen HA (1) và khung vector (2) sau khi đã xử
lý bằng BamHI và PspOMI (C): colony-PCR chọn lọc các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp
(D): cắt kiểm tra vector bằng BamHI và PspOMI.
3.1.5.2. Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_SP_His_HA trimeric-IgMFc
Kết quả điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng nằm ở kích thước
khoảng 5,5 kb theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.11.A.1); trong khi đó sản phẩm cắt vector
pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc cho 2 vạch băng: 1 vạch có kích thước gần 3,2 kb
tương ứng với cassette 35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc, vạch băng còn lại có kích thước gần
2,7 kb là đoạn khung vector còn lại (Hình 3.11.A.2). Các phân đoạn DNA có kích thước 5,5 kb và
3,2 kb sau đó được thu nhận và tinh sạch để phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển
gen CB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc. Vector tái tổ hợp này được kiểm chứng bằng xử
lý enzyme giới hạn HindIII (Hình 3.11. B). Đồng thời để chọn được vector chứa gen mã hóa
protein HA-pII-IgMFc có chiều biểu hiện ngược chiều gen kháng kháng sinh, chúng tôi đã cắt
kiểm tra bằng enzyme NcoI (Hình 3.11.C). Các kết quả trên đã chứng minh vector
pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc đã được thiết kế thành công.

Hình 3. 11. Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc (A): xử lý vector
pCB301-Kan (1) và RTRA_35S_SP_His_HA trimeric_IgMFc (2) bằng HindIIIB): Cắt kiểm tra
vector CB301_35S_SP_His_HA trimeric_IgMFc bằng HindIII (C): Cắt kiểm tra vector
pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc bằng NcoI.
3.2. Tối ưu các điểu kiện biểu hiện và tinh sạch protein HA tái tổ hợp
3.2.1. Tối ưu các điểu kiện biểu hiện protein HA tái tổ hợp
3.2.1.1. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ
Để đánh giá mức độ hoạt động của vector mang gen mã hóa cho protein tái tổ hợp HA và

vector hỗ trợ mang gen mã hóa cho protein HcPro_PRSV ức chế bất hoạt gen hoạt động dưới sự
kiểm soát của promotor CaMV35S, hai thí nghiệm khác nhau được thực hiện đồng thời sử dụng
chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector hỗ trợ trên. Ở thí nghiệm đầu tiên chủng vi khuẩn
12


mang gan mã hóa cho protein tái tổ hợp HA được nuôi đến khi nồng độ khuẩn OD600 đạt 0,5 và được
xâm nhiễm vào cây thuốc lá (4-6 tuần tuổi) bằng phương pháp hút chân không. Ở thí nghiệm thứ 2
chủng vi khuẩn mang gan mã hóa cho protein tái tổ hợp HA được nuôi đến khi nồng độ khuẩn OD 600
đạt 0,5 và được xâm nhiễm vào cây (4-6 tuần tuổi) cùng với vector hỗ trợ pIBT/HC-Pro PRSV bằng
phương pháp hút chân không. Mẫu lá sẽ được thu sau 6 ngày xâm nhiễm để tách protein. Mức độ
biểu hiện của HA khi không có vector hỗ trợ và có vector hỗ trợ được đánh giá bằng phương pháp lai
miễn dịch. Kết quả thể hiện ở Hình 3.12.

Hình 3.12. Kết quả đánh
giá biểu hiện kháng nguyên
HA
(A): Dịch chiết protein khi không sử dụng vector hỗ trợ ; (B): Dịch chiết protein khi sử dụng vector
hỗ trợ HcPro PRSV.
3.2.1.2. Kết quả tối ưu quy trình biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA trên cây thuốc lá
Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp nói chung và kháng nguyên HA nói riêng ở thực vật bằng
phương pháp biểu hiện tậm thời khi sử dụng máy hút chân không chưa từng được tiến hành ở Việt
Nam. Mặc dù quy trình thực hiện đơn giản nhưng có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng biểu hiện
của protein tái tổ hợp như: Nồng độ chất dẵn dụ Acetone syringone (AS), nồng độ vi khuẩn cho xâm
nhiễm, vị trí lá xâm nhiễm, thời gian thu mẫu lá. Vì vậy, việc tiến hành xây dựng một quy trình chuẩn
cho biểu hiện protein tái tổ hợp là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tối ưu bốn
yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện tạm thời HA trong điều kiện có sự hỗ trợ của protein HC-pro là:
Nồng độ chất dẫn dụ acetone syringone (AS), nồng độ khuẩn cho xâm nhiễm, vị trí lá xâm nhiễm và
thời gian thu mẫu. Kết quả biểu hiện của HA tại các điều kiện khác nhau được đánh giá bằng lai miễn
dịch (Hình 3.13) và phân tích bằng phần mềm ImageJ. Số liệu được xử lý trên Excel và ảnh hưởng

của các yếu tố đến biểu hiện của protein HA được đánh giá bằng phần mềm INOVA.

Hình 3.13. Kết quả biểu hiện protein HA tại các điều kiện thí nghiệm khác nhau
M: Marker; 1,2,3,4,5,6,7,8,9: Dịch chiết protein từ lá biểu hiện protein tại các công thức thí
nghiệm L1,L2,L3,L4,L5,L6,L7,L8,L9; 10,11,12,13 lần lượt là: 50,100,150,200 ng ScFv-cmyc;14:
Đối chứng âm là dịch chiết protein từ cây hút chân không với đệm MES.
3.2.1.3. Tối ưu nồng độ PEG cho tinh sạch protein HA có gắn đuôi ELP
Kháng nguyên tái tổ hợp cần được tinh sạch cho nghiên cứu đặc tính kháng nguyên, khả
năng gây miễn dịch động vật...Trong nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra phương pháp đơn giản để
tinh sạch protein tái tổ hợp dựa trên sự gắn đuôi ELP. Sự chuyển pha nghịch đảo của protein gắn
ELP phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ muối. Sự tăng nồng độ muối và nhiệt độ dẫn đến sự hình
thành các protein không tan, những phân tử protein này sẽ được tách ra khỏi dung dịch bằng ly
13


tâm ở nhiệt độ nhất định. Protein gắn ELP không tan sẽ được hòa tan lại bằng đệm lạnh nồng độ
ion thấp. Meyer và cộng sự đã quan sát thấy nguyên nhân gây ra sự chuyển pha nghịch đảo là do
sự hình thành các khối kết tụ kích thước nhỏ của protein gắn ELP. Những khối kết tụ này có thể
được gắn trên màng. Đây là cơ sở cho thí nghiệm tinh sạch HA mono_ELP và HA trimeric_ ELP
bằng màng lọc dựa trên sự chuyển pha nghịch đảo (mITC). Tuy nhiên, trong quá trình tinh sạch
qua màng ES 0,2 µm khi cho dịch protein trong muối NaCl 2M ở nhiệt độ thường dịch không đi
được qua màng. Nguyên nhân là do có quá nhiều protein tạp chưa bị loại ở các bước li tâm và qua
màng PES 0,22 µm. Vì vậy, để loại bớt protein tạp chúng tôi đã bổ sung PEG 8000 vào dịch
protein sau khi li tâm. Nồng độ PEG đã được tối ưu nhằm thu lại được nhiều HA nhất và ít tạp
nhất. Kết quả tối ưu nồng độ PEG được thể hiện qua (Hình 3.14).

Hình 3.14. Kết quả tối ưu nồng độ PEG cho protein HA trimeric _ ELP
(A): được đánh giá bằng SDS-PAGE; (B): lai miễn dịch
3.2.2. Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein HA
3.2.2.1. Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein HA trimeric bằng IMAC

Protein tái tổ hợp HA sau khi biểu hiện trên lá thuốc lá được tiến hành tách chiết và tinh
sạch để sử dụng cho thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột. Trong nghiên cứu này chúng
tôi có sử dụng phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực. Nhằm loại bỏ sự ảnh hưởng của
các protein không đặc hiệu đến hoạt tính sinh học của kháng nguyên đích HA. Đây là phương
pháp hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với His-tag. Phương pháp này dựa trên xu
hướng tự nhiên của histidine tạo thành một phức hợp với các kim loại hóa trị II (ví dụ như niken)
ở pH trung tính. Sự biểu hiện kháng nguyên HA trimeric và kết quả tinh sạch đã được kiểm tra
bằng điện di SDS-PAGE và phương pháp Western-blot (Hình 3.15.A,B).

Hình 3. 15. Kết quả biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính protein HA trimeric.
(A): Kết quả biểu hiện HA trimeric được đánh giá bằng lai miễn dịch. WT: Mẫu protein tách chiết từ
cây không chuyển gen được sử dụng làm đối chứng âm
(B): Kết quả tinh sạch protein HA trimeric được đánh giá bằng điện di SDS-page và lai miễn
dịch. M: marker, RE: Dịch thô, FL: Dịch qua cột, W: Dịch rửa cột, P: Dịch thu protein HA
trimeric tinh sạch.
3.2.2.2. Kết quả biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA trimeric-IgMFc bằng IMAC
Kết quả biểu hiện đúng protein HA trimeric IgM-Fc được đánh giá bằng Western blot bằng
14


Coomassie-blue (Hình 3.16) cho thấy có vạch băng có kích thước khoảng 100 kDa và 33 kDa
tương ứng với HA trimeric dung hợp IgM-Fc.

Hình 3.16. Kết quả western blot
chứng tỏ sự biểu hiện của kháng nguyên HA
dung hợp IgM-Fc và một trimeric dung hợp IgM-Fc sử dụng kháng thể kháng c-myc. M: Marker
protein 10-170 kDa; 1: Dịch chiết protein chứa kháng nguyên HA dung hợp IgM-Fc; (2): Dịch chiết
protein chứa một trimeric
Kết quả tinh sạch được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE và lai miễn dịch (Hình 3.17) cho
thấy HA trimeric-IgMFc chỉ xuất hiện một băng mầu nâu duy nhất có kích thước khoảng 100 kDa

. Điều này chứng tỏ HApII trimeric-IgMFc đã tinh sạch bàng phương pháp sắc ký ion cố định
kim loại với hiệu suất thu hồi 72,6% và độ tinh sạch là 89,6%.

Hình 3.17. Kết quả tinh sạch HA trimeric-IgMFc bằng sắc ký ái lực (IMAC).
3.2.2.3. Kết quả tinh sạch proten HA mono_ELP bằng mITC
Kết quả cho thấy lượng protein giảm đi rất nhiều ngay khi cho nồng độ PEG 2%,và nồng độ
PEG 10% là protein mất đi nhiều nhất bao gồm cả protein HA và protein tạp. Tuy nhiên, kết quả lai
miễn dịch lại ở hai nồng độ PEG 2%,và nồng độ PEG 10% cho thấy gần như không còn protein tạp.
Phân tích hình ảnh bằng phần mềm Image J cho thấy ở nồng độ 2% PEG 8000 là có băng đậm nhất
(Hình 3.18).

Hình 3.18. Kết quả tối ưu nồng độ PEG cho tinh sạch protein HA trimeric _ ELP được đánh giá
bằng SDS-PAGE (A) và lai miễn dịch (B).
3.3.2.1. Kết quả tinh sạch protein HA mono_ELP bằng mITC
15


Kết quả kiểm tra (Hình 3.19.A) cho thấy ở giếng số 1 (Dịch chiết thô trước xử lý) xuất
hiện nhiều băng protein và trong đó có một băng vạch đậm có kích thước khoảng 108 kDa. Ở
giếng số 2 không xuất hiện băng vạch (dịch chiết cây không chuyển gen), giếng số 3 là đối
chứng dương ScFv-Cmyc. Điều này cho thấy protein HA mono đã biểu hiện thành công trên mô
lá cây thuốc lá. Kết quả chạy điện di các mẫu sau mỗi bước tinh sạch gồm dịch chiết thô trước
xử lý, dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng và dịch tinh sạch protein HA tách rửa
khỏi màng bằng nước lạnh cho thấy protein tái tổ hợp có gắn đuôi ELP đã được giữ lại một
cách chọn lọc trên màng trong khi các protein khác đi qua khỏi màng thể hiện ở một băng vạch
duy nhất tương ứng với kích thước chính xác của HA mono_ELP, và các vạch băng protein
giống nhau giữa dịch thô và dịch đi qua màng trừ băng tương ứng với kích thước với protein tái
tổ hợp gắn ELP. Gel nhuộm Coomassie blue cũng cho thấy protein được tinh sạch bằng phương
pháp mITC có độ tinh sạch và nồng độ cao (Hình 3.19.B). Mức độ tinh sạch, kích thước protein
được đánh giá bằng SDS-PAGE và lai miễn dịch (Hình 3.19).

A
Hình 3.19. Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA mono_ELP bằng SDSPAGE và lai miễn dịch
(A). 1: Dịch chiết thô chứa protein HA mono_ELP, 2: dịch chiết từ cây không chuyển gen, 3: đối
chứng dương ScFv-Cmyc; M:Marker
(B).1,4: Dịch chiết thô chứa protein HA mono_ELP trước xử lý; 2,3: Dịch chiết từ cây không
chuyển gen; 6,7: Dịch rửa màng sau khi khi đưa dịch thô qua màng
5,8; Dịch tách rửa HA mono_ELP khỏi màng bằng nước lạnh.
3.2.2.4. Kết quả tinh sạch protein HA trimeric_ELP bằng mITC
Kết quả kiểm tra (Hình 3.22. A) cho thấy ở giếng số 1và 2 (Dịch chiết thô trước xử lý) xuất
hiện nhiều băng protein và trong đó có hai băng vạch đậm có kích thước khoảng 108 kDa và 72
kDa. Điều này cho thấy protein HA trimeric_ELP đã biểu hiện thành công trên mô lá cây thuốc
lá. Kết quả chạy điện di các mẫu sau mỗi bước tinh sạch gồm dịch chiết thô trước xử lý, dịch ra
khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng và dịch tinh sạch protein HA tách rửa khỏi màng bằng
nước lạnh cho thấy protein tái tổ hợp có gắn đuôi ELP đã được giữ lại một cách chọn lọc trên
màng trong khi các protein khác đi qua khỏi màng thể hiện ở một băng vạch duy nhất tương ứng
với kích thước chính xác của HA trimeric_ELP khoảng 108 kDa (Hình 3.20.B) và các vạch băng
protein giống nhau giữa dịch thô và dịch đi qua màng trừ băng tương ứng kích thước với protein
tái tổ hợp gắn ELP. Gel nhuộm Coomassie blue cũng cho thấy protein được tinh sạch bằng
phương pháp mITC có độ tinh sạch và nồng độ cao (Hình 3.20.B). Mức độ tinh sạch, kích thước
protein được đánh giá
bằng SDS-PAGE và lai
miễn dịch được thể
hiện trên (Hình 3.20).

16


B

A

Hình 3.20. Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA trimeric_ELP bằng SDS-PAGE và lai
miễn dịch
(A). M:Marker; 1, 2: Dịch chiết thô chứa protein HA trimeric_ELP, (B). M: Marker; 1: Dịch chiết
thô chứa protein HA trimeric_ELP trước khi tinh sạch; 2: Dịch đối chứng dương ScFv-Cmyc; 3:
Dịch rửa màng sau khi khi đưa dịch thô qua màng; 4: Dịch tách rửa HA trimeric_ELP khỏi màng
bằng nước lạnh.
3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric bằng phản
ứng liên kết ngang.
Kết quả lai miễn dịch cho thấy protein HA trimeric và HA trimeric_ELP tinh sạch trong điều
kiện biến tính không xử lý BS3 chỉ cho một băng duy nhất tương ứng kích thước monomer của HA
trimeric là khoảng 72 kDa và HA trimeric_ ELP là 108 kDa. Trong khi đó, protein HA trimeric và
HA trimeric_ELP khi được xử lý BS3 đã hình thành cấu trúc trimer tương ứng với kích thước khoảng
hơn 200 kDa và hơn 300 kDa. (Hình 3.21).

Hình 3.21. Kết quả kiểm tra khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric (A) và HA
trimeric_ELP (B) bằng phản ứng crosslinking sử dụng BS3 và lai miễn dịch.
+BS3: Protein được xử lý với BS3; -BS3: Protein không được xử lý với BS3.
3.3. Kết quả tạo phức hệ, khả năng gây ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và phức
hệ HA trimeric:ND
3.3.1. Kết quả tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND
3.3.1.1. Kết quả tổng hợp và đặc điểm hạt ND
Kết quả phân tích phân bố kích thước và ảnh TEM của hạt NDs được thể hiện ở Hình 3.24.
Kết quả cho thấy rằng hạt NDs trong H 2O có kích thước khá đều và không khác nhau nhiều dao
động 5-50nm, trong khi trong PBS 1X các hạt NDs có xu hướng kết tủa lại với nhau thành các hạt
có kích thước lên đến hơn 2000 và độ đồng đều kém (Hình 3.22.A). Ảnh TEM (Hình 3.22.B)
chụp NDs trong H2O cho thấy các hạt nano gắn kết với nhau và có bề mặt không tròn đều.

Hình 3.22. Kết quả tổng hợp và đặc điểm hạt NDs

(A): Sự phân bố kích thước hạt NDs trong H2O và 1X PBS; (B): Ảnh TEM của ND trong H2O
3.3.1.2. Kết quả tổng hợp phức hệ HA trimeric:ND
17


Phức hệ HA trimeric-ND được tạo thành bằng cách siêu âm hỗn hợp hạt NDs với protein
HA trimeric trong 1 giờ. Mẫu được hòa trong H 2O deion và PBS1X để đo kích thước hạt và zeta
potential. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.23.

Hình 3.23. Kết quả tổng hợp và tính chất vật lý của HA trimeric-ND.
( A): Kích thước của hạt NDs trước và sau khi gắn HA trimeric trong H 2O deion
(B): PBS1X Zeta potential của HA trimeric-ND; (C): ND
3.3.1.3. Kết quả sàng lọc tỷ lệ trộn protein HA trimeric và hạt ND
Một trong những ứng dụng quan trọng của vật liệu nano kim cương là cố định protein lên
trên bề mặt giúp tăng độ bền và hoạt tính của protein. Trong nghiên cứu này, protein HA trimeric
được gắn lên toàn bộ bề mặt hạt ND tạo cấu trúc tương tự hạt virus nhằm tăng độ bền của kháng
nguyên tinh sạch cũng như tăng hoạt tính sinh học của kháng nguyên. Bởi vì, khả năng kích thích
kháng thể ở vật chủ của một kháng nguyên phụ thuộc nhiều vào đặc điểm cấu trúc của kháng
nguyên. Chính vì vậy, việc gắn kháng nguyên HA lên hạt ND sẽ giúp tăng khả năng kích thích
đáp ứng miễn dịch ở vật chủ. Bên cạnh đó, hiệu quả tăng độ bền cho protein tinh sạch cũng là
một ưu điểm của ND. Tuy nhiên, nồng độ, tỷ lệ hạt ND trộn với kháng nguyên để hiệu quả bám
của kháng nguyên và hoạt tính sinh học của HA cao nhất cần được đánh giá. Các tỷ lệ trộn
protein với hạt ND bao gồm 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9,1:12, 1:15 (g protein : g hạt) đã được thử
nghiệm. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.24.

Hình 3.24. Kết quả sàng lọc tỷ lệ trộn HA trimeric và hạt ND được đánh giá bằng lai miễn
dịch với kháng thể kháng cmyc
(A) và phản ứng ngưng kết hồng cầu (B). 5µg HA trimeric tinh sạch trộn ND theo tỷ lệ khác
nhau( 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9,1:12, 1:15 , w/w). Sản phẩm được rửa bằng nước và pha trong PBS
cho lai miễn dịch và phản ứng ngưng kết hồng cầu.

3.3.2. Đánh giá khả năng ngưng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA trimeric-IgMFc
18


Hoạt tính sinh học của kháng nguyên tinh sạch HA trimeric-IgMFc và trimeric-IgMFc
được xác định bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu. Phản ứng này dựa trên sự tương tác của
protein HA với các thụ thể có mặt trên tế bào hồng cầu. Quá trình tương tác tạo thành một
mạng lưới, gây ngưng kết hồng cầu. Nếu không có quá trình tương tác giữa protein với thụ
thể, hồng cầu sẽ không bị ngưng kết, các tế bào hồng cầu sẽ bị kéo xuống và hình thành giọt
máu ở đáy giếng chữ V (Hình 3.25).

Hình 3.25. Kết quả phản ứng gây ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên trimericIgMFc và HA trimeric-IgMFc. PBS được sử dụng làm đối chứng âm. Virus bất hoạt chủng
H5N1/Vietnam/2004 được sử dụng làm đối chứng dương.
3.3.3. Đánh giá khả năng gây ngưng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA mono ELP và HA
trimeric ELP.
Kết quả ngây ngưng kết hồng cầu cho thấy protein HA trimeric_ELP và HA trimeric có
khả năng gây ngưng kết hồng cầu với 5 µg protein, trong khi đó PBS dịch chiết protein từ cây không
chuyển gen và HA mono_ELP tinh sạch không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu (Hình 3.26).

Hình 3.26. Kết quả ngưng kết hồng cầu Hemagglutinin HA
Đối chứng dương virus bất hoạt H5N1-2004; protein HA trimeric_ELP; protein HA trimeric; protein
HA mono_ELP; WT- cây không chuyển gen; PBS- đối chứng âm.
3.4. Đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA và phức hệ HA
trimeric:ND trên động vật
3.4.1. Kết quả thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
Trong thí nghiệm trên chuột, tính sinh miễn dịch của kháng nguyên HA trimeric_ELP, HA
trimeric và HA trimeric trộn hạt ND tỷ lệ 1:12 được đánh giá. Các lô chuột được tiêm dưới da ba lần,
mỗi lần tiêm cách nhau 14 ngày, mỗi con khoảng 200 µl. Huyết thanh từ máu chuột được thu vào
ngày thứ 7 sau lần tiêm thứ 2 và thứ 3, được sử dụng như kháng thể 1cho việc tìm kháng thể đặc hiệu
bằng ELISA và lai miễn dịch. Sơ đồ thí nghiệm được thể hiện ở (Hình 3.27).

19


Hình 3.27. Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột
Kết quả (Hình 3.28 ) cho thấy HA trimeric và HA trimeric:ND đều kích thích sinh kháng thể đặc
hiệu với H7 sau lần tiêm thứ 2 và thứ 3 thể hiện ở vạch màu nâu tương đương kích thước H7 khoảng
hơn 60 kDa giống đối chứng dương trong khi đối chứng âm không xuất hiện băng vạch.

Hình 3.28. Kết quả kiểm tra kháng thể IgG đặc hiệu với H7 bằng lai miễn dịch
Kết quả cho thấy đáp ứng kháng thể được tìm thấy ở tất cả các con chuột khi tiêm HA trimeric và HA
trimeric:ND thể hiện ở sự sai khác giá trị ELISA giữa các nhóm này với nhóm đối chứng tiêm
PBS:ND đều có ý nghĩa thống kê (P<0.05). Đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào bản chất kháng
nguyên, lần gây miễn dịch. Kết quả ELISA cho thấy HA trimeric:ND gây đáp ứng miễn dịch mạnh
hơn HA trimeric 4.6 lần ở lần tiêm thứ 2 và ở lần tiêm thứ 3 tỷ lệ này là 1.8 lần (sự sai khác có ý
nghĩa với tất cả các giá trị P<0.05) thể hiện ở (Hình 3.29).

Hình 3.29. Đáp ứng kháng thể ở chuột được xác định bằng ELISA.

20


CHƯƠNG 4
BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Lựa chọn kháng nguyên trong thiết kế vector biểu hiện
Trong nghiên cứu này, ngoài việc biểu hiện tạm thời gen HA mono_ELP, HA
trimeric_ELP, HA trimerric, HA trimeric_gMFc mã hoá cho kháng nguyên HA. Thì việc nghiên
cứu về vị trí điểm phân cắt đơn phân HA0 thành 2 tiểu phần HA 1 và HA2 của kháng nguyên HA
được xác định là một PEIPKGR/GLF (Li và cs., 2015). Trình tự gen HA của các chủng virus cúm
H7N9 gây bệnh trên người và gia cầm tại Trung Quốc không mang vị trí điểm cắt HA gồm mạch
liên tục các axit amin kiềm (multi–basic cleavage sites, ví dụ PQRESRRKK/GLF) – đặc điểm

đặc trưng của các virus cúm H5 và H7 độc lực cao [Senne và cs., 1996; Subbarao và cs., 2003].
Dựa vào các phân tích của Thomas Bowden (2013), trên toàn bộ chuỗi polypeptide HA gồm 559
axit amin, 5 vị trí asparagine có sự glycosyl hóa đã được xác định bao gồm Asn30, Asn46,
Asn249 trên tiểu phần HA1 và Asn421, Asn493 trên tiểu phần HA2. Cả 5 vị trí này đều có tính bảo
thủ cao trên kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H7N9 gây bệnh trên người và gia cầm
trong các giai đoạn 2013-2016. Ngoài ra, virus cúm gia cầm cũng ưu tiên gắn với thụ thể sialic
acid (SA) có liên kết α2,3 với phân tử đường galactose cuối cùng (α2,3-SA), nhân giúp các chủng
virus H7N9 mới có khả năng gắn với thụ thể α2,6-SA, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lây
nhiễm và nhân bản của virus trong cơ thể người.
Các vector biểu hiện tái tổ hợp được thiết kế mang gen mã hoá cho protein HA với mục
đích sẽ tạo ra được các kháng nguyên tái tổ hợp, biểu hiện ở mức cao trong thực vật nhằm
phát triển sản xuất vaccine phòng bệnh cúm gia cầm. Các vector chuyển gen bao gồm pCB301
35S-HA mono_ELP, pCB301 35S-HA trimeric_ELP, pCB301 35S- HA trimeric_IgMFc và HA
trimeric đã được thiết kế thành công và các chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector
chuyển gen tương ứng đã được tạo ra. Các chủng vi khuẩn mang các vector trên đã được sử
dụng để biến nạp vào mô lá thuốc lá bằng phương pháp biểu hiện tạm thời nhằm thu nhận các
kháng nguyên tái tổ hợp với số lượng lớn phục vụ mục đích phát triển sản xuất vaccine. Mức
độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA
trimeric_IgMFc thu dược kết quả như trên đã chứng minh được sự biểu hiện thành công ba loại
kháng nguyên này bằng phương pháp biểu hiện tạp thời nhờ Agrobacterium ở lá thuốc lá với hàm
lượng khá cao: protein HA trimeric_ELP là 62 mg/kg lá tươi (62000 ng/g), HA trimeric là 68
mg/kg lá tươi (68000 ng/g) và HA trimeric_IgMFc là 63 mg/kg (63000 ng/g) lá tươi. Mức độ biểu
hiện kháng nguyên đạt được là cao hơn so với một số kết quả biểu hiện gen HA trong cây trồng
chuyển gen khác. Mức độ biểu hiện protein HA trong cây thuốc lá N. tabacum chuyển gen NtN1ELP chỉ đạt 20,3 mg/kg lá tươi (Hoang và cs., 2011). Trong nghiên cứu trước đó việc kết hợp thẻ
100xELP với C-terminalhemagglutinin và neuraminidase đã làm tăng sự biểu hiện của các
protein trong cả lá và hạt chuyển gen, mức độ biểu hiện của NtHA1-ELP, NtH5-ELP, NtN1-ELP
lần lượt cao hơn 30, 12,5 và 50 lần so với NtHA1, NtH5 và NtN1. Nếu NtHA1-ELP và NtN1ELP có số lần tăng rất cao (30 và 50-gấp, tương ứng), đó là do NtHA1 và NtN1 được biểu hiện ở
cây chuyển gen với nồng độ rất thấp tương ứng khoảng 0,01 và 0,004% TSP (Hoang và cs.,
2014). t Sự ích lũy của hemagglutinin trimeric của Nt (H5pII-ELP) cao gấp 2 lần so với NtH5ELP monomerichemagglutinin với mức 0,5 và 1% TSP tương ứng. Mức độ biểu hiện của NtN1ELP không phù hợp với Nt (pLI-N1-ELP) 4 tetrameric neuraminidase khoảng 0,2%. Trong một
số nghiên cứu, Patel và cộng sự trước đó cũng đã đưa ra các mức protein tổng hợp ELP IL4, IL10

và MaSp2 lần lượt cao hơn 85, 90 và 60 lần so với IL4, IL10 và MaSp2 không được gắn
thẻ100xELP điều này một lần nữa lý cho cho việc gắn thẻ 100xELP đã làm tắng sự tích lũy
protein ở thực vật. Tương tự, Scheller và cộng sự cũng nghiên cứu kết quả biểu hiện scFvs hợp
nhất với 100xELP trong hạt thuốc lá chuyển gen thì sự tích lũy protein trong hạt tăng 40 lần
(Scheller và cs., 2006).
21


Như vậy, mức độ biểu hiện của ba loại protein tái tổ hợp HA trimeric, HA trimeric_ELP và
HA trimeric_IgMFc bằng phương pháp biểu hiện tạm thời nhờ Agrobacterium ở lá thuốc lá N.
benthamiana là cao hơn so với biểu hiện tạm thời nhờ vector virus thực vật hoặc trong cây
trồng chuyển gen. Đặc biệt, hàm lượng của HA trimeric trong lá thuốc lá N. benthamiana đạt 68
mg/kg (68000 ng/g) lá tươi là cao nhất trong 3 kháng nguyên đã nghiên cứu, bên cạnh đó kết
quả tinh sạch giữa các cấu trúc là tương đương nhau. Chính vì vậy trong các bước thí nghiệm
tiếp theo chúng tôi đã lựa chọn và sử dụng cấu trúc HA trimeric cho thí nghiệm gây đáp ướng
miễn dịch trên chuột khi kết hợp với hạt nono.
Khả năng tạo oligomer HA và tăng cường hoạt tinh sinh học
Sau khi tinh chế các protein HA trimeric, HA trimeric_ELP từ lá cây thuốc lá, trạng thái
oligomeric của các protein này được xác định bởi Phản ứng liên kết ngang sử dụng hóa chất
BS3, một chất liên kết ngang hòa tan trong nước và đồng đẳng, phản ứng với các amin chính
của protein để tạo liên kết amide ổn định. Khi protein oligomer được tiếp xúc với BS3, các liên
kết chéo giữa mỗi tiểu đơn vị của protein đa sắc tố được hình thành. Sau khi hình thành liên kết
ngang, các sản phẩm phản ứng được phân tách trên gradient 4-10% SDS-PAGE trong điều kiện
giảm, làm mờ và miễn dịch bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng chống c-myc. Kết quả miễn
dịch được thể hiện trong hình 3.21. B. Đối với monomer của HA trimeric là khoảng 200 kDa và
HA trimeric_ ELP là 300 kDa. Sau khi tinh sạch sau khi biến tính không xử lý BS3 chỉ cho một
băng duy nhất tương ứng kích thước mono của HA trimeric là khoảng 72 kDa và HA
trimeric_ELP là 108 kDa. Kêt quả này cũng trùng hợp với nghiên cứu trức đó của Phan và cộng
sự (2014) Khi H5-ELP và (H5pII-ELP)3 được liên kết chéo riêng lẻ bởi BS3 và được phân tách
trên gradient 4-10% SDS-PAGE, các dải có trọng lượng phân tử 100 kDa và 300 kDa. Các

trọng lượng phân tử này tương ứng với monome và trimer của NtH5-ELP và Nb(H5pII-ELP)3,
tương ứng, trong khi các protein không tiếp xúc với BS3 luôn xuất hiện dưới dạng một dải có
trọng lượng phân tử 100 kDa. Những kết quả này ngụ ý rằng NtH5-ELP là một protein đơn
phân, trong khi Nb(H5pII-ELP)3 là protein trimeric. Kết quả của thí nghiệm liên kết ngang với
protein NtHA1-ELP cho thấy protein là hỗn hợp của protein monomer và trimeric kể từ khi hai
dải miễn dịch tương ứng với 110 kDa và 250 kDa được phát hiện. Kết quả gây ngưng kết hồng
cầu cho thấy rằng, các protein HA sau khi tinh sạch chỉ gây ngưng kết hồng cầu khi chúng ở dạng
đa phân tử, còn protein HA tồn tại ở dạng đơn phân thì không có khả năng gây ngưng kết hồng
cầu. Kết quả này cũng trùng với nhận định của (Phan và cs., 2013). Kết quả phân tích gây ngưng
kết hồng cầu của các protein sau khi tinh sạch cho thấy cấu trúc HA trimeric ngây ngưng kết hồng
cao cao nhất ở 22 HAU, protein HA mono_ELP không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Để
phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo, nhằm làm tăng khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên
chúng tôi đã kết hợp giữa protein tinh sạch HA trimeric với hạt nano kim cương để tạo ra cấu trúc
tương tự như hạt virus nhằm tăng độ bền cho kháng nguyên tinh sạch cũng như làm tăng hoạt tính
sinh học của protein HA. Kết quả hoạt tính sinh học của HA trimeric sau khi kết hợp với hạt nano
cũng được đánh giá bằng phản ứng gây ngưng kết hồng cầu thể hiện trên hình 3.26.B. Kết quả
trên cho thấy hiệu giá ngưng kết hồng cầu cũng tăng theo tỷ lệ trộn protein : hạt từ 1:1 đến 1:12,
hiệu giá ngưng kết cao nhất khi trộn protein HA trimeric với hạt theo tỷ lệ 1:12 đạt 1024 HAU.
Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột
Trong nghiên cứu này, đối với thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột, 2 loại kháng nguyên
tái tổ hợp trong dịch chiết lá thuốc lá đã được tinh sạch và được tiêm cho chuột với liều lượng
gây miễn dịch với kháng nguyên tái tổ hợp là 5 µg/con chuột.
Từ các kết quả xác định kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh chuột bằng ELISA và Western
blot (Hình 3.27- Hình 3.28) các nhóm chuột thí nghiệm được tiêm kháng nguyên tái tổ hợp, HA
trimeric và HA trimeric : ND, đều cho kết quả dương tính với kháng thể IgG.Tuy nhiên, các giá
trị ELISA phân tích huyết thanh học ở các mẫu huyết thanh của các nhóm chuột được gây miễn
dịch bởi các kháng nguyên khác nhau là khác nhau giữa lần tiêm thứ 2 và lần tiêm thứ 3 sau khi
nhắc lại kháng nguyên tương ứng.
22

Kết quả phân tích huyết thanh chuột bằng ELISA ở ngày 21 sau 2 lần tiêm kháng nguyên HA
trimeric và HA trimeric : ND đều đã xác định được kháng thể IgG đặc hiệu. Kết quả lai Western blot
(Hình 3.26.B) cho thấy các kháng thể đều kích thích sinh kháng thể đặc hiệu với H7 sau lần tiêm thứ
2 và thứ 3 thể hiện ở các vạch màu nâu tương đương kích thước HA khoảng hơn 60 kDa giống đối
chứng dương trong khi đối chứng âm không xuất hiện băng vạch. Trong đó, đáp ứng miễn dịch tăng
đáng kể HA trimeric : ND cho khả năng kích thích sinh kháng thể tốt hơn so với kháng nguyên tinh
sạch HA trimeric 4,6 lần ở lần tiêm thứ 2 và ở lần tiêm thứ 3 ( sự sai khác có ý nghĩa với tất cả các
giá trị P <0.05). Trong một nghiên cứu trước đó, hạt như virus tổng hợp được tạo ra bằng cách trộn
hạt vàng 100 nm với protein gai và so sánh khă năng kích thích miễn dịch với protein gai không trộn
hạt. Kết quả cho thấy các hạt như virus tăng cường sự vận chuyển kháng nguyên tới các hạch bạch
huyết, tăng đáp ứng tế bào T của lách và giảm các triệu chứng liên quan đến nhiễm trùng trong mô
hình nhiễm virus coronavirus ở chim (Chen và cs., 2016).
Kết quả xác định kháng thể đặc hiệu kháng HA trimeric và HA trimeric:ND bằng ELISA,
các kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV đã được phát hiện ngay sau 2 lần tiêm và giá trị
ELISA đã tăng lên rõ rệt sau 3 lần tiêm nhắc lại. Như vậy trong 35 ngày theo rõi độ dài miễn
dịch, vẫn phát hiện các kháng thể IgG trong huyết thanh chuột được gây miễn dịch bởi 2 loại
kháng nguyên này. Ở ngày 35, các giá trị ELISA phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu kháng HA
trimeric : ND là tương đối cao.
Từ các kết quả biểu hiện, sinh tổng hợp protein trong lá thuốc lá cho thấy, biểu hiện tạm
thời chỉ biểu hiện protein trong các mô đã biệt hoá, không tạo ra cây chuyển gen nên không gặp
phải những vấn đề về pháp lý đối với cây chuyển gen (An toàn sinh học, các vấn đề về môi
trường sinh thái đối với cây chuyển gen: Ảnh hưởng đến hệ sinh thái trong đất, phát tán nguồn
gen...). Quy trình thực hiện đơn giản, giá thành cho sản xuất thấp, có thể sản xuất lượng protein
mong muốn trong thời gian ngắn. Mức độ biểu hiện cao rất quan trọng. Có thể chỉ cần một lượng
sinh khối lá nhỏ có thể đã đáp ứng được nhiều liều vaccine. Trong khi cây chuyển gen biểu hiện
protein rất thấp, tinh sạch cũng khó khăn đối với các phần thân, rễ. Đối với phương pháp biểu
hiện tạm thời, để duy trì nguyên liệu cho sản xuất vaccine thế hệ mới bằng phương pháp này chỉ
cần lưu giữ các trình tự vector đã được thiết kế thành công (hoặc các chủng Agrobacterium mang
vector tương ứng). Đây cũng là những ưu điểm trong sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp.

Kết quả đạt được là yếu tố quan trọng để tiếp tục nghiên cứu sản xuất vaccine, thử nghiệm
hiệu quả bảo hộ của vaccine tiểu đơn vị sử dụng protein tái tổ hợp HA tổng hợp trong thực vật
làm kháng nguyên vaccine. Đặc biệt là đối với kháng nguyên HA trimeric, mức độ biểu hiện
trong thực vật cao nhất, tính sinh miễn dịch dịch thể tốt nhất trong 3 loại kháng nguyên nghiên
cứu. Đây là các kháng nguyên ứng viên tiềm năng cho nghiên cứu sản xuất vaccine tiểu phần
chống lại virus cúm. Các kháng nguyên tiểu đơn vị đã được sản xuất thành công trong thực vật
với hàm lượng khá cao, tính sinh miễn dịch tốt. Như vậy, các kháng nguyên này cần được tiếp tục
nghiên cứu và phát triển thành vaccine thương mại phòng chống bệnh gia cầm.

23