Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú epinephelus SP phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------

MẪN HỒNG PHƢỚC

NGHIÊN CỨU KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA
VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ
Epinephelus sp. PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN TÁI
TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------

MẪN HỒNG PHƢỚC

NGHIÊN CỨU KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS
GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ Epinephelus sp.
PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60.42.01.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thị Tâm
PGS.TS. Võ Thị Thƣơng Lan

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và
sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Thị Tâm và PGS.TS. Võ Thị Thƣơng Lan, đã hƣớng dẫn
tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ về tài chính cũng nhƣ phƣơng
pháp từ đề tài cấp Nhà nƣớc mã số KC04.03/11-15. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ
Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên ĐHQGHN, đặc biệt là tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học
- Viện Đại học Mở Hà Nội đã chia sẻ khó khăn, giúp tôi triển khai các nội dung của
đề tài.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, gia đình, bạn bè
đã động viên và nhiệt tình ủng hộ để tôi hoàn thành khóa học này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Tác giả luận văn

Mẫn Hồng Phước


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
NỘI DUNG .................................................................................................................4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4
1.1. SƠ LƢỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ ................................4

1.1.1. Cá mú ................................................................................................................4
1.1.2. Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrocis - VNN) ..................................6
1.1.3. Tình hình dịch bệnh VNN .................................................................................7
1.1.4. Phòng và điều trị bệnh VNN .............................................................................9
1.2. VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH (NERVOUS NECROSIS VIRUS NNV) ..........................................................................................................................10
1.2.1. Nguồn gốc .......................................................................................................10
1.2.2. Bộ gen của Betanodavirus ..............................................................................10
1.2.3. Cơ chế gây bệnh của Betanodavirus ...............................................................13
1.3. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƢƠNG VÀ VẮC XIN PHÒNG BỆNH VNN
CHO CÁ MÚ ............................................................................................................16
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch ở cá xƣơng .......................................................................16
1.3.2. Một số kết quả nghiên cứu vắc xin phòng bệnh VNN ở cá mú ......................19
1.3.3. Các loại vắc xin sử dụng cho cá ......................................................................20
1.3.4. Nguyên tắc dùng vắc xin cho cá ....................................................................22
1.4. MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ
THUẬT GEN ............................................................................................................25
1.4.1. Các enzyme sử dụng trong kỹ thuật gen .........................................................25
1.4.2. Vector plasmid ................................................................................................27
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................30
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................................................30
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................30
2.1.2. Các sinh phẩm .................................................................................................30


2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................30
2.1.4. Môi trƣờng và dung dịch .................................................................................31
2.1.5. Thiết bị ............................................................................................................32
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................33
2.2.1. Phƣơng pháp tách dòng ...................................................................................33
2.2.2. Phƣơng pháp biểu hiện ....................................................................................41

2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 46
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................52
3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA
NNV ..........................................................................................................................52
3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số......................................................................52
3.1.3. Kết quả tách dòng gen .....................................................................................55
3.1.4. Biến nạp vector tái tổ hợp pGEMT-T4 Easy vào E. coli JM109 ....................56
3.1.5. Kiểm tra bằng PCR và phản ứng cắt của enzyme giới hạn. ............................57
3.1.6. Kết quả giải trình tự gen T4 mã hóa kháng nguyên vỏ của NNV...................59
3.2. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CỦA NNV ......61
3.2.1.Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 ...........................................................61
3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3) ....................................66
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO KHÁNG THỂ CỦA KHÁNG
NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ...........................................................................................72
3.3.1 Kết quả đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ
hợp trên thỏ ...............................................................................................................72
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ
hợp trên cá mú ...........................................................................................................75
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................78
TÀI LIỆU TIẾNG ANH ...........................................................................................79
PHỤ LỤC ..................................................................................................................87


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Bốn kiểu gen chính của Betanodavirus ....................................................12
Bảng 2.1. Mồi khuếch đại gen T4 .............................................................................30
Bảng 2.2. Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu ......................................................32
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt gen T4 .............................................................36
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 và pGEM - T ..............................37
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ......................................................................39

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng xử lý pGEM - T/T4 bằng enzyme hạn chế ...........40
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 vào pET-32a(+) .........................42
Bảng 3.1 So sánh mức độ tƣơng đồng của trình tự đoạn gen T4 thu đƣợc...............59
Bảng 3.2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử
thần kinh ở hệ thống in vitro .....................................................................................73
Bảng 3.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần
kinh ở mô hình in vivo...............................................................................................73
Bảng 3.4. Kết quả xác định hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus ..........75


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Một số loài cá mú nuôi chủ yếu ..................................................................4
Hình 1.2. Cấu trúc không gian của Betanodavirus ...................................................10
Hình 1.3. Cấu trúc gen của Betanodavirus ...............................................................11
Hình 1.4 Sơ đồ pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen ...................................28
Hình 1.5. Plasmid pET-32a+ .....................................................................................28
Hình 2.1. Quy trình tách dòng gen T4 ......................................................................33
Hình 2.4. Quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV ............41
Hình 2.5. Quy trình đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 46
Hình 3.1. Biểu hiện của cá mú khi mắc bệnh hoại tử thần kinh ...............................52
Hình 3.2. Kết quả điện di RNA tổng số ....................................................................53
Hình 3.3. Kết quả RT-PCR của 10 mẫu RNA tổng số..............................................54
Hình 3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm RT-PCR........................................................55
Hình 3.5 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEMT- T4 ..............................................56
Hình 3.6. Nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trƣờng LB có Ampicilin, chất chỉ thị
màu X-gal, chất cảm ứng IPTG ................................................................................57
Hình 3.7 Tách plasmid từ khuẩn lạc trắng ................................................................57
Hình 3.8 Điện di PCR kiểm tra sự mang gen T4 của plasmid tách đƣợc. ................58
Hình 3.9 Điện di sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra sự mang gen T4 của plasmid tách
đƣợc bằng EcoRI. ......................................................................................................58

Hình 3.10 So sánh độ tƣơng đồng của đoạn gen giải trình tự với đoạn gen T4 của
Betanodavirus mã số HM017077.1 ...........................................................................61
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+- T4 ................................62
Hình 3.12 Cắt vector pGEMT-T4(A) và vector pET32a+ (B) bằng enzyme EcoRI .........63
Hình 3.13. Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 và vector pET32a+ ..........64
Hình 3.14. Đĩa khuẩn lạc thu đƣợc sau khi chuyển gen pET32a+-T4 vào E. coli
JM109 ........................................................................................................................64
Hình 3.15. Điện di đồ kiểm tra sự tạo thành vector pET32a+-T4 trong vi khuẩn E. coli JM109.........65
Hình 3.16. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen T4 trong vector tái tổ hợp ......65


Hình 3.17. Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp pET32a+-T4 vào E.coli BL21. .............66
Hình 3.18. Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E. coli BL21(DE3) mang
vector pET32a+-T4 ....................................................................................................67
Hình 3.19. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra khả năng biến nạp vector tái tổ hợp
pET32a+ -T4 vào chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3). .............................................67
Hình 3.20. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% các mẫu thuộc dòng số 1
và 2 ............................................................................................................................68
Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng số 3, 4 ...................69
Hình 3.22. Kết quả Westen blot của protein tái tổ hợp T4 .......................................71
Hình 3.23. Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS-PAGE ................................72


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BFNNV

: Barfin flounder nervous necrosis virus

CNS

: Central nervous system

CPE

: Cytopathic effect

ELISA

: Enzyme linked immunosorbent assay

GGNNV

: Greasy grouper nervous necrosis virus

GNNV

: Grouper nervous necrosis virus

GS

: Grouper spleen

IFAT

: Indirect fluorescent antibody test

IPTG

: isopropyl β-D- thiogalactoside

NNV

: Nervous necrosis virus

NCR

: Non coding region

ORF

: Open reading frame

RGNNV

: Red spotted grouper nervous necrosis virus

SJNNV

: Stripped jack nervous necrosis virus

UV

: Ultraviolet light

TCID50

: 50% Tissue culture infective dose

VNN

: Viral nervous necrosis

TBS

: Tris Buffer Saline

TBST

: TBS - Tween


BSA

: Bovine Serum Albumin

EDTA

: Ethyllene diamine tetra acetic acid

TAE

: Tris - acetate - EDTA

LB

: Lubria – Bertani

PBS

: Phosphate buffer

IgG

: Immunoglobulin G


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm phát
triển nhanh nhất trên thế giới. Ở Việt Nam, nghề nuôi trồng thủy sản đã không
ngừng phát triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói
riêng và kinh tế đất nƣớc nói chung. Với kim ngạch xuất khẩu năm 2010 đạt 4,94 tỷ
USD thì đây là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho tổng kim ngạch xuất
khẩu của Việt Nam. Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn)
cho biết, giai đoạn 2011 – 2015 ngành Thủy sản hƣớng đến sự phát triển bền vững,
là một ngành xuất khẩu hàng hóa lớn, có khả năng cạnh tranh cao và hội nhập vững
chắc với thế giới. Mục tiêu quan trọng hàng đầu là đẩy mạnh xuất khẩu đạt kim
ngạch 6,5 tỷ USD vào năm 2015 và chiếm khoảng 37% trong khối nông lâm ngƣ
nghiệp. Vì vậy việc quản lý dịch bệnh trên các đối tƣợng chủ lực là yếu tố quan
trọng để đạt đƣợc mục tiêu trên. Tuy nhiên hiện tại nghề NTTS tại Việt Nam đang
gặp phải những trở ngại lớn nhƣ dịch bệnh xuất huyết trên cá rô phi, bệnh đốm đỏ
trên cá trắm cỏ, bệnh đốm trắng trên tôm sú, bệnh virus trên cá biển (cá mú, cá
chẽm, cá bơn)…[3]. Để quản lý các dịch bệnh trên các đối tƣợng quan trọng, nhiều
giải pháp đã đƣợc đặt ra nhƣ: lựa chọn các con giống sạch bệnh, quản lý tốt môi
trƣờng, dinh dƣỡng, sử dụng thuốc và hóa chất, tuy nhiên chƣa mang lại hiệu quả
cao. Vì vậy việc phát triển và ứng dụng các chế phẩm sinh học, đặc biệt là vắc xin
trong NTTS có ý nghĩa cấp thiết trong việc quản lý dịch bệnh đạt hiệu quả cao hơn.
Bên cạnh sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi cá nƣớc ngọt thì nghề nuôi cá
ven biển và cá biển vẫn khẳng định đƣợc vai trò của mình. Trong đó, đối tƣợng cá
mú với những ƣu điểm nhƣ cá có giá trị kinh tế cao, thịt thơm, ngon đang đƣợc

quan tâm phát triển. Tuy nhiên, khi phát triển nuôi cá mú với mật độ cao và nuôi
thâm canh thì cũng phát hiện một số bệnh ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng
cá. Qua nghiên cứu, ngƣời ta đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên
cá mú thƣờng là virus, nấm, vi khuẩn mà trong đó nguy hiểm nhất là bệnh hoại tử
thần kinh (Viral Nervous Necrosis-VNN) hay bệnh não và võng mạc (VER-Viral
1


Encephalopathy) do Betanodavirus còn gọi là Piscine nodavirus gây ra. Chúng gây
bệnh trên cá mú ở tất cả các độ tuổi, song thƣờng gặp nhiều nhất ở giai đoạn ấu
trùng (từ 10-25 ngày tuổi) và cá giống. Biểu hiện lâm sàng là cá bỏ ăn, bơi lờ đờ
trên mặt nƣớc, bơi không định hƣớng. Não xung huyết, cá nhiễm bệnh có biểu hiện
rối loạn về thần kinh nhƣ: bơi không bình thƣờng, lòng vòng không định hƣớng,
mất thăng bằng, đầu chúc xuống dƣới. Cá bệnh ít hoạt động, đầu treo trên mặt nƣớc
hoặc nằm dƣới đáy bể, đáy lồng. Cá chết sau 3-5 ngày có dấu hiệu bệnh với tỷ lệ
cao, có thể từ 80-100%. Ở nƣớc ta, bệnh xuất hiện ở hầu hết các vùng nuôi cá mú
trên cả nƣớc từ tháng 5-10, đặc biệt khi mƣa nhiều, khi nhiệt độ khoảng 25-30ºC.
Tỷ lệ chết do bệnh gây ra dao động từ 50- 100% tùy thuộc vào loài và giai đoạn
xuất hiện bệnh [4].
Từ tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng
đòi hỏi các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn
dịch khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó vắc xin phòng bệnh cho cá là giải pháp
hữu hiệu. Ở nƣớc ta hiện tại vắc xin sử dụng để phòng bệnh cho cá mú là vắc xin
bất hoạt, tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt khoảng 60-65%. Vì vậy, cần có một vắc xin có hiệu
lực cao hơn, đem lại khả năng phòng bệnh tốt hơn, giúp giảm thiểu sự thất thoát do
bệnh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hƣớng đến việc tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ
hợp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV làm tiền đề cho việc
nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh cho cá mú, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên
cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú
Epinephelus sp. phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp”.

2


2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Nghiên cứu gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp T4 của virus phục vụ công
tác chẩn đoán và nghiên cứu nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh hoại tử thần
kinh ở cá mú.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Nghiên cứu đƣợc gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp T4 của virus gây
bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú.
- Xác định đƣợc khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp
T4 trên động vật thí nghiệm làm cơ sở nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh cho cá.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T4 của virus gây bệnh hoại
tử thần kinh (NNV) ở cá mú.
(2) Biểu hiện gen thành công kháng nguyên bề mặt của NNV trong tế bào vi
khuẩn E.coli BL21(DE3).
(3) Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp:
- Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp
trên thỏ.
- Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp
trên cá mú.

3


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. SƠ LƢỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ
1.1.1. Cá mú
Cá mú hay cá song là giống cá có tên khoa học là Epinephelus (tên tiếng
Anh: groupers) thuộc họ (Serranidase), bộ cá vƣợc (Perciformes), lớp cá vây tia
(Actinopterygii), ngành Chordata [65].

Cá mú hoa nâu
Epinephelus malabaricus

( Epinephelus fuscoguttatus)

Cá mú chấm đỏ (Epinephelus

Cá mú dẹt (Cromileptes altivelis)

akaara)

Cá mú bleekeri (Epinephelus bleekeri)

Cá mú chấm tổ ong (E. merra)

Hình 1.1. Một số loài cá mú nuôi chủ yếu
Cá mú là loại cá nƣớc mặn, sống tại những vùng nƣớc ấm, phân bố chủ yếu ở
vùng biển nhiệt đới và á nhiệt đới, tập trung nhiều loài ở vùng biển Thái Bình
Dƣơng. Theo Viện Hải dƣơng học Nha Trang, nƣớc ta có khoảng trên 30 loài cá
mú, trong đó có nhiều loài có giá trị kinh tế cao, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu nhƣ: cá
4


mú vạch (E. brunneus), cá mú chấm tổ ong (E. merra), cá mú đỏ (E. akaara), cá mú

hoa nâu (E. fuscoguttatus), cá mú cáo (E. megachir), cá mú đen (E. heeberi), cá mú
mỡ (E. tauvina). Vùng biển Bắc Bộ có cá mú mỡ, cá mú đen, cá mú cáo. Vùng biển
miền Trung có cá mú đỏ. Vùng biển Đông và Tây Nam Bộ có cá mú đỏ, cá mú mỡ.
Ngoài ra, cũng còn nhiều loài có giá trị cao nhƣng chƣa đƣợc đƣa vào nuôi phổ
biến, chủ yếu có đƣợc là do đánh bắt nhƣ cá mú nghệ (E. lanceolatus).
Nhiệt độ thích hợp cho cá mú là từ 22 - 28oC, thích hợp nhất là từ 25 - 28oC.
Chúng thƣờng sống ở các hốc đá, các áng, vùng ven bờ quanh các đảo có rạn đá san
hô, nơi có độ sâu từ 10 - 30 m, chịu đựng đƣợc độ mặn rộng từ 11 - 41‰. Cá mú
thuộc loài cá dữ, có tính ăn thịt và bắt mồi theo phƣơng thức rình mồi, thƣờng săn
mồi ở nơi yên tĩnh. Cá con mới nở ăn động vật phù du, cá lớn cỡ từ 8 - 12 cm ăn
động vật sống (cá con, tôm, tép...), cá mú rất ít khi ăn mồi đã chết và mồi chìm ở
đáy.
Ở cá mú có sự chuyển đổi giới tính đực cái. Thông thƣờng lúc còn nhỏ chúng là
cá cái, nhƣng khi đạt đến kích cỡ và tuổi nhất định thì chuyển thành cá đực. Tuy nhiên,
vẫn có một số ít không có sự chuyển đổi giới tính. Cá mú có thể đẻ quanh năm nhƣng
tập trung vào những tháng lạnh, nhiệt độ thấp, vì thế ở từng vùng khác nhau, mùa vụ
xuất hiện cá giống cũng khác nhau. Sức sinh sản của cá khá cao, mỗi con cái có thể đẻ
từ vài trăm ngàn đến vài triệu trứng. Tại Việt Nam, nguồn cá giống chủ yếu đƣợc đánh
bắt ngoài tự nhiên vào tháng 5 đến tháng 7 ở miền Bắc và tháng 1 đến tháng 3 ở miền
Trung, ngoài ra có thể nhập khẩu từ Đài Loan, Philippines, Trung Quốc… Năm 2005,
Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản TW2 chính thức thông báo ƣơng giống thành
công loài cá mú đen chấm đỏ. Hiện tại, một số trung tâm giống cũng tự sản xuất đƣợc
một lƣợng giống nhất định nhƣng còn rất ít so với nhu cầu giống của thị trƣờng nội địa
[64].
Cá mú có giá trị kinh tế rất cao, giá thị trƣờng hiện nay đối với loài cá mú
đen và cá mú hoa nâu là 200.000 - 300.000 đồng/kg (kích cỡ từ 800 g - 1 kg). Với
cá mú chấm đỏ loại này có giá 400.000 - 500.000 đồng/kg [65]. Vì vậy, hiện nay
5

ngoài việc đánh bắt tự nhiên, phong trào nuôi cá mú lồng bè cũng rất phát triển. Cá
mú có thể đƣợc nuôi trong các lồng tre, bè gỗ có phủ lƣới, đƣợc đặt cố định hay thả
nổi ở các vùng biển ít gió bão, sóng nhẹ nhƣ các vịnh, đầm phá. Tuy nhiên, cá mú
thƣờng gặp một số bệnh do vi sinh vật gây ra nhƣ: bệnh đốm đỏ, bệnh hoại sơ, bệnh
đƣờng ruột, bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết…[3]. Một trong những bệnh nguy
hiểm nhất do vius gây ra là bệnh hoại tử thần kinh, thƣờng xảy ra ở giai đoạn ấu
trùng và cá giống. Cá bị bệnh thƣờng có tỉ lệ chết cao và nhanh. Hiện nay chƣa có
thuốc đặc trị đối với bệnh này, biện pháp chủ yếu vẫn là phòng ngừa bằng cách đảm
bảo vệ sinh và cách ly với các nguồn virus tiềm tàng.
1.1.2. Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrocis - VNN)
Bệnh hoại tử thần kinh hay gọi là bệnh não và võng mạc do Betanodavirus
còn gọi là Piscine nodavirus gây ra [66]. Virus này ký sinh trong tế bào chất của tế
bào thần kinh trong não và trong võng mạc mắt. Bệnh xuất hiện ở nhiều loài cá biển
và phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau [22]. Những chi tiết đầu tiên mô
tả về bệnh vào những năm 1989 - 1991, bệnh đƣợc phát hiện gần nhƣ đồng thời tại
Úc, Na Uy, Pháp và Nhật Bản [14],[15],[28],[41]. Bệnh VNN sau đó đã đƣợc phát
hiện trên 30 loài cá biển thuộc 14 họ trên vùng biển Thái Bình Dƣơng, khu vực Địa
Trung Hải, Scandinavia và Bắc Mỹ [24]. Bệnh thƣờng gặp ở cá nuôi lồng nhƣ cá
mú điểm đai (Epinephelus malabaricus) - Thái Lan, cá mú mỡ (E. tauvina) Singapore, cá mú vân mây (E. moara), cá mú chấm đỏ (E. akaara) - Nhật Bản, cá
mú bảy sọc (E. septemfasciatus) - Hàn Quốc, cá mú lƣng gù (Cromileptes altivelis)
- Indonesia. Khi nhiễm bệnh, cá thƣờng bỏ ăn, bơi lội mạnh không định hƣớng, đầu
chúc xuống dƣới, chết rải rác, có sự xung huyết trong não mà có thể nhìn thấy đƣợc.
Cá chết và hấp hối hầu hết đều có bóng hơi trƣơng phồng. Cá chết sau 3 - 5 ngày có
dấu hiệu bệnh, tỷ lệ chết 70 - 100% ở cá hƣơng (2,5 - 4 cm), khi cá lớn (15 cm) tỷ lệ
chết giảm còn 20%. Ở Việt Nam, các loài cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng
thƣờng gặp bệnh hoại tử thần kinh. Bệnh phát từ tháng 5 đến tháng 10, đặc biệt khi
mƣa nhiều, nhiệt độ thích hợp cho bệnh phát triển là từ 25 - 30oC [67].
6

1.1.3. Tình hình dịch bệnh VNN
1.1.3.1. Tình hình dịch bệnh VNN trên thế giới
VNN là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, xuất hiện ở hơn 40 loài cá biển trên
toàn thế giới, đặc biệt là cá chẽm, cá mú và một số loài cá biển khác [22],[42]. Bệnh
đã đƣợc báo cáo ở tất cả các châu lục trừ Nam Mỹ [34],[42],[45]. Bệnh thƣờng xuất
hiện ở những khu vực nuôi thâm canh các loài sinh vật biển nhƣ: Châu Đại Dƣơng
(Úc, Tahiti), Địa Trung Hải (Israel, Croatia, Bosnia, Hy Lạp, Malta, Ý, Pháp, Tây
Ban Nha, Bồ Đào Nha, Tunisia), Anh, Scandinavia (Na Uy) và Bắc Mỹ (Mỹ,
Canada). Ở Châu Á, bệnh VNN đã đƣợc báo cáo chính thức từ Úc, Hồng Kông,
Indonesia, Nhật Bản, Malaysia, Philippines, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam
[12],[17],[20],[23],[45],[49].
Trong những năm gần đây, VNN đã thực sự trở thành mối đe dọa đối với
ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới. Năm 1994 - 1995, bệnh này đã gây chết 80
- 90% cá bột và cá giống loài E. akaara ở Nhật. Fukuda và cộng sự (1996) cũng
khẳng định rằng Nodavirus chính là tác nhân gây bệnh cho E.septemfasciatus ở
Nhật, bệnh thƣờng xảy ra khi nhiệt độ cao (tháng 7 - 8). Bệnh VNN cũng đƣợc báo
cáo tại một số nƣớc khác: Tại Thái Lan, bệnh thƣờng xảy ra trên cá mú
E.malabaricus, gây chết 100% nếu cá ở giai đoạn nhỏ, cá lớn chết 20% (Danaxado
và cộng sự, 1995), bệnh có thể xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá
nhƣng khả năng nhiễm bệnh nặng nhất là giai đoạn ấu trùng dƣới 20 ngày tuổi; Tại
Triều Tiên, bệnh có thể gây chết tới 80% số cá chỉ trong một vài tuần (Salem và
cộng sự, 1996) [7].
1.1.3.2. Tình hình dịch bệnh VNN ở Việt Nam
Ở Việt Nam, một số loài cá thuộc họ cá mú cũng đã phát hiện thấy sự hiện
diện của VNN. Trong đó có các loài: E. coioides, E. fuscogutatus, E. tauvina, E.
lanceolatus, E. malabaricus ở Khánh Hoà; loài E. coioides ở Cát Bà (Hải Phòng) và
Cửa Hội (Nghệ An).

7

Bệnh hoại tử thần kinh trên cá biển tại Việt Nam đƣợc báo cáo lần đầu tiên
vào năm 2002 trên cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng ở Hạ Long - Quảng Ninh.
Kết quả điều tra ở huyện Vân Đồn, Quảng Ninh (2002) có số lồng bị bệnh. Bệnh
VNN phát triển mạnh vào mùa có nhiệt độ cao, ở nhiệt độ 28oC độc lực của virus
này mạnh hơn nhiều so với nhiệt độ 16oC [67].
Ở Khánh Hòa (2008), có khoảng 30% hộ nuôi cá biển chịu tác hại của bệnh
này. Giai đoạn cá nhỏ (5 - 20 cm) thƣờng chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn. Tỷ
lệ chết có thể đến 50 - 100% và đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng. Cũng ở Khánh
Hòa vào tháng 7 năm 2008, ngƣời ta đã phát hiện bệnh VNN trên cá mú cỡ 5 - 6 cm
nuôi tại bè của trƣờng Đại học Nha Trang, bệnh lây lan rất nhanh và gây chết 100%
cá trong vòng một tuần. Khi cá trong lồng bị bệnh, ngƣời ta còn quan sát đƣợc một số
loài cá khác sống xung quanh lồng cũng có dấu hiệu tƣơng tự. Kết quả điều tra sơ bộ
của khoa Nuôi trồng thủy sản - Đại học Nha Trang cho thấy cá nuôi tại vùng biển
Khánh Hòa thƣờng gặp bệnh có dấu hiệu tƣơng tự nhƣ bệnh hoại tử thần kinh [4].
Vào tháng 5/2010, tại hai khu vực nuôi cá mú nƣớc lợ bằng lồng của chi hội
nghề cá Hƣơng Giang và chi hội nghề cá Thái Dƣơng Thƣợng Tây thuộc xã Hải
Dƣơng, huyện Hƣơng Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế đã diễn ra hiện tƣợng cá mú đang
nuôi từ một đến hai tháng tuổi chết hàng loạt, số lƣợng thiệt hại ƣớc tính trên 25 vạn
con thả nuôi với tổng giá trị thiệt hại khoảng 450 triệu đồng. Cá bị bệnh có dấu hiệu
bỏ ăn, màu sậm, xƣơng sống cong lên, mắt lồi, bơi lòng vòng, chết rất nhanh, chết
đồng loạt.
Theo số liệu của Nguyễn Ngọc Du và cộng sự, đối với cá mú nuôi tại Vũng Tàu,
bệnh VNN thƣờng xảy ra trên cá giống, 53/64 mẫu bị nhiễm bệnh (tƣơng ứng 82,8%), tỷ
lệ chết do virus gây hoại tử thần kinh là từ 90 - 100% [2].
Một nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2006) về VNN
trên cá song chấm nâu tại tỉnh Hải Phòng và Nghệ An cũng cho thấy có dấu hiệu của VNN
thông qua kết quả biểu hiện bệnh lý bên ngoài và kết quả nghiên cứu mô bệnh học [7].

8

1.1.4. Phòng và điều trị bệnh VNN
Bệnh VNN đã đƣợc phát hiện hơn 20 năm, nhƣng những hiểu biết về cơ chế
bệnh và dịch tễ học vẫn còn hạn chế, đó cũng có thể là một trong số các lý do khiến
cho chƣa có loại vắc xin nào đạt đƣợc hiệu quả mong muốn. Vì vậy, những biện
pháp đảm bảo vệ sinh, tránh các nguồn lây nhiễm vẫn đƣợc coi nhƣ là biện pháp
chủ yếu để tránh gây thiệt hại lớn, cụ thể:
- Lựa chọn cá bố mẹ không mang virus bằng cách kiểm tra trứng cá trƣớc khi
cho cá đẻ bằng kỹ thuật PCR.
- Sát trùng bể ƣơng và dụng cụ bằng Chlorine 100 ppm 1 tuần/lần và rửa kỹ
lại bằng nƣớc sạch trƣớc khi sử dụng. Khử trùng trứng đã thụ tinh bằng ozone,
ozone có thể trung hòa hoàn toàn những virus bám trên bề mặt của trứng, do đó
giảm khả năng nhiễm bệnh cho ấu trùng, hàm lƣợng O3 là 1 g /lít trong 1 phút
(Grotmol và Totland, 2000) [68]. Ngoài ra, có thể sử dụng một trong số những hóa
chất diệt virus nhƣ: iodophor - loại dung dịch có hiệu quả ngay cả ở nồng độ thấp
25 - 100 ppm (Frerichs, 2000), (Maltese và Bovo, 2001) [27],[37]; dung dịch
hypochlorite cũng có hiệu quả khá tốt (Arimoto, 1996) [9].
- Khoanh vùng, tiêu hủy những dìa nuôi, lồng nuôi có dấu hiệu của bệnh VNN;
loại bỏ những đàn cá bột khi đã phát hiện VNN dƣơng tính thông qua kỹ thuật PCR.
- Tăng hoạt động trao đổi nƣớc trong bể ƣơng ấu trùng để đảm bảo môi
trƣờng tốt và loại bỏ bớt tác nhân gây bệnh. Theo Munday và cộng sự (2002), nƣớc
đi vào bể ƣơng nên đƣợc xử lý với ozone và không quay vòng. Tuy nhiên, nếu điều
kiện không cho phép thì chỉ nên tái sử dụng tối đa 1/2 lƣợng nƣớc của bể [42]. Xử
lý nƣớc đi vào bể nuôi với tia UV cũng đƣợc nhiều tác giả khuyến cáo.
- Đối với cá nuôi lồng bè trên biển, thả giống kích cỡ nhỏ mang lại hiệu quả
kinh tế cao hơn, nhƣng do nguy cơ của bệnh VNN gây tác hại lớn ở giống cỡ nhỏ,
vì vậy nên thả giống cỡ lớn để hạn chế tác hại của bệnh VNN.

9

1.2. VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH (NERVOUS NECROSIS
VIRUS - NNV)
1.2.1. Nguồn gốc
Virus gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) thuộc giống Betanodavirus, họ
Nodaviridae. Tên gọi Nodavirus đƣợc bắt nguồn từ tên của một ngôi làng ở Nhật Bản là
Nodamura (hiện nay là thành phố Nodashi), nơi mà Nodavirus đƣợc phân lập đầu tiên
[52].
1.2.2. Bộ gen của Betanodavirus
1.2.2.1. Cấu trúc gen của Betanodavirus

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của Betanodavirus
Betanodavirus không có màng bao, hình cầu, đƣờng kính 25 - 30 nm, 20 mặt
đối xứng, vỏ bao gồm 180 protein.
Bộ gen của Betanodavirus là RNA mạch đơn, sợi (+), tuyến tính hai phía, có
cấu trúc phân đoạn gồm hai tiểu phần RNA-1 và RNA-2.
- Tiểu phần lớn RNA-1 dài 3103 nucleotit mã hóa cho 2 protein: RNA
polymerase phụ thuộc RNA hay gọi là protein A (chứa khoảng 982 axit amin, khối
lƣợng phân tử ƣớc tính 110 kDa) và protein B (11 kDa).
10


- Tiểu phần nhỏ RNA-2 dài 1433 nucleotit mã hóa cho phân tử protein vỏ
lớn có kích thƣớc 42 kDa. Trên RNA-2 chứa một khung đọc mở mã hóa cho một
protein vỏ, có hai vùng bảo tồn cao là T2 (870 bp) và T4 (420 bp) [41],[53].

Hình 1.3. Cấu trúc gen của Betanodavirus
- Đôi khi bộ gen của Betanodavirus có sở hữu thêm một phân đoạn RNA3. RNA-3 là một hệ gen phụ (371 nucleotit) có chứa một khung đọc mở (ORF)
mã hóa protein B2 (giả thuyết là một protein không cấu trúc, có chức năng ức

chế sau phiên mã) [16],[25],[32],[56]. RNA-3 đƣợc hình thành từ quá trình sao
chép RNA-1, chỉ có trong các tế bào bị nhiễm và không đƣợc đóng gói thành các
hạt virus [39],[47].
1.2.2.2. Phân loại kiểu gen của Betanodavirus
Dựa trên tính tƣơng đồng của một trình tự khoảng 421 bp trên RNA-2, type
huyết thanh, vật chủ đặc hiệu và nhiệt độ phát triển tối ƣu ở điều kiện invitro, giống
Betanodavirus đƣợc chia thành 4 kiểu gen chính (bảng 1.1) [33],[47],[48],[55].

11


Bảng 1.1. Bốn kiểu gen chính của Betanodavirus

Kiểu gen

Type
huyết
thanh

Nhiệt độ
tối ƣu

Vật chủ

SJNNV
(Striped jack nervous

A

Striped jack

20 - 25ºC

B

Tiger puffer

20ºC

necrosis virus)
TPNNV
(Tiger puffer nervous
necrosis virus)
BFNNV
(Barfin flounder

C

Các loài cá nƣớc lạnh: Atlantic
halibut, Atlantic cod, flounders...

15 - 20ºC

nervous necrosis virus)
RGNNV
(Red-spotted grouper
nervous necrosis virus)

Các loài cá nƣớc ấm: Groupers,
C

Asian

seabass,

European 25 - 30ºC

seabass...

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các kiểu gen khác nhau của Betanodavirus
phân bố theo các vùng địa lý khác nhau và tính gây bệnh cũng khác nhau:
- Kiểu gen BFNNV và TPNNV có nhiệt độ phát triển tối ƣu thấp hơn 20ºC.
Đây là kiểu gen gây bệnh đối với cá sống ở những vùng biển có nhiệt độ lạnh nhƣ:
Nhật Bản, Bắc Mỹ và Châu Âu. Cá bị bệnh chủ yếu là cá bơn và cá hổ.

12


- Kiểu gen SJNNV là kiểu gen mà bộ gen đƣợc nghiên cứu khá kỹ lƣỡng ở
các nƣớc Nhật Bản, Mỹ và Châu Âu. Nhiệt độ thích hợp thƣờng thấp hơn 25ºC. Cá
bị bệnh chủ yếu là cá sọc.
- Kiểu gen RGNNV là kiểu gen gây bệnh nhiều nhất ở các nƣớc thuộc khu
vực Thái Bình Dƣơng. Nghiên cứu của các tác giả ở nhiều quốc gia nhƣ: Trung
Quốc, Đài Loan, Philippines, Indonesia...đều cho thấy Betanodavirus có kiểu gen
RGNNV gây bệnh trên các loài cá biển ở các quốc gia này. Hệ gen của RGNNV
đƣợc giải trình tự đầy đủ vào năm 2003 cho thấy kích thƣớc RNA-1là 3105 bp,
trong đó từ nucleotit 79 đến 3027 là vùng ORF mã hóa cho protein A (RNA dependent RNA polymerase), kế 2 bên là vùng 5' và vùng 3' không mã hóa (NCR non coding region) với kích thƣớc lần lƣợt là 78 bp và 76 bp. Từ trình tự trên, khối
lƣợng phân tử dự đoán của RNA-1 của RGNNV là khoảng 992.735 Da. Vùng ORF
mã hóa cho protein A với khối lƣợng phân tử ƣớc tính 110.420 Da. Phân tử protein
A có kích thƣớc 982 axit amin, cũng đã đƣợc giải trình tự đầy đủ. Ngoài ra, từ

nucleotit 2753 đến 2980 là đoạn gen mã hóa cho protein B có kích thƣớc 75 axit
amin, kích thƣớc protein này tƣơng đƣơng giữa nhiều loài NNV ở những kiểu gen
khác nhau, vai trò của protein B trong quá trình tái bản của NNV chƣa đƣợc làm rõ.
RNA-2 của RGNNV có kích thƣớc 1434 bp, trong đó từ nucleotit 27 đến 1043 mã
hóa cho protein vỏ của virus có kích thƣớc 338 axit amin. Hai vùng 5' NCR và 3'
NCR có kích thƣớc lần lƣợt là 26 nucleotit và 390 nucleotit. Khối lƣợng phân tử
ƣớc tính của RNA-2 là 459.025 Da và mã hóa cho protein capsid khối lƣợng
khoảng 37.004 Da [16],[36],[45],[58].
1.2.3. Cơ chế gây bệnh của Betanodavirus
1.2.3.1. Sự xâm nhập của virus
Những tổn thƣơng mô bệnh học liên quan tới nhiễm Betanodavirus đều
chứng minh một cách rõ ràng rằng virus tấn công trƣớc tiên vào hệ thần kinh
trung ƣơng (CNS) và võng mạc, nơi có vị trí tái bản của nó. Tuy nhiên còn có

13


những quan điểm khác nhau về con đƣờng cũng nhƣ phƣơng thức lây truyền của
NNV trong cơ thể cá.
Theo Nguyen và cộng sự (1996), một trong số những điểm tái bản đầu tiên
có thể là ở tủy sống. Từ đó virus có thể tới não đầu tiên và sau đó là tới võng mạc
thông qua dây thần kinh thị giác [46].
Munday (1992) và Grotmol (1999) lại đƣa ra giả thuyết rằng lớp biểu mô
phân tầng của ruột trƣớc có thể là điểm tái bản đầu tiên của virus. Virus đƣợc đƣa
vào thông qua nƣớc và thức ăn, ở đây chúng dễ dàng tƣơng tác và thông qua dây
thần kinh sọ não, virus có thể đƣợc đƣa đến não và gây bệnh tích điển hình tại đây
[29],[43].
Ngoài ra, Mladineo (2003) còn phát hiện kháng nguyên ở thùy khứu giác,
điều ấy cho thấy khoang mũi cũng có khả năng là một đƣờng vào của virus bên
cạnh đƣờng qua mang, miệng, da (Peducasse, 1999) [40],[50].

Một số tác giả khác cũng cho biết, kỹ thuật IFAT cho phép phát hiện thấy
virus ở những cơ quan khác nhau của những cá thể cá sống sót sau dịch bệnh nhƣ:
tuyến sinh dục, gan, thận, ruột, dạ dày nhƣng lại không phát hiện thấy virus ở CNS
và võng mạc [26]. Kết quả đó củng cố thêm giả thuyết về sự nhiễm virus của trứng
cá qua con đƣờng tuyến sinh dục.
1.2.3.2. Phương thức lây lan bệnh
Qua quan sát từ thực tế cùng với một số thí nghiệm dƣới những điều kiện
đƣợc kiểm soát, các nhà khoa học đều cho thấy tồn tại hai phƣơng thức lây truyền
bệnh VNN: phƣơng thức lây truyền theo chiều ngang và phƣơng thức lây truyền
theo chiều dọc [29].
a) Sự truyền bệnh theo phương ngang
Là sự lan truyền virus trực tiếp từ những con cá bị bệnh sang những con khỏe
hoặc gián tiếp thông qua thức ăn, dòng chảy lƣu vực mang tới hay qua các vật dụng.
14


Có rất nhiều nghiên cứu trên ấu trùng và cá bột của nhiều loài cá khác nhau
để xác nhận về những yếu tố liên quan đến con đƣờng lây truyền theo phƣơng
ngang. Các thí nghiệm lây nhiễm theo nhiều cách đã đƣợc thực hiện: lây nhiễm
bằng cách nhốt chung các con cá khỏe mạnh với những con cá bệnh, lây nhiễm
bằng cách ngâm cá trong nƣớc có hòa dịch virus. Kết quả đều cho thấy cá bị nhiễm
bệnh và có tỉ lệ chết tùy thuộc hàm lƣợng virus cho thí nghiệm cao hay thấp. Điều
đó cho thấy môi trƣờng nƣớc vẫn luôn là môi trƣờng trung gian cho sự truyền virus
từ những con cá bị bệnh, xác chết thối rữa của chúng hay từ những nơi khác.
Năm 1998, Skrilis và Richards đƣa ra giả thuyết về khả năng nhiễm bệnh
thông qua thức ăn tƣơi hàng ngày nhƣ Artemia salina và Brachionus plicatilis,
những sinh vật phù du, tuyến trùng thƣờng dùng làm thức ăn cho cá ở giai đoạn ấu
trùng. Nhƣng những kết quả phân lập virus và kiểm tra mô học ở 2 loài trên đều cho
kết quả âm tính, vậy nên mới chỉ dừng lại ở giả thuyết rằng chúng chỉ có vai trò nhƣ
những cá thể mang virus cơ học [54]. Đến năm 2005, Chi và cộng sự đã chính thức

phân lập đƣợc virus từ nguồn thức ăn hàng ngày cho cá nhƣ: Artemia salina,
Tigriopus japonicas, Acetesinte medius và khẳng định đó cũng là một trong những
nguồn lây nhiễm virus [19]. Những nghiên cứu của Mori (2005) tiếp đó cũng đã
củng cố thêm cho nhận định trên. Ngoài ra, việc những con cá trong cùng một bể
nuôi ăn thịt lẫn nhau cũng đƣợc xem nhƣ là một con đƣờng lây nhiễm virus [38].
b) Sự truyền bệnh theo phương dọc
Giả thuyết về sự lây truyền theo phƣơng dọc đƣợc đƣa ra khi Arimoto (1992)
phát hiện thấy virus ở trứng đã thụ tinh của striped jack bằng phƣơng pháp ELISA
[8]. Liên tục tiếp đó là những phát hiện tƣơng tự bằng phƣơng pháp PCR và IFAT
đƣợc báo cáo. Một số báo cáo cũng chứng tỏ sự truyền theo phƣơng dọc đã đƣợc
phát hiện ở cá chẽm châu Âu, cá bơn Nhật Bản, cá chẽm châu Á [11],[21],[61].

15