Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía nam và nghiên cứu vắc xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ THU PHƯƠNG

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ORF2 CỦA PCV2 TỪ
HEO NUÔI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM VÀ
NGHIÊN CỨU VẮC-XIN PHÒNG BỆNH LIÊN
QUAN PCV2 TRÊN HEO SAU CAI SỮA

Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi
Mã số: 9.64.01.02
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải
TS. Nguyễn Thị Thu Hồng

TP. Hồ Chí Minh – tháng 11 năm 2019


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan những công bố trong luận án này là trung thực, một phần dữ
liệu là công trình nghiên cứu của tôi chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác, một phần dữ liệu trong luận án thuộc đề tài độc lập trong chương
trình nhiệm vụ nghiên cứu đặc thù, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đặt
hàng theo công văn số 2151/BNN-KHCN ngày 21/4/2011 và theo hợp đồng số 23

HĐ/TC-KHCN giữa Văn phòng Bộ NN-PTNN và Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y –
Công ty TNHHMTV Thuốc Thú Y Trung Ương – NAVETCO ngày 07/6/2011 do
TS. Nguyễn Thị Thu Hồng làm chủ nhiệm. Những số liệu trong luận án được phép
công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì.
Tác giả

Lê Thị Thu Phương


iii

LỜI CẢM ƠN
Xin thành kính biết ơn công lao sinh thành dưỡng dục đến Ba Má.
Xin thành kính ghi ơn PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải và TS. Nguyễn Thị Thu
Hồng đã hết lòng hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình công tác,
học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này.
Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Tất Toàn, PGS.TS. Lâm Thị Thu
Hương, PGS. TS. Nguyễn Văn Khanh, TS. Hồ Thị Kim Hoa, PGS.TS. Lê Thanh
Hiền, PGS.TS. Trần Thị Dân, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã động viên và tận tình
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Công ty Cổ phần Thuốc Thú Y
Trung Ương NAVETCO, BLĐ Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y đã đồng ý và tạo điều
kiện về thời gian, cơ sở vật chất để tôi được học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn
thành luận án này.
Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố
Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm và quý Thầy Cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng
đạo tạo sau đại học đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và tạo điều kiện
thuận lợi cũng như những hỗ trợ khác để tôi hoàn thành khóa học.
Xin chân thành cảm ơn Ông Chris. J. Morrissy và Ông Darren Schafer thuộc
phòng thí nghiệm Australian Animal Health Laboratory – CSIRO, đã cung cấp một

số sinh phẩm trong nghiên cứu này.
Xin chân thành cảm ơn Anh Đặng Hùng, Chị Lam Hương và các bạn đồng
nghiệp Ngọc Ánh, Nhị Hà, Vô Ngôn, Hồng Phúc, Tấn Liêm, Hào Quang, Thu Lâm,
Minh Hải ở Trung Tâm Nghiên Cứu, bạn Kim Phúc và anh Hải, Chị Thu Hà, Chị
Diệu Thúy, Em Thanh Phong đã đồng hành và động viên tôi trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Xin gởi lời cảm ơn và lời yêu thương chân thành đến đại gia đình đã ủng hộ,
động viên tôi trong công tác, học tập và hoàn thành luận án.


iv

TÓM TẮT
Đề tài “Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía

Nam và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa”
được thực hiện nhằm xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2
lưu hành tại một số tỉnh phía Nam Việt Nam và nghiên cứu thử nghiệm vắc-xin phòng
hội chứng còi, giảm lượng vi-rút huyết trong mô và bệnh tích liên quan PCV2 trên heo
dựa trên chủng phân lập trong nghiên cứu. Kết quả đạt được như sau:
Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên toàn bộ ORF2 của 48 mẫu PCV2 thu
thập từ năm 2007 đến 2016 từ 44 trại heo ở 13 tỉnh thành Việt Nam (gồm 12 tỉnh phía
Nam và 1 tỉnh Bắc Trung Bộ) cho thấy, có sự lưu hành đồng thời PCV2b, PCV2d và
PCV2-Re (2h) (trước đây được xếp vào nhóm PCV2 tái tổ hợp, theo cách phân loại
mới được xếp vào genotype PCV2h), trong đó phổ biến nhất là PCV2b (24/48). Sự xuất
hiện và ngày càng trở nên phổ biến của genotype PCV2d, đặc biệt là PCV2d-2 (15/16
mẫu thuộc PCV2d) từ năm 2012 trở đi. Mức độ tương đồng về nucleotide ở mỗi
genotype tương ứng 98,7% - 100% đối với PCV2b, 98,5 - 100% đối với PCV2d-

2 và PCV2-Re (2h) là 98,7 - 100%. Khoảng cách di truyền (p - distance) giữa các

genotype khá cao, từ 0,0595 ± 0,0096 đến 0,0663 ± 0,0102, cao hơn rất nhiều so
với
ngưỡng p = 0,035.
Đã phân lập được 18 chủng PCV2 thuộc các genotype PCV2b (9 chủng),
PCV2d (6 chủng) và PCV2-Re (2h) (3 chủng) từ 21 mẫu bệnh phẩm dương tính PCV2

- thu nhận từ heo có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích bệnh do circovirus. Hiệu giá
vi-rút đạt được trên môi trường tế bào PK15A dao động từ 1,67 đến 5,50log 10
TCID50/ml ở lần tiếp đời thứ 3. Ba chủng thuộc 3 genotype khác nhau có hiệu giá
cao ổn định qua các lần tiếp đời (≥ 5,0log 10 TCID50/ml): NAVET-DongNai2/2009
(PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re
(2h)) được sử dụng để lựa chọn làm giống gốc nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng
bệnh do circovirus trên heo.
Đánh giá sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 thuộc các genotype
khác nhau bằng phản ứng trung hòa chéo. Kết quả cho thấy giữa chủng NAVET-


v

DongNai2/2009 và NAVET-vietnam3/2004 tương đồng hoàn toàn về kháng nguyên
với hệ số R là 104,20%. Hệ số R giữa chủng NAVET-DongNai2/2009 và chủng
NAVET-LongAn2/2012; giữa NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004
tương ứng là 91,60% và 91,30%, tất cả đều > 70%. Qua đây cho thấy, cả 3 chủng
này tuy khác nhau về genotype nhưng tương đồng với nhau về kháng nguyên.
Từ các kết quả nghiên cứu về đặc tính di truyền, nuôi cấy trên tế bào, tương
đồng kháng nguyên cho thấy, chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) đáp ứng đầy
đủ các tiêu chí để được chọn làm giống gốc trong nghiên cứu sản xuất vắc-xin.
Sử dụng binary ethylenimine (BEI) để bất hoạt vi-rút chế tạo kháng nguyên
0

PCV2, với nồng độ BEI 3 mM, ở nhiệt độ 37 C, sau 24 giờ có thể vô hoạt hoàn toàn
các vi-rút thuộc các chủng NAVET-vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 và
NAVET-LongAn2/2012, với tốc độ bất hoạt tương ứng với các chủng lần lượt là
0,71; 0,86 và 1,33log10 TCID50/giờ.
Đánh giá hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm từ chủng
NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b). Thí nghiệm 3: lúc 4 tuần tuổi, heo ở lô thí
nghiệm (n = 6) được tiêm vắc-xin thử nghiệm (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên
6,0

10 TCID50) và sử dụng dịch chiết tế bào PK15A trên lô đối chứng (n = 4). Sau
tiêm vắc-xin 28 ngày, tất cả heo được công cường độc bằng cách nhỏ mũi 2 ml và
tiêm bắp 2 ml với vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 ở tiếp đời thứ 6 với hiệu
giá 5,33log10TCID50/ml. Ở lô thí nghiệm, heo có sự chuyển đổi kháng thể ở 14 - 21
ngày sau tiêm vắc-xin. Heo sau tiêm vắc-xin và công cường độc đều khỏe mạnh,
tăng trọng bình thường, có thời gian vi-rút huyết ngắn, bài thải vi-rút qua phân và
dịch tiết mũi với tỉ lệ thấp hơn so với heo đối chứng. Tỉ lệ heo mắc PMWS trên lô
vắc-xin là 0/6 và ở lô đối chứng là 1/4. Kết quả cho thấy vắc-xin vô hoạt nhũ dầu
này có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch cũng như bảo hộ heo về mặt lâm
sàng chống lại PCV2b, giảm tỉ lệ heo có vi-rút huyết và giảm hiệu giá vi-rút trong
mô lúc 28 ngày sau công cường độc.


vi

SUMMARY
The study “Genetic analysis of PCV2-ORF2 from pigs in Southern
Vietnam and study on vaccine against porcine circovirus diseases in post-weaning
pigs” was carried out from June 2012 to June 2018, in Veterinary Research Center –
NAVETCO National Veterinary Joint Stock Company, Nong Lam University Ho
Chi Minh City. The aims were to determine the prevalence of PCV2 genotypes,

genetic homology of PCV2 isolates circulating in Southern of Vietnam and research
on vaccine against porcine circovirus in post-weaning pigs based on PCV2 isolates
in this study.
Full-length ORF2 of 48 PCV2 isolates from 44 pig farms in 13 provinces in
Vietnam (including 12 Southern and 1 North Central Coast provinces) between
2007 and 2016 was analysed nucleotide sequence. The results showed that genotype
PCV2b, PCV2d and PCV2-Re (2h) (formerly classified as recombinant cluster) coexisted, of which the most prevalent genotype was PCV2b (24/48). PCV2d
genotype was emergent and predominant, especially PCV2d-2 (15/16) from 2012
onwards. Nucleotide homology for each genotype was 98.7% - 100% for PCV2b,
98.5 - 100% for PCV2d-2 and 98.7 - 100% for PCV2-Re (2h). p - distance among
genotypes were quite high and range from 0.0595 ± 0.0096 to 0.0663 ± 0.0102.
Eighteen PCV2 strains were isolated from the PCV2 PCR positive samples,
belonged to genotype PCV2b (9 strains), PCV2d (6 strains) and PCV2-Re (2h) (3
strains). The viral titer of PCV2 isolates at the third passages in PK15A cells was in
the ranges from 1.67 to 5.50log 10 TCID50/ml. Three PCV2 field strains, which the
viral titers were stably high (≥ 5.0log10 TCID50/ml) through passages, belonged to
different

genotypes,

namely

NAVET-DongNai2/2009

(PCV2b),

NAVET-

LongAn2/2012 (PCV2d) and NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)), were
selected as master seed for studying of PCV2 vaccines.

Applying cross neutralization test and R value (cross-reactivity value) to
determine antigenic diversity of PCV2 strains. The R value obtained by cross
neutralization test between NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-vietnam3/2004
was 104.20%; NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012; NAVET-


vii

LongAn2/2012 and NAVET-vietnam3/2004 were 91.60% and 91.30%, respectively.
These results indicated that no antigenic differences were found among these strains
(R > 70%).
Using binary ethylenimine (BEI) to inactivate virus for producing PCV2
0

antigen, BEI at 3 mM, 37 C after 24 hours was able to inactivate completely NAVETvietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012 strains with
inactivation rates 0.71; 0.86 and 1.33log10 TCID50 per hour, respectively.

Efficacy of experimental inactivated oil emulsion PCV2 vaccine based on
NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) strain: Experiment 3: at 4 weeks of age, vaccine
group (n = 6) were vaccinated with the experimental PCV2 vaccine (2 ml/dose,
6.0

contains 10 TCID50) by intramuscular route, and control group (n = 4) were
injected with 2 ml of PK15A cell extract. After 4 weeks post-vaccination, the
vaccinated together with unvaccinated controls were challenged intranasally and
intramuscularly with 4x10

5,33

TCID50 of NAVET-DongNai2/2009 strain, and

observed for 28 days post challenge. The seroconversion started at 14 - 21 dpv in
vaccinated pigs. The vaccinated pigs had no increase in body temperature, without
any clinical signs during the experiment. The obtained results indicated that this
vaccine induced immunological responses in vaccinated pigs that appeared to
provide clinically protective against PCV2b infection. Viremia, shedding and viral
load in tissues were reduced in vaccinated pigs compared to controls.


viii

MỤC LỤC
Trang

Trang phụ bìa........................................................................................................................................... i
Lời cam đoan.......................................................................................................................................... ii
Lời cảm ơn............................................................................................................................................. iii
Tóm tắt/Summary................................................................................................................................ iv
Mục lục.................................................................................................................. viii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt................................................................... xii
Danh mục các bảng................................................................................................. xv
Danh mục các hình, biểu đồ và sơ đồ.................................................................... xvii
Mở đầu...................................................................................................................... 4
Chương 1. Tổng quan................................................................................................ 4
1.1. Giới thiệu về PCV2............................................................................................ 4
1.1.1. Phân loại PCV2............................................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của PCV2............................................... 5
1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy của PCV2.......................................................................... 6
1.2. Các bệnh do circovirus trên heo......................................................................... 8
1.2.1. Tên gọi............................................................................................................ 8

1.2.2. Đặc điểm dịch tễ.............................................................................................. 9
1.2.3. Cơ chế sinh bệnh........................................................................................... 11
1.2.4. Đáp ứng miễn dịch chống PCV2................................................................... 13
1.2.5. Triệu chứng và bệnh tích............................................................................... 17
1.2.6. Các biện pháp phòng và kiểm soát PMWS.................................................... 18
1.3. Các nghiên cứu về di truyền của PCV2............................................................ 18
1.3.1. Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 trên thế giới.......................18
1.3.2. Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 ở Việt Nam........................21
1.4. Các nghiên cứu về vắc-xin PCV2..................................................................... 22
1.4.1. Các loại vắc-xin PCV2.................................................................................. 22
1.4.1.1. Vắc-xin cổ điển........................................................................................... 22
1.4.1.2. Vắc-xin thế hệ mới..................................................................................... 23
1.4.2. Các nghiên cứu vắc-xin PCV2 ở Việt Nam................................................... 26


ix

1.4.3. Hiệu quả của việc tiêm phòng vắc-xin PCV2................................................ 27
1.4.3.1. Lâm sàng.................................................................................................... 27
1.4.4.2. Cận lâm sàng.............................................................................................. 28
1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiêm phòng vắc-xin PCV2.....................30
1.4.5.1. Kháng thể thụ động..................................................................................... 30
1.4.5.2. Quy trình tiêm phòng.................................................................................. 31
1.4.5.3. Các tác nhân đồng nhiễm............................................................................ 33
1.4.5.4. Sự biến đổi di truyền của PCV2.................................................................. 34
1.4.6. Thất bại sau tiêm phòng vắc-xin PCV2......................................................... 34
1.5. Cơ sở khoa học nghiên cứu sản xuất vắc-xin PCV2......................................... 35
1.5.1. Cơ sở chọn thể loại vắc-xin để nghiên cứu.................................................... 35
1.5.2. Cơ sở chọn chủng vi-rút vắc-xin.................................................................... 36
1.5.3. Cơ sở lựa chọn chất vô hoạt PCV2................................................................ 36

1.5.4. Cơ sở lựa chọn chất bổ trợ............................................................................. 38
1.5.5. Tiêu chuẩn đánh giá vắc-xin.......................................................................... 39
1.5.5.1. An toàn....................................................................................................... 39
1.5.5.2. Hiệu lực...................................................................................................... 39
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu................................................... 43
2.1. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu..................................................................... 43
2.1.1. Địa điểm........................................................................................................ 43
2.1.2. Thời gian....................................................................................................... 43
2.1.3. Đối tượng....................................................................................................... 43
2.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 43
2.3. Vật liệu, hóa chất.............................................................................................. 43
2.3.1. Vật liệu thí nghiệm........................................................................................ 43
2.3.2. Hóa chất và các sinh phẩm............................................................................ 44
2.3.3. Dụng cụ và trang thiết bị............................................................................... 45
2.4. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 45
2.4.1. Phân tích di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành Việt Nam......................45
2.4.2. Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập............................. 47
2.4.2.1. Phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A..........................................47
2.4.2.2. Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm......................................................... 48


x

2.4.2.3. Xác định thời gian thu hoạch tối ưu đối với các chủng phân lập................ 49
2.4.2.4. So sánh sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 phân lập thuộc các
genotype khác nhau................................................................................................. 50
2.4.2.5. Thí nghiệm 1. Đánh giá khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng
NAVET-DongNai2/2009......................................................................................... 52

2.4.3. Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu...................................... 55

2.4.3.1. Quy trình vô hoạt PCV2............................................................................. 55
2.4.3.2. Chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu...................................................... 56
2.4.3.3. Tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm.............56
2.5. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu................................................................. 59
2.5.1. Phương pháp ly trích ADN............................................................................ 59
2.5.2. Kỹ thuật PCR phát hiện PCV2...................................................................... 59
2.5.3. Các phương pháp huyết thanh học................................................................. 60
2.5.3.1. Phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp định lượng kháng thể .. 60

2.5.3.2. Phương pháp ELISA phát hiện IgG............................................................ 60
2.5.3.3. Phương pháp trung hòa............................................................................... 60
2.5.4. Phương pháp phân lập PCV2 trên tế bào PK15A.......................................... 61
2.5.5. Phương pháp chuẩn độ PCV2........................................................................ 62
2.6. Xử lý thống kê.................................................................................................. 62
Chương 3. Kết quả và thảo luận.............................................................................. 63
3.1. Phân tích di truyền của các mẫu PCV2 tại một số tỉnh thànhViệt Nam............63
3.1.1. Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của PCV2.......................63
3.1.2. Phân tích đa dạng di truyền của PCV2 dựa vào ORF2..................................67
3.1.3. Đặc điểm ORF2 của các chủng PCV2 ở Việt Nam........................................ 68
3.1.4. Phân tích sự tái tổ hợp................................................................................... 72
3.2. Kết quả phân lập PCV2 và đặc tính nuôi cấy của một số phân lập PCV2........78
3.2.1. Kết quả phân lập PCV2 từ các mẫu thực địa................................................. 78
3.2.2. Xác định liều lượng gây nhiễm của chủng NAVET-DongNai2/2009 trên tế bào
PK15A..................................................................................................................... 82

3.2.3. Khả năng gây bệnh tích tế bào....................................................................... 83
3.2.4. Khả năng nhân lên của PCV2 trên môi trường tế bào PK15A.......................85
3.2.5. Tính ổn định.................................................................................................. 86

xi

3.3. Sự tương đồng kháng nguyên giữa các phân lập PCV2 thuộc các genotype khác
nhau......................................................................................................................... 87
3.4. Thí nghiệm 1: Khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng NAVETDongNai2/2009....................................................................................................... 89
3.5. Kết quả vô hoạt PCV2...................................................................................... 97
3.5.1. Vô hoạt PCV2 với các nồng độ chất vô hoạt khác nhau................................ 97
3.5.2. Kết quả vô hoạt ba chủng PCV2 phân lập với nồng độ BEI 3 mM..............100
3.6. Đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm
chủng NAVET-DongNai2/2009............................................................................. 103
3.6.1. Thí nghiệm 2................................................................................................ 103
3.6.2. Thí nghiệm 3................................................................................................ 107
Chương 4. Kết luận và đề nghị.............................................................................. 124
Danh mục các công trình đã công bố của tác giả................................................... 126
Tài liệu tham khảo................................................................................................. 127
Phụ lục................................................................................................................... 155


xii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt
aa

Tiếng Anh
Amino acid

Tiếng Việt

AAHL

Australian Animal Health

Phòng thí nghiệm sức khỏe
động vật quốc gia Úc

ADN

Laboratory
Deoxyribonucleic acid

ARN

Ribonucleic acid

bp

Base pair

Cap

Capsid

CD/CD

Cesarean-derived colostrum-

Mổ lấy thai và không bú sữa

DC

deprived
Dendritic cell

đầu
Tế bào tua

dpc

Day post-challenge

Ngày sau gây nhiễm

ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent

Phản ứng miễn dịch hấp phụ

FAID

Assay
Fluorescent antibody infectious

nối kết enzyme
Liều gây nhiễm được xác định

FCM

dose
Fetal cardinomonocyte

bằng kháng thể huỳnh quang
Tế bào đơn nhân tim thai

IFN

Interferon

Cản nhiễm tố

IL

Interleukin

IPMA

Immunoperoxidase monolayer

Phương pháp miễn dịch

IPX

assay
Immunoperoxidase

peroxidase trên tế bào một lớp
Phương pháp nhuộm miễn dịch

kb

Kilobase

kDa

kilodalton

A-xít a-min

peroxidase


xiii

MOI
NIPC

Multiplicity of infection
Natural interferon producing cell

Tỷ số gây nhiễm
Tế bào tiết interferon tự nhiên

NK

Natural killer cell

Tế bào giết tự nhiên

nt

Nucleotide

ORF

Open reading frame

Khung đọc mở

Ori

Origin of replication

Gốc sao chép

PAM

Porcine alveolar macrophages

Đại thực bào phế nang của heo

PBMC

Peripheral blood mononuclear cell

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng tạo chuỗi do
polymerase

PCV2

Porcine circovirus type 2

PCVD

Porcine circovirus diseases

Các bệnh do circovirus trên

PDNS

Porcine dermatitis and nephropathy

heo
Hội chứng viêm da và bệnh lý

PK15A

syndrome
Pig kidney 15A

thận ở heo
Tế bào thận heo dòng 15A

PMWS

Postweaning multisystemic wasting Hội chứng còi trên heo sau cai

PNP

syndrome
Proliferative and necrotising

PPV

pneumonia
Porcine parvovirus

PRRS

Porcine reproductive and

Hội chứng rối loạn sinh sản và

respiratory syndrome
Replicase

hô hấp trên heo

Rep
SE

Standard error

Sai số chuẩn

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

S phase

Synthesis phase

Pha tổng hợp

sữa
Viêm phổi hoại tử và tăng sinh


xiv

TCID
TLR

Tissue culture infectious dose
Toll-like receptor

Liều gây nhiễm tế bào
Thụ thể giống Toll

TNF

Tumor necrosis factor

Yếu tố hoại tử khối u

VNT

Virus neutralization test

Xét nghiệm trung hòa vi-rút


xv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tóm tắt triệu chứng và bệnh tích bệnh PCVD.................................................... 17
Bảng 1.2. Tổng kết các nghiên cứu về vắc-xin PCV2.......................................................... 25
Bảng 1.3. Các loại vắc-xin PCV2 thương mại ở Việt Nam................................................ 27
Bảng 2.1. Các mẫu dương tính ADN-PCV2 thu nhận từ năm 2007 đến 2016............46
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập
................................................................................................................................. 50
Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền trong cùng genotype và giữa các genotype lưu hành

ở các tỉnh thành Việt Nam từ năm 2007 đến 2016............................................ 68
Bảng 3.2. Các a-xít a-min của protein Cap khác nhau giữa các genotype PCV2 ......69
Bảng 3.3. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và a-xít a-min giữa các chủng
PCV2.................................................................................................................................. 71
Bảng 3.4. Phần trăm tương đồng giữa các mẫu PCV2-Re (2h) với chủng bố mẹ giả định

dựa trên ORF2

72

Bảng 3.5. Kết quả phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A................................. 79
Bảng 3.6. Hiệu giá của các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012

và NAVET-vietnam3/2004 qua các lần tiếp đời trên tế bào PK15A..........86
Bảng 3.7. Hiệu giá kháng thể trung hòa của phản ứng trung hòa chéo giữa huyết thanh

heo với các genotype PCV2 phân lập.................................................................... 88
Bảng 3.8. Hệ số tương đồng kháng nguyên R giữa ba chủng PCV2 khảo sát............88
Bảng 3.9. Khối lượng và điểm thể trạng heo thí nghiệm 1................................................. 89
Bảng 3.10. Tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí nghiệm 1...........................90
Bảng 3.11. Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh và mô của heo ở thí nghiệm 1
................................................................................................................................. 91
Bảng 3.12. Số lượng bạch cầu của heo ở thí nghiệm 1........................................................ 92
Bảng 3.13. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 1.......................93
Bảng 3.14. Hiệu giá vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 theo thời gian vô hoạt ở
các nồng độ BEI............................................................................................................. 97
Bảng 3.15. Hiệu giá vi-rút của ba chủng PCV2 phân lập giảm theo thời gian vô hoạt
ở nồng độ BEI 3 mM................................................................................................. 101


xvi

Bảng 3.16. Khối lượng ban đầu và tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí
nghiệm 2......................................................................................................................... 103
Bảng 3.17. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 2...................... 105
Bảng 3.18. Khối lượng và điểm thể trạng heo thí nghiệm 3............................................ 108
Bảng 3.19. Tăng trọng bình quân hàng ngày của heo ở thí nghiệm 3.........................108

Bảng 3.20. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 3......................110
Bảng 3.21. Số lượng bạch cầu ở heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3.................115
Bảng 3.22. Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu ngoáy
trực tràng trên heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3............................... 116
Bảng 3.23. Hiệu giá vi-rút ở mô heo thí nghiệm 3, mổ khảo sát lúc 28 dpc.............119


xvii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử............................................................... 6
Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen PCV2.................................................................................................... 7
Hình 2.1. Tóm tắt nội dung nghiên cứu..................................................................................... 44
Hình 2.2. Mô tả thiết kế thí nghiệm 1......................................................................................... 52
Hình 2.3. Mô tả thiết kế thí nghiệm 2......................................................................................... 57
Hình 2.4. Mô tả thiết kế thí nghiệm 3......................................................................................... 58
Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 dựa trên trình tự nucleotide
ORF2.................................................................................................................................. 65
Hình 3.2. Phân tích các mẫu PCV2-Re (2h) bằng phần mềm RDP4 v.4.39 dựa trên
ORF2.................................................................................................................................. 74
Hình 3.3. So sánh nucleotide giữa các mẫu PCV2-Re (2h) và chủng bố mẹ..............77
Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR 760 bp để phát hiện ADN-PCV2............................... 80
Hình 3.5. Phản ứng IPMA phát hiện PCV2 phân lập trên môi trường tế bào PK15A
................................................................................................................................................................... 80

Hình 3.6. Heo 16 tuần tuổi có biểu hiện viêm da................................................................... 81
Hình 3.7. Thai khô ở các giai đoạn khác nhau........................................................................ 81
Hình 3.8. Hình dạng tế bào tế bào PK15A nhiễm PCV2..................................................... 84
Hình 3.9a. Nang bạch huyết bình thường ở heo đối chứng................................................ 96
Hình 3.9b. Suy giảm tế bào lym-phô và xuất hiện tế bào đa nhân khổng lồ ở nang

bạch huyết......................................................................................................................... 96
Hình 3.10a. Phổi heo đối chứng.................................................................................................... 96
Hình 3.10b. Viêm phổi kẽ................................................................................................................ 96
Hình 3.11. Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào............100
Hình 3.12. Nhuộm IPX xác định sự hiện diện của PCV2 trong tế bào PK15A.......100
Hình 3.13. Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào............102
Hình 3.14. Các bệnh tích đại thể trên heo sau công cường độc 28 ngày....................120
Hình 3.15. Các bệnh tích vi thể trên heo sau công cường độc 28 ngày...................... 121


xviii

Biểu đồ 3.1. Phân bố theo thời gian của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt
Nam từ năm 2007 đến 2016....................................................................................... 67
Biểu đồ 3.2. Phân bố theo địa lý của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam
từ năm 2007 đến 2016.................................................................................................. 67
Biểu đồ 3.3. Phân tích tương đồng của các mẫu PCV2-Re (2h) và 2 chủng bố mẹ giả
định...................................................................................................................................... 73
Biểu đồ 3.4. Hiệu giá vi-rút theo hệ số MOI và thời gian thu hoạch của chủng
NAVET-DongNai2/2009............................................................................................. 83
Biểu đồ 3.5. Đường cong sinh trưởng của các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-

LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A...................86
Biểu đồ 3.6. Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 1................................ 94
Biểu đồ 3.7. Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút theo thời gian vô hoạt ở các nồng
độ BEI................................................................................................................................ 98
Biểu đồ 3.8. Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút của các chủng PCV2 theo thời gian
vô hoạt ở nồng độ BEI 3 mM................................................................................. 102
Biểu đồ 3.9. Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 2............................. 106
Biểu đồ 3.10. Diễn biến đáp ứng kháng thể chống PCV2 trên heo thí nghiệm 3...112

Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu
ngoáy trực tràng, hiệu giá kháng thể trung hòa chống PCV2 ở heo sau công

cường độc....................................................................................................................... 117


1

MỞ ĐẦU

Porcine circovirus type 2 (PCV2) liên quan đến một số bệnh trên heo, gọi chung
là các bệnh do circovirus trên heo (procine circovirus diseases – PCVD) (Segalés,
2012). Trong đó, đáng lưu ý nhất là hội chứng còi trên heo sau cai sữa (postweaning
multisystemic wasting syndrome - PMWS) làm gia tăng tỉ lệ heo chết và loại thải, tăng
tiêu tốn thức ăn và giảm tăng trọng, vì thế gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả
kinh tế trong chăn nuôi heo. Ngoài ra, PCV2 còn gây ảnh hưởng bất lợi lên đáp ứng
miễn dịch sau tiêm vắc-xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo
(porcine reproductive respiratory syndrome) (Opriessnig và ctv, 2006a).

Trước khi có vắc-xin PCV2 thì việc phòng PCVD chủ yếu dựa vào các biện
pháp quản lý, an toàn sinh học và kiểm soát yếu tố đồng nhiễm. Đến nay, có khá
nhiều nghiên cứu về vắc-xin PCV2, bao gồm cả loại vắc-xin dạng cổ điển và loại
dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại; nhiều loại đã được thương mại hóa.
Các nghiên cứu thí nghiệm và thực địa đã chứng minh hiệu quả của việc phòng
PMWS bằng vắc-xin như cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tỷ lệ chết,
tỷ lệ loại thải, giảm lượng vi-rút bài thải cũng như giảm bệnh tích vi thể ở các mô
bạch huyết (Kristensen và ctv, 2011; Fraile và ctv, 2012a; Seo và ctv, 2014b).
Hiện nay, vắc-xin PCV2 được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới trong
đó có Việt Nam. Tuy nhiên, các loại vắc-xin PCV2 thương mại lưu hành tại Việt Nam
hiện hành đều là ngoại nhập, và đa số dựa trên genotype PCV2a. Trong khi đó, PCV2

lưu hành ở Việt Nam thuộc genotype PCV2b, PCV2d và nhóm tái tổ hợp (Nguyễn
Ngọc Hải và ctv, 2013; Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv, 2012, 2013; Phạm Hồng Quân và ctv,
2017). Ngoài ra, một số kết quả nghiên cứu cho thấy, genotype của PCV2 có thể ảnh
hưởng đến hiệu quả phòng PMWS bằng vắc-xin (Takahagi và ctv, 2010; Opriessnig và
ctv, 2013a). Do đó, việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin từ chủng PCV2 thuộc genotype lưu
hành phổ biến ở Việt Nam là cần thiết, nhằm giúp chủ


2

động nguồn cung vắc-xin, góp phần kiểm soát hiệu quả bệnh PMWS, cũng như giảm
giá thành chăn nuôi. Để góp phần giải quyết các vấn đề thực tiễn trên, đề tài: “PHÂN

TÍCH TRÌNH TỰ ORF2 CỦA PCV2 TỪ HEO NUÔI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA
NAM VÀ NGHIÊN CỨU VẮC-XIN PHÒNG BỆNH LIÊN QUAN PCV2 TRÊN
HEO SAU CAI SỮA” được tiến hành.
Mục tiêu nghiên cứu
 Xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2 lưu hành
tại một số tỉnh thành ở Việt Nam.
 Nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa
dựa trên chủng phân lập của đề tài.


3

Những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn từ các kết quả nghiên cứu này

Nghiên cứu được sự lưu hành, đa dạng di truyền và tương đồng gen của các
chủng PCV2 phân lập ở heo tại Việt Nam.
Phân lập được một số chủng PCV2 làm nguồn gen trong việc nghiên cứu chế

tạo vắc-xin và các ứng dụng công nghệ sinh học khác.
Chế tạo thành công vắc-xin vô hoạt nhũ dầu bằng chủng PCV2b phân lập
ngoài thực địa phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa.


4

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về PCV2
1.1.1. Phân loại PCV2
Porcine circovirus (PCV) thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae. Dựa vào
kích thước virion và cấu trúc bộ gen của vi-rút, Ủy ban quốc tế về phân loại vi-rút
(International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV) năm 2017 chia họ
Circoviridae thành 2 giống là Circovirus và Cyclovirus (Breitbart và ctv, 2017).
Porcine circovirus gồm 3 type là PCV1, PCV2 và PCV3 (Rosario và ctv, 2017;
Lefkowitz và ctv, 2018).
Dựa vào kết quả phân tích bộ gen, các nhà nghiên cứu còn phân chia PCV2
thành các genotype. Grau-Roma và ctv (2008) đã đề ra một định nghĩa cho các
genotype PCV2, dựa trên các so sánh trình tự theo cặp (PAirwise Sequence
Comparisions - PASC) để xác định mức độ biến đổi di truyền (p), giá trị này được tính
toán bằng cách chia số nucleotide khác nhau cho tổng số nucleotide so sánh giữa các bộ
gen (Kumar và ctv, 2001). Kết quả là xây dựng một khoảng cách p và biểu đồ tần số
cho phép xác định các giá trị ngưỡng để phân biệt các genotype với nhau (Rogers và
Harpending, 1992; Biagini và ctv, 1999). Có 2 cách để phân chia các genotype của
PCV2: (1) dựa trên sự phân tích toàn bộ bộ gen PCV2 với giá trị ngưỡng
p = 0,02 (Grau-Roma và ctv 2008); (2) dựa trên mức độ biến đổi di truyền của ORF2
thì giá trị ngưỡng p = 0,035 (Segalés và ctv, 2008). Gần đây, Franzo và Segalés (2018)
đề xuất cách phân loại genotype PCV2 dựa trên 3 tiêu chí, đó là khoảng cách di truyền
(p-diastance) tối đa giữa các genotype (intra-genotype) là 13% (dựa trên trình tự

ORF2), giá trị bootstrap ở các nút (node) > 70% và có ít nhất 15 trình tự chuỗi có
sẵn. Các phân lập PCV2 được chia thành 8 genotype chính là PCV2a, PCV2b,
PCV2c, PCV2d (trước đây còn gọi là mutant PCV2b, viết tắt là mPCV2b), PCV2e
(Xiao và ctv, 2015; Davies và ctv, 2016), PCV2f (Bao và ctv, 2017), PCV2g và


5

PCV2h (Franzo và Segalés, 2018). Dựa vào kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại,
Xiao và ctv (2015) phân PCV2d thành 2 subgenotype đó là PCV2d-1 và PCV2d-2.
Ngoài ra, còn có sự hiện diện của nhóm PCV2 tái tổ hợp (recombinant cluster) còn
được gọi là các chủng trung gian (intermediate strains) trong thực địa (Cai và ctv, 2012;
Xiao và ctv, 2015; Franzo và ctv, 2016). Nhóm tác giả Franzo và ctv (2016) đã phân
tích 898 trình tự chuỗi nucleotide ở 32 quốc gia từ năm 1980 đến 2014 (dữ liệu thu thập
từ GenBank). Kết quả cho thấy có đến 33% (304/898) trình tự chuỗi nucleotide được
nhận dạng là tái tổ hợp. Hầu hết các quốc gia ở khắp các châu lục đều có sự lưu hành
của nhóm tái tổ hợp, trong đó có Việt Nam. Đáng lưu ý, theo cách phân loại mới của
Franzo và Segalés (2018) một số chủng PCV2 trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp
(recombinant cluster) nay được xếp vào genotype PCV2g và PCV2f. Kết quả phân tích
của Franzo và Segalés (2018) cho thấy c ó đến 45/75 chủng PCV2 của Việt Nam đăng ký
trên GenBank (đến thời điểm ngày 5 tháng 7 năm 2018) được xếp vào PCV2h mà trước đây
các chủng này được xếp vào nhóm tái tổ hợp. Vì thế, trong phần trình bày này các chủng

trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp nhưng nay theo cách phân loại mới được xếp vào
PCV2h sẽ được viết tắt là PCV2-Re (2h).

1.1.2. Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của PCV2
PCV có kích thước rất nhỏ, đường kính khoảng 17 ± 1,3 nm, không có vỏ
bọc (Tischer và ctv, 1982). Virion hình cầu, đối xứng 20 mặt, với 60 phân tử protein

capsid (Crowther và ctv, 2003), chứa ADN sợi đơn dạng vòng kích thước khoảng
1,76 - 1,77 kb (Meehan và ctv, 1997; 1998).
PCV rất ổn định ở điều kiện khác nhau của môi trường, đề kháng rất cao với
0

0

nhiệt độ và pH: ổn định ở pH = 3, nhiệt độ 56 C và 70 C trong 15 phút. Các thí nghiệm
in vitro cho thấy, PCV2 đề kháng với nhiệt độ khô, khả năng gây nhiễm của PCV2
0

giảm tương ứng 0,75log và 1,25log sau khi xử lý nhiệt độ khô ở 80 C trong vòng 72
0

giờ và 120 C trong vòng 30 phút (Welch và ctv, 2006). PCV2 bị bất hoạt ở nhiệt độ ướt
0

80 C trong 15 phút (O'Dea và ctv, 2008). Ở pH = 2, trong vòng 30 phút, hiệu giá PCV2
giảm từ 5,5 log xuống còn 2,7 log (Kim và ctv, 2009c). Tính gây nhiễm của PCV2
giảm đáng kể ở pH = 11 và hầu như biến mất ở pH = 12 (Lyoo, 2009). Hiệu giá vi-rút
cũng giảm bởi một số chất sát trùng gốc kiềm (ví dụ như


6

NaOH), các tác nhân oxy hóa (ví dụ như sodium hypochlorite) hoặc amonium bậc 4
(Royer và ctv, 2001; Martin và ctv, 2008). PCV2 đề kháng với chloroform, các chế
phẩm chứa cồn, iodine, formaldehyde và phức hợp chlohexidine.

(A)

(B)

Hình 1.1. Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử. (A) Hình ảnh PCV2
dưới kính hiển vi điện tử (Allan và ctv, 2012). (B) Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi
điện tử lạnh (Cryo-electron microscopy) (Nguồn: King và ctv, 2012)
1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy của PCV2
PCV2 là vi-rút phát triển chậm, một chu kỳ nhân lên của PCV2 trên tế bào
PK15 mất khoảng 30 - 36 giờ (Cheung và Bolin, 2002; Meerts và ctv, 2005a). PCV2
nhân lên trong tế bào dòng thận heo PK15 và cũng nhân lên trong một số loại tế bào tế
bào sơ cấp như tế bào đơn nhân tim thai (fetal cardinomonocyte - FCM), đại thực bào
phế nang heo (porcine alveolar marcophage - PAM), tế bào đơn nhân máu ngoại vi
(peripheral blood mononuclear cell - PBMC), tế bào tua (dendritic cell - DC) nhưng
hiệu giá vi-rút đạt được rất thấp (Gilpin và ctv, 2003; Vincent và ctv, 2003; Meerts và
ctv, 2005a; Chang và ctv, 2006; Yu và ctv, 2007b). Kết quả nghiên cứu của Allan và ctv
(1994) về một số đặc tính sinh học của PCV cho thấy, PCV cũng có thể nhân lên trên
các tế bào có nguồn gốc từ heo và tế bào Vero, các tế bào sơ cấp từ bò và cừu cũng
nhạy cảm với PCV nhưng không thể tiếp đời PCV trên các tế bào này.

1.1.4. Cấu trúc bộ gen PCV2
PCV2 chứa ADN sợi đơn dạng vòng kích thước từ 1.766 đến 1.768 nucleotide
(Hamel và ctv, 1998; Meehan và ctv, 1998; Guo và ctv, 2010). Bộ gen PCV2 được sắp
xếp thành 11 khung đọc mở giả định (open reading frames - ORF). Trong đó, ORF1,


7

ORF5, ORF7 và ORF10 nằm trên chuỗi dương cùng chiều kim đồng hồ, ngược lại các
ORF2, 3, 4, 6, 8, 9 và 11 nằm trên chuỗi bổ sung và ngược chiều kim đồng hồ (Hamel
và ctv, 1998). Ở vùng trung gian lớn giữa ORF1 và ORF2 chứa gốc sao chép (Origin

of DNA replication - Ori), có một cấu trúc cuống - vòng (stem - loop), giúp PCV2 nhân

lên theo cơ chế vòng tròn lăn. Đến nay, chỉ xác định được 4 khung đọc mở mã hóa
protein đó là ORF1, 2, 3 và 4 (Hình 1.2), riêng protein được mã hóa từ ORF5 cũng đã
được nghiên cứu, tuy nhiên, cần phải tiếp tục nghiên cứu thêm để xác định vai trò cụ

thể của protein này (Lv và ctv, 2015).

Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen PCV2. ORF1 (màu đỏ) mã hóa protein Rep và
Rep’. ORF2 (màu xanh dương) mã hóa protein Cap. ORF3 (màu xanh lá cây) mã
hóa protein ORF3. ORF4 (màu vàng) mã hóa protein ORF4. Gốc sao chép (Ori)
nằm ở vùng trung gian giữa các điểm bắt đầu của 2 khung đọc ORF1 và ORF2. H1,
H2, H3 và H4 là các hexanucleotide (Faurez và ctv, 2009)
ORF1 còn được gọi là gen Rep, dài 945 nucleotide, nằm trên chuỗi dương và
theo chiều kim đồng hồ, là vùng rất bảo tồn của giống Circovirus, mã hóa protein không