PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử sách đào tạo sau đại học y dược

A

___

Bỏ YTẼ

VA MỌT SO KY THUẠT
Y SINH HỌC PHÂN TỬ
■

(Sách đào tạo sau đại học y dược)
Chủ bỉên: PGS.TS. TẠ THÀNH VÀN

HQGHN

72
R
0

)0489

Ỹ

NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC


*

__ a '

BỘ Y TÊ

PCR
VÀ MỘT
■ SỐ KỸ THUẬT
■
Y SINH HỌC PHÂN TỬ
■

Sách đào tạo sau đại học y dược
Mã số: Đ.01.Y.06VV
Chủ biên: PGS. TS. TA THÀN H VĂN

NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC
■
HÀ N Ộ I- 2 0 1 0
■


CHÍ ĐẠO BIẼN SOẠN:

Vụ Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tê
CHỦ BIÊN:

PGS. TS. Tạ Thành Văn
NHỮNG NGƯỜI BIÊN SOẠN:

PGS. TS. Tạ Thành Văn
THAM GIA TỔ CHỨC BẢN THẢO:

ThS. Phí Văn Thâm

TS. N gu yển Mạnh Pha

© Bản quyền thuộc Bộ Y tê (Vụ Khoa học và Đào tạo)


LỜI GIỚI THIỆU
■

Đào tạo nguồn nhân lực cán bộ chất lượng cao là một trong những môi
quan tâm hàng đầu của ngành Y tế. Song song vỏi việc đầu tư cơ sơ vật chất cho
các cơ sơ đào tạo, Bộ Y tế đã đặc biệt chú trọng tăng cương các phương tiện dạy
vè học, trong đó việc biên soạn giáo trình, tài liệu giảng dạy đặc biệt ưu tiên.
Sách “PCR và một sô kỹ th u ật y sinh học phân tử” này được biên soạn
nhằm phục vụ chủ yếu cho việc đào tạo sau đại học trong các Trường đại học Y,
Dược dựa trên chương trình khung của Trường Đại học Y Hà Nội nhưng cũng là
tài liệu đề đào tạo đại học và tham khảo, tự học cho các nghiên cứu viên làm
việc trong lĩnh vực y sinh. Bên cạnh những kiến thức lý thuyết và nguyên lý cơ
bản của các kỹ th u ậ t y sinh học phân tử, cuốn sách còn cung cấp những quy
trình kỹ th u ậ t cụ thể hướng dẫn cho những người bắt đầu triến khai các kỹ
th u ậ t chuyên sâu này.
Cuốn sách này được biên soạn bởi PGS. TS. Tạ Thành Văn, một nhà khoa
học giàu kinh nghiệm trong lĩnh vực Hóa sinh học phân tử và tế bào. Sách đã
được Hội đồng chuyên môn của Bộ Y tê thẩm định theo Quyêt định sô 928/QĐ BYT ngày 22 tháng 3 năm 2010 gồm các chuyên gia thuộc các chuyên ngành
Hóa sinh, Miễn dịch, Sinh lý bệnh, Vi sinh và Sinh học. Cuốn sách được ban
hành làm tài liệu sử dụng chính thức phục vụ đào tạo đại học và sau đại học
của ngành Y tế. Đồng thòi cuốn sách cũng sẽ là tài liệu tham khảo hữu ích cho
các cán bộ làm việc trong các phòng thí nghiệm, phòng xét nghiệm y sinh.
Bộ Y tế xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Phan Thị Phi Phi, Chủ tịch Hội
đồng thẩm định, GS. TS. Phùng Đắc Cam và PGS. TS. Nguyễn Thị Hà, ủy viên
phản biện và các ủy viên Hội đồng đã đọc, đóng góp nhiều ý kiến quý báu đê

cuôn sách được hoàn thiện.
Đây là lần xuất bản đầu tiên, cuốn sách chắc chắn sẽ được chỉnh lý, bổ
sung và cập n h ật trong những lần xuất bản tiếp sau. Chúng tôi mong nhận
được ý kiến đóng góp của đồng nghiệp và các độc giả để sách được hoàn chỉnh
hơn cho những lần xuất bản sau.
VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y T Ế

3


LỜI MỞ ĐẦU

Các kỹ th u ậ t sinh học phân
khoa học làm việc trong lĩnh vực
gen người được hoàn tất, các kỹ
trong y học và phát huy hiệu quả
trị và phòng bệnh.

tử là một công cụ đặc biệt hữu ích cho các nhà
công nghệ sinh học. Kê từ khi việc giải mã bộ
thuật này ngày càng được ứng dụng rộng rãi
to lốn trong chẩn đoán, theo dõi hiệu quả điều

Cuôn sách “PCR uà một sô kỹ thuật y sinh học phân tử ' này được biên
soạn dành cho các nghiên cứu viên, sinh viên bậc đại học và sau đại học thuộc
các chuyên ngành khác nhau trong lĩnh vực y sinh. Cuốn sách cung cấp cho các
dộc giả không chỉ những kiến thức lý thuyết cơ bản, nguyên lý, triển vọng ứng
dụng của PCR và các kỹ th u ật y sinh học phân tử khác, mà còn cung cấp những
quy trình kỹ th u ật cụ thê hướng dẫn cho những người bắt đầu triển khai các kỹ

th u ậ t chuyên sâu này.
Nội dung cuốn sách để cập đến những lĩnh vực mà các kỹ th u ật sinh học
phân tử chuyên biệt đang được áp dụng. Các độc giả có thể tìm thấy trong cuốn
sách này những kiến thức khoa học chuyên sâu, cơ sỏ lý luận khoa học của việc
thiết lập các quy trình kỹ thuật, từ đó mỗi cán bộ khoa học có thê tự điểu chỉnh,
thay đổi, cải tiến các quy trình này sao cho phù hợp vối từng mục đích và điều
kiện của từng phòng thí nghiệm để phát huy tối đa hiệu quả trong nghiên cứu
khoa học cũng như trong hoạt động chuyên môn thường quy của mình. Vối tất
cả nội dung được trình bày, cuốn sách sẽ là tài liệu học tập, tham khảo cho các
cán bộ khoa học thuộc các chuyên ngành Kỹ th u ật Y học, Hóa sinh, Sinh học,
Miễn dịch học, Vi sinh của các Trường đại học Y Dược, Trường đại học Tổng hợp
và các Viện nghiên cứu.
Với tốc độ phát triển rất nhanh của công nghệ sinh học trong những năm
gần đây, đặc biệt là các kỹ th u ật sinh học phân tử ứng dụng trong y học, trong
khuôn khô cuốn sách này, tác giả không hướng tối mục đích mô tả chi tiêt tất cả
các quy trình kỹ th u ậ t cũng như các ứng dụng khác nhau của PCR nói riêng và
của các kỹ th u ậ t sinh học phân tử nói chung. Tuy nhiên, có thê nói những kiến
thức được trình bày ở đây là những kiến thức nền cơ bản nhất, mà thường
những kỹ th u ậ t dù mới th ế nào đi chăng nữa cũng đểu dựa trên những nguyên
tắc khoa học này.
Tác giả xin bày tỏ sự biết ơn tói các đồng nghiệp đã dành thời gian đọc bản
thảo và góp ý chi tiết về nội dung, cũng như cách trình bày, các cán bộ của Vụ
Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tế, Nhà xuất bản Y học đã giúp đỡ tác giả trong quá
trình hoàn thiện cuốn sách này.
Hà Nội, ngày 01 tháng 3 năm 2010
PGS. TS. TẠ THẢNH VĂN

5

MỤC LỤC
■

■

Lời giới thiệu

3

Lời mở đầu

5

Chương I. N hững kiến thức cơ bản chu ng
A. Thành phần hóa học và cấu trúc acid nu cleic

11
11

1. Thành phần hóa học của acid nucleic

11

2. Cấu trúc hóa học của acid nucleic

13

2.1. Cấu trúc của acid deoxyribonucleotid (DNA)

13

2.1.1. Cấu trúc xoắn kép

13

2.1.2. Cấu trúc Watson-Crick (B-DNA)

13

2.1.3. Các dạng cấu trúc xoắn khác của acid nucleic

14

2.1.4. Các lực hóa học và cấu trúc làm bền vững cấu trúc acid
nucleic
2.1.5. Sự biến tính th u ận nghịch
1.2. Cấu trúc của acid ribonucleic (RNA)

15
16
17

1.2.1. Cấu trúc RNA

17

1.2.2. Các loại RNA

17

B. Câu trúc gen và các yếu tô điểu hòa hoạt động của gen ở tê
bào có nhân

18

1. Gen điều khiển và gen tăng cường

19

1.1. Một số phức hợp gen tăng cường

20

1.1.1. Phức hợp gen tăng cường có nguồn gốc virus

20

1.1.2. Phức hợp gen tăng cường có nguồn gốc tế bào

22

1.2. Gen điều khiển và gen tăng cường cảm ứng

22

1.3. Cơ chế hoạt động của gen tăng cường

22

2. Môi tương tác giữa gen điều khiển và intron

23

3. Các tín hiệu thoái hóa của mRNA và quá trình polyadenin hóa

24

4. Kiểm soát quá trình sao chép

25

5. Các hiện tượng liên quan

26

Chương II. Giới th iệu c h u n g về kỷ th u ậ t PCR

28

1. Giối thiệu chung: PCR, một máy photocopy

28

7


2. Lịch sử của kỹ th u ật PCR

28

3. Kỹ thuật PCR liên quan đến quá trình sao chép DNA

29

4. PCR được điều khiển bởi nhiệt độ

30

5. Liệu kỹ th uật PCR có thê thay thê được kỹ thuật tạo dòng gen?

31

6. ứ n g dụng của kỹ th u ậ t PCR

32

Chương III. N guyên tắc của kỹ thuật PCR

33

1. Kỹ thuật PCR được tiến hành như th ế nào?

33

2. Triển vọng ứng dụng của PCR

35

3. DNA khuôn là bộ gen hoặc một phần bộ gen của tê bào

36

4. Động học của phản ứng PCR

37

4.1. Những chu kỳ đầu (E)

38

4.2. Những chu kỳ giữa (M)

38

4.3. Những chu kỳ cuối và độ bão hòa (L)

39

5. Phân tích sản phẩm PCR

39

Chương IV. Hóa chất và th iết bị

40

1. Những ưu điểm của kỹ thuật PCR

40

2. Các dung dịch phản ứng

40

3. Dung dịch đệm PCR

40

3.1. Tris-HCl
3.2. KC1

41
41

3.3. MgCl2

41

4. Nucleotid

42

5. Hỗn hợp dung dịch PCR trộn trước (PCR premix)
6. Đoạn oligonucleotid mồi

43
43

6.1. Nhiệt độ nóng chảy (Tm)

45

6.2. Mồi được đánh dấu ỏ đầu 5’

46

6.3. Khuếch đại gen đích nhò hỗn hợp các mồi

47

6.4. Nồng độ mồi

47

7. DNA polymerase
7.1. DNA polvmerase bển với nhiệt
7.2. Đặc tính của Taq DNA polymerase

48

7.3. Một số loại Taq DNA polymerase thương mại

49

7.4. Một sô loại DNA polymerase bền vối nhiệt có hoạt tính sửa chữa

50

8. Acid nucleic khuôn

8

48
48

50


9. Vật tư tiêu hao

51

10. Máy tạo chu kỳ nhiệt cho PCR

51

11. Xây dựng hệ thống phòng xét nghiệm sinh học phân tử

51

11.1. Phòng tách chiết DNA/RNA

51

11.2. Phòng chuẩn bị Mastermix

52

11.3. Phòng bố sung khuôn

52

11.4. Phòng đặt máy RCR/Realtime PCR

52

11.5. Phòng điện di

52

Chương V. Phân tích sản phẩm PCR

54

1. Điện di (Electrophoresis)

54

2. Southern và dot blot

56

3. PCR lồng

57

4. Sử dụng enzym cắt giới hạn

59

5. Giải trình tự gen trực tiếp

60

6. Đánh dấu trực tiếp sản phẩm PCR

61

7. Kỹ thuật miễn dịch

62

8. Kỹ thuật điện hóa phát quang

62

9. Realtime PCR và PCR định lượng

63

10. Phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe
ampliíication)

66

11. Biểu hiện sản phẩm PCR in vitro

68

12. Một sô vấn đề kỹ th u ật cần lưu ý khi đọc và phân tích kết quả PCR

69

Chương VI. Tinh sạch và tách dòng sản phẩm PCR

73

1. Tinh sạch sản phẩm PCR

73

1.1. Tủa bằng ethanol

73

1.2. Gắn vào gel (In-gel ligation)

74

1.3. Tinh chê bằng cột và ly tâm (Spin columns)

74

1.4. Điện di đẩy (Electroelution)

74

1.5. Tinh chê bằng hỗn hợp silica hoặc glassmilk

75

1.6. Sử dụng các kit thương mại

75

2. Tách dòng sản phẩm PCR

75

2.1. Các vector tách dòng

76

2.2. Phân tích các clon mang DNA đích

79

Chương VII. Các phương pháp phân tích bộ gen

80

1. Phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn

81
9


1.1. Nguyên tắc

81

1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự di chuyến của sợi đơn DNA

83

2. Phản ứng nối chuỗi

84

2.1. Nguyên tắc

84

2.2. Một sô đặc điểm của kỹ th u ật LCR

85

3. Hệ thống khuếch đại các đột biến bên với nhiệt

86

4. Khuếch đại phân đoạn cấu trúc đa hình thái

87

5. P hân tích kiểu gen “một ông nghiệm Tm"

88

6. Phương pháp sử dụng enzym giới hạn phân tích chuỗi gen đa hình

thái

90

7. Khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình thái

91

8. Phân tích thê đa hình thái A lu bằng PCR đa mồi

92

9. Phân tích sự lặp lại của minisatelite

93

10. Microsatelite

95

Chương VIII. Các quy trình kỹ th uật sinh học phân tử

97

Quy trình 2.1. Quy trình cơ bản của PCR

97

Quy trình 3.1. Phosphoryl hóa đầu 5 của chuỗi oligonucleotid

99

Quy trình 3.2. Tách chiết genomic DNA từ mô thực vật

100

Quy trình 3.3. Chuẩn bị DNA khuôn

101

Quy trình 3.4. Tách chiết DNA sử dụng proteinase K

103

Quy trình 4.1. Southern blotting
Quy trình 4.2. Giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR

105
107

Quy trình 4.3. Giải trình tự gen

108

Quy trình 5.1. Tạo các phân đoạn PCR đầu tù

110

Quy trình 5.2. Tủa sản phẩm DNA bằng ethanol

111

Quy trinh 5.3. Biến nạp DNA vào hệ vi khuẩn

112

Quy trình 6.1. Quy trình sao chép ngược

114

Quy trình 6.2. Thu hồi DNA từ gel đã khô

115

Quy trình 6.3. Khuếch đại nhanh cDNA từ đầu tận (5’-RACE)

116

Quy trình 6.4. Cô định lát cắt mô vào phiến kính

118

Tài liệu tham khảo

120

10


Chương I

NHỮNG KIẾN THỨC c ơ BẢN CHUNG

A. THÀNH PHẨN HÓA HỌC VÀ CẤU TRÚC ACID NUCLEIC
■

Nucleotid là những hợp chất sinh học tham gia vào nhiều các quá trình
chuyên hóa của tế bào. Chúng là phương tiện dự trữ và vận chuyển năng lượng,
là sự đáp ứng hóa học của tê bào đối với các hormon và các chất kích thích ở
khoảng gian bào, là th àn h phần cấu trúc của các coenzym hay các chất chuyển
hoá trung gian. Song điều quan trọng nhất phải kế đến là nucleotid chính là
th àn h phần cấu tạo nên các acid nucleic: acid deoxyribonucleic (DNA) và acid
ribonucleic (RNA), cơ sỏ vật chất của thông tin di truyền.
1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ACID NƯCLEIC
Cấu trúc hóa học của acid nucleic được Phoebus Levine và Alexander Todd
đưa ra trong những năm đầu của những năm 50 của th ế kỷ trước. Acid nucleic
là các chuỗi polymer thang (phổ biến) của nucleotid nôi vối nhau bằng cầu nôi
phosphat ở vị trí 3’ và 5’ của hai phân tử đường liên tiếp.

I----------------

iiì;

--------------—

— "

adenine

5' end ũ

0 — p — 0 — CH

' 0 — p — 0 — (etc)
nucleic aciđ

Q

3' end

H ình 1.1. Thành phần và mô hình cấu trúc của dinucleotid
(adenyl-3’ , 5’-cytidyl-3’, '-phosphat (ACp))

11


(a)
Base

*o3po-

Base

*03P 0 -ró 2 ^0

ch2^ o

OH

OH

Ribonucleotid

OH H

D e oxynb onucle otid

H ình 1.2. Cấu trúc hóa học của (a) ribonucleotid và (b) deoxyribonucleotid

Các gốc phosphat của chuỗi polynucleotid và các nhóm phosphodieste là các
gốc acid, chính vì vậy mà ở pH sinh lý, acid nucleic là những chuồi anion. Phân tử
DNA là chuỗi xoắn kép, có lượng cân bằng các gốc adenin và thymin
(A = T) cũng như guanin và cytosin (G = C). Phân tử RNA thường là chuỗi xoắn
đơn ngoại trừ RNA của một số virus có cấu trúc xoắn kép. Trong khi đó DNA của
một sô virus lại có cấu trúc xoắn đơn. Tuy nhiên khi các phân tử DNA này xâm
nhập vào trong tế bào chủ và nhân lên, nó sẽ hình thành cấu trúc xoắn kép.

H ình 1.3. Thành phần, tên gọi các base nitơ, nucleosid và nucleotid

12


Một sô' DNA và RNA có chứa các dẫn xuất của các base, đặc biệt là trong
các vi sinh vật. Đó là các dẫn xuất methyl hóa, các dẫn xuất này được tạo ra bởi
các enzym đặc hiệu.
RNA dễ dàng bị thuỷ phân trong môi trường kiềm đế tạo ra một hỗn hợp
các 2’ và 3’ nucleotid trong khi DNA vì không có nhóm 2’-OH nên bền vững
trong môi trường kiềm và do vậy phân tử DNA rấ t bền vững so với RNA.
Nucleotid là este phosphat của đưòng pentose, trong đó base nitơ liên kết

với c , của đường. Trong ribonucleotid, đường pentose là D-ribose còn trong
deoxyribonucleotid (hay còn gọi là deoxynucleotid) có trong DNA thì lại là 2’deoxy-D-ribose. Gốc phosphat có thê gắn ở vị trí C3- hoặc C5. của nguyên tử
đưòng đề tạo hoặc 3’-nucleotid hoặc 5’-nucleotid. Phức hợp trên nếu không có
gốíc phosphat thì được gọi là nucleosid.
2. CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA ACID NUCLEIC
2.1. Cấu trúc acid d eo x y rib o n u cleic (DNA)
2.1.1. Cấu trú c x o ắ n kép
P hát minh ra cấu trúc xoắn kép của DNA bởi Jam es Watson và Francis
Crick năm 1953 đã khai sinh ra ngành Sinh học phân tử hiện đại. Sự ra đời của
cấu trúc Watson-Crick đã khắc phục được tất cả các khiếm khuyết của các cấu
trúc do các nhà khoa học khác đề xuất trước đó và lý giải được tất cả các hoạt
động chức năng của DNA cũng như cơ chê phân tử của bệnh lý di truyền. Ngày
nay, người ta n h ậ n thấy rằng DNA và RNA tồn tạo ở một vài dạng cấu trúc
xoắn kép khác n h au phụ thuộc vào nhiều yếu tô như: độ ẩm, sự có mặt của các
cation hay trình tự các base.
2.1.2. Cấu trú c W atson-C rick (B-DNA)
Cấu trúc B-DNA được xác định bởi nhiễu xạ tia X với sự có m ặt của Na+ và
ỏ độ ẩm 92%. Đây là cấu trúc tự nhiên của DNA bởi lẽ DNA ở đầu tinh trùng
tồn tại ở dạng cấu trúc này (hình 1.4). Cấu trúc B-DNA của Jam es VVatson và
Francis Crick có các đặc điểm sau:
- Bao gồm hai chuỗi polynucleotid xoắn vặn xung quanh một trục theo hai
chiều ngược nhau theo quy tắc bàn tay phải vài đường kính vòng xoắn khoảng
20 Ẩ. Cấu trúc xoắn vặn của hai chuỗi polynucleotid tạo cho DNA có một cấu
trúc bển, hai chuỗi không thế tách rời khỏi nhau nếu như không được mỏ xoắn.
Trục xoắn là các base còn các chuỗi đương - phosphat thì cuộn xung quanh.
- M ặt phảng của các base hầu như vuông góc với trục xoắn ốc. Mỗi base
của chuỗi này liên kết vối base của chuỗi kia bằng liên kết hydro theo nguyên
tắc bổ sung. Trong đó guanin và cytosin liên kết vối nhau bằng 3 liên kết hydro
(G=C) còn adenin và thymin liên kết vối nhau bằng 2 liên kết (A=T). Do vậy mà
trậ t tự các base ở chuỗi thứ n h ấ t bổ sung với trậ t tự các base ở chuỗi thứ 2.

13


Mỗi một chu kỳ xoắn B-DNA lý tưởng gồm có 10 đôi base có độ dốc là
34Ả, góc xoắn vặn của mỗi cặp base là 36° trong đó mỗi base cách nhau 3,4 Ả.
Richard Dickerson và Horace Drew đã đo lại và cho thấy mỗi chu kỳ xoắn là
10,1 đôi base và góc xoắn vặn của mỗi cặp base là 35,6°.

H ình 1.4. Mô hình mô phỏng cấu trúc B-DNA

2.1.3. Các d a n g câu trú c xoắn khác của a c id nucleic
- Dạng A-DNA: cấu trúc A-DNA rộng hơn, vòng xoắn theo quy tắc bàn tiy
phải từ phải qua trái dẹt hơn so với cấu trúc B-DNA. Một chu kỳ xoắn của ADNA có 11 đôi base có độ dốc là 28 Ă và góc xoắn vặn của mỗi cặp base so 'ới
trục là 20°. Cấu trúc này được thấy ở dạng bào tử của vi khuẩn Gram dươrg.
Đây là cơ chế tự bảo vệ của vi khuẩn vì DNA ở dạng này bền vững với lia
cực tím.
- Dạng Z-DNA: có cấu trúc xoắn theo quy tắc bàn tay trái. Mỗi chu kỳ xoín
có 12 đôi base với độ dốc là 45 Ả. Chức năng sinh học của dạng Z-DNA chia
được khẳng định song có giả thuyết cho rằng có sự biến đổi th u ận nghịch từ cíu
trúc B-DNA sang Z-DNA trong một số điều kiện n h ất định như: tái tổ hợp g3n
trong quá trình thể hiện gen.

14


Bảng 1.1. So sánh đậc tính cấu trúc A, B và Z-DNA
........ ..........

..............

A

B

z

Hướng xoắn

Nguyên tắc bàn tay
phải

Nguyên tắc bàn
tay phải

Nguyên tắc bàn tay trái

Đường kính

-2 6 Ả

-2 0 Ả

~ 18 Ả

Số đỏi base mỗi chu
kỳ xoắn

11

10

12

Độ xoắn vận/đôi base

33°

36°

60°

Mức độ xoắn/vòng

28 Â

34 Ả

45 Â

Độ xoắn/đỏi base

2,6 Ả

3,4 Â

3,7 Ả

Độ nghiêng với trục
xoắn

20°

6°

7°

Đường rãnh chính

Hẹp và sâu

Rộng và sâu

Phẳng

Đường rãnh phụ

Rộng và nông

Gốc đường

C3'-endo

C 2’-endo

C 2’-endo đối với
pyrimidin và C 3’-endo đối
với purin

Liên kết glycosidic

Ngược

Ngược

Ngược đối với pyrimidin
và thuận đối với purin

Hẹp

và sâu

Hẹp và sâu

2.1.4. Các lực h óa hoc và cấu trúc là m bên vững cấu trú c a c id nucleic
- DNA không có cấu trúc phức tạp như các phân tử protein bởi lẽ nó chỉ có
một số lượng giới hạn các hình dạng cấu trúc bậc 2 trong khi không có cấu trúc
bậc 3 và bậc 4. Điều này có thể được giải thích bằng sự đa dạng về đặc tính hóa
]ý của 20 acid am in trong phân tử protein so với vẻn vẹn chỉ 4 loại base khác
nhau trong phân tử DNA. Tuy nhiên rấ t nhiều phân tử RNA có cấu trúc bậc 3.
Các lực tham gia hình thành cấu trúc phân tử của acid nucleic giông như các
lực tham gia bình ổn cấu trúc phân tử protein. Tuy nhiên phương thức kết hợp
giữa các lực tương tác đã tạo cho acid nucleic có đặc tính hoàn toàn khác so với
protein.
- Cấu trúc của các gốc đường -phosphat: cấu trúc của đơn vị nucleotid có 6
góc xoắn của khung đường phosphat và một góc xoắn là hướng của base về liên
kết glycosidic. Bảy góc độ này tạo cho mỗi nucleotid trong chuỗi polynucleotid
độ linh động rấ t cao. Tuy nhiên trên thực tế, cấu trúc của chuỗi polynucleotid
lại rấ t bển vững và ổn định.
- Cặp base: các cặp base liên kết chặt vối nhau nhằm duy trì cấu trúc xoắn
kép của acid nucleic. Liên kết hydro không có tác dụng làm bền vững phân tử

DNA mặc dù nó có vai trò quyết định cho sự cặp đôi theo nguyên tắc bô sung.

15


Trong khi đó, liên kết kỵ nước đóng vai trò quyết định trong việc duy trì cấu
trúc ổn định của DNA.
- Cụm các base và tương tác kỵ nước: các n h â n purin và pyrimidm có
khuynh hướng hình thành các chồng m ặt phang song song. Các m ặt phang này
tương tác với nhau bằng các liên kết kỵ nước. Đây chính là yếu tô" đảm bảo cho
cấu trúc bền vững của DNA. Tuy nhiên, cho tối nay các lực liên kết kỵ nước này
vẫn chưa được hiểu hết.
- Tương tác ion: về m ặt lý thuyết
phải tính đến vai trò của các sự tương
điện. Thực nghiệm cho thấy Tm tỷ lệ
trò quan trọng trong việc duy trì cấu
chuyên, RNA ribosom.

thì sự bền vững của cấu trúc acid nucleic
tác tĩnh điện của các gốc phosphat mang
th u ậ n với nồng độ cation. Mg2+ đóng vai
trúc của nhiều loại RNA như RNA vận

- Cấu trúc siêu xoắn của DNA: tấ t cả các phân tử DNA của vi khuẩn và đa
số DNA của virus có cấu trúc hình vòng. Cấu trúc DNA vòng cũng xuất hiện ở
trong ty thể mà ty thể thì có ỏ hầu hết các tế bào bậc cao. Mỗi đầu của chuỗi
DNA đơn liên kết lại vói nhau tạo ra cấu trúc vòng khép kín. Một sô’ cấu trúc
DNA hình vòng này có hình dạng siêu cuộn, siêu xoắn vặn hay siêu xoắn ốc.
Cấu trúc này đôi khi được gọi là cấu trúc bậc 3 của DNA. Trạng th ái siêu xoắn
của phân tử DNA được điều hòa bởi nhóm các enzym có tên là topoisomerase

bao gồm hai nhóm khác nhau là topoisomerase I và II.
2.1.5. Sự biến tín h th u ậ n ngh ịch
Khi dung dịch DNA bị đun nóng trên nhiệt độ riêng thì cấu trúc tự nhiên
sẽ bị phá hủy, hai chuỗi bổ sung sẽ tách khỏi n h au và sẽ tạo ra cấu trúc sỢi đơn
xoắn ngẫu nhiên (Hình 1.5). Quá trìn h biến tính này sẽ làm thay đổi tính chất
lý học của DNA chẳng hạn như độ nhớt của DNA ở trạn g thái biến tính sẽ bị
giảm đáng kể. Khi DNA bị biến tính, độ hấp th ụ m ật độ quang ở vùng bưốc sóng
tử ngoại tăng lên đáng kể (khoảng 40%).
Quá trình biến tính của DNA được biểu diễn bằng đương cong nóng chảy
và điểm uốn của đường cong này được gọi là nhiệt độ nóng chảy (Tm), là nhiệt
độ mà vào tại điểm đó 50% chuỗi DNA đôi được tách th àn h các sợi đơn. Giá trị
Tm phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nồng độ ion, pH, nồng độ phân tử của base G và
c. Ba liên kết hydro giữa G và c bền vững hơn so với hai liên kết hydro giữa A
và T.
Nếu làm lạnh nhanh và duy trì nhiệt độ khoảng 25 °c dưới T m trong một
khoảng thời gian nhất định thì hai sợi đdn DNA bị biến tính sẽ bắt cặp trỏ lại
theo nguyên tắc bổ sung để trở về trạn g thái y nguyên như ban đầu (Ju liu s
Marmur, 1960). Sự liên kết bổ sung giữa DNA và RNA gọi là sự lai hóa và sự lại
hóa DNA-RNA sẽ kém bền vững hơn so với DNA-DNA.

16


1.2. Câu trú c acid r ib o n u c le ic (RNA)
1.2.1. Cấu trú c RNA
Cũng như DNA, liên kết chính trong RNA là liên kết 3’, 5’ phosphodieste.
RNA là một chuỗi nucleotid xoắn đơn, cấu trúc bậc 2 do sự xoắn kép của hai
đoạn bổ sung nhau trên phân tử RNA. Ngoài ra RNA cũng có cấu trúc bậc 3 do
phân tử RNA tồn tại nhiều liên kết hydro.
1.2.2. Các lo ạ i RNA

- RNA vận chuyển (tRNA), chiếm khoảng 15% tổng số RNA của tế bào.
tRNA có hai chức năng và do gôc OH ở đầu 3’ của bộ ba CCA-OH không tham
gia xoắn kép và bộ ba đối mă đảm nhiệm:
+ Hoạt hóa acid amin để phân tử này dễ dàng tạo liên kêt peptid và vận
chuyên acid amin này đến vị trí tổng hợp protein.
+ Nhận biết mã trên p h ân tử mRNA.
Mỗi một tRNA có khả năng vận chuyến một acid amin song một số acid
amin lại có hai tRNA. tRNA có chiều dài khoảng từ 65 đến 110 ribonucleotid và
có cấu trúc chung hình lá chẻ ba với nhiều vùng chức năng khác nhau.
- RNA ribosom (rRNA), chiếm khoảng 80% tổng số RNA của tê bào. rRNA
có nhiều loại khác nhau về trọng lượng p h ân tử và cấu trúc phức tạp. ơ tê bào
PCR-2

17


không nhân có rRNA 5S với 120 mononucleotid; rRNA 23S có 3200
mononucleotid và rRNA 16S gồm 1540 mononucleotid. ơ tê bào có nhân, có các
loại rRNA 5S; rRNA 5,8S với 160 mononucleotid; rRNA 18S gồm 1900
mononucleotid và rRNA 28S có 4700 mononucleotid. 0 ty thê của tê bào động
vật có rRNA 12S và rRNA 16S.
RNA thông tin (mRNA), chiếm khoảng 5% tổng số RNA của tê bào.
mRNA là chất trực tiếp mang thông tin di truyền từ nhân đến ribosom ở bào
tương, ở tê bào có nhân, mRNA có cấu trúc bắt đầu là phân tử 7-methyl
guanosin 5’-triphosphat (gọi là mũ), rồi đến một đoạn nucleotid không mã hóa
acid amin sau đó mối đên đoạn nucleotid mã hóa khỏi đầu bằng bộ ba mã hóa
AUG. Kết thúc đoạn phiên dịch là một trong ba bộ ba mã hóa UAA, UAG, UGA,
rồi tiêp đoạn không phiên dịch thứ 2 và cuôi cùng là đuôi poly A với khoảng 20200 gốc adenosinmonophosphat.
RNA nhỏ của nhân (small nuclear RNA/snRNA) có kích thước khoảng 60300 nucleotid. Người ta phát hiện được hàng chục các loại snRNA khác nhau và
có 5 loại tồn tại nhiều trong nhân tê bào VỚI tên gọi là snRNA U l; U2; U4; Ư5

và snRNA U6. Các snRNA tham gia trong cơ chê cắt bỏ đoạn intron trong quá
trình hoàn thiện mRNA bằng cách cắt và nôi các exon cũng như intron.
Ribozym (RNA enzym) là các phân tử RNA có hoạt tính enzym được p hát
hiện bởi Thomas R. Cech (1980) và đạt giải thưởng Nobel năm 1989. Các
ribozym có khả năng thủy phân các liên kết đặc hiệu trong phân tử RNA. Một
số các ribozym có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc tạo ra các thuốc điều trị
dựa trên nguyên tắc thủy phân hoặc bất hoạt trực tiếp lên các RNA ngay sau
khi mới được tổng hợp. Đồng thời công nghệ ribozym cũng tạo ra các bước đột
phá trong việc nghiên cứu chức năng của bộ gen cũng như tạo các vật liệu cảm
biên sinh học. Một sô' ribozym tồn tại trong tự nhiên như: Peptidvl transferase
23S rRNA, RNase p, nhóm 1 và nhóm II introns, ribozym nhánh GIR1, ribozym
hỉnh kẹp tóc leadzyme, ribozym hình đầu búa, ribozym HDV, ribozyrn CPEB3 ở
động vật có vú, ribozym v s , ribozym glniS, ribozym CoTC.
Ngày nay các nhà khoa học đã tông hợp được nhiều loại ribozym khác
nhau có hoạt tính sinh học tương tự như các ribozym có nguồn gốc từ tự nhiên.

B. CẤU TRÚC GEN VÀ CÁC YẾU Tố ĐIỂU HÒA HOẠT ĐỘNG CỦA
GEN ở TẾ BÀO CÓ NHẢN
Trước khi tiến hành chuyển gen vào trong tê bào hoặc động vật, chúng ta
cần phải cân nhắc đến nhiều vếu tố tác động hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp đên
quá trình biểu hiện gen như: cấu trúc CỈS-DNA, gen điều khiển (promoter), gen
tàng cường (enhancer), các tín hiệu cắt nối gen (splice signals), tín hiệu
polyadenin hóa (polyadenilation signals) và các tín hiệu quyêt định đòi sống
bán hủy của RNA thông tin (mRNA). Tất cả các vếu tố trên liên quan chặt chẽ
đên tính đặc hiệu tê bào của các gen sẽ được biểu hiện. Hơn nữa, các yếu tố này
còn có sự tương tác VỚI nhau và VỚI các yếu tô' khác đế tạo nên các yếu tô tái tô
18


hợp của một sinh vật mỏi. Chính vì vậy, chúng ta phải chặt chẽ tuân thủ

nguyên tắc khi thiết kê cấu trúc gen.
1. GEN ĐIỂU KHIÊN VÀ GEN TĂNG CƯỜNG (Prom oter and Enhancer)
Bàng kỹ th u ật cắt và phân đoạn gen sử dụng công nghệ DNA tái tố hợp,
người ta đã phân tích cấu trúc phân tử của gen điều khiên ở tê bào có nhân
(eukaryotic promoter) và qua đó phát hiện ra yếu tô hoạt động dạng cis (cis■
actmg elements). Yếu tô này điều hòa quá trình biêu hiện gen và có tính đặc
hiệu tê bào. Các yêu tô này được gọi là yếu tô" tăng cường. Các yếu tô" tăng cường
tham gia vào việc hình thành khung cấu trúc cho sự tương tác DNA/protein đê
tạo nên các cấu trúc của chromatin có độ trậ t tự cao hơn nhằm mục đích điều
hòa quá trình sao chép gen đích từ các gen điểu khiển của RNA polymerase
(RNA polymerase promoter). Việc xác định các yếu tô tăng cương cho phép phân
lập và xác định đặc tính của các yếu tố hoạt động dạng trans (trans-actmg
factor). Các yếu tô này có khả năng gắn hoặc thông qua mối tương tác nào đó đê
tác động đến hoạt động của gen điều khiển hoặc gen tăng cường. Khi đánh giá
vai trò của các protein tham gia điều hòa sao chép và cơ chê tác động của chúng,
các nhà khoa học đã khang định rằng cả gen điều khiển và gen tăng cường đểu
đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình điều hòa biểu hiện gen.
Nghiên cứu đầu tiên về gen điều khiển của herpes simplex thymidine
kinase (HSVtk) năm 1982 và của (3- globin người (1981) cho thấy cấu trúc đồng
bộ của các yếu tô" tham gia phức hợp điều khiển của RNA polymerase II. Thành
phần quan trọng n hất của cấu trúc điêu khiển này là vị trí mũ của mRNA
(mRNA cap site), vị trí được coi là khởi điểm của trình tự mRNA. Ngoài ra còn
có khung mã TATA (TATA box), vị trí này thường ở vị trí khoảng -25 tính từ mũ
mRNA. VỊ trí khung mã TATA chính là nơi khởi đầu quá trình dịch mã. Trình
tự nucleotid ở phía trước so vối khung mã TATA thường khác nhau giữa các gen
điều khiển. Ví dụ đối vói gen điều khiển của HSVtk và (3- globin người thì cấu
trúc trình tự CCAAT thường thấy ở các vị trí khác nhau nằm trong
khoảng -70 đến -80 tính từ khung mã TATA. Trong khi cũng tại các vị trí này
của các gen nội chuẩn (house keeping gene) thì lại có các đoạn nucleotid lặp lại
giàu GC. Các phân đoạn lặp lại này là cấu trúc bắt buộc của trình tự của gen

điêu khiển ỏ tê bào có nhân để đảm bảo cho quá trình phiên mã hoạt động.
Trong một sô trường hợp ngoại lệ, khi thiết kê phức hợp biểu hiện gen
chúng ta phải lựa chọn giữa các yếu tô" tăng cường hoặc các yếu tố tái tô hợp.
Khi nghiên cứu bộ gen của SV40 và retrovirus ở chuột (M urine retroviruses)
người ta phát hiện ra rằng các phức hợp gen tăng cường của chúng rất đặc biệt,
bao gồm nhiều yếu tô biểu hiện gen. Vai trò của các yếu tô" này hiện nay chưa
được biết đầy đủ song chúng ta có thế đưa ra một sô" nét đặc trưng nhất của
phức hợp gen tăng cường:
Là phức hợp lốn, thường có các đoạn trình tự lặp lại và có thể có các chức
năng riêng biệt.

19


Có khả năng thể hiện chức năng mặc dù nằm ở những vùng gen xa cách
tới vài ngàn đôi base.
Hoạt động theo hướng nhất định.
Có thế hoạt động theo phương thức độc lập tại chỗ (tại vùng gen mã hóa)
hoặc ở xa (phía dưối của vùng này). Tuy nhiên, phức hợp gen tăng cường
này chỉ có khả năng hoạt động khi ở dạng cấu trúc cis. Nếu có một vài
gen điều khiển nằm cạnh nhau thì gen tăng cường sẽ tác động trực tiếp
lên gen điều khiển ở gần nhất.
Có tính đặc hiệu tổ chức hoặc phụ thuộc vào giai đoạn biệt hóa của tê
bào.
Phức hợp gen tăng cường được xác định là liên kết với cả virus và các gen
của tê bào.
1.1. Một sô phức hợp gen tăng cường
1.1.1. Phức hợp gen tă n g cư ờ ng có nguồn gốc viru s rviral enhancer)
- Gen tă n g cư ờ ng sv 40: nằm gần ở vị trí khởi đầu của sao chép. Gen
này bao gồm 3 đơn vị chức năng A, B và c. Mỗi đơn vị này phối hợp vối các đơn

vị khác hoặc với nhau để thúc đẩy quá trình sao chép. Vị trí của gen tăng cường
SV40 ảnh hưởng nhiều đến quá trình biểu hiện gen trong cùng một loại
plasmid. Đồng thời có các yếu tô" liên kết vói gen tăng cường đóng vai trò hoặc là
hoạt hóa hoặc là ức chê đôi vối quá trình phiên mã của gen đích mà nó tham gia
điều hòa.
- Gen tă n g cư ờ ng c ủ a Polyom a: nằm ở vị trí khởi đầu của sao chép
giông như gen tăng cường SV40. Tuy nhiên có một điểm khác biệt là hoạt động
của gen này cần có sự tham gia của các yếu tố điều hòa. Gen điều hòa polyoma
bình thường ở trạng thái bất hoạt ở dòng tê bào F9 EC chưa biệt hóa và chỉ
chuyển sang dạng hoạt động khi tê bào đã được biệt hóa. Tuy nhiên, dạng đột
biến của virus Polyoma lại có thể nhân lên ở cả tê bào chưa biệt hóa lẫn tê bào
đã biệt hóa. Sự thay đổi trình tự nucleotid ở thể virus đột biến này là những đột
biên nhân đoạn hav các đột biến khác xảy ra ở vùng khởi đầu sao chép hoặc tại
vùng gen tăng cường. Những đột biến này đã làm tăng cường mạnh mẽ quá
trình sao chép của bộ gen virus. Người ta đã xác định được các vị trí đột biên
này ở gen tàng cường của Polyoma. Chính vì vậy, người ta cho rằng các đột biến
điểm đã tạo điều kiện cho các tác nhân trong tế bào hoặc ngoại bào khác thúc
đẩy quá trình sao chép gen và biệt hóa tế bào.
- Gen tă n g cư ờ ng c ủ a retro viru s: các retrovirus cũng mang các gen
tăng cường trong đó phải kể đến các gen tăng cường của virus M urine leukemia
và sarcoma. Các gen tăng cường của retrovirus có tính đặc hiệu tê bào. Ví dụ
các gen tăng cường của virus Mononey murine leukemia (MoNuLV) và của virus
Monoley murine sarcoma (MoMuSV) có tính đặc hiệu tê bào khác với gen tăng
cường của virus Friend m urine leukemia mặc dù cả 3 gen tăng cường này đều có
20


hoạt tính tương đương nhau ơ tê bào hồng cầu non. Hai gen tăng cường
MoMuSV và MoMuLV có hoạt tính cao hơn gen tăng cường Friend MuLV tối
20-40 lần ở tế bào lympho T. Kết quả nghiên cứu thực nghiệm chuyển gen

retrovirưs vào tê bào đã đưa ra những bằng chứng khoa học về tính đặc hiệu tô
chức của gen tăng cường và gen điều khiển.
- Gen tă n g cường của v iru s P apillom a: virus Papiỉỉoma của người và
bò có các phức hợp gen tăng cường và đều có tính đặc hiệu tố chức. Các tê bào
nhiễm virus này sẽ duy trì DNA của virus ở trong nhân ỏ dạng plasmid. Ba yếu
tố hợp th àn h phức hợp gen tăng cường điểu hòa hoạt tính sao chép của virus
Papilloma (BPV) nằm từ ví trí 59 của đầu 3’ đến đầu đoạn polyadenin ở đầu
vùng gen sao chép của virus. Đầu 5’ của gen tăng cường nằm cạnh gen điều
khiển của virus và có thê trở thành dạng hoạt hóa trans bởi protein E2. Virus
Papilloma người (HPV) type 18 có ba vùng phức hợp gen tăng cường trong đó
hai phức hợp (IE2, IE6) là phức hợp tăng cương cảm ứng (inducible enhacer) và
một phức hợp tăng cường cô định (constitutive enhancer). Các gen tăng cường
này hoạt động độc lập với nhau và phụ thuộc vào các giai đoạn khác nhau trong
chu kỳ sông của virus.
- Gen tă n g cư ờ ng củ a v iru s viêm g a n B (Hepatitis B)\ nằm ở vị trí 3’
của gen mã hóa kháng nguyên bê mặt của virus viêm gan B. Các nghiên cứu đã
khắng định rằng gen tăng cường của HBV có khả năng làm tăng mức độ biểu
hiện của các gen được điều hòa bởi gen tăng cương hoặc gen điều khiển SV40.
Song điều này chỉ đúng khi gen tăng cương của HBV nằm ở trong vùng sao
chép. Hiện nay vẫn còn nhiều tran h luận về cơ chê quyêt định tính đặc hiệu tê
bào của gen tăng cường này.
- Gen tă n g cường của v iru s g â y suy g iả m m iễn d ịch ở người (Human
immunodeficiency ưirus): virus này có hệ thông điều hòa hết sức phức tạp liên
quan đến protein hoạt hóa trans (írans-activating protein viết tắt là tat) và yêu
tố hoạt hóa cis đồng loại (cís-acting element viết tắt là tar). Mặc dù yếu tố đồng
loại tar không thuộc phức hợp gen tăng cường, song nó có vai trò hết sức quan
trọng trong quá trình biểu hiện gen. Tat cùng với tar có khả năng làm tăng
mRNA của virus và quá trình sinh tổng hợp protein lên khoảng 100 lần, trong
đó tăng quá trình sao chép RNA khoảng 20 lần và tăng quá trình phiên mã lên
5 lần. Thêm vào đó HIV còn có gen tăng cường xác thực (authentic enhancer)

nằm ở phía trước vùng gắn của S P l ở giữa U3 của LTR (vị trí -137 đến -17).
Gen tàng cường này không đặc hiệu và có thể thay thê bằng gen tăng cường
RSV hoặc SV40.
- Gen tă n g cường c ủ a C yto m eg a lo viru s người (HCMV'): bộ gen của
virus này có kích thưốc 135 kb và mang gen tăng cường có hoạt tính thúc đẩy
quá trình sao chép rất mạnh. Gen tăng cường của HCMV nằm ỏ phía trước
vùng bắt đầu sao chép (trong khoảng -525 đến -118) có hoạt tính mạnh hơn
SV40 khoảng vài lần và ít tài liệu đề cập đến tính đặc hiệu tế bào và tính đặc
hiệu tố chức của gen này.

21


1.1.2. Phức hợp geti tă n g cường có nguồn gốc t ế bào (Cellular enhancerj
Các nghiên cứu quá trình biểu hiện gen của tế bào đã p h át hiện ra một số
lượng lốn các gen tăng cường có nguồn gốc tế bào, và số lượng các gen này được
phát hiện ngày càng tăng. Các gen tăng cưòng này được chia th à n h hai nhóm: i)
nhóm các gen tăng cường liên quan đến các gen của hệ thống miễn dịch như gen
mã hóa chuồi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể, các gen hòa hợp tố chức, các
gen của thụ thể tê bào T, các gen mã hóa interferon p và gen mã hóa th ụ thể
của interleukin -2; và ii) nhóm các gen tăng cương liên quan đến các gen còn lại
của cơ thê như P-actin người, creatinin kinase ngưòi, prealbumin, elastase I,
methallothionein, collagenase, a-fetoprotein, Ỵ-globin và P-globin, c-fos, c-ras,
insulin và các phân tử kết dính tế bào (NCAM).
1.2. Gen điều k hiển và gen tăng cường cảm ứng (Inducible promoter and
enhancer)
Đại đa sô các gen đều không được biểu hiện liên tục mà chúng chỉ được
hoạt hóa cảm ứng hoặc ức chê trong những thời điểm hoặc giai đoạn nào đó
trong cuộc đời của cá thể. Nhờ những hiểu biết vê cơ chế quá trinh ức chê và
hoạt hóa gen, chúng ta có thế kiểm soát in vitro quá trình này thông qua việc

thêm hoặc loại đi những tác nhân điều hòa ở môi trường nuôi cấy tê bào. Có hai
yếu tô điều hòa được ứng dụng rộng rãi trong các thực nghiệm chuyển gen ở tê
bào có nhân là: i) các yếu tố điều hòa biểu hiện metallothionein và ii) các yếu tô
điêu hòa đáp ứng glucocorticoid.
1.3. Cơ c h ế hoạt động của gen tăn g cường
Một câu hỏi đặt ra: gen tàng cường hoạt động theo cơ chê phân tử nào?
Chúng ta biết rằng gen tăng cường có khả năng ảnh hưởng r ấ t mạnh đến quá
trình sao chép kể cả khi nó được đặt ở xa vị trí của gen điều khiển. Nhiều bằng
chứng khoa học đã cho thấy rằng cùng một gen tăng cường song ỏ trạng thái
phức hợp (multimer) thì gen này có hoạt tính cao hơn rấ t nhiều so với ở dạng
cấu trúc đơn (monomer). Thêm vào đó, ngày nay người ta đã phân lập được
nhiều loại protein gắn với gen tăng cường một cách đặc hiệu và thông qua đó
thúc đẩy hoạt tính của các gen này.
Bảng 1.2. Các gen điều khiển và gen tăng cường cảm ứng
Các yêu tô điều hòa

Tác nhân cảm ứng

MT II

Phorbol ester (TPA)

Tài liệu tham khảo

Kim loại nặng
MMTV (mouse m am m ary
tum or virus)

G lucocorticoid

p-lnterferon

poly(rl)X
poly (rc)

Adenovirus 5 E2

E1a

Collagenase

Phorbol ester

99

Angel và cs., 1987


Strom elysin

Phorbol ester

Angel và cs., 1987

SV40

Phorbol ester

Angel và cs., 1987

Gen m urine MX

Interíeron,

Hug và cs., 1988

Virus bệnh Nevvcastle
Gen GRP78

A23187

Resendez và cs., 1988

u-2-m acroglobulin

IL-6

Kunz và cs., 1989

Vim entin

Serum

Ritting và cs., 1989

MHC lớp 1 gen H-2Kb

Interteron

Blanar và cs., 1989

HSP70

E1a

VVilliams và cs., 1989

SV40 large T antigen
Proliterin

Phorbol Ester-TPA

Mordacg và Linzer, 1989

Yếu tố hoại tử khối u (TNF)

PMA

Hensel và cs., 1989

Gen Thyroid stim ulating
horm on a

Thyroid hormon

Chatterjee và cs., 1989

Có hai cách lý giải cơ chê hoạt động của gen tăng cường: i) Tác dụng xa
của gen tăng cưòng được giải thích là do gen này tác động lên mối tương tác
gen-protein, thông qua đó ảnh hưởng đến phức hợp sao chép (gồm RNA

polymerase, các protein đặc hiệu của gen điều khiển ỏ vi trí của gen này). Mối
tương tác này liên cỊ&an đến cấu trúc thòng lọng của DNA (loop structure). Các
nghiên cứu cho rằn g do khoảng cách giữa các phức hợp sao chép tối vị trí cấu
trúc thòng lọng của DNA quá gần nên tại vị trí uổn lượn của DNA phải có vị trí
gắn của các protein đặc hiệu và lẽ dĩ nhiên cấu trúc của các phức hợp DNAprotein này phải thích hợp với cấu trúc xoắn kép tại vị trí đó; ii) Có một phân tử
trung gian đóng vai trò tạo phức hợp DNA-protein để hình thành một phức hợp
lớn mà không cần các cấu trúc thòng lọng uốn lượn của DNA. Một sô" phân tử
trung gian đã được p hát hiện trong quá trình nghiên cứu sao chép thực nghiệm
in ưitro.
Hai mô hình trên đã lý giải cơ chế của sự tương tác giữa gen điều khiển và
gen tăng cường. Tuy nhiên, các mô hình trên không lý giải được cơ chế của sự
tương tác xa giữa các gen điều khiển và gen điều hòa. Một sô" các nhà khoa học
đã giải thích rằng sở dĩ có sự tương tác xa giữa gen điều khiển và gen điểu hòa
là nhờ sự hình th à n h cấu trúc thòng lọng. Với cấu trúc này, hai gen nằm xa
n hau (ở cấu trúc bậc 1) song lại có thể gần nhau (ở cấu trúc bậc 3). Sự tương tác
này cho phép hình th àn h một phức hợp bền vững hơn, dễ điều hòa hơn đôi với
những phức hợp lớn đa phân tử, có nhiều gen điều hòa và gen điều khiển tương
tác với nhau.
2. MỐI TƯƠNG TÁC GIỮA GEN ĐIÊU KHIEN v à INTRON
Đây là một trong số những hiện tượng khó giải thích về các yếu tô' ảnh
hưởng đến hiệu quả hoạt động của các cistron tái tổ hợp. Tuy nhiên, những
23


bằng chứng thực nghiệm đã chỉ ra rằng điều kiện cần thiết đối vói intron có
chức năng trong cistron tái tổ hợp là nó phải phụ thuộc gen điều khiển. Điều
này có nghĩa là khi chuyển gen thì một số gen điều khiển hoạt động hiệu quả
hơn khi nó được kèm theo gen chứa intron.
Trong thí nghiệm chuyển gen của các cistron tái tố hợp, cần thiết phải có
m tron khi quá trình sao chép được điều khiển bởi gen điều khiển/gen tăng

cưòng immunoglobulin |i tái tố hợp. Mặc dù không cần một intron chuyên biệt
nào song hầu như sự hiện diện của intron là một trong những điều kiện bắt
buộc đê quá trình sao chép có thể xảy ra. Quá trình biểu hiện gen (3-globin được
điểu khiển bởi gen điều khiển SV40 thì cũng cần phải có tín hiệu từ những đoạn
gen đặc hiệu. Tuy nhiên, những thông tin hỗ trợ từ những đoạn gen này không
thê làm quá trình biêu hiện gen [3-globin được ổn định khi nó được đặt ở vị trí
cuối (downstream) của vùng polyadenin. Thêm vào đó, đoạn gen được lấy từ gen
mã hóa thymidin kinase của herpes simplex virus lại có khả năng thúc đẩy quá
trình biểu hiện của gen P-globin mạnh lên tối 100 lần (không phụ thuộc ìntron)
khi sử dụng gen điều khiển SV40 ở phía trước (early promoter).
Các nhánh của intron dường như đóng vai trò quan trọng trong việc xác
định mức độ tích tụ của mRNA ở các cistron ngoại lai được đưa vào trong chuột
chuyển gen. Brinster và cs (1988) đã kiểm tra hoạt động của các thể lai giữa gen
tăng cường/gen điều khiên/gen cấu trúc bằng cách gắn metallothionin I chuột
nhắt hoặc gen tăng cường/gen điều khiển của elastase I chuột công với gen mã
hóa hormon tăng trưởng của chuột công. Thế lai giữa metallothionein I của
chuột nhắt với hormon tăng trương được xác định ở gan bào thai trong khi thể
lai elastase I của chuột cống/hormon tăng trưởng được xác định ở tụy. Phương
thức hoạt động của gen mã hóa metallothionein chuột nhắt đột biến vối chuỗi
oligonucleotid tổng hợp làm tăng cường sự khác biệt của mRNA tạo ra bởi các
gen đồng vị ngoại sinh và nội sinh. Gen mã hóa P-globin ngưòi đưa vào chuột
chuyên gen được kiểm tra song song. Trong mỗi trường hợp, khoảng 10-100 lần
mRNA được tạo ra từ phức hợp có chứa intron. Hơn thê nữa, cả cấu trúc
metallothinein chuột n h ắt có hoặc không có intron đều có hoạt tính tương đương
nhau khi được đưa vào các tê bào nuôi cấy. Điêu này cho thấv intron có vai trò
quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình sao chép của các gen được chuyến. Tuy
nhiên cơ chế phân tử của sự tương tác giữa gen điều khiển/intron vẫn chưa được
làm sáng tỏ.
3.

CÁC

TÍN

HIỆU

THOÁI

HÓA

CỦA mRNA VÀ

QUÁ

TRÌNH

POLYADENIN HÓA
Tính bền vững của mRNA ở tê bào rất khác nhau (từ 15 phút đến hàng
giờ). Một điều rõ ràng là tỷ lệ phân hủy của mRNA là chỉ sô quan trọng đê đánh
giá sự điều hòa quá trình biểu hiện gen. Các yêu tô kiểm soát tính bền vững của
mRNA chính là cấu trúc tự nhiên của Ĩ1 Ó. Sự phân hủy có tính chất chọn lọc
dường như là hậu quả của quá trình tương tác giữa endonuclease hoặc các yếu
tố khác với cấu trúc đặc hiệu nội phân tử của phân tử mRNA.
24


Quá trình điều hòa một cách tinh tê sự thoái hóa mRNA được minh họa
bởi sự gắn kết giữa phân hủy mRNA của histon H3 vối sự tái bản của DNA
trong chu kỳ tê bào và bởi tốc độ quay vòng mRNA của transterin receptor cùng
với sự có mặt của sắt. c ả hai sự kiện trên đêu góp phần tạo nên cấu trúc thòng

lọng ở đầu 3’ của mRNA mã hóa protein.
Một số loại RNA có đời sông ngắn mang các đoạn gen giàu trình tự AU
(AU-rich sequences) ở đầu không mã hóa 3’. Những đoạn gen này có vai trò
quan trọng về mức độ bền vững trong chuyển hóa của các loại RNA này. Tuy
nhiên, các vùng gen tương tự cũng được tìm thấy ỏ đầu không mã hóa 3’ của (3globin nhưng phân tử này lại có độ bền vững cao. Điều đó chứng tỏ rằng phải có
những những vị trí chọn lọc đặc hiệu cho các đoạn gen giàu AU mà nó mang lại
hoạt tính kém bển vững cho phân tử mRNA. Những đoạn trình tự này được
phát hiện nhiều ỏ các gen mã hóa lymphokin cũng như ỏ các gen gây ung thư
(oncogene) như c-fos và c-myc. Trong trường hợp vối c-fos, sự thoái hóa mRNA
có thê là do tập hợp của nhiều yếu tô' kém bền vững. Việc loại bỏ vùng trình tự
gen giàu AU cũng chưa đủ để duy trì tình trạng bền vững của mRNA. Riêng
vùng gen mã hóa c-fos cũng có thế ở trình trạng kém bên vững mặc dù nằm
trong một phân tử bền vững. Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng có hai vùng
gen có hoạt tính kém bền vững hoạt động theo hai cơ chê khác nhau. Trên thực
tế, các chất ức chế quá trình sao chép can thiệp vào quá trình thoái hóa của một
RNA mang vùng gen c-fos giàu AU nhưng lại không can thiệp vào sự thoái hóa
của cấu trúc chỉ mang vùng gen c-fos.
Vai trò của đuôi poly-A trong việc duy trì tính bền vững của mRNA chưa
rõ ràng. Kết quả nghiên cứu thực nghiệm cắt ngắn dần đuôi poly-A sau đó theo
dõi tính bền vững của các phân tử mRNA này đều gợi ý rằng đuôi poly-A có tác
dụng bảo vệ các phân tử mRNA trán h khỏi sự thoái hóa nhanh. Người ta phát
hiện ra rằng phân tử mRNA có > 32 gốc polyadenin thì có độ bền vững tương
đương với các mRNA có 150 gốc. Tuy nhiên với những mRNA chỉ có 16
polyadenin thì tính bền vững giảm đi 10 lần so với những phân tử có 32-150
polyadenin. Trong khi đó, không có một bằng chứng khoa học nào chứng tỏ đuôi
poly-A có tác dụng ức chê quá trình biểu hiện gen. Chính vì vậy, cistron tái tô
hợp cần phải mang đuôi poly-A để thúc đẩy quá trình biểu hiện gen.
Nhiều dấu hiệu đã cho thấy cơ chê phân tử của đặc tính bển vững hoặc
kém bền vững của phân tử mRNA chính là sự tương tác giữa đoạn gen ở đầu 3’
không mã hóa giàu AU vối đuôi poly-A. Phức hợp này được gọi là nhóm các

protein gắn vối đuôi poly-A (poly-A binding proteins).
4. KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SAO CHÉP
Có một nhóm các yếu tô' ở dạng cis- và trans- ảnh hưởng đến hiệu quả của
quá trình phiên mã của mRNA ở tế bào có nhân (eukaryotic). Điều này đã cho
phép tạo ra các cistron tái tổ hợp. Nghiên cứu của Jang và cs (1988) đã chỉ ra
ràng đoạn gen từ virus Encephalomyocarditis có khả năng thúc đẩy quá trình
phiên mã của cả hai chuỗi gen mã hóa của bi-cistronic mRNA. Đoạn gen này có
25


chức năng như là một vùng tiếp nhận của ribosom. Khi đoạn gen này nằm ở
phía dưới (downstream) vùng gen mã hóa của một gen, nhưng lại nằm ở phía
trên (upstream) vùng gen mã hóa của một gen khác nằm trên cùng một phân tử
mRNA, thì cả hai vùng gen mã hóa trên sẽ đều được phiên mã. Việc thêm đoạn
gen này vào phân tử DNA tái tổ hợp ở vị trí thích hợp sẽ cho phép quá trình
phiên mã diẹn ra hiệu quả hơn đối với cả hai gen trên phân tử bi-cistronic
mRNA, thậm* chí có thể đối với ba gen ở dạng tri-cistronic mRNA.
Một yếu tô" khác là trans- có khả năng tác động mạnh đến quá trình phiên
mã của mRNA được gọi là gen VA của adenovirus. Khi đồng thời chuyển yếu tô"
này cùng với các gen khác vào tê bào cos, quá trìn h phiên mã của các gen này
sẽ được tăng cường, song không phải đôi với tấ t cả các mRNA.
Cơ chế giả định về vai trò gen VA của adenovirus trong quá trình phiên
mã liên quan đến một protein kinase có tên gọi là yếu tô ức chê hoạt hóa dsRNA
(dsRNA-activated inhibitor) viết tắt là DAI. Sau khi nhiễm virus, hai phân tử
mRNA của VA RNA polymerase III được biểu hiện ở mức độ r ấ t cao và điều này
cần thiết cho việc phiên mã mRNA một cách hiệu quả của adenovirus được
nhiễm tiếp ở những lần sau đó. VA RNA có khả năng gắn với DAI kinase và ức
chế sự hoạt hóa của dsRNA in vitro. Có giả thiết cho rằng sự xuất hiện của
dsRNA được tạo ra từ sự sao chép bất đối của bộ gen adenovirus, có tác dụng
hoạt hóa DAI kinase đế phosphoryl hóa tiểu đơn vị của yếu tô bắt đầu sô" 2 hoạt

hóa ở tế bào có nhân (active eukaryotic initiation factor 2) viết tắ t là eIF2. Kết
quả cuối cùng là ức chế sự khởi đầu quá trình phiên mã. VA RNA ức chế DAI
kinase và do vậy ngăn cản sự ức chế quá trình khởi đầu sao chép. Chính vì vậy,
VA RNA điều hòa mức độ của eIF2 hoạt hóa. Trong các ứng dụng đặc biệt là đối
với các thí nghiệm về tái bản nhanh ở tê bào c o s , việc bổ sung gen VA trong
hỗn hợp chuyển gen ở dạng cis- hay trans- là một công cụ hữu hiệu để làm tăng
quá trình biểu hiện các gen được chuyên đối với đa sô gen, song không phải tất
các các gen điều khiển.
5. CÁC HIỆN TƯỢNG LIÊN QUAN
Việc lần đầu tiên phát hiện ra gen tăng cường đã thúc đẩy các nhà khoa
học tìm hiểu sâu hơn nguồn gốc quá trìn h tái bản ở tê bào có n h ân như các yếu
tô" cis- nhằm mục đích tăng cường hiệu quả biến đổi của các gen chỉ điểm
(marker gen). Trên thực tế, có nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự kết nối giữa
chức năng của các gen tăng cường với quá trình tái bản DNA. Nhiều nghiên cứu
đã chỉ ra rằng chức năng của gen tăng cường có tính đặc hiệu tê bào.
Một số yếu tố khác cũng có thê ảnh hưởng đến chức năng của cistron tái tổ
hợp khi được đưa vào trong tê bào và động vật. Ví dụ: các kiểu methyl hóa DNA
có thể ảnh hương đến quá trình điều hòa p hát triển chức năng gen tăng cường
khi bộ gen của retrovirus hòa nhập vào dòng tế bào gốc của chuột nhắt Ụ ahner
và Jaenisch, 1985) hoặc điều hòa p hát triển của gen immunoglobulin ở tế bào
nuôi cấy (Kelley và cs., 1988). Thêm vào đó, vị trí hòa nhập của cistron tái tô
hợp vào bộ gen của tê bào chủ có thể làm thay đổi đáng kể khả năng biểu hiện
26