bệnh học thực vật, chẩn đoán bệnh và một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh và nấm đối kháng

KILOBOOKS.COM

1
Li cm n

Trc ht em xin chõn thnh gi li cm n n Phũng bnh hc
phõn t - Vin di truyn nụng nghip cựng cỏc cỏn b cụng nhõn viờn
trong phũng ó to iu kin giỳp em trong sut thi gian thc tp
va qua.
Em cng xin gi li cm n n Vin Cụng ngh Sinh hc Thc
phm - i hc Bỏch Khoa H Ni v cụ giỏo hng dn to iu
kin cho em hon thnh t thc tp k thut.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

2
Li m u

Vin Di truyn nụng nghip c thnh lp ngy 10/10/1989, tin thõn
ca Vin l Trung tõm Di truyn Nụng nghip (thnh lp nm 1984). Hin nay,
Vin nm trờn a bn huyn T Liờm, H Ni.
Chc nng chớnh ca Vin l :
-Nghiờn cu, ng dỳng cỏc phng phỏp di truyn hc hin i v cụng
ngh sinh hc chn to cỏc ging cõy trng cú nng sut cao, phm cht tt,
chng chu sõu bnh v cỏc iu kin bt li ca mụt trng.
-To cỏc chng vi sinh vt mi phc v bo qun v ch bin lng thc-
thc phm, sn xut cỏc loi ch phm sinh hc phc v nn nụng nghip bn
vng v bo v mụi trng.
-Tng cng hp tỏc quc t v tham gia o to cỏn b v lnh v Di
truyn v Cụng ngh sinh hc.

thc hin c cỏc chc nng trờn, Vin ó t chc thnh 10 n v
nghiờn cu v chuyn giao cụng ngh vi tng s cỏn b l 116 ngi trong ú
cú 3 tin s , 6 phú giỏo s, 16 phú tin s v 8 thc s.
Trong nhng nm qua, Vin ó t c rt nhiu thnh tu, ó thc hin
v ch trỡ 18 ti nh nc, 42 ti cp ngnh, 8 d ỏn sn xut th, to c
nhiu ging lỳa mi v cỏc ch phm sinh hc phc v nụng nghip, to ra cỏc
quy trỡnh tin b k thut c cụng nhn. Ngoi ra, Vin cũn thc hin cỏc d
ỏn hp tỏc quc t vi cỏc t chc UNDP, FAO Nh cỏc thnh t trờn m
Vin ó nhn c nhiu gii thng cú giỏ tr c trong v ngoi nc: Gii
thng quc t v úng gúp phỏt trin nụng nghiờph Chõu ỏ Thỏi Bỡnh Dng,
huõn chng lao ng hng 3




THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

3
Gii thiu chung v bnh hc thc vt

I. Quan nim v bnh hi thc vt
Vic ch ra đc chính xác lúc nào cây b bnh ln là mt vn đ khó
khn và đc các nhà khoa hc quan tâm nghiên cu. Ngi ta cho rng mt
cây đc coi là kho mnh và phát trin bình thng khi nó biu hin các chc
nng sinh lý  mc ti đa tim nng di truyn ca nó. Các t bào mơ phân sinh
ca cây kho mnh thc hin chc nng phân chia và chun hố khi c th đòi
hi là cn thit. Các kiu t bào chun hố khác nhau hp th nc và dinh
dng t đt, đa nc và dinh dng đn tt c các b phn ca cây, tin hành
q trình quang tng hp, các q trình chuyn hố và trao đi cht, hoc lu

gi các sn phm ca q trình quang tng hp và to ht hoc các c quan tái
to khc cho kh nng sinh tn và phát trin. Bt c khi nào các t bào ca mt
cây hay mt b phn nào đó ca cây có kh nng thc hin mt hay nhiu chc
nng đc bit b can thip do các vi sinh vt hoc là yu t mơt trng bt li
thì các hot đng ca các t bào b gián đon, b thay đi hay b c ch hoc b
cht và cây trng tr nên b bnh.
u tiên bnh mi ch xy ra  mt vài t bào và vn cha biu hin ra
nhng ch trong mt thi gian ngn, bnh lan rng và các b phn cây b bnh
bt đu thay đi và biu hin ra ngồi các triu chng bnh mà mt thng có
th thy đc. Da vào nhng thay đi mà cây th hin khi phn ng li s xâm
nhim ca vi sinh vt hay nh hng ca các yu t mơi trng bt li mà
chúng ta có th bit đc mc đ bnh ca cây. T đó bnh ca cây có th đc
đnh ngha là : mt chui các phn ng ca các t bào và các mơ thc vt vi
các vi sinh vt gây bnh hoc vi các yu t mơi trng mà ta có th nhìn thy
đc hoc khơng nhìn thy đc, dn đn nhng thay đi bt li theo hình dng,
chc nng, hoc tình trng ngun vn ca cây trng và có th dn đn s suy
yu hoc có th gây cht tồn phn hoc tng phn ca cây.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

4
Cỏc tỏc nhõn gõy bnh vi sinh vt thng gõy bnh bng cỏch can thip
vo quỏ trỡnh trao i cht ca t bo cõy thụng qua cỏc enzyme, cỏc cht c t,
cỏc cht iu ho sinh trng v cỏc loi cht khỏc m chỳng tit ra khi tip xỳc
vi cõy ch, hoc hp th dinh dng ca t bo ch phc v cho mc ớch s
dng ca chỳng. Mt s sinh vt khỏc li gõy bnh bng cỏch sng ký sinh v
phỏt trin, sinh sn trong h thng bú mch mụ g hay bú mch libe v hu qu
tt yu l lm tc nghn ng vn chuyn lờn xung ca nc v ca ng.
Ngoi ra, cỏc yu t mụi trng cng gõy bnh trờn thc vt khi tỏc ng vi

mc ngoi ngng chng chu ca cõy.
Cú rt nhiu loi bnh hi cõy trng, chỳng c phõn nhúm theo rt
nhiu tiờu chun: theo triu chng bnh, theo b phn cõy b bnh, theo loi cõy
b bnh Hin nay, ph bin nht l ngi ta phõn loi bnh cõy da vo loi
tỏc nhõn gõy bnh. Theo tiờu chun ny, bnh thc vt c chia lm 2 loi:
bnh gõy ra do cỏc yu t sinh hc v bnh gõy ra bi cỏc yu t khụng sinh hc.
Theo tiờu chun ny, ta cú th ch ra c nguyờn nhõn gõy bnh, quỏ trỡnh tin
trin v cỏch lan truyn bnh t ú suy ra c bin phỏp phũng tr bnh








THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

5
Phn i: Ni cy mơ t bào thc vt

I. Khái nim chung:

Ni cy mơ t bào là mt phm trù khái nim chung cho tt c các loi
ni cy nhng ngun liu thc vt hồn tồn sch các vi sinh vt trên mơi
trng dinh dng nhân to và trong điu kin vơ trùng. Bao gm:
- Ni cy các c th thc vt hồn chnh.
- Ni cy các c quan, b phn tách ri ca thc vt nh mu lá, mu r,
mt đon thân, mt b phn ca hoa, qu

- Ni cy phơi non (phơi cha phân hố hồn tồn), phơi trng thành.
- Ni cy mơ so (callus)
- Ni cy t bào: T bào thc vt đn (ni cy huyn phù t bào), t bào
trn

Cơng ngh ni cy mơ, t bào thc vt da trên tính tồn nng ca t bào
do Haberlandtf phát biu (1898): Mi t bào ca c th đa bào có kh nng tim
tàng đ phát trin thành mt c th hồn chnh trong điu kin phù hp. C s
vt cht ca tính tồn nng là mi t bào trong c th đa bào đu cha đy đ
vt cht thơng tin di truyn. Khi to đc mơi trng ni cy phù hp, s dng
các cht điu khin sinh trng thc vt, ta có th hot hố gen cn thit đ bt
mt t bào bt k ca c th thc vt phát trin đc thành cây hồn chnh.
Phân hố và phn phân hố ca t bào cng là c s lý thuyt ca cơng
ngh này. Trong đó, s phân hố là vic chuyn nhng t bào phơi sinh tr
thành các t bào chun hố đ thc hin nhng chc nng khác nhau v sinh lý,
sinh hố; còn s phn phân hố là s chuyn các t bào đã chun hố tr li
trng thái phơi sinh, có kh nng phân chia đ cho ra các t bào mi.
iu kin đ t bào th hin tính tồn nng qua con đng phân hố và
phn phân hố là mơi trng ni cy.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

6

II.Mơi trng ni cy mơ t bào thc vt:

Mơi trng ni cy là yu t quan trng, nó quyt đnh cho s thành cơng
ca vic ni cy mơ t bào thc vt tách ri. Thành phn chính bao gm:

1. Ngun t khống đa lng: Là các ngun t nh N, P, K, Mg, S,
Ca ,chim nhiu trong mơi trng ni cy vi hàm lng ca mi
ngun t thng ln hn 30mg/l. Chúng là ngun liu đ t bào, mơ
thc vt xây dng nên thành phn cu trúc.
2. Các ngun t khống vi lng: Là các ngun t nh Fe, Mn, Mo, B, I,
Cu, Zn, Co vi hàm lng mi ngun t nh hn 30mg/l. Chúng là
thành phn ca coenzim đ xúc tác phn ng hố sinh din ra trong t bào
sng.
3. Ngun cacbon: Trong ni cy mơ, t bào thc vt, các mơ và t bào
chuyn sang phng thc sng d dng nên cn phi cung cp cho chúng
mt ngun cacbon hu c, thng là đng mía saccaroza (trong mt s
trng hp còn s dng glucoza, maltoza, lactoza ).
Ngồi ra, manitol, sorbitol đc s dng rng rãi trong ni cy huyn
phù và t bào trn vi chc nng n đnh áp sut thm thu.
4. Vitamin: T bào và mơ thc vt trong điu kin in vitro vn có kh nng
tng hp vitamin nhng lng tng hp đc khơng đ nên phi b sung
vitamin ngoi sinh vào mơi trng cy. Vitamin thng dùng là nhóm B
d hồ tan vào trong nc nh B
1
, B
2
, B
3
, B
5
, B
6
vi hàm lng t
mt đn mt vài mg/l. Chúng là thành phn coenzim ca hàng lot
enzim xúc tác cho các phn ng hố sinh, vì vy khơng th thiu

trong mơi trng ni cy.


THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

7
*Myo-Inositol là mt hp cht th cp có vòng thm (cha đc xp
vào vitamin), do s tham gia hình thành hp cht pectin to thành t bào,
có tác đng kích thích mnh m s phân chia ca t bào, đc s dng
vi lng ln ~ 100 mg/l.
5. Cht điu khin sinh trng: Là thành phn quan trng nht ca
mơi trng ni cy, giúp điu khin đc q trình phân hố và phn
phân hố t bào, th hin đc tính tồn nng ca t bào trong ni cy
t bào và mơ thc vt tách ri. Ngi ta thng s dng ch yu hai
nhóm cht điu khin sinh trng thc vt sau:

-
Auxin: kích thích q trình tng trng ca t bào, kích thích
s hình thành mơ so và r bt đnh. Các loi thng dùng là
IAA(axit indolaxetic), NAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit
indol butyric), 2,4
DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lng
dùng nh 10
-5
-10
-7
mol/l.
-
Xytokinin: kích thích s phân chia t bào và to chi bt đnh.

Các loi thng dùng là Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin),
Zeatin, TDZ(Thidiazuron) vi hàm lng 10
-5
-10
-7
mol/l.
Ngi ta s dng phi hp auxin và cytokinin vi t l và hàm lng
phù hp đ đt mc đích mong mun. Quy lut tng đi: t l auxin
trên xytokinin ln thì các mu cy to r bt đnh, t l trung bình thì
mu cy to mơ so, còn t l thp thì to chi.
Ngồi ra hp cht Gibberillin có vai trò quan trng trong sinh lý ng
ngh ca ht, chi, phát trin ca hoa, tng tng chiu dài thc vt,
s dng nhiu trong ni cy mơ phân sinh; các hp cht c ch sinh
trng: axit absisic (ABA), CCC… s dng trong bo qun ngun
gen invitro.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

8
5. õy l thnh phn thng dựng nhng khụng bt buc trong mụi
trng nuụi cy. Bao gm nc da, dch nghin mt s rau, c, qu:
khoai tõy, chui, tỏo, c rt dch chit nm men, hp cht cazein,
pepton gia tng cỏc cht dinh dng, cỏc cht cú hot tớnh iu
khin sinh trng v s phỏt trin ca mu cy.

6.
Cht lm ụng cng mụi trng: L giỏ th cho mu cy. Thng
dựng nht l Agar agar. õy l polysaccarit ca to bin, ho tan vi
nc khi nhit ln hn 80

0
C thỡ dng lng cũn khi nhit
nh hn 40
0
C li dng rn(gel). Agar cú kh nng ngm nc cao,
ch cn 6-12 g cú th lm ụng c 1l nc v khi trng thỏi rn thỡ
t bo v mụ thc vt vn d dng hp thu c cỏc cht dinh dng
t mụi trng.


III. Nguyờn tc, k thut chung trong nuụi cy mụ t bo:

Ngy nay, hu ht cỏc nh nghiờn cu khoa hc u thng nht rng thnh
cụng ca nuụi cy mụ t bo ch t c khi nú tri qua 5 bc sau:

Bc 0: Bc chun b
Chn lc cõy m t tiờu chun sau:
- Cõy m cú c im di truyn, c im nụng, sinh hc quý ta cn.
- Cú kh nng sinh trng v phỏt trin tt.
- Sch bnh, c bit l sch virus.
- Nu trong t nhiờn khụng cú nhng cõy t tiờu chun trờn, phi trng cỏc
cõy m trong iu kin cỏch ly vi ngun bnh hoc ti u v iu kin
chm súc, dinh dng, bo v thc vt cú cõy m t tiờu chun.

Bc 1: Nuụi cy khi ng

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

9

Mc đích ca giai đon này là tái sinh mu ni cy. Mu ni cy thng
s dng trong phòng thí nghim là chi đnh, chi nách ca cây m. Ngồi ra,
tu thuc tng đi tng ni cy ngi ta còn có th s dng các mu ni cy
nh mu lá, đài hoa, cánh hoa, mu r, phơi non.
Cn xác đnh ch đ kh trùng cho mu cy trc khi tin hành đ đm bo mu
sch vi sinh vt nhng t l sng cao. Hin nay s dng ch yu là phng pháp
sát trùng b mt bng cht hố hc, thng là HgCl
2
0,1% sát trùng trong 5-10
phút. ít ph bin hn là các dung dch hypoclorit nh NaOCl, Ca(OCl)
2
5%
trong 20-30 phút. Ngồi ra còn dùng H
2
O
2
15%,dung dch Brom 5-10% nhng
hiu qu khơng cao.
Sau khi kh trùng mu cy, ta tin hành đa mu cy vào mơi trng thích hp
đ mu cy to thành chi mm hoc phơi vơ tính. Vic la chn mơi trng
thích hp là rt khó khn, cn phi đc bit chú ý đn t l, hàm lng các cht
điu khin sinh trng trong mơi trng đ làm cho mu cy phát sinh đc
hình thái.

Bc 2: Nhân nhanh mu
Tồn b q trình ni cy mơ t bào xét cho cùng ch nhm mc đích
chính là to ra h s nhân chi cao nht. Chính vì vy giai đon này đc coi là
giai đon đánh giá tính u vit hay khơng u vit ca phng pháp ni cy mơ
t bào.
 giai đon này, mơi trng dinh dng nhân to đ ni cy thng đc

đa thêm vào cht điu khin sinh trng, các cht b sung khác nh nc da,
nc chit nâm men, dch thu phân casein kt hp vi các yu t nhit đ, ánh
sáng nhm đt đc h s nhân chi cao nht mà vn đm bo sc sng, bn
cht di truyn, có th to thành cây hồn chnh, đt tiêu chun cây ging  giai
đon sau . Tuy nhiên, tu tng đi tng ni cy, ngi ta có th đt đc h
s nhân cao bng vic kích thích s hình thành các cm chi hay kích thích s
phát trin ca các chi nách hoc thơng qua vic to cây t phơi vơ tính.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

10


Bc 3: To cây hồn chnh
Khi đt đc mt kích thc nht đnh, các chi đc chuyn t mơi
trng trong bc 2 vào mơi trng to r. Thng sau 2-3 tun, t nhng chi
riêng l này s xut hin r.  giai đon này, ngi ta b sung vào mơi trng
các auxin vì auxin là nhóm hormon thc vt quan trng có chc nng to r ph
t mơ ni cy. Tuy nhiên,  mt s lồi nh chui hoc cây ngái s hình thành
r tt hn c đt đc trong mơi trng khơng có cht điu hồ sinh trng.

Bc 4: Thích ng cây in vitro trong điu kin t nhiên
Giai đon đa cây hồn chnh t ng nghim ra đt là bc cui cùng ca
quy trình ni cy mơ t bào.
Cây ly ra ng nghim phi đc ra sch agar bám trên b mt r đ tránh s
xâm nhp ca cơn trùng và nm mc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy
trình này s thành cơng hn nu trc khi đa cây con ra đt ta m cây trên cát
có đ m 90% t 10 đn 15 ngày. Trong nhng khong thi gian này, r mi
đcc sinh ra và bt đu hình thành lá mi. Sau đó chuyn cây ra đt vi ch đ

chm sóc bình thng.
Tuy nhiên vn còn mt s các vn đ tn ti trong vic ni cy mơ t
bào.ó là:
- S bt đnh di truyn
+ Khi s dng k thut ni cy mơ đ nhân ging vơ tính, có xy
ra hin tng bin d soma: s sai khác v hình thái, đc đim sinh
lí, sinh hố, di truyn ca nhng cây tái sinh nhn đc  ngay giai
đon invitro hoc giai đon exvitro.
+ Khc phc: Chn mu cy là mơ non ít chun hố đ d điu
khin và phát trin hình thái, gim lng cht điu khin sinh
trng s dng, t đó gim đc nh hng ca chúng. ng thi,

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

11

phi hn ch s ln cy chuyn khi nhõn nhanh (5-6 ln), gim
s tớch lu, gia tng nh hng ca cỏc chỏt iu khin sinh trng.
- S nhim mu cy
+ Cú mt s vi sinh vt cú kh nng xõm nhp v tn ti rt sõu
trong h thng mụ dn ca thc vt. Khi t bo thc vt bt u
phỏt trin, phõn chia, chỳng lm nhim mu vo mụi trng sau 2-3
tun nuụi cy.
+ Khc phc: Chn v nuụi trng cõy m ỳng tiờu chun, nu cõy
m b bnh cú th dựng khỏng sinh kh trựng mu
- S tit c t t mu cy
+ Sau 1-2 ngy a vo mụi trng, mu cy tit ra nhng cht
mu en, nõu lm hng mụi trng, cht mu. Cỏc cht ú cú th l
tanin, polyphenol b oxy hoỏ.

+ Khc phc: Chn mu non gim hm lng tanin, polyphenol ;
gõy vt thng c gii ti thiu nht; x lý mu cy bng cỏch
ngõm trong dung dch axit hu c cú tớnh kh mnh: axit ascorbic,
axit xitric; b sung vo mụi trng than hot tớnh hp ph cỏc
cht núi trờn.
- Hin tng thu tinh hoỏ mu cy
+ Khi nuụi cy trong mụi trng lng v bỡnh nuụi b hn ch v
kh nng trao i khớ thỡ t bo v mụ thc vt b mng nc, tr
nờn trong sut, cú hỡnh dng khụng bỡnh thng
+ Khc phc: B sung vo mụi trng cht gõy ỏp sut cao, cht c
ch tng hp etilen, tng cng chiu sỏng v gim nhit
phũng nuụi .

IV. ng dng ca nuụi cy mụ t bo trong cụng tỏc ging cõy trng:


THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

12

Ni cy mơ, t bào thc vt có th phc v rt nhiu lnh vc khác nhau.
Trong cơng tác ging cây trng, ni cy in vitro đc ng dng đ:
- Làm phong phú vt liu di truyn cho cơng tác chn ging.
- Duy trì, bo qun, nhân nhanh các ging và cá th có ý ngha khoa hc, có
giá tr kinh t cao.
- Làm sch virus, phc tráng ging b thối hố vì bnh.
Trong s đó, ng dng đ nhân nhanh ging vơ tính cây trng bng
phng pháp ni cy in vitro đc quan tâm hn c. Ngi ta c tính có
khong 300 loi cây có th đc nhân ging bng phng pháp này. Li ích ca

nó là  ch: có th to ra mt qun th cây con vi s lng ln mà vn gi
ngun đc tính cây m, đó cng là nhng cây ging kho mnh, sch virus,
sinh trng tt và cho nng sut cao; có th phc tráng mt qun th thc vt có
nguy c dit vong; có th trao đi quc t ngun gen và lu gi, b qun dng
cây in vitro. Chính nh k thut ni cy mơ t bào, ngi ta có th to ra đc
h s nhân ging cao, sm phát huy đc hiu qu kinh t, khơng tn din tích
cho nhân ging, d chm sóc và d dàng khc phc đc nhng điu kin bt li.
Phng pháp này t ra đc bit hiu qu vi nhng loi cây khó nhân ging
bng con đng hu tính, các ging q him có s lng ging ban đu hn
ch mà li cn nhân nhanh.
 Vit Nam, t nm 1975, nhiu phòng ni cy mơ trong c nc đã đc
thành lp và cho đn nay đã thu đc mt s kt qu đáng k. Ti vin Sinh vt-
Trung tâm Khoa hc và Cơng ngh Quc gia đã hồn thin quy trình nhân ging
in vitro mt s ging cây trng có kh nng chng chu nh lúa, thuc lá, khoai
lang, da si Ti trng i hc Nơng nghip I Hà Ni đã hồn thin quy
trình nhân ging khoai tây cht lng cao, bc đu đi vào sn xut.Ti các tnh
phía Nam đã xây dng đc ngân hàng cà phê vi 10 dòng khác nhau, hồn
thin quy trình nhân ging cây cao su . Ngồi ra, các phòng thí nghim ni cy
mơ t bào trong c nc đã nghiên cu thành cơng nhiu quy trình nhân ging
cây hoa, cây n qu, cây rng, cây q him có giá tr cao.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

13

Tóm li, ni cy mơ t bào thc vt hin nay đc đa vào trong các
chng trình chn ging và nhân ging hin đi, nó góp phn tích cc vào lý
lun sinh hc cây trng, vào thc tin nơng nghip, m ra mt hng đi mi cho
nghiên cu di truyn hc, hố sinh, sinh lý thc vt , đc bit nó đem li nhng

ng dng to ln trong cơng tác lai to và nhân nhanh ging cây trng.


V.Kt qu và tho lun
Thc hin ni cy mơ đi vi loi mu là cây hoa cúc ly t vn ca
vin Di truyn nơng nghip.
- Mu cây đc ct b lá và ct thành nhng đon dài 5-7 cm.
- Ra mu bng nc ra bát lỗng sau đó ra li bng nc sch 3 ln.
- Ra mu bng cn 70 đ trong 1 phút đ sát trùng s b sau ra li bng
nc sch 3 ln.
- Kh trùng mu bng hydroperoxide trrong 10-15 phút sau đó tráng sch bng
nc ct.
- Ct cành thành tng đon ngn, mi đon có ít nht mt mt ng.
- Cy mu vào mơi trng ni cy có nng đ aucin-cytokinin thích hp, sau
3 tun các mt ng s phát trin thành chi.
- Thng sau q trình này câty đc ni cy bng phng pháp ct lát mng
đ có đc h s nhân nhanh ln.
-Sau khi đã có đc chi tin hành x lý ra r bàng cách ct chi cy vào mơi
trng thích hp,sau khong 2 tun s có r.
- Khi cây đã có r có th tin hành vic thích nghi cây vi điu kin sng t
nhiên trong vn m :có gi th thng là đt trn tru hun có b sung các
ngun cht dinh owng trong điu kin chiu sáng 50%.
- Mt thi gian sau,nu t l cây sng đt hn 85% có th đem cây con trng
trong điu kin bình thng.


THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

14

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN
KILOBOOKS.COM

15

Phn ii: chn oỏn bnh

I.Khỏi nim
1.Tỡnh hỡnh bnh hi trờn ging cõy trng thc vt Vit Nam.
m bo an ninh lng thc ng thi phỏt trin nhanh nn kinh t,
trong nhng nm gn õy Vit Nam ó nhp nhiu ging cõy trng v hoa cõy
cnh t nhiu quc gia trờn th gii. iu ny luụn kốm theo cỏc nguy c xõn
nhp ca vi sinh vt gõy hi, c bit l cỏc bnh hi thc vt thuc din KDTV
Vit Nam.
Trờn th gii cng nh Vit Nam, bnh hai thc vt gõy nờn nhng thit
hi vụ cựng to ln v chỳng ang lm nh hng ỏng k n cht lng sn
phm cng nh nng sut cõy trng. c bit l bnh hi do virus gõy ra: Virus
PVY l virus gõy bnh thi c khoai tõy, lm gim nng sut c ti 80%, nú
cng gõy thit hi ỏng k trờn cõy c chua, t, thuc lỏ. Khi thuc lỏ b nhim
virus ny thỡ nng sut gim ti 30%. Trong lnh vc hoa cõy cnh cũn trm
trng hn. Vic ỏp dng nhng thnh tu khoa hc k thut ca CNSH, c bit
l sinh hc phõn t v Min dch liờn kt gn enzim vo sn xut l rt cn thit
nhm tng nng sut cõy trng, chn oỏn nhanh v chớnh xỏc tỏc nhõn hi cõy
trng, ỏp ng c ũi hi cp bỏch ca KDTV.
Mt s tỏc nhõn gõy bnh thng thy trờn c chua, khoai tõy, thuc lỏ.
Virus khm da chut Cucumber Mosaic Viruses (CMV)

Loi virus ny gõy ra cỏc loi khm v bin dng lỏ khỏc nhau, in hỡnh
nht l dng bin dng hỡnh kim, gõy nờn nhng thit hi nghiờm trng
trong sn xut c chua v thuc lỏ. Virus ny c lan truyn qua Aphis
gossyphii. Nú thuc nhúm Cucumovirus cú cu trỳc ARN mch n. Xut
hin dch bnh khụng cú quy lut bỏo trc.
Virus khm thuc lỏ - Tobacco Mosaic Viruses (TMV)
Loi virus ny gõy ra cỏc loi khm v phng lỏ khỏc nhau, in hỡnh nht
l dng khm san hụ gõy nờn nhng thit hi nghờim trng trong sn xut

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

16

cà chua, gây nh hng đn cht lng thuc lá. Virus này đc lan truyn
bng con đng c hc, đng thi đi vi cà chua virus này còn lan truyn
qua ht. Nó thuc nhóm Tobamovirus có cu trúc ARN mch đn.
Virus Y khoai tây – Potato Y Viruses (PVY).
Loi virus này gây ra các loi khm và các dng hoi t  tht và gân lá
khác nhau, gây nên nhng thit hi nghiêm trng trong sn xut cà chua và
thuc lá. Vect ca virus này là các loi mui khác nhau. Nó thuc nhóm
polyvirus có cu trúc ARN mch đn.

2.S lan truyn virus trong t nhiên

Virus thc vt không th t lây nhim vào các mô, t bào ca vt ch mà
chúng ch thâm nhp vào khi các t bào hoc các mô ca vt ch b tn thng.
Trong t nhiên quá trình này đc thc hin thông qua các vi sinh vt khác,
nhng sinh vt mang virus t cây này truyn cho cây khác gi là vect truyn
bnh. Ngày nay nhng phng thc truyn bnh ca virus đã đc xác đnh,

bao gm nhng phng thc sau:
2.1 Lây lan c hc
Các virus thc vt truyn t cây bnh sang cây kho nu nng đ virus
trong cây bnh và đ bn vng ca virus là cao nh các bnh khm thuc
lá, khm cà chua, khm da chut… chúng có th truyn trc tip t cây
này sang cây khác khi lá chm vào nhau, hoc gián tip qua môi trng đt,
nc, qun áo ngi lao đng, chân tay… Nhân ging vô tính cng là
phng thc là cho virus xâm nhp vào các vt ch thông qua các dng c
chit, ct, ghép…
2.2 Lan truyn qua cht dinh dng
Virus có kh nng lây nhim vào tt c các b phn ca cây nh lá, thân, r,
c mm… Nhng cây mi phát trin t vt nhim virus đu duy trì cho

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN
KILOBOOKS.COM

17

virus sng t mựa ny sang mựa khỏc l ngun lan truyn bnh virus ra
nhiu vựng trờn th gii.
2.3 Lan truyn qua ht.
Trc õy ngi ta cho rng bnh virus khụng lõy lan qua ht, n nm
1910 ó phỏt hin virus khm c chua, 1919 virus khm u v ngy nay ó
cú nhng bng chng v s lõy lan ca bnh virus thụng qua ht.

2.4 Lan truyn nh cỏc vect truyn bnh
Cỏc vect truyn bnh cú th l cụng trựng, rp, bột, nm ngi ta chia
cụn trựng truyn bnh thnh 4 nhúm:
- Cụn trựng sau khi mang virus ly t cõy lõy bnh ch cú kh nng truyn
bnh sau ú 1-2h, lõu hn na thỡ virus khụng cũn kh nng lõy nhim,

c gi l tn ti khụng vnh vin (Non persistent).
- Cụn trựng sau vi gi mang virus t cõy bnh mi cú kh nng truyn
bnh sang cõy khỏc. Kh nng ny ch tn ti trong vi ngy liờn tc,
trng hp ny gi l bỏn vnh vin (semi-persistent).
- Cụn trựng ch cn 15 phỳt lõy nhim virus t cõy bnh nhng ch cú th
truyn bnh sau ú vi gi v truyn bnh liờn tc trong mt vi tun, gi l
truyn bnh vnh vin tun hon (persistent circulative).
- Cụn trựng sau 15 phỳt lõy virus cú th truyn bnh liờn tc sut c chu
k sng v c th h sau ú vn cũn nguyờn kh nng truyn bnh, gi l
truyn bnh vnh vin lan truyn (persistent psopagative).
3. K thut min dch liờn kt enzym
( ELISA enzym linked immuno _sorbent assay)
Phng phỏp th min dch da trờn phn ng gia mt khỏng nguyờn v
mt khỏng th l nhng protein cú trng lng phõn t ln thu c do to
min dch mỏu núng ca ng vt cú vỳ ( chut, th, nga, dờ ) bng nhng
phõn t gõy min dch ( protein, polysaccharides, ARN 2 mch b xung
, ).Trong trng hp ny khỏng th c gi l khỏng th a dũng

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

18

(polyclonaux) vì chúng đc to ra t các dng hot hố ca mt qun th d
cht ca nhng t bào limpho B trong máu đng vt. Chúng là mt hn hp ca
các kháng th khác nhau phn ng vi nhiu đim cui ca kháng ngun hoc
nhng đnh ca phân t gây min dch. Phn ng kháng th – kháng ngun là
mt cơng c rt hiu nghim đ chun đốn bnh virut, vi khun, nm,
mycoplasma, tuyn trùng và các véc t truyn bnh. Hin nay k thut ELISA
còn giúp chúng ta xác đnh đc hàm lng thuc tr sâu (pesticide) tn d

trong đt. Các phân t đánh du cng là mt phc hp kháng th –kháng
ngun đã đc s dng t lâu đ chun đốn bnh cho phép nhn thy kt qu
bng mt thng. Hin nay vic s dng các phân t phóng x đ đánh du đã
b hn ch .Bên cnh đó, ngi ta thng dùng enzym (Alkaline phosphatasa),
peroxidaza, cht floresence và Avidin –Biotin đ tng đ nhy ca phép chun
đốn ta cng có th s dng các cht hunh quang, phosphattase alkaline
Phng pháp min dch liên kt enzym đc nhiu tác gi hồn thin vào
nm 1971 (Avrameanvà Cs; Van Weemen và Cs; Engvall và Cs ). Nhóm cui
cùng đã s dng thut ng ELISA (Enzym linked immuno –sorbent assay) ln
đu tiên vào nm 1971 đ áp dng vào phng pháp đnh lng mt vài kháng
th đc hiu. ây là phng pháp đc phát trin bi rt nhiu tác gi và là mt
phng pháp nhanh nhy trong chun đốn và đnh lng mt s kháng ngun,
kháng th. Nó đã đc Voller và đng nghip ng dng trong chun đốn bnh
virut thc vt nm 1976. Clack và Adams  Anh là hai trong nhng ngi đu
tiên dùng phng pháp này đ chun đốn 2 bnh virut là AWM ( Arabis
Mosaic Virus) và PPV ( Plum PoxVirut). Phng pháp này rt nhy, cho phép
thm dò  mc nhim rt thp.  thc hin phng pháp ELISA, ta phi tinh
ch kháng th (IgG) và bit s dng kháng th đánh du. S đánh du kháng th
cho phép nhìn thy phn ng kháng ngun kháng th và tng thêm kh nng
thm dò ca nhng phn ng đc hiu. Phân t đánh du có th là enzym, cht
phóng x (S
35
hoc I
128
), kim loi (hoc cht keo ), hoc cht hunh quang. Phn
ng min dch din bin  pha rn. Virus đc gi li bng cách chn lc và c

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

19

đnh bng mt kháng th đc hiu hp th trên b mt vt cng ti các going ca
mt vi chun đ ( plaque de microtitration ) cu to bng polyvinyl hoc
polystyrene. Nhng phn ng khác nhau xy ra liên tip và nhng phân t t do
đc loi tr bng các ln ra. Phn ng ca virus cng tp trung và đc tng
cng bng mt pha đa thêm vào mt kháng th đc hiu có gn mt enzym
đánh du, có phn ng hồn tồn vi virus và đc tìm ra bng nhum màu
trong din bin gim dn ca enzym  cht nn thích hp. S thu phân din ra
qua mt phn ng màu quan sát đc bng mt hoc đo bng dng c quang
hc. Trong trng hp khơng có virus trong mu kim tra, enzym gn vi kháng
th khơng gi li đc gi li và s khơng có mu.
Phng pháp ELISA khơng nhng đáp ng đc nhng tiêu chí phc tp mà
còn d dàng t đng hố và d dàng tìm kim nhng cht phn ng trên th
trng .
'ng dng ca ELISA trong vic phòng chng và phát hin bnh:
- Nhn bit các tác nhân gây bnh ch yu, đa ra nhng d liu v bnh dch
hc, xác đnh đc mc đ nhim đ qun lý đánh giá các ging kháng
bnh…
- Thu đc các ngun liu thc vt sch bnh bng quy trình chn ging
sch bnh  nhng giai đon nhân ging khác nhau.
- Kim tra ngun liu thc vt nhp ni và ngn nga s xâm nhp ca các
bnh l vào lãnh th.
- Theo dõi thng xun các loi vi sinh vt, phát hin và dit tr  dch có
th là các kho cha các vt truyn bnh (cơn trùng, tuyn trùng, nm…)

II.Vt liu và nghiên cu
1.Vt liu nghiên cu.
1.1 Vt liu thc vt.
Các mu cà chua thu thp ti vn thí nghim ca vin di truyn nơng

nghip.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

20

1.2 Vt liu vi sinh
Loi bnh đc nghiên cu là : Potato virus Y, Tobaco etch virus.
1.3 Các dung dch đm dung trong DAS-ELISA.
- Dung dch Coating pH=9,6
NaCO
3
1,59g NaN
3
0,20g
NaHCO
3
2,93g Nc ct 2 ln 1000ml
- Dung dch PBS pH7,4
NaCl 8,00g KCl 0,20g
KH
2
PO
4
0,20g NaN
3
0,20g
Na
2

PO
4
42,9g Nc ct 2 ln 1000ml
- Dung dch PBS – T: PBS + 0,5ml Tween 20.
- Dung dch PBS – T – PVP
PBS – T + 2% PVP (polyvinyl pyrolidone)
- Dung dch hin màu (Substrate) pH9,8
Diethanolamine 97,00ml
NaN
3
0,20g
Nc ct 2 ln 900ml

2 Phng pháp nghiên cu

2.1 Phng pháp chun b mu.
- 0,5 gam mu đc ly  các v trí khác nhau (Virus đ chn đốn bnh ta ly
mu  lá, mt s mu ly  ngn ) và đc nghin trong dung dch chit.
- Mu đc nghin trong dung dch dch chit vi t l 1/10 (1mg/ 10ml dung
dch đm). Sau đó dch nghin đc lc qua bơng thu tinh đ gi li nhng
phn thc vt khơng b nghin nát đ thu đc mt dch đng nht. Dch này
đc pha lỗng vi các t l khác nhau đ:
o Xác đnh ngng gii hn ca phép th (Gii hn đ hồ lỗng kháng
ngun).

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

21

o Tìm ra nng đ hồ lỗng tt nht, nó có nng đ đ đ chn đốn
lng tác hân gây bnh và đơng thi phép th khơng b che khut bi
sc t dip lc ca cây. ( loi tr dip lc trong dch chit mu 
nng đ hồ lỗng thp ta tin hành ly tâm  7000 rpm trong 5 phút)

2.2 Phng pháp DAS-ELISA, các bc tin hành
*Ngun lý ca phng pháp DAS-ELISA
Dùng kháng th đa dòng bao ph b mt ging đ bt gi kháng ngun thích
hp
Cho kháng ngun vào
Kháng th gn enzyme đc s dng đ phát hin
Cui cùng là s nhân bit các mu bng phn ng tng tác vi cht hin màu.


THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

22

Hình 1. Ngun lý ca phng pháp ELISA “Sandwich kp kháng th 2 ln” –
Phng pháp trc tip.

Các bc tin hành
1. t kháng th đc hiu đã đc hồ lỗng trong dung dch đm coating
vào ging ca đa plaque (100l/ging).
Enzyme

Th฀ c฀ng
h฀p
฀
฀
t kháng th
฀


฀฀c hi฀u
Kháng th

฀

Kháng
B
฀

m
฀
t
฀
฀
t kháng ngun

฀
฀
t kháng th
฀

có g
฀
n
ENZYME g฀i là th฀ c฀ng
h฀p (conjugate)
Kh
áng th
฀

Bi
฀
u hi

฀
n c
฀
a ph
฀
n
฀ng
Ch
฀
t n
฀
n cho
ph฀n ฀ng
nhu฀m màu

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

23

o  trong 2h  37
0
C
o Ra đa plaque 3 ln bng dung dch PBS – T.
2. Cho dch cây nghiên cu đã đc hồ lỗng trong dung dch đm PNS –
T + PVP vào ging ca đa plaque (100l/ging).
o   37
0
C trong 2h hoc 1 đêm  4
0

C.
o Ra đa plaque 3 ln bng dung dch PBS – T.
3. t kháng th gn enzyme Phosphataza kim đã đc hồ lỗng trong
dung dch đm PBS – T + PVP vào ging ca đa plaque (100l/ging).
o   37
0
C trong 2h hoc 1 đêm  4
0
C.
o Ra đa plaque 3 ln bng dung dch PBS – T.
4. Cht nn ca enzyme là para Nitro Phenyl Phosphat (pNPP) pha vào dung
dch đm hin màu substrate nng đ 2mg/ml sau đó cho vào ging ca
đa plaque (100l/ging).
o   37
0
C trong 30 phút đn 2h. Khi mun dng phn ng thì dùng
50l dung dch NaOH 3M đ dng phn ng.
5. c kt qu bng máy so màu quang hc  bc sóng 405nm. Ch s
quang hc D.O th hin kt qu ca phn ng O.D ln gp 2 ln O.D đi
chng sch bnh là cây đã b nhim virus (Theo Sanofi-Pasteur).

Iii: Kt qu và tho lun
S đ b trí thí nghim:
Mu đi chng đi vi 10 ging đu tiên là TEV: kim tra mu cà chua.
Mu đi chng đi vi 10 ging tip theo là TSV: kim tra mu cà chua.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

24



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B TP 1 4 7 10 - 3 6 9
C TP 1 4 7 10 - 3 6 9
D + 2 5 8 TP 1 4 7 10
E + 2 5 8 TP 1 4 7 10
F - 3 6 9 + 2 5 8
G - 3 6 9 + 2 5 8
H

Bng tng hp kt qu đo O.D
Tên virus

Mu
TEV
(Tobacco Etch Virus)
TSV
(Tobacco Spot Virus)
1 1.6985 0.3165
2 1.6440 0.330
3 1.583 0.294
4 1.925 0.3075
5 2.548 0.3035
6 1.1665 0.3005
7 1.378 0.325
8 1.817 0.268
9 * 0.2815
10 1.870 0.440
TP 1.4205 0.206
P * 0.3385
N 1.945 0.318

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN
KILOBOOKS.COM

25

T bng kt qa núi trờn ta thy:
Vi bnh do virus TEV gõy ra trờn cõy c chua, mi mu phõn tớch cho

kt qu gn tng t nh mu i chng sch, thm chớ cú mu cũn cho
kt qu nh hn, iờự ny cho phộp ta kt lun mu c chua em phõn tớch
hon ton khụng b nhim TEV.
Vi bnh do virus TSV gõy ra, hu ht cỏc mu phõn tớch u cho kt qu O.D
nh hn mu i chng sch, ch cú mu s 2 l cho kt qu ln hn nhng li
ch ln hn cú 1.037 ln. Mu s 10 cú ch s O.D ln hn c ch s mu i
chng dng. Nh vy kt qu mu phõn tớch cho ta thy cõy ờm phõn tớch
bc u nhim virus TSV.
Cỏc yu t nh hng n kt qu ca DAS-ELISA:
1. nh hng ca nhit bo qun:
- Mu sau khi tỏch chit c chia ra bo qun cỏc nhit khỏc nhau 20, -4,
-20 v -84
0
C cho nhng giỏ tr OD khỏc nhau rừ rt. T s liu thu c cho
thy -84
0
C cho giỏ tr cao nht.
2. nh hng ca thi gian bo qun mu ti kt qu thớ nghim:
- Mu tin hnh thớ nghim ngay sau khi c tỏch chit cho kt qu chớnh xỏc
nht. Ngha l nờu skhụng bt buc phi bo qun mu trong -84
0
C cho kt qu
chớnh xỏc v nhy nht. Nu s dng mu qua bo qun kt qu s cho nhy
kộm hn v ch nờn dựng mt ln khụng nờn lp li.
3. nh hng ca thi gian bo qun a ti kt qu thớ nghim sau khi cho
khỏng th hỳt bỏm b mt cỏc ging:
- Khi so sỏnh giỏ tr OD i vi i chng bnh v i chng sch ca thớ
nghim ti cỏc thi im sau khi cho khỏng th hỳt bỏm b mt ging cho thy
thi gian bo qun a khỏc nhau khụng nh hng ti giỏ tr OD.
4. nh hng ca bt khớ khi cho dung dch cht hin mu vo trong mi ging

trc khi c kt qu:
Giỏ tr OD thay i rt ln trong cựng mt mu khi cú bt khớ v khụng cú bt
khớ trong cỏc ging, thm chớ trong mt s trng hp i chng sch bnh cho

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN