Nghiên cứu họ gene mã hóa protein vận chuyển sucrose ở loài đậu gà (cicer arietinum) trong quá trình tiến hóa

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
--------*****-------

CHU THỊ BÍCH THỦY

NGHIÊN CỨU HỌ GENE MÃ HÓA PROTEIN VẬN
CHUYỂN SUCROSE Ở LOÀI ĐẬU GÀ (CICER
ARIETINUM) TRONG QUÁ TRÌNH TIẾN HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học

HÀ NỘI, 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
--------*****-------

CHU THỊ BÍCH THỦY

NGHIÊN CỨU HỌ GENE MÃ HÓA PROTEIN VẬN
CHUYỂN SUCROSE Ở LOÀI ĐẬU GÀ (CICER
ARIETINUM) TRONG QUÁ TRÌNH TIẾN HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học
Ngƣời hƣớng dẫn:
TS. CHU ĐỨC HÀ
ThS. PHẠM THỊ PHƢƠNG THU

HÀ NỘI, 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện cùng với sự
hƣớng dẫn của TS. Chu Đức Hà - phòng Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông
nghiệp. Các số liệu kết quả trong khóa luận văn là trung thực.
Tôi cam đoan rằng các thông tin, số liệu, hình ảnh trích dẫn của luận văn
đƣợc chỉ dẫn nguồn gốc và nghiên cứu đầy đủ.
Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2019

Sinh viên

Chu Thị Bích Thủy


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới TS. Chu Đức Hà - Phòng Sinh
học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình hƣớng dẫn, dặn dò chỉ bảo
và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá học tập, thực hiện và
hoàn thành khóa luận này.
Xin gửi lời cảm ơn tới anh chị các cán bộ phòng Sinh học phân tử - Viện
Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận tại đây.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Phạm Thị Phƣơng Thu - Khoa Sinh Kỹ thuật Nông nghiệp trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ và
tạo điều kiện cho tôi đƣợc tham gia vào nghiêm cứu khoa học này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động
viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện khóa
luận.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2019

Sinh viên

Chu Thị Bích Thủy


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3. 1: Kết quả mức độ tƣơng đồng của 6 cặp gene lặp của C.arietinum .... 17
Bảng 3. 2: Kết quả phân t ch đặc đi m tiến h a của họ gene SWEET ở
C.arietinum .......................................................................................................... 23


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Thuật ngữ Tiếng Anh

Thuật ngữ Tiếng Việt

DNA

Deoxyribonucleic acid

Acid đêoxyribônucleic

k-mer

Các chuỗi con c độ dài k
-

từ một lần đọc thông qua
trình tự DNA

NST
MEGA
mya
SWEET
PCR

-

Nhiễm sắc th

Molecular Evolutionary Genetics

Phân tích di truyền tiến hóa

Analysis

phân tử

millions years ago

Triệu năm về trƣớc

Sugars will eventually be exported
transporter
Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi polymerase
kỹ thuật phòng thí nghiệm

qRT-PCR

-

đ khuếch đại các phân tử
DNA

SSR

Simple Sequence Repeats

Chuỗi lặp lại đơn giản

TCN

-

Trƣớc công nguyên

TM

Transmembrane domain

Trình tự xuyên màng


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1:Cây đậu gà ........................................................................................ 5
Hình 1. 2: Đặc đi m hình thái của cây đậu gà ................................................. 6
Hình 1. 3: Các loại hạt của cây đậu gà .............................................................. 7
Hình 2. 1: Phƣơng ph p dự đo n hiện tƣợng lặp gen ..................................... 11
Hình 2. 2: Cổng thông tin Phytozome ............................................................. 12
Hình 2. 3: Thanh công cụ ClustalX 2.1........................................................... 13
Hình 2. 4: Giao diện BioEdit........................................................................... 13
Hình 2. 5: Thanh công cụ sequence identily matrix ....................................... 14
Hình 3. 1: Sự iện lặp gene của họ gene mã h a họ gene SWEET ở đậu gà . 20
Hình 3. 2: Căn trình tự tƣơng đồng của họ protein SWEET ở đậu gà ............ 25
Hình 3. 3: Phân t ch trình tự motif đặc trƣng của họ SWEET ở đậu gà ......... 27


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ..................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2
5.Ý nghĩa hoa học và ý nghĩa thực tiễn........................................................... 2
5.1.Ý nghĩa khoa học ......................................................................................... 2
5.2.Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ....... 4
1.1.Tổng quan về họ gene SWEET ................................................................... 4

1.2. Vài nét về cây đậu gà (Cicer arietinum) .................................................... 5
1.2.1. Vai trò của đâu gà .................................................................................. 8
1.2.2. Đặc điểm di truyền của cây đậu gà......................................................... 9
Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
2.1. Dữ liệu nghiên cứu ................................................................................... 10
2.2. Thời gian và địa đi m nghiên cứu............................................................ 10
2.3.Nội dung của nghiên cứu .......................................................................... 10
2.4. Phƣơng ph p nghiên cứu.......................................................................... 10
2. .1. h

ng pháp ự đoán hi n t

ng ặp g n ........................................... 10

2.4.2. Phƣơng ph p x c định trị số thay thế đồng nghĩa, tr i nghĩa và thời
đi m lặp gen .................................................................................................... 14
2.4.3. Phƣơng ph p phân t ch v ng bảo thủ .................................................... 15
Chƣơng 3: K T QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 16
3.1. Kết quả x c định sự iện lặp gene ở họ gene SWEET ở đậu gà. ............ 16
3.2. Kết quả x c định vai tr chọn lọc tự nhiên đến cơ chế nhân rộng của họ
gene mã h a protein vận chuy n sucrose ở đậu gà ......................................... 21
3.3. Kết quả phân t ch v ng bảo thủ của protein SWEET ở đậu gà ............... 24
K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ......................................................................... 29


1. Kết luận ....................................................................................................... 29
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 31
PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Môi trƣờng sống có nhiều biến đổi vì vậy việc thích nghi của sinh vật nói
chung và thực vật n i riêng ngày càng c ý nghĩa. Với điều kiện khắc nghiệt
môi trƣờng, việc thực vật thích nghi với môi trƣờng sống là điều hết sức quan
trọng đ thực vật có th tồn tại đƣợc. Những điều kiện khắc nghiệt này có th
làm biến đổi về mặt sinh lí ảnh hƣởng đến hình thái, chất lƣợng của thực vật
(Darwin et al., 1859)[11]. Vì vậy, chúng ta cần phải có những biện pháp nhằm
nâng cao khả năng chống lại c c điều kiện khắc nghiệt của môi trƣờng.
Sucrose đƣơc định nghĩa là một phân tử chứa năng lƣợng đƣợc tổng hợp
bởi các sinh vật quang hợp oxy. Ở trong thực vật, sau hi sucrose đƣợc tổng
hợp nó sẽ đƣợc vận chuy n tới nơi sử dụng hoặc lƣu trữ sucrose còn là chất
chuy n hóa và phân tử tín hiệu nó có ảnh hƣởng tới sự tăng trƣởng, phát tri n
và sinh lý của thực vật. Sucrose có vai trò nổi bật nhất là phân tử vận chuy n
đƣờng (Molinier et al., 2006) [22]. Ngoài ra, sucrose còn đƣợc coi là một phân
tử tín hiệu đ ki m soát ki u hình của c c đột biến (Wind et al., 2010) [28]. Sở
hữu những chức năng quan trọng nhƣ vậy, không ít nhà khoa học nghiên cứu
đ tìm ra loại protein vận chuy n sucrose vào một số cây trồng (Alisdair et al.,
2011)

[3]

. Trong số đ , Chen và cộng sự cũng đã công bố họ protein vận

chuy n đƣờng đơn sucrose là SWEET (surgar will eventually be exported
transporters) vào năm 2010. SWEET là protein vận chuy n sucrose qua màng
tế bào tập hợp trong tế bào nhu mô phloem. SWEET chức năng tải sucrose ra
khỏi lá và có th bị tấn công bởi các vi khuẩn gây bệnh đ có th thu đƣợc
đƣờng cho sự sinh trƣởng của chúng (Baker et al., 2012) [5].

SWEET đã đƣợc phân tích trên một số đối tƣợng cây trồng quan trọng
nhƣ cây đậu nành (Glycine max) (Patil et al., 2015) [24], gạo (Oryza sativa)
(Aoki et al., 2003) [4], lúa miến (Sorghum bicolor) (Mizuno et al., 2016) [21],
1


sắn (Manihot esculenta) (Ha et al., 2018)[8]. Tuy nhiên, chƣa c nghiên cứu
nào đầy đủ về họ protein SWEET trên cây đậu gà (Cicer arietinum) và nó
đƣợc nhân rộng nhƣ thế nào trong tiến hóa? Trong số gene đ , gene nào đ ng
vai trò quan trọng trong việc tham gia vào qu trình đ p ứng với các yếu tố
bất lợi từ ngoại cảnh của cây đậu gà? Từ đ , chúng tôi đã chọn đề tài:
“Nghiên cứu họ gene mã hóa protein vận chuyển sucrose ở loài đậu gà
(Cicer arietinum) trong quá trình tiến hóa”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Kết quả của nghiên cứu này sẽ cung cấp dữ liệu quan trọng đ phân tích
cơ chế nhân rộng họ SWEET ở cây đậu gà (Cicer arietinum) nói riêng và thực
vật nói chung trong tiến hóa.
3. Nội dung nghiên cứu
- Dự đo n hiện tƣợng gene lặp ở họ gene SWEET ở đậu gà.
- Phân tích vai trò của đột biến và áp lực của chọn lọc tự nhiên đến
gene lặp.
- Phân tích sự kiện lặp gene.
- Phân tích cấu trúc vùng bảo thủ, MEME.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: họ gene mã hóa protein vận chuy n sucrose ở
cây đậu gà (Cicer arietinum)
- Phạm vi nghiên cứu: Phòng Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp.
5.Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1.Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu nhằm cung cấp những hi u biết

cơ bản về cơ chế tiến hóa của họ protein SWEET ở đậu gà cũng nhƣ trên thực
vật. Các kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi tạo tiền đề cho các nghiên
cứu tiếp theo trong vấn đề này.
2


5.2.Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu này cho phép chúng tôi cung cấp đƣợc những gene có vai trò
quan nhằm mục đ ch phục vụ cho công tác chọn tạo giống đậu gà có khả năng
chống chịu với c c điều kiện bất lợi.

3


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.Tổng quan về họ gene SWEET
Quang hợp đƣợc định nghĩa là quá trình tạo ra các chất hữu cơ của thực
vật và đặc biệt là tạo ra đƣờng, một sản phẩm có nhiệm vụ cung cấp năng
lƣợng cho tế bào hoạt động. Sucrose là một phân tử chứa năng lƣợng đƣợc
tổng hợp bởi các sinh vật quang hợp oxi. Ở trong thực vật, sau khi sucrose
đƣợc tổng hợp nó sẽ đƣợc vận chuy n tới nơi sử dụng hoặc lƣu trữ sucrose
còn là chất chuy n hóa và phân tử tín hiệu nó có ảnh hƣởng tới sự tăng
trƣởng, phát tri n và sinh lý của thực vật. Sucrose có là phân tử vận chuy n
đƣờng (Molinier et al., 2006)[22]. SWEET (surgar will eventually be exported
transporters) là một nhóm thuộc protein vận chuy n có vai trò vận chuy n
đƣờng, dự trữ nhựa nguyên trong mô libe, tƣơng t c giữa cây chủ và mầm
bệnh. Nhờ biến cảm quang học của sucrose, Baker x c định đƣợc SWEET hỗ
trợ chuy n động của sucrose qua màng tế bào tập hợp trong tế bào nhu mô
phloem và là chìa khóa cho sự vận chuy n sucrose ra khỏi lá (Baker et al.,

2012)[5] .
Với một số chức năng quan trọng, SWEET này đã thu hút đƣợc rất nhiều
sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Ví dụ nhƣ: nghiên cứu Patil
năm 2015 đã khám phá khía cạnh tiến hóa của họ gene SWEET trong các loài
thực vật đa dạng bao gồm tảo đơn nguyên thủy với các hạt kín với sự nhấn
mạnh chính về đậu tƣơng (Glycine max). C c t nh năng tiến hóa cho thấy sự
mở rộng và nhân đôi của họ gene SWEET trong cây trồng trên đất liền. Với
các công cụ BLAST và sắp xếp chuỗi và x c định 52 gene SWEET đã đƣợc
ánh xạ tới 15 nhiễm sắc th trong hệ gene đậu tƣơng nhƣ c c sự kiện trùng lặp
song song. Các gene SWEET đậu nành (GmSWEET) cho thấy một loạt các
cấu trúc bi u hiện trong c c mô h c nhau và c c giai đoạn phát tri n. Phân
4


tích dữ liệu và lƣợc tả bi u hiện bằng cách sử dụng PCR định lƣợng thời gian
thực (qRT-PCR) cho thấy phần lớn các gene GmSWEET đƣợc giới hạn trong
phát tri n mô phân sinh. Ở trên cây đậu gà, các họ gene mã hóa protein trao
đổi cation (Cation exchangers, CAX) đã đƣợc Cao Phi Bằng nghiên cứu và
công bố vào năm 2017 (Cao Phi Bằng et al., 2017)[2]. Tuy nhiên chƣa c
nghiên cứu nào về họ gene mã hóa protein vận chuy n sucrose trên cây đậu
gà.
1.2. Vài nét về cây đậu gà (Cicer arietinum)
Đậu gà (Cicer arietinum) thuộc chi Cicer, phân họ Đậu Faboideae, họ Đậu
Fabaceae. Đậu gà có th đƣợc bắt nguồn từ khu vực Đông Nam của Thổ Nhĩ
Kỳ nơi tiếp giáp với Syria ngày nay, loại cây này đƣợc trồng từ rất lâu đời,
chúng xuất hiện c ch đây t nhất 7500 năm TCN (Redden et al., 2007)[26].

Hình 1. 1: Cây đậu gà (Nguồn: Tài liệu Wikipedia)
Chiều cao trung bình của đậu gà khoảng 20 cm đến 100 cm, là loại cây
trồng hằng năm và chỉ phát tri n trong một vụ mùa. Cây mọc thẳng, có cuống

5


đơn giản hoặc phân nhánh. Rễ mang nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm
(trong đ chứa các chủng Rhizobium). Lá chia thành 5 - 5 cặp lá chét. Lá chét
dài tới 16 mm và rộng 14 mm c rìa răng và những sợi lông yếu, xòe, tuyến.
C c quy ƣớc hình tam giác (phần phụ giống nhƣ l ) đƣợc sinh ra ở gốc lá.
Hoa đậu thƣờng dài tới 12 mm, hoa đơn, có màu trắng hoặc màu hoa cà đến
cánh hoa tím. Quả nhỏ, phồng và tròn, dài tới 3 cm và rộng 1,5 cm, có lông
tuyến. Hạt hình cầu thô, có bề mặt nhẵn hoặc nh m, đƣờng kính lên tới 14
mm. Một hoặc hai hạt mỗi quả (Rachwa et al., 2013) [25].

Hình 1. 2: Đặc đi m hình thái của cây đậu gà (Nguồn: Tài liệu Wikipedia)
A: Cây đậu gà; B: Quả; C: Lá đậu gà; D: Hạt đậu gà; E: Hoa đậu gà
Đậu gà gồm hai loại desi và abuli. Đậu gà có túi chứa khí thổi xung quanh
hạt. Thông thƣờng, mỗi quả chứa từ hai đến ba hạt. Chiều dài mỗi hạt khoảng
17-30 mm. Đối với desi, hoa thƣờng có nhiều màu sắc khác nhau từ màu
hồng đến màu đỏ, màu xanh vân đến màu tím. Các hạt desi có bề mặt nhăn
6


nheo và có tính chất lao. Hạt giống có màu khác nhau từ màu em đến da
cam, xanh l cây đậm, màu nâu, màu đen, chủ yếu đƣợc trồng ở Châu Á và
Châu Phi. Đối với abuli, hoa thông thƣờng có màu kem và màu trắng. Hạt
giống có màu trắng, còn các màu hồng, màu đỏ, màu đen xảy ra với tần số
thấp (Rachwa et al., 2013)[25]. Lá hoa có tờ rời vì vỏ quả c xu hƣớng lớn.
kabuli chủ yếu đƣợc trồng ở Bắc Phi, Bắc Mỹ, Tây Á và Châu Âu (Jukanti et
al., 2012)[16].

Hình 1. 3: Các loại hạt của cây đậu gà

A: Kabuli; B:Desi

7


1.2.1. Vai trò của đâu gà
Đậu gà là một loại cây họ đậu phổ thứ hai sau đậu nành. Giống đậu này có
hàm lƣợng dinh dƣỡng cao có lợi cho sức khỏe (Rachwa et al., 2013)[25]. Đậu
gà là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dƣỡng, đã từ rất lâu, chúng đƣợc sử
dụng đ làm thức ăn cung cấp cho con ngƣời. Đậu gà là một nguồn cung cấp
năng lƣợng, chất khoáng, vitamin, chất xơ, protein có lợi cho sức khỏe.
Hạt đậu xanh là một nguồn protein tuyệt vời và chứa nhiều loại axit amin.
Chúng có nhiều chất xơ, t chất béo và chứa phốt pho, canxi và sắt. Hạt chƣa
trƣởng thành đƣợc tiêu thụ tƣơi, luộc hoặc rang và muối nhƣ đồ ăn nhẹ. Hạt
đậu xanh đ ng hộp rất phổ biến ở Hoa Kỳ và Châu Âu. Ở ti u lục địa Ấn Độ,
hầu hết đậu xanh đƣợc chế biến thành bột mì đ làm bánh. Hạt đậu gà nảy
mầm đƣợc ăn nhƣ một loại rau hoặc thêm vào món salad. Hạt đậu gà đƣợc
nghiền đ làm bột, đƣợc sử dụng đ nấu súp và bánh mì. Hạt đậu gà đƣợc
chuẩn bị với hạt tiêu, muối và chanh và phục vụ nhƣ một m n ăn phụ
(Rachwa et al., 2013)[25].
Cây đậu gà đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc ở nhiều nƣớc đang ph t tri n.
Vỏ hạt và thân và l tƣơi hoặc hô đƣợc sử dụng làm thức ăn dự trữ, nhƣng
chúng có chứa lƣợng axit oxalic đ ng

và không tốt nhƣ thức ăn thô xanh.

Hạt giống đôi hi đƣợc xay cho thức ăn gia súc (Milán et al., 2007).
Đậu gà đ ng vai tr quan trọng trong việc duy trì sự phì nhiêu tƣơi tốt cho
đất, điều này có ý nghĩa đặc biệt ở những nơi đất khô cằn bằng cách cố định
nito trong khí quy n. Việc cố định nito đƣợc thực hiện bằng cách cộng sinh

với nito địa hình. Trên rễ của cây đậu gà chứa các nốt sần, nốt sần này chứa
các chủng vi khuẩn Rhizobium, mối quan hệ giữa chủng vi khuẩn này với rễ
cây đ ng vai tr quan trọng trong sự cung cấp nito cho cây.

8


1.2.2. Đặc điểm di truyền của cây đậu gà
Đậu gà có bộ nhiễm sắc th 2n=16. Chúng có khả năng tự thụ phấn. Dựa
theo số liệu thống kê k - mer bộ gene của đậu gà c

ch thƣớc khoảng 730,09

Mb với khoảng 28269 gen, trong đ , c 73,8% bộ gene đƣợc nằm trong
khung protein và 36,3% bộ gene không nằm trong khung protein. Protein là
một thành phần dinh dƣỡng quan trọng của đậu gà, hàm lƣợng protein trong
hạt desi chiếm 16,7% - 30,6% và trong kabuli chiếm 12,6% - 29%, thƣờng
cao gấp 2 - 3 lần hạt ngũ cốc (Rachwa et al., 2013)[25]. Bộ gene của đậu gà
chứa 81845 chuỗi lặp lại đơn giản (SSR) trong đ c chứa 48289 chuỗi lặp lại
đơn giản phù hợp với thiết kế mồi PCR đƣợc sử dụng làm dấu hiệu di truyền
(Rachwa et al., 2013)[25].

9


Chƣơng 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Dữ liệu nghiên cứu
Genome và proteome của đậu gà “CDC Frontier” đƣợc khai thác trên
Phytozome () (Goodstein et al., 2012).

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2017 - 4/2019
Địa đi m nghiên cứu:
Phòng Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp.
Tổ di truyền học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.3.Nội dung của nghiên cứu
Dự đo n hiện tƣợng gene lặp ở họ gene SWEET ở đậu gà
Phân tích vai trò của đột biến và áp lực của chọn lọc tự nhiên đến gene lặp.
Phân tích sự kiện lặp gene.
Phân tích cấu trúc vùng bảo thủ, MEME.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2. .1. hư ng ph p dự đo n hi n tượng ặp gene

10


Hình 2. 1: Phƣơng ph p dự đo n hiện tƣợng lặp gene

11


- Bƣớc 1: Khai thác trình tự nucleotide của 21 gene CaSWEET từ nghiên cứu
trƣớc đây trên cổng thông tin Phytozome (Goodstein et al., 2012).

Hình 2. 2: Cổng thông tin Phytozome
- Bƣớc 2: Căn trình tự tƣơng đồng trình tự nucleotide của 21 gene CaSWEET
bằng công cụ ClusTalX 2.1 (Larkin et al., 2007; Thompson et al., 1997).

12

Hình 2. 3: Thanh công cụ ClustalX 2.1
- Bƣớc 3: Truy xuất kết quả căn trình tự thành định dạng .fasta.
- Bƣớc 4: Tiến hành phân tích kết quả căn trình tự trên giao diện
BioEdit (Hall, 1999).

Hình 2. 4: Giao diện BioEdit

13


- Bƣớc 5: X c định mức độ tƣơng đồng ở cấp độ nucleotide
(sequenceidentily matrix) trên công cụ BioEdit (Hall., 1999).

Hình 2. 5: Thanh công cụ sequence identily matrix
- Bƣớc 6: Truy xuất kết quả đ nh gi mức độ tƣơng đồng thành định
dạng .txt.
- Bƣớc 7: Tiến hành ki m tra kết quả đ nh gi trên công cụ Microsoft
Excel.
- Bƣớc 8: Tìm kiếm cặp gene lặp với mức độ tƣơng đồng > 70%.
2.4.2. Phƣơng pháp ác định trị số thay thế đ ng nghĩa, trái nghĩa và
thời điểm l p gen
Trị số thay thế đồng nghĩa Ks (synonymous substitutions per synonymous
site) và trị số thay thế tr i nghĩa Ka (nonsynonymous substitutions per
synonymous site) đƣợc x c đinh bằng c ch phân t ch trình tự nucleotide của 2
gene lặp trên phần mềm DNAsp.
Phƣơng ph p x c định thời đi m lặp gene: Thời đi m xảy ra hiện tƣợng
gene lặp trong qu trình tiến h a đƣợc x c định tƣơng đối theo công thức: T =
14

Ks/2λ (Malviya et al., 2016). Trong đ , T là thời đi m ph t sinh hiện tƣợng
lặp gene đơn vị mya (million years ago) ; λ là t lệ xuất hiện Ks (Galtier et al.,
1996).
2.4.3. Phƣơng pháp phân t ch v ng ảo thủ
Vùng bảo thủ đƣợc c c định bằng c ch căn trình tự tƣơng đồng trên
MEGA. Thông số đƣợc cài đặt nhƣ sau, hình phạt hoảng trống đầu tiên (Gap
open penalty) là 10, hình phạt hoảng trống ph a sau (Gap extension penalty)
là 0,2.

15


Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả ác định sự kiện l p gene ở họ gene SWEET ở đậu gà.
Hiện tƣợng lặp gene (gene duplication) đƣợc giả thuyết là cơ chế ch nh
đ nhân rộng c c họ đa gene (multigene family) ở thực vật (Panchy et al.,
2016)[23]. Hiện tƣợng này đƣợc giải thích là do những alen tƣơng đồng trao
đổi bất thƣờng tao nên cặp gene lặp ở khoảng cách gần nhau và sự lặp của c c
v ng nhiễm sắc th lớn (Clark et al., 2018)[10].
Đ x c định đƣợc sự kiện lặp gene, trình tự nucleotide của 21 CaSWEET
đƣợc khai thác từ nghiên cứu trƣớc. Sau đ , c c trình tự nucleotide đƣợc đƣa
vào căn t nh tự bằng công cụ ClustalX 2.1 (Larkin et al., 2007; Thompson et
al., 2002). Kết quả đạt đƣợc định dạng (.fasta) đƣợc sử dụng đ căn trình tự
tƣơng đồng bằng công cụ BioEdit (Hall.,1999). Ở nghiên cứu này, hai (hoặc
nhiều gene) đƣợc gọi là cặp gene lặp khi chúng có trình tự nucleotide tƣơng
đồng lớn hơn 70%, tƣơng tự nhƣ ghi nhận gần đây (Chu et al., 2018)[9]. Kết
quả cho thấy, trên trình tự nucleotide của 21 CaSWEET thì có 6 cặp gene lặp
tƣơng đồng đƣợc xác định với mức độ tƣơng đồng ở cấp độ nucleotit lớn hơn

70 %. Kết quả đƣợc th hiện ở bảng 3.1.

16