Tìm hiểu vai trò của họ gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose liên quan đến tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi loài đậu gà (cicer arietinum)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.51 MB, 56 trang )
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
KHOA SINH - KTNN
======
NGUYỄN HÀ MY
NGUYỄN HÀ MY
TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦ
HỌ GENE M
H
“TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦ HỌ GENE M
HÓA PROTEIN VẬN CHUYỂN ĐƢỜNG
LIÊN QU N ĐẾN TÍNH CHỐNG CHỊU
SUCROSE LIÊN QU N ĐẾN TÍNH CHỐNG
ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH BẤT LỢI
CHỊU ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH BẤT LỢI
LOÀI ĐẬU GÀ (CICER ARIETINUM)
LOÀI ĐẬU GÀ (CICER ARIETINUM)”
PROTEIN VẬN CHUYỂN ĐƢỜNG SUCROSE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học
Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học
Hà Nội - 2019
HÀ NỘI - 2019
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
KHOA
SINH - KTNN
======
NGUYỄN HÀ MY
NGUYỄN HÀ MY
TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦ
HỌ GENE M
H
“TÌM HIỂU
TRÒ CỦ
HỌ SUCROSE
GENE M
PROTEIN
VẬNVAI
CHUYỂN
ĐƢỜNG
HÓA PROTEIN VẬN CHUYỂN ĐƢỜNG
LIÊN QU N ĐẾN TÍNH CHỐNG CHỊU
SUCROSE LIÊN QU N ĐẾN TÍNH CHỐNG
ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH BẤT LỢI
CHỊU ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH BẤT LỢI
LOÀI ĐẬU GÀ (CICER ARIETINUM)
LOÀI ĐẬU GÀ (CICER ARIETINUM)”
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học
Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
Ngƣời hƣớng dẫn:
TS. Chu Đức Hà
ThS.
Phƣơng Thu
TS.
ChuPhạm
Đức Hà
ThS. Phạm Phƣơng Thu
Hà Nội - 2019
HÀ NỘI - 2019
LỜI C M ĐO N
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong đề tài “Tìm
hiểu vai trò của họ gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose liên quan đến
tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi loài đậu gà (Cicer arietinum)”. Mọi kết
quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Hà My
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em xin bày tỏ sự biết n vô c ng s u
sắc tới thầy TS. Chu Đức Hà - Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông
Nghiệp và cô ThS. Phạm Phư ng Thu - Bộ môn Sinh học phân tử - Khoa sinh - Kỹ
thuật nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 về những hướng dẫn tận
tình chu đ o ên cạnh những kiến thức xã hội
ch kh c.
Bên cạnh đ em c ng xin ch n thành c m n sự giúp đỡ quý báu, nhiệt tình
của tập thể cán bộ thuộc bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp là
n i em đã tiến hành kh a luận tốt nghiệp của mình.
Cuối c ng em xin c m n sự giúp đỡ của c c thầy cô trong Bộ môn Sinh
học phân tử, Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2.
Hà Nội, ngày...tháng...năm...
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Hà My
D NH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Thuật ngữ Tiếng Anh
Thuật ngữ Tiếng Việt
ABA
Abscisic acid
Axit abxixic
ANF
Anti-nutritional factor
Yếu tố kh ng dinh dưỡng
ASWF
Available soil water fraction
Phần nước có sẵn trong đất
ER
Early reproductive stage
Giai đoạn sinh sản sớm
GEO
Gene Expression Omnibus
Omnibus biểu hiện gen
GRAVY
Grand average of hydropathicity
Độ ưa nước
II
Instability index
Chỉ số bất n định
kDa
Kilodalton
-
L
Length
K ch thước
LIS
Legume information system
Hệ thống thông tin họ Đậu
LR
Late reproductive stage
Giai đoạn sinh sản muộn
Mb
Megabyte
-
mW
Molecular weight
Trọng lượng phân tử
NJ
Neighbor-Joining
-
NST
-
Nhiễm sắc thể
pI
Isoelectric point
Điểm đẳng điện
RNA
Ribonucleic acid
Axit ribonucleic
STT
-
Số thứ tự
SUC
Sugar carrier
Chất mang đường
SUT
Sugar transporter
Chất vận chuyển đường
SWEET
Sugars will eventually be exported
Chất vận chuyển đường sau
transporter
cùng
TAG
Triacylglycerol
Triaxyglyxerol
TCN
-
Trước công nguyên
TF
Transcription factor
Yếu tố phiên mã
TM
Transmembrane domain
Trình tự xuyên màng
WGS
Whole genome shotgun
Kỹ thuật x c định trình tự
toàn hệ gen
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài .................................................................................................1
2. Mục đ ch nghiên cứu ...........................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. C chế đ p ứng môi trường ở c y tr ng ...........................................................3
1.2. T ng quan về họ protein vận chuyển đường sucrose SWEET ở thực vật ........4
1.2.1. Cấu trúc và vai trò của protein vận chuyển đường sucrose SWEET ở thực
vật .........................................................................................................................4
1.2.2. Tình hình nghiên cứu protein vận chuyển đường sucrose SWEET ở thực
vật .........................................................................................................................5
1.3. T ng quan về c y đậu gà ..................................................................................6
1.3.1. Ngu n gốc và phân loại của c y đậu gà .....................................................6
1.3.2. Đặc điểm của c y đậu gà ............................................................................7
1.3.2.1. Đặc điểm hình thái của c y đậu gà ..........................................................7
1.3.2.2. Đặc điểm di truyền của c y đậu gà .........................................................8
1.3.3. Vai trò của c y đậu gà ................................................................................9
1.3.3.1. Vai trò của c y đậu gà làm thực phẩm ....................................................9
1.3.3.2. Vai trò của cây đậu gà trong chăn nuôi .................................................10
1.3.3.3. Vai trò của c y đậu gà trong cải tạo đất ................................................11
1.3.3.4. Vai trò của c y đậu gà trong sản xuất nhiên liệu ..................................11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........13
2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................13
2.2. Phạm vị nghiên cứu địa điểm và thời gian ....................................................14
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................14
2.2.2. Thời gian nghiên cứu................................................................................14
2.3. Phư ng ph p nghiên cứu ................................................................................14
2.3.1. Phư ng ph p ph n t ch đặc t nh protein SWEET trên c y đậu gà ...........14
2.3.2. Phư ng ph p x y dựng c y ph n loại họ protein SWEET ở đậu gà ........15
2.3.3. Phư ng ph p x c định mức độ iểu hiện của c c gene mã h a SWEET ở
đậu gà..................................................................................................................17
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................20
3.1. Kết quả ph n t ch đặc tính protein SWEET ở đậu gà .....................................20
3.2. Kết quả x y dựng c y ph n loại họ protein SWEET ở đậu gà .......................28
3.3. Kết quả x c định mức độ iểu hiện của c c gene mã h a SWEET ở đậu gà .30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................37
1. Kết luận ..............................................................................................................37
2. Đề nghị ...............................................................................................................37
DANH MỤC C NG TR NH Đ C NG Ố LIÊN QU N ĐẾN LUẬN V N ....38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................39
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Họ SWEET của một số loài ........................................................................5
Bảng 1.2. Đặc tính lý hóa của dầu hạt desi ...............................................................11
Bảng 2.1. Thông tin chú giải về họ SWEET ở đậu gà ..............................................13
Bảng 2.2. Những tham số để căn trình tự tư ng đ ng
ng MEGA ........................16
Bảng 2.3. Những ph n t ch ưu tiên ...........................................................................17
Bảng 3.1. K ch thước và trọng lượng protein SWEET ở đậu gà ..............................21
Bảng 3.2. Điểm đẳng điện và vị tr cư trú dưới tế ào được dự đo n của protein
SWEET ở đậu gà .......................................................................................................24
Bảng 3.3. Chỉ số bất n định của họ protein SWEET ở đậu gà ................................26
Bảng 3.3. Độ ưa nước của họ protein SWEET ở đậu gà ..........................................27
Bảng 3.4. Mức độ đ p ứng của c c gene CaSWEET ở rễ đậu gà trong điều kiện xử
l hạn và mặn ............................................................................................................34
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Đặc điểm hình th i loài đậu gà....................................................................7
Hình 1.2. Genome của đậu gà .....................................................................................9
Hình 2.1. C sở dữ liệu Expasy - Protparam ............................................................15
Hình 2.2. C sở dữ liệu TargetP ...............................................................................15
Hình 2.3. C sở dữ liệu MEGA ................................................................................16
Hình 2.4. C sở dữ liệu LIS ......................................................................................18
Hình 2.5. C sở dữ liệu GEO ....................................................................................19
Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại protein SWEET ở đậu gà .................................28
Hình 3.2. Biểu hiện các gene CaSWEET trong ba mẫu mô của c y đậu gà trong điều
kiện thường................................................................................................................30
Hình 3.3. Mức độ iểu hiện của họ gene mã h a CaSWEET ở 8 mô hoa trong điều
kiện thường................................................................................................................32
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hiện tượng biến đ i khí hậu và thời tiết cực đoan đã và đang t c động rất lớn
đến sản xuất nông nghiệp. Những yếu tố bất lợi phi sinh học của môi trường như
hạn hán, mặn, nhiệt độ đã ảnh hưởng tới qu trình sinh trưởng và phát triển của thực
vật. Thực vật đ p ứng các bất lợi môi trường nhờ một loạt gene thuộc hai nhóm là
protein chức năng và protein điều hòa.
Trong nh m protein chức năng họ protein vận chuyển đường sucrose là
SWEET sugars will eventually e exported transporters) được iết đến với rất
nhiều vai tr quan trọng liên quan đến trao đ i chất và đ p ứng ất lợi trong tế ào.
Loại protein này có chức năng vận chuyển uniporter sucrose qua màng tế bào tập
hợp trong tế bào nhu mô phloem và có thể bị tấn công bởi các vi khuẩn gây bệnh để
có thể thu được đường cho sự sinh trưởng của chúng. Qu trình này giúp cho
sucrose được vận chuyển từ c quan t ng hợp l ) đến c c vị tr cần thiết trong c y
phục vụ qu trình sinh t ng hợp và trao đ i chất. Vì vậy nghiên cứu về họ protein
SWEET luôn thu hút được sự quan t m của c c nhà khoa học.
Đậu gà (Cicer arietinum L.) là cây họ Đậu (Fabaceae) phát triển hàng năm
được tr ng ph biến ở nhiều n i. Đậu gà là một loại thực phẩm tư ng đối rẻ và giàu
dinh dưỡng (protein, vitamin, khoáng chất và chất x ) c lợi cho sức khỏe. Bên
cạnh đ vỏ hạt, thân và lá của đậu gà c n thường được dùng làm nguyên liệu cho
thức ăn gia súc. C ng như những cây họ Đậu kh c đậu gà có khả năng cải tạo đất
vì vậy luôn được khuyến kh ch tr ng lu n canh với c c c y tr ng ch nh nh m tăng
năng suất nông sản c ng như trả lại độ phì nhiêu cho đất. T m lại C. arietinum n i
riêng và c y họ Đậu n i chung là một trong những đối tượng thu hút được rất nhiều
sự quan t m trên thế giới và trong nước.
Trên đậu gà người ta đã iết đến các họ gene g m CaNAC, CaTCP và
CaNF-Y thuộc nh m protein điều hòa. Sự biểu hiện của những gene thuộc ba họ
gene này là khác nhau trong các mô khác nhau. Ba họ gene này đều được phát hiện
là chứa những gene đ p ứng với hạn h n theo con đường phụ thuộc hoặc không phụ
thuộc
scisic acid). Tuy nhiên chưa c nghiên cứu nào về nh m gene vận
chuyển sucrose liên quan đến tính chống chịu ở c y đậu gà.
Một c u hỏi được đặt ra là liệu r ng c c protein vận chuyển đường sucrose
SWEET c đ ng vai tr trong đ p ứng với điều kiện ngoại cảnh ở c y đậu gà hay
1
không Để giải quyết vấn đề này đề tài “Tìm hiểu vai trò của họ gene mã hóa
protein vận chuyển đường sucrose liên quan đến tính chống chịu điều kiện ngoại
cảnh bất lợi loài đậu gà (Cicer arietinum)” đã được thực hiện.
2. Mục đích nghiên cứu
Sử dụng phư ng ph p tin sinh học, nh m tìm hiểu về cấu trúc của họ protein
SWEET trên c y đậu gà. Đ ng thời nghiên cứu vai trò của họ gene SWEET đối với
tính chống chịu của đậu gà trước điều kiện bất lợi. Từ đ đưa ra c sở cho phát
triển nghiên cứu giống cây tr ng chống chịu điều kiện bất lợi.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích c c đặc t nh l h a học của protein SWEET trên cây đậu gà.
- Xây dựng c y ph n loại của họ protein SWEET ở đậu gà.
- X c định mức độ iểu hiện của c c gene mã h a SWEET ở c c ộ phận của
c y đậu gà trong một số điều kiện.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học của đề tài nh m cung cấp những hiểu iết c
ản về đặc
tính và chức năng của họ protein SWEET ở đậu gà. Bên cạnh đ c n cung cấp
những dữ liệu về sự biểu hiện của các gene CaSWEET trong điều kiện thường và
bất lợi. Từ đ c những hiểu biết rõ h n về c y đậu gà, đặc biệt có cái nhìn t ng
qu t h n về tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh ất lợi của thực vật.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nh m cung cấp các thành viên họ gene
CaSWEET đ p ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Từ đ c thể mở ra hướng
nghiên cứu ứng dụng nh m phục vụ công t c chọn tạo giống nh m n ng cao t nh
chống chịu.
2
CHƢƠNG 1. TỔNG QU N TÀI LIỆU
1.1. Cơ chế đ p ứng môi trƣờng ở c
tr ng
Sự sinh trưởng và phát triển của thực vật chịu ảnh hưởng lớn từ các bất lợi
liên quan đến độ ẩm, n ng độ muối và nhiệt độ của môi trường [47-tr.44]. Theo
Agarwal (2010) năng suất tiềm năng của cây tr ng có thể bị giảm tới 70% trong vụ
mùa khi chịu t c động từ các bất lợi môi trường [6-tr.39]. Tuy nhiên, thực vật có thể
đ p ứng và thích nghi với những bất lợi đ
ng một loạt những thay đ i về mặt
sinh lý, sinh hóa. Một số yếu tố phiên mã (Transcription factor - TF) quy định biểu
hiện của một số gene liên quan tới bất lợi môi trường đã được phát hiện. Ví dụ như
sản phẩm của một số gene đ p ứng hạn ở mức phiên mã được cho r ng có khả năng
đ p ứng với bất lợi về hạn. Nhiều gene đ p ứng hạn c ng đ p ứng bất lợi về mặn và
nhiệt độ thấp, cho thấy sự t n tại của c chế đ p ứng bất lợi tư ng tự [48-tr.44].
Thực vật đ p ứng các bất lợi của môi trường nhờ một loạt các gene có chức
năng kh c nhau [16-tr.40]. Sản phẩm của c c gene này được phân chia thành hai
nhóm. Nhóm một bao g m những protein chức năng như protein màng protein
LEA (Late embryogenesis abundant) [27-tr.41]. Nhóm này có thể hoạt động bảo vệ
thực vật một cách trực tiếp trong chống chịu các yếu tố bất lợi [48-tr.44]. Nhóm hai
là nhóm những protein điều h a như protein kinase TF. Nhóm protein này liên
quan đến điều chỉnh truyền tín hiệu và biểu hiện gene đ p ứng bất lợi [44-tr.43].
Chính hai nhóm protein này đã tham gia vào qu trình trả lời k ch th ch và k ch hoạt
biểu hiện ph ng thủ ở cây tr ng trong điều kiện bất lợi của ngoại cảnh. Phân tích
chức năng của c c gene đ p ứng bất lợi giúp chúng ta hiểu thêm về c chế phân tử
chống chịu và đáp ứng bất lợi của thực vật.
Nh m protein điều h a được khá nhiều nhà khoa học nghiên cứu trên c c đối
tượng thực vật. Một số gene thuộc nh m protein điều hòa liên quan tới đ p ứng bất
lợi đã được biết tới như NAC [28-tr.42], TCP [45-tr.43] hay NF-Y [15-tr.40]. Tư ng
tự, nhóm protein chức năng c ng được chú ý bởi nhiều thành viên có liên quan tới
đ p ứng bất lợi. Điển hình trong số đ là SUT - protein vận chuyển sucrose qua
màng đã được nghiên cứu trên nhiều loài thực vật khác nhau [31-tr.42]. Bên cạnh
đ một thành viên triển vọng mới thuộc nhóm protein chức năng dành được nhiều
sự quan tâm không kém là SWEET (sugars will eventually be exported transporter)
[8-tr.39]. Đ y là họ protein vận chuyển đường sucrose trong thực vật [14-tr.40]. Để
hiểu rõ h n về nh m protein vận chuyển này cấu trúc và vai tr của SWEET ở thực
vật được tìm hiểu rõ n t h n ở nội dung tiếp theo.
3
1.2. Tổng quan về họ protein vận chu ển đƣờng sucrose SWEET ở thực vật
1.2.1. Cấu trúc và vai trò của protein vận chu ển đƣờng sucrose SWEET ở thực
vật
Thực vật là sinh vật có khả năng quang hợp tạo ra các hợp chất hữu c với
đường là sản phẩm chủ yếu và có nhiệm vụ cung cấp năng lượng cho tế bào [4tr.39]. Trong đ sucrose là car ohydrate c ản cho phép vận chuyển đường dài,
được tải vào phloem từ tế bào ngu n và xuất vào n i chứa [4-tr.39]. Để làm được
điều này cần có loại protein có khả năng vận chuyển và đưa sucrose đi qua màng.
SUT (sugar transporter) hay SUC (sugar carrier) là protein vận chuyển cùng chiều
H+/sucrose sử dụng chuyển động proton trên màng plasma của yếu tố rây và tế bào
kèm để tải sucrose chống lại gradient n ng độ vào phloem [12, 13].
Bên cạnh đ
một họ protein vận chuyển đường mới được x c định là
SWEET [14-tr.40]. SWEET thuộc họ MtN3/saliva, chúng vận chuyển đường
monosaccharides hoặc disaccharides qua màng nội bào hoặc màng plasma, với
MtN3 được x c định là gene đ ng vai tr trong dinh dưỡng cộng sinh Rhizobium
gây nên sự phát triển nốt sần rễ Medicago truncatula [14-tr.40]. Các phân tử
SWEET nhỏ h n so với chất vận chuyển đường khác với 7 TM (Transmembrane
domain). Chen et al. 2010) đã mô tả cấu trúc của phân tử SWEET có dạng 3+1+3
[14-tr.40]. Mô hình đã chỉ ra r ng cấu trúc của SWEET là kết quả từ sự sao chép
của một polypeptit được hợp nhất bởi 3 xoắn xuyên màng thông qua một xoắn TM
trung tâm; N và C-terminal tư ng ứng n m ở ngoại bào và dịch ào tư ng [14tr.40].
SWEET là protein vận chuyển uniporter sucrose qua màng tế bào tập hợp
trong tế bào nhu mô phloem. Các protein này có chức năng tải sucrose ra khỏi lá và
có thể bị tấn công bởi các vi khuẩn gây bệnh để có thể thu được đường cho sự sinh
trưởng của chúng [8-tr.39]. Những vi khuẩn gây bệnh này tấn công trực tiếp vùng
promoter SWEET gây ra sự biểu hiện khác nhau của c c gene SWEET. Điều này
cho thấy chức năng vận chuyển đường của các SWEET là mục tiêu để các mầm
bệnh và vi khuẩn cộng sinh giành dinh dưỡng [14-tr.40]. Những phân tích về họ
SWEET hoàn chỉnh có thể giúp giải quyết một vài bí ẩn về sản xuất mật hoa, phát
triển hạt giống và phấn hoa. Điều này có thể giúp giải thích về chuyển hóa dinh
dưỡng từ thực vật trong t c động qua lại với vi sinh vật [14-tr.40].
4
1.2.2. Tình hình nghiên cứu protein vận chu ển đƣờng sucrose SWEET ở thực
vật
Họ protein SWEET có sự phân bố rộng trong sinh giới được x c định có ở
thực vật con người động vật nguyên sinh động vật đa ào vi khuẩn và vi khuẩn
c [8-tr.39]. Những nghiên cứu về họ protein SWEET ở thực vật đã được tiến hành
trên một số đối tượng như Arabidopsis thaliana [14-tr.40], lúa (Oryza sativa) [49tr.44] đậu tư ng (Glycine max) dưa chuột (Cucumis sativus), bông sợi (Gossypium
hirsutum). Cụ thể các nhà nghiên cứu đã x c định có 17 gene SWEET ở A. thaliana
[14-tr.40] và 21 OsSWEET ở lúa (O. sativa) [49-tr.49]. Năm 2015 trên đối tượng
đậu tư ng c c nhà khoa học đã x c định được 52 gene GmSWEET [41-tr.43]. Tiếp
đến, 68 BnSWEET đã được x c định ở cải dầu [31-tr.42]. Năm 2018, 28 thành viên
SWEET trên sắn (Manihot esculenta) c ng đã được x c định [1-tr.39]. Gần đ y
nhất, nghiên cứu của Chu Đức Hà và cs. 2019) đã x c định có 21 gene CaSWEET ở
đậu gà [2-tr.39].
Bảng 1.1. Họ SWEET của một số loài
STT
Tên khoa học
Tên loài
Số lƣợng SWEET
1
Arabidopsis thaliana
-
17
2
Oryza sativa
Lúa
21
3
Glycine max
Đậu tư ng
52
4
Manihot esculenta
Sắn
28
5
Brassica napus
Cải dầu
68
6
Cicer arietinum
Đậu gà
21
Thành viên đầu tiên của họ SWEET thực vật được x c định là gene
AtSWEET1 ở A. thaliana [14-tr.40]. Protein do gene này mã h a c liên quan đến
việc cung cấp chất dinh dưỡng cho thể giao tử hoặc tuyến mật hoa [14-tr.40]. Hai
thành viên khác là AtSWEET11 và AtSWEET12 hoạt động chiếm ưu thế ở màng
plasma đ ng vai tr như chất điều chỉnh dòng sucrose, glucose, fructose. Đ ng
thời, hai SWEET này còn liên quan đến đ p ứng bất lợi về lạnh và điều kiện thiếu
nước [14-tr.40]. Thêm vào đ AtSWEET15 được kỳ vọng có cảm ứng trong sự già
5
của lá và những bất lợi thẩm thấu (độ mặn cao, lạnh và hạn) theo con đường phụ
thuộc ABA [30-tr.42].
Ở lúa, OsSWEET1a/2a/3a/4/5/16 có biểu hiện cao ở hoa hoặc bông tại các
giai đoạn phát triển khác nhau. Theo một nghiên cứu đã chứng minh r ng đột biến
câm OsSWEET14 khiến c y sinh trưởng chậm, tạo ra hạt có k ch thước nhỏ [36tr.42]. Bên cạnh đ OsSWEET11 và OsSWEET14 bị các vi khuẩn gây bệnh tấn
công trực tiếp b ng cách tiết ra một loại protein đặc trưng liên kết với vùng
promoter SWEET và hoạt hóa gene SWEET [8-tr.39]. Do đ c thể thấy, khả năng
vận chuyển của SWEET là mục tiêu tấn công của các mầm bệnh và vi khuẩn cộng
sinh. Nhờ đ nghiên cứu về họ SWEET ở thực vật giúp nâng cao hiểu biết về sự
phát sinh mầm bệnh ở thực vật tìm hướng kháng bệnh thông qua dòng vận chuyển
của SWEET [41-tr.43].
Trên một đối tượng khác là cải dầu (Brassica napus), kết quả nghiên cứu cho
thấy, sự biểu hiện BnSWEET12 được cảm ứng tích cực bởi sự xử lí ABA, GA
(Gibberellin) và BR (Brassinosteroid) trong hạt [31-tr.42]. Bên cạnh đ , mức độ
biểu hiện của đa số gene SlSWEET ở cà chua (Solanum lycopersicum) được quan
s t để điều chỉnh một vài nếp trong đ p ứng với bất lợi mặn và nhiệt độ [21-tr.41].
Từ đ c thể thấy, các gene SWEET c liên quan đến đa dạng sinh lý, sinh hóa và
đ ng vai trò quan trọng trong chống chịu bất lợi phi sinh học.
1.3. Tổng quan về cây đậu gà
1.3.1. Ngu n gốc và ph n loại của cây đậu gà
Đậu gà (Cicer arietinum L.) thuộc chi Cicer, phân họ Đậu (Faboideae), họ Đậu
(Fabaceae). C. reticulatum Ladz được xem như t tiên hoang dại của đậu gà. Dựa
theo sự phân bố hiện nay của C. reticulatum đậu gà có thể đã được thuần hóa tại
Đông Nam natolia ph a Đông Nam Th Nhĩ Kì gần Syria ngày nay) khoảng 7500
TCN hoặc có thể sớm h n. Cuối thời kỳ đ đ mới đậu gà đã ph t triển rộng về
phía Tây tới Hy Lạp hiện nay. Trong thời kỳ đ đ ng đậu gà tiếp tục phát triển
rộng ở phía Tây Crete, phía trên Ai Cập ở phía Nam, hướng Đông qua Iraq ngày
nay đến tiểu lục địa Ấn Độ; sau đ lan ra Nam và T y Á vào thời kỳ đ sắt đ ng
thời có mặt lần đầu tại Ethiopia [43-tr.43].
6
1.3.2. Đặc điểm của cây đậu gà
1.3.2.1. Đặc điểm hình th i của cây đậu gà
Đậu gà là c y hàng năm ph t triển nhanh, phân nhánh, thân có lông, chiều cao
từ 20 đến 60 cm hoặc có thể lên tới 1 m. Rễ cái sâu, dài (2 m), nhiều rễ phụ (15 - 30
cm) có các nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm. Lá kép dài 5 cm với 10 - 20 lá chét
hình trứng hoặc elip m p l c răng cưa. Hoa đậu điển hình, màu trắng, h ng tía
hoặc xanh. Quả nhỏ hình thuôn ph ng, vỏ có lông, chứa 1 hoặc 2 hạt [50-tr.44].
Hình 1.1. Đặc điểm hình th i loài đậu gà [51-tr.44]
Đậu gà được chia làm hai nhóm chính là desi và kabuli. Loại desi có hạt nhỏ,
nhăn màu tối. Hạt kabuli c k ch thước lớn h n ề mặt hạt mịn, màu trắng hoặc be.
Trọng lượng hạt desi khoảng 0,1 - 0,3 g và kabuli là 0,2 - 0,6 g. Desi chiếm khoảng
80 - 85% t ng diện tích tr ng của cây đậu gà, chủ yếu được tr ng ở Châu Á và
7
Ch u Phi. Trong khi đ
ka uli được tr ng rộng rãi ở Tây Á, Bắc Phi, Bắc Mỹ và
Châu Âu [32-tr.42].
Giống đậu gà được quan tâm trong nghiên cứu này là 'CDC Frontier'. Đ y là
một giống ka uli Canada được phát hành lần đầu tiên năm 2003 và được phát triển
bởi Trung tâm phát triển cây tr ng Đại học Saskatchewan. CDC Frontier có kiểu lá
kép, hoa trắng, các lá mầm vàng và vỏ hạt màu sữa. Hạt giống c k ch thước trung
ình c y sinh trưởng trung bình và tiềm năng năng suất cao trong những v ng đất
n u và n u đen trên thảo nguyên Canada [17, 32].
1.3.2.2. Đặc điểm di tru ền của cây đậu gà
Đậu gà là c y lưỡng bội (2n = 16), tự thụ phấn. Năm 2013 nh m t c giả Ấn
Độ đã đưa ra ản phác họa trình tự gene của CDC Frontier b ng phư ng ph p WGS
(whole genome shotgun), b sung các ngu n gene có sẵn cho nghiên cứu cây họ
Đậu. Kết quả đã thu được 153,01 Gb dữ liệu trình tự, với k ch thước genome đậu gà
được ước lượng là 738,09 Mb (với h n 28 000 gene) dựa trên số liệu thống kê kmer [46-tr.43]. Có thể thấy r ng 73,8% của genome được chiếm trong các scaffold,
còn lại 36,3% (genome không lắp r p) được làm giàu cho các chuỗi lặp lại [46tr.43].
Khoảng một nửa 49 41%) genome đậu gà bao g m các yếu tố chuyển vị và
lặp lại chưa ph n loại, có thể so sánh với trình tự các cây họ đậu kh c như M.
truncatula (30,5%), đậu triều (Cajanus cajan 51 6%) và đậu tư ng 59%). C c
nhân tố chuyển vị ngược có trình tự lặp lại dài ở đầu tận cùng là lớp yếu tố vận
động d i dào nhất, và chiếm > 45% t ng số genome nhân [46-tr.43].
Parween et al. 2015) đã đưa ra báo cáo về genome của ICC 4958 (phiên bản
2.0), loại Desi được tạo ra b ng cách sử dụng dữ liệu trình tự b sung và một bản đ
di truyền cải tiến [40-tr.43]. Điều này dẫn đến sự gia tăng gấp 2,7 lần chiều dài của
các phân tử giả và giảm đ ng kể khoảng cách trình tự. Việc lắp r p genome ước tính
bao phủ h n 94% không gian gene và dự đo n sự có mặt của 30.257 gene mã hóa
protein bao g m 2230 và 133 gene mã h a tư ng ứng cho các TF tiềm năng và c c
gene đề kh ng tư ng đ ng [40-tr.43].
8
Hình 1.2. Genome của đậu gà [46-tr.43]
1.3.3. Vai trò của cây đậu gà
1.3.3.1. Vai trò của cây đậu gà làm thực phẩm
Đậu gà là một loại thực phẩm tư ng đối rẻ và giàu dinh dưỡng (protein,
vitamin, khoáng chất và chất x ) lợi cho sức khỏe [5-tr.39]. Ngu n carbohydrate và
protein trong đậu gà chiếm khoảng 80% t ng khối lượng hạt khô so với c c đậu hạt
kh c. Đậu gà chủ yếu được tiêu thụ dưới dạng thức ăn hạt hoặc dưới những hình
thức kh c nhau như ột được dùng làm bánh (Nam Á), chế biến cà ri hoặc d ng để
chế biến c c m n ăn nhẹ.
Hàm lượng tinh bột chiếm 41 - 50% t ng car ohydrate c trong đậu gà. Kabuli
chứa nhiều đường h a tan sucrose glucose và fructose) h n Desi. So với các loại
ng cốc, đậu gà có hàm lượng tinh bột thấp h n nhưng hàm lượng amylose cao h n
(30 - 40% so với 25% trong lúa mì) [11, 17].
Chất x trong đậu gà (10 - 20%) g m chất x h a tan và chất x không h a tan
giúp giảm cholesterol, n định đường trong máu, chống lại ung thư. Hàm lượng
9
chất
o trong 100 g đậu gà 6 04 g) cao h n so với c c đậu hạt kh c như đậu lăng
(1,06 g); cả với ng cốc như lúa mì 1 70 g) và lúa 1 64 g) [32-tr.42]. Thực phẩm
từ đậu gà cung cấp một lượng lớn protein (bột đậu gà: 24,4 - 25,4%; bột lúa mì: 9,3
- 14 3%) và năng lượng cho chế độ ăn kiêng. Ở c c nước Ch u Á c c đậu hạt
thường được sử dụng cùng với ng cốc để b sung đ p ứng nhu cầu amino acid
trong chế độ ăn h ng ngày. Hàm lượng amino acid thiết yếu (39,89 g/100 g protein)
và amino acid nội sinh (58,64 g/100 g protein) trong bột đậu gà cao h n so với bột
mì (32,20 g/100 g protein) [42-tr.43]. Người ta thấy r ng các protein phân lập từ bột
đậu gà có cấu trúc lỏng lẻo h n do đ c thể con người có thể tiếp thu chúng một
cách dễ dàng [32-tr.42].
Đậu gà không thể coi là một loại hạt dầu do hàm lượng dầu khá thấp (3,8 10%) so với đậu tư ng. Tuy nhiên, dầu đậu gà chứa các tocopherol, sterol và
tocotrienol có giá trị dược liệu và dinh dưỡng quan trọng. Hàm lượng α-tocopherol
trong 100 g đậu gà tư ng đối cao h n 8 2 mg) so với c c đậu hạt kh c như đậu lăng
(4,9 mg) hay đậu xanh (1 mg). Cùng với hàm lượng α-tocopherol, n ng độ của dtocopherol làm cho dầu đậu gà oxy hóa n định và góp phần tốt h n trong lưu trữ.
Các giá trị acid thấp h n được quan sát ở đậu gà khiến tinh chế dầu dễ h n. Gi trị
peroxide (3,97 - 6,37 mequiv/kg) n m trong giới hạn tối đa của khuyến cáo Codex
(10 mequiv/kg) cho dầu ăn được [32-tr.42].
Đậu gà c ng cung cấp vitamin và khoáng chất cần thiết. Hạt đậu gà thô (100 g)
cung cấp trung bình khoảng 5,0 mg Fe; 4,1 mg Zn; 138 mg Mg; 160 mg Ca [32tr.42]. Khi được sử dụng cùng thức ăn kh c đậu gà có thể b sung về nhu cầu
vitamin ở người. Đậu gà là ngu n acid folic và tocopherol (cả α và γ) tốt, với một số
vitamin tan trong nước như 2, B5, B6 ở mức tư ng tự hoặc cao h n trong c c loại
đậu hạt khác [32-tr.42].
1.3.3.2. Vai trò của cây đậu gà trong chăn nuôi
Vỏ hạt th n và l tư i hoặc khô) của đậu gà thường được dùng làm nguyên
liệu cho thức ăn gia súc. Tuy nhiên chúng lại có một lượng acid oxalic đ ng kể
không tốt đối với thức ăn gia súc. Đôi khi hạt được xay x t để làm thức ăn cho động
vật. Hoạt động của yếu tố kh ng dinh dưỡng trong đậu gà đối với động vật nhai lại
ít gặp vấn đề h n nhờ lên men ở dạ cỏ. Đậu gà thô c hàm lượng chất ức chế trypsin
và chymotrypsin thấp h n đậu Hà Lan đậu thông thường và đậu tư ng. Điều này
dẫn đến các giá trị dinh dưỡng cao h n và t vấn đề về tiêu h a h n ở động vật dạ
dày đ n [32-tr.42]. Khẩu phần ăn của động vật dạ dày đ n c thể được hoàn thành
10
với 200 g/kg đậu gà thô để thúc đẩy sản xuất trứng và sinh trưởng ở chim và lợn. Số
lượng có thể cao h n khi đậu gà được xử lý b ng nhiệt.
1.3.3.3. Vai trò của cây đậu gà trong cải tạo đất
Một đặc trưng của các cây họ Đậu là có vi khuẩn sống cộng sinh tại các nốt
sần trên rễ của chúng. Tư ng tự với đậu gà, trong nốt sần chứa vi khuẩn cố định
đạm (Rhizobium) ở rễ có khả năng chuyển đ i Nit kh quyển (N2) thành các dạng
chất mà cây có thể hấp thụ được (NO3- hay NH4+). Do đã thu được một lượng N cần
thiết nên cây ít khi có biểu hiện thiếu N.
Heuzé V. et al. (2015) cho biết khả năng cố định N ở đậu gà có thể lên tới 100
kg N/ha [50-tr.44]. Việc tr ng lu n canh đậu gà với các cây tr ng khác có vai trò
quan trọng trong cải tạo và duy trì độ màu mỡ của đất tr ng; đ ng thời giúp phá vỡ
chu kỳ bệnh và côn trùng gây hại làm tăng năng suất cây tr ng [7, 20].
1.3.3.4. Vai trò của cây đậu gà trong sản xuất nhiên liệu
Thân, lá và rễ c y đậu gà được con người sử dụng làm nhiên liệu đốt. Bên
cạnh đ c c cây họ Đậu thường chứa nhiều hợp chất có thể được tinh chế để phục
vụ sản xuất nhiên liệu sinh học. Hạt c y đậu gà tuy chứa ít dầu h n so với các loại
hạt cho dầu khác (lạc đậu tư ng) nhưng dầu đậu gà có các chỉ số tư ng đối cao h n
[32-tr.42]. Dựa trên số liệu của Zia-Ul-Haq et al. 2007 và Shad et al. 2009 năm
2012, . K. Jukanti et al. đã t m tắt đặc tính lý hóa của dầu hạt đậu gà loại desi
trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Đặc tính lý hóa của dầu hạt desi [32-tr.42]
Ngu n
Zia-Ul-Haq et al.
Shad et al.
T ng dầu (%)
5,88 - 6,87
-
Giá trị Acid (mg KOH/g)
2,55 - 2,67
2,40 - 2,50
Giá trị Iodine phư ng ph p Wijs)
111,87 - 113,69
112,56 - 113,87
Giá trị xà phòng hóa (mg KOH/g)
183,98 - 185,64
178,90 - 180,64
2,99 - 3,71
3,42 - 3,47
-
0,9339 - 0,9346
0,96
-
Đặc điểm
Chất không xà phòng hóa (%, w/w)
Trọng lượng riêng
Mật độ tư ng đối (g/cm3, tại 408C)
11
Chỉ số khúc xạ (tại 408C)
1,48
-
Màu sắc
Nâu - vàng
-
Giá trị peroxide (mequiv/kg)
3,97 - 6,37
-
Giá trị p-Anisidine
5,39 - 8,74
-
13,09 - 22,34
-
Điểm mùi
-
-
MAG (%)
2,2 - 2,7
-
DAG (%)
0,7 - 1,6
-
TAG (%)
55,7 - 63,2
-
- 3,85 - 13,01
1531,71 - 1560,63
Giá trị oxi hóa
Giá trị năng lượng (kJ/100 g mẫu)
MAG: monoacylglycerols; DAG: diacylglycerols; TAG: triacylglycerols.
Trong xu hướng diesel h a động c trên toàn cầu diesel sinh học đang ngày
càng được ưa chuộng h n nhiều so với diesel khoáng. Điểm n i bật trong khi sử
dụng, diesel sinh học không tạo các sản phẩm cháy gây ô nhiễm môi trường như
SO2 [3-tr.39]. Dầu thực vật và mỡ động vật là những nguyên liệu chính để sản xuất
diesel sinh học. Khi TAG phản ứng với alcohol sẽ tạo ra các alkyl ester - thành phần
chính của diesel sinh học [3-tr.39]. Như quan s t ảng 1.2, dễ dàng nhận thấy hàm
lượng TAG trong dầu đậu gà desi cao, do vậy, có thể sử dụng đậu gà để điều chế
diesel sinh học. Thêm vào đ t ng lượng car ohydrate trong đậu gà (60,7 g/100 g)
cao h n c c đậu hạt khác [32-tr.42]. Hàm lượng carbohydrate, lipid và protein cao
là nguyên liệu c sở cho sản xuất khí biogas. Chính vì vậy, có thể xem xét sử dụng
đậu gà để sản xuất nhiên liệu sinh học bảo vệ môi trường.
12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
˗ Đối tượng nghiên cứu: Giống đậu gà ka uli CDC Frontier [46-tr.43].
˗ Dữ liệu nghiên cứu: Dữ liệu genome và proteome của đậu gà ka uli CDC
Frontier' [46-tr.43] trên Phytozome v. 12.1 ( [26tr.41].
- Trình tự gene và protein của 21 thành viên SWEET trên đậu gà được thu
thập từ nghiên cứu trước đ y [2-tr.39].
Bảng 2.1. Thông tin chú giải về họ SWEET ở đậu gà [2-tr.39]
STT
Tên gene
M định danh gene
M định danh protein
1
CaSWEET01
XM_004488926.2
XP_004488983.1
2
CaSWEET02
XM_004487778.2
XP_004487835.1
3
CaSWEET03
XM_012719392.1
XP_012574846.1
4
CaSWEET04
XM_004489049.2
XP_004489106.1
5
CaSWEET05
XM_004490445.2
XP_004490502.1
6
CaSWEET06
XM_004489239.2
XP_004489296.1
7
CaSWEET07
XM_004489238.2
XP_004489295.1
8
CaSWEET08
XM_004491623.2
XP_004491680.1
9
CaSWEET09
XM_004491624.2
XP_004491681.1
10
CaSWEET10
XM_004498321.2
XP_004498378.1
11
CaSWEET11
XM_004498340.2
XP_004498397.1
12
CaSWEET12
XM_004502518.2
XP_004502575.1
13
CaSWEET13
XM_004501669.2
XP_004501726.1
14
CaSWEET14
XM_004501759.2
XP_004501816.1
15
CaSWEET15
XM_004502010.1
XP_004502067.1
16
CaSWEET16
XM_004502557.2
XP_004502614.1
13
17
CaSWEET17
XM_004503532.2
XP_004503589.1
18
CaSWEET18
XM_004503722.2
XP_004503779.1
19
CaSWEET19
XM_004503721.1
XP_004503778.1
20
CaSWEET20
XM_004508799.2
XP_004508856.1
21
CaSWEET21
XM_004515143.1
XP_004515200.1
2.2. Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
˗ Phòng Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp.
˗ Phòng bộ môn Sinh học phân tử - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 3/2018 đến tháng 5/2019.
2.3. Phƣơng ph p nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng ph p ph n tích đặc tính protein SWEET trên c
đậu gà
Đầu tiên, trình tự amino acid của 21 protein vận chuyển SWEET được thu
thập từ nghiên cứu trước của Chu Đức Hà và cs. (2019).
Những đặc tính của phân tử protein g m số lượng aa (amino acid) trọng
lượng ph n tử mW molecular weight) điểm đẳng điện pI isoelectric point) chỉ
số bất n định II insta ility index) và độ ưa nước (GRAVY, grand average of
hydropathicity) được x c định thông qua việc đưa trình tự amino acid của các
CaSWEET vào công cụ Expasy ( [24-tr.41] Hình 2.1).
Sau đ dữ liệu được đưa vào ph n t ch trên phần mềm EXCEL.
14
Hình 2.1. Cơ sở dữ liệu Expas - Protparam
Tiếp đến, sự dự đo n vị tr định khu của protein trong tế ào được thực hiện
ng c ch đưa trình tự protein của 21 thành viên thuộc họ CaSWEET vào truy vấn
trên chư ng trình TargetP v1.1: [18, 19]
Hình 2.2).
Hình 2.2. Cơ sở dữ liệu TargetP
2.3.2. Phƣơng ph p x
dựng c
ph n loại họ protein SWEET ở đậu gà
Cây phân loại được xây dựng bởi phần mềm MEGA (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis) [34-tr.42] Hình 2.3). Để xây dựng cây phân loại,
tiến hành c c ước sau:
15
Hình 2.3. Cơ sở dữ liệu MEGA
ước 1: Trình tự protein CaSWEET được đưa vào truy vấn trên MEG để căn trình
tự tư ng đ ng theo mặc định (Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Những tham số để căn trình tự tƣơng đ ng
Thông tin mặc định
STT
1
2
Bắt cặp hai trình tự
Bắt cặp nhiều trình tự
ng MEG
Thông số mặc định
Hình phạt khoảng trống đầu tiên
10
Hình phạt khoảng trống kéo dài
0,1
Hình phạt khoảng trống đầu tiên
10
Hình phạt khoảng trống kéo dài
0,2
3
Ma trận trọng lượng protein
4
Nhóm hình phạt dư lượng - cụ thể
ON
5
Nhóm hình phạt c t nh ưa nước
ON
6
Khoảng cách chia khoảng trống
4
7
Tách khoảng trống cuối
OFF
8
Sử dụng ma trận phủ định
OFF
9
Sự cản trở cắt phân tán (%)
30
Gonnet
16
