Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn (democarpus longan)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

VŨ LỆ GIANG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ
KHẢ NĂNG LÊN MEN TẠO ĐỒ UỐNG GIẢI KHÁT
TỪ NHÃN (DIMOCARPUS LONGAN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Hà Nội - 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

VŨ LỆ GIANG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ
KHẢ NĂNG LÊN MEN TẠO ĐỒ UỐNG GIẢI KHÁT
TỪ NHÃN (DIMOCARPUS LONGAN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian hoàn thiện đề tài ngoài sự cố gắng và nỗ lực của
bản thân em cũng đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình, và quý báu của các tập
thể và cá nhân trong và ngoài trƣờng. Đặc biệt đề tài này đƣợc hoàn thành
dƣới sự quan tâm, chỉ bảo và hƣớng dẫn tận tình của PGS.TS. Đinh Thị Kim
Nhung.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô giáo, các
cán bộ trong phòng thí nghiệm vi sinh và ban chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN,
cùng ban lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện
giúp đỡ cho em trong suốt thời gian làm đề tài. Cuối cùng em xin gửi lời cảm
ơn tới gia đình và bạn bè, những ngƣời luôn yêu thƣơng em cho em sự khích
lệ, động viên và luôn bên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh Viên
Vũ Lệ Giang


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì tôi viết trong khóa luận này là sự thật, là kết
quả tôi làm ra. Các số liệu ở trong bảng biểu và hình ảnh đều đƣợc tôi thu
thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không trùng với kết quả của bất kỳ
tác giả nào đã công bố dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung.
Trong đề tài của tôi có sử dụng một số dẫn liệu của tác giả khác, tôi xin
phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình đƣợc hoàn
thiện hơn.

Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Vũ Lệ Giang


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATP

Adenozin triphotphat

Nxb

Nhà xuất bản

MT1

Môi trƣờng phân lập giữ giống

MT2

Môi trƣờng nhân giống cơ bản

MT3

Môi trƣờng lên men

STT

Số thứ tự

Tb

Tế bào

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

Vsv

Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng có trong 100g thịt nhãn .......................... 7
Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu ............................................... 17
Bảng 2.3. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của nƣớc giải khát ........ 18
Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ..................... 19
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái và kích thƣớc của các chủng nấm men ......... 21
Bảng 3.6. Hoạt lực lên men của chủng nấm men ......................................... 25
Bảng 3.7. Khả năng lên men ở các nồng độ cồn khác nhau của các
chủng nấm men ............................................................................... 26
Bảng 3.8. Khả năng đồng hóa lên men đƣờng saccharose và đƣờng
glucose của các chủng giống đã phân lập ....................................... 28
Bảng 3.9. Xác định khả năng lên men ở các độ pH khác nhau .................... 29
Bảng 3.10. Khả năng tạo hƣơng thơm và độ trong sản phẩm của các
chủng nấm men ............................................................................... 30
Bảng 3.11. Bảng tổng hợp kết quả tuyển chọn 6 chủng nấm men ............... 31


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh cây nhãn............................................................................. 6
Hình 3.2. Chủng nấm men phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa...................... 22
Hình 3.3. Chủng nấm men trên môi trƣờng thạch nghiêng ............................ 23
Hình 3.4. Ảnh chụp tế bào nấm men trên kính hiển vi điện tử
(× 1000 lần) ....................................................................................... 23
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn chiều cao cột kết lắng của các chủng
nấm men ............................................................................................ 27
Hình 3.6. Thử hoạt tính catalaza ..................................................................... 28
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae PI6 .......................................................... 32


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
4.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 2
5. Điểm mới của đề tài ...................................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Nƣớc giải khát lên men .............................................................................. 3
1.2. Tổng quan về nguyên liệu .......................................................................... 5
1.2.1. Nguồn gốc, phân loại .............................................................................. 5
1.2.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 5
1.2.3. Đặc tính mùa vụ năng suất ...................................................................... 6
1.2.4. Thành phần dinh dƣỡng .......................................................................... 6

1.2.5. Ứng dụng ................................................................................................. 7
1.3. Hệ vi sinh vật ............................................................................................. 8
1.3.1. Nấm men ................................................................................................. 8
1.4. Lịch sử nghiên cứu vấn đề ......................................................................... 9
1.4.1. Trên thế giới ............................................................................................ 9
1.4.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 12
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 12
2.1.1. Mẫu thực vật.......................................................................................... 12
2.1.2. Mẫu vi sinh vật ...................................................................................... 12
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 12
2.1.4. Hóa chất và các loại môi trƣờng ........................................................... 12


2.1.5. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 13
2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................ 13
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 13
2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh .............................................................................. 13
2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh ........................................................................... 17
2.2.3. Phƣơng pháp cảm quan ......................................................................... 17
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích thống kê ........................................................... 19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 21
3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm
đồ uống giải khát từ nhãn .......................................................................... 21
3.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tạo sản phẩm
đồ uống giải khát từ nhãn .......................................................................... 24
3.2.1. Đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men ........................... 24
3.2.2. Khả năng chịu cồn của các chủng nấm men ......................................... 25
3.2.3. Thử nghiệm khả năng kết lắng .............................................................. 27
3.2.4. Thử nghiệm hoạt tính catalaza .............................................................. 27

3.2.5. Thử khả năng sử dụng đƣờng glucozo của các chủng nấm men .......... 28
3.2.6. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau ............................................ 29
3.2.7. Khả năng tạo hƣơng thơm và độ trong của sản phẩm........................... 30
3.4. Lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn .................................................... 33
3.4.1. Sơ đồ quy trình công nghệ lên men nƣớc giải khát lên men từ nhãn. .. 33
3.4.2. Thuyết minh quy trình công nghệ ......................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36
PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam là nƣớc có khí hậu khô nóng nên nhu cầu về nƣớc giải khát
của ngƣời dân vô cùng lớn, chính vì vậy việc tìm ra một loại nƣớc giải khát
vừa phù hợp với sức khỏe con ngƣời vừa gần gũi với thiên nhiên đƣợc ƣu tiên
hàng đầu. Trong đó phải kể đến dòng sản phẩm lên men đang rất đƣợc ngƣời
dân ƣa chuộng hiện nay. Dòng sản phẩm này đang xâm nhập mạnh mẽ vào thị
trƣờng tiêu dùng và dần trở nên quen thuộc gần gũi đối với chúng ta.
Khác với sản phẩm nƣớc giải khát công nghiệp nƣớc giải khát lên men
đƣợc chế biến hoàn toàn từ các loại trái cây tƣơi không sử dụng chất bảo
quản, các phụ phẩm hóa học và chất tạo màu thực phẩm còn dòng sản phẩm
nƣớc giải khát công nghiệp vẫn còn chứa một số chất hóa học tổng hợp có thể
gây bệnh béo phì, không tốt cho tim mạch. Chính vì vậy chúng tôi lựa chọn
nƣớc giải khát lên men để thay thế cho sản phẩm nƣớc giải khát công nghiệp
đảm bảo an toàn cho mọi đối tƣợng sử dụng. Sản phẩm này ngoài việc tham
gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào mà nó còn bổ sung các dƣỡng chất
thiết yếu cho cơ thể để bù lại những hao hụt về năng lƣợng và dinh dƣỡng bị
tiêu hao trong các hoạt động sống của con ngƣời. Sản phẩm này có độ cồn
nhẹ, vị chua ngọt và vẫn giữ đƣợc hƣơng thơm của dịch quả vậy nên nó dễ

dàng chinh phục thị hiếu của ngƣời tiêu dùng hiện đại, nhất là thế hệ trẻ
những ngƣời luôn tìm kiếm cảm giác mới mẻ.
Nƣớc giải khát lên men là dòng sản phẩm lên men nhờ vi sinh vật.
Ngoài việc tạo cho các chủng vi sinh vật môi trƣờng lên men tốt đầy đủ chất
dinh dƣỡng thì để có sản phẩm có chất lƣợng tốt chúng tôi cần tuyển chọn các
chủng vi sinh vật có khả năng lên men tốt, không sinh độc tố và tạo cho sản
phẩm độ trong đẹp mắt. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài "Phân lập,
tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống giải khát từ
nhãn (democarpus longan)”.

1


2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo
đồ uống giải khát từ nhãn.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống
giải khát từ nhãn.
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống
giải khát từ nhãn.
3.3. Nghiên cứu động thái lên men của chủng tuyển chọn.
3.4. Lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Cơ sở khoa học của quá trình lên men rƣợu là quá trình lên men yếm
khí với sự có mặt của nấm men chúng sẽ chuyển hóa đƣờng thành rƣợu và
chuyển tiếp thành các acid hữu cơ.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng sản phẩm nƣớc giải khát lên men từ dịch nhãn phục vụ cho đời

sống hàng ngày của ngƣời dân, góp phần nâng cao giá trị cây nhãn. Tạo ra sản
phẩm mới góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày
càng cao của ngƣời tiêu dùng. Tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu rẻ tiền, lên
men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng, có lợi cho sức khỏe con ngƣời.
5. Điểm mới của đề tài
Chúng tôi đã phân lập đƣợc 50 chủng sơ tuyển đƣợc 6 chủng nấm men
là PI1, PI2, PI3, PI4, PI5, PI6. Tuyển chọn đƣợc 1 chủng có khả năng lên
men tạo sản phẩm nƣớc giải khát và dựa vào đặc tính sinh học của nấm men
xác định chủng tuyển chọn là nấm men Saccharomyces serevisiae PI6.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nƣớc giải khát lên men
Nƣớc giải khát lên men là sản phẩm tạo thành nhờ tác nhân là nấm men
từ môi trƣờng lên men là nƣớc quả tự nhiên. Trong quá trình lên men này chủ
yếu là quá trình lên men rƣợu ngoài ra còn có quá trình lên men axit hữu cơ.
* Lên men ethanol (lên men rƣợu)
Quá trình lên men rƣợu chia làm 2 thời kì chính: thời kì phát triển sinh
khối (với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kì lên
men chuyển đƣờng thành rƣợu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các
chất dinh dƣỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác
sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rƣợu và
CO2).
Sau khi đƣờng cùng các chất dinh dƣỡng khác của môi trƣờng lên men
đƣợc hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men, khuếch tán qua màng bán
thấm vào trong tế bào. Đƣờng bị chuyển hóa qua một chuỗi phản ứng theo
con đƣờng đƣờng phân để tạo pyruvate, pyruvate bị decarbonxyl dƣới tác

dụng xúc tác của enzim pyruvate decarboxylase tạo thành acetaldehyde giải
phóng CO2, acetaldehyde nhận H+ từ NADH tạo ethanol. Trong quá trình lên
men ethanol, nhiều axit hữu cơ đƣợc tạo thành và một số axit hữu cơ đƣợc
sinh tổng hợp từ chu trình Krep, nếu quá trình lên men không ở trong điều
kiện kị khí nghiêm ngặt thì các axit chiếm hàm lƣợng cao nhất trong dịch lên
men là axit citric, axit malic, axit axetic, axit lactic… [6]
Phƣơng trình tổng quát của quá trình lên men:
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi

2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

Sự chuyển hóa đƣờng hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế
bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lƣợng của nấm men
trong điều kiện kị khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ đƣợc nấm men thải

3


vào môi trƣờng lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào
dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp
chất này đƣợc tìm thấy với hàm lƣợng rất nhỏ, chúng đƣợc chia thành 4
nhóm: glyxerol cùng rƣợu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá
trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ đƣợc tạo thành (The Moll, 1990).
* Lên men axetic
Lên men axetic là quá trình oxi hóa rƣợu thành acid axetic dƣới tác
dụng của vi khuẩn
C2H5OH + O2
CH3CHO + H2O
CH3CH(OH)2 + O2

CH3CHO (Axetaldehyd) + H2O
CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyd)
CH3COOH + H2O

* Lên men lactic
Lên men lactic là quá trình trao đổi năng lƣợng. Các phân tử ATP đƣợc
hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ đƣợc vi khuẩn giữ lại trong
tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trƣởng của vi sinh vật. Ngƣợc
lại các sản phẩm nhƣ acid lactic, ethanol, CO2 đƣợc vi khuẩn thải vào môi
trƣờng lên men. Kết quả hàm lƣợng acid lactic tích lũy trong môi trƣờng lên
men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trƣờng và kéo theo những biến đổi lý
hóa khác. Bản chất là quá trình chuyển hóa đƣờng thành acid lactic nhờ vi
sinh vật. Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men
đồng hình), acid axetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men
còn xuất hiện nhiều hợp chất hóa học mới khác, đây là sản phẩm trung gian
hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Một số hợp chất trong nhóm trên
rất dễ bay hơi, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành
nên mùi vị đặc trƣng cho các sản phẩm lên men lactic. Lƣợng sản phẩm phụ
tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trƣờng dinh
dƣỡng và điều kiện ngoại cảnh, acid lactic thƣờng chiếm 40% lƣợng đƣờng

4


đã đƣợc phân hủy, acid sucxinic 20%, rƣợu etylic chiếm 10%, acid axetic
10% và các loại khí gần 20% [6].
1.2. Tổng quan về nguyên liệu
1.2.1. Nguồn gốc, phân loại
Nhãn có tên khoa học là Dimocarpus longan
Thuộc họ Bồ hòn (Sapidaceae)

Nhãn có nguồn gốc ở Ấn Độ, đƣợc trồng ở miền Nam Trung Quốc,
Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia.
Ở Việt Nam Nhãn chủ yếu đƣợc trồng ở đồng bằng sông Cửu Long,
miền Bắc và Vùng Đông Nam Bộ. Trong đó, đồng bằng sông Cửu Long
chiếm 70- 80% tổng diện tích trồng.
1.2.2. Đặc điểm hình thái
Nhãn là cây thân gỗ, tƣơng đối lớn, cao khoảng 5- 10m, có thể lên đến
20m, tán tròn đều, rậm lá, xanh quanh năm. Vỏ thân dày, thƣờng sần sùi, có
nhiều vết nứt dọc nhỏ đôi khi bong tróc từng mảng, gỗ giòn.
Lá thuộc lá kép lông chim, mọc đối xứng hay so le. Mặt lá xanh đậm,
bóng loáng còn lƣng lá có màu xanh nhạt, cuống lá ngắn, gân chính và gân
phụ nổi rõ. Lá non màu đỏ tím hay đỏ nâu tùy giống và thay đổi màu theo thời
gian sống.
Hoa nhãn màu trắng vàng, 5 cánh mọc từng chùm ở đầu cành. Nhãn có
rất nhiều hoa, số lƣợng hoa nhiều hay ít tùy thuộc vào tuổi của cây, giống
nhãn, mùa vụ trong năm,… có thể vài trăm hoa tới 2- 3 nghìn hoa.
Quả nhãn thuộc loại quả hạch, mọc theo chùm rủ xuống, đỉnh quả tròn
cuống hơi lõm, thƣờng quả sẽ chín sau khi hoa nở đƣợc 3- 5 tháng. Vỏ quả
mỏng, bóng loáng màu nâu. Giữa vỏ và hạt có lớp thịt quả do cuống noãn
phát triển thành, màu trắng trong hay trắng sữa, rất mềm và ngọt có mùi thơm
đặc trƣng . Thịt nhãn gồm khoảng 70% nƣớc và 16% chất khô hòa tan. Hạt
nhãn tròn, đen và láng, cuống hạt có màu trắng. Lá mầm trong hạt màu trắng

5


có nhiều tinh bột, phôi màu vàng, độ lớn của hạt khác nhau tùy giống có
giống hạt rất lớn (nhãn long) có giống hạt rất nhỏ (nhãn tiêu) hoặc hầu nhƣ
không có hạt do kết quả thụ tinh kém [16].

Hình 1.1. Hình ảnh cây nhãn
1.2.3. Đặc tính mùa vụ năng suất
Giống địa phƣơng nhãn nƣớc có đặc tính dễ trồng thích hợp với đất thịt
pha cát và cho năng suất cao, mỗi năm thƣờng có 1 vụ vào khoảng tháng 8
đến tháng 9. Một số giống nhãn khác nhƣ nhãn long, nhãn Vĩnh Châu có thể
cho 2 vụ một năm vào tháng 2 – 3 và tháng 8 – 9.
1.2.4. Thành phần dinh dưỡng
Nhãn rất giàu giá trị dinh dƣỡng nhƣ protein, chất béo, đƣờng thiên
nhiên, các loại vitamin và khoáng chất nhƣ: vitamin A, C, kali, photpho,
magie, sắt, axit hữu cơ, chất xơ…Trong quả nhãn chứa hợp chất có khả năng
làm chậm quá trình lão hóa ở con ngƣời. Ngoài ra, nhãn còn có tác dụng tăng
cƣờng sức đề kháng cho cơ thể, chống lại các bệnh nhƣ cảm cúm và làm đẹp
da.

6


Nhãn tăng cƣờng hàm lƣợng Vitamin C trong cơ thể con ngƣời. Trong
100 gam nhãn có chứa đến 84 mg hàm lƣợng Vitamin C và con số này đủ
cung cấp 100% nhu cầu Vitamin C cần thiết hàng ngày cho nữ và 93% nhu
cầu cho nam giới.
Trong thành phần của quả nhãn có chứa Riboflavin, đây là một loại
vitamin có tác dụng tích cực đối với mắt, nếu nhƣ thiếu loại Vitamin này rất
dễ dẫn đến hiện tƣợng đục thủy tinh thể hay mờ mắt…
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng có trong 100g thịt nhãn [16]
Thành phần dinh dƣỡng

Hàm lƣợng

Năng lƣợng

109 Kcal

Ẩm

72,4%

Protein

1g

Béo

0,1- 0,5g

Carbohydrate

16- 25g

Xơ

0,4g

Tro

0,7g

Ca

2- 10 mg

P

6- 42 mg

Fe

0,3- 1,2 mg

Vit A

28 IU

Vit B1

0,04 mg

Vit B2

0,07 mg

Niacin

0,6 mg

1.2.5. Ứng dụng
Cùi nhãn ăn tƣơi, đông lạnh, đồ hộp, sấy khô, nƣớc giải khát, làm rƣợu.
Nhãn sấy khô làm long nhãn là thuốc bổ, thuốc an thần, điều trị suy
nhƣợc thần kinh, chứng sút kém trí nhớ, mất ngủ hay hoảng hốt.

7


Hạt nhãn, vỏ quả nhãn dùng làm thuốc trong đông y. Nhãn là cây
nguồn mật quan trọng có chất lƣợng cao. Gỗ nhãn non có thể làm thức ăn gia
súc, hạt nhãn có thể làm hồ, chế rƣợu…[19]
1.3. Hệ vi sinh vật
1.3.1. Nấm men
1.3.1.1. Hình thái và cấu tạo tế bào của nấm men
Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, hình trụ, elip, ovan…, và có
kích thƣớc rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn. Chiều dài trung bình từ 910 µm, chiều rộng trung bình từ 2-7 µm. Ở mỗi loài, mỗi lứa tuổi và điều kiện
nuôi cấy khác nhau chúng có hình dạng và kích thƣớc khác nhau.
1.3.1.2. Sự sinh sản của nấm men
Một số hình thức sinh sản của nấm men là nảy chồi, phân đôi, sinh sản
bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh
sản đơn tính).
1.3.1.3. Phân loại nấm men
Chủ yếu có 2 lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (fungi
imporfecti)
Lớp nấm men thật (Ascomyces) phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Sacchromyces; giống
Endomyces; giống Schizosaccharomyces.
Lớp nấm men giả (fungi imporfecti) Crytococus (toscula, tornlopsis);
Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã đƣợc xếp vào lớp nấm mốc);
Rhodotorula [9].
Phần lớn các loài nấm men thuộc về ngành nấm túi (Ascomycota), một
số ít loài thuộc ngành nấm đảm (Basidimycota). Saccharomyces là một chi
nấm men đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm. Trên 1000 loài nấm
men đã đƣợc miêu tả, loài nấm men đƣợc con ngƣời sử dụng nhiều nhất là

8


Saccharomyces cerevisiae trong sản xuất rƣợu vang, bánh mì, bia… từ hàng
nghìn năm trƣớc.
Saccharomyces cerevisiae phổ biến trong quá trình lên men nƣớc hoa
quả, chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nƣớc quả khi lên
men. Nguồn dinh dƣỡng cacbon của loại này là đƣờng, axit hữu cơ và những
tác nhân sinh trƣởng là axit pantotinic, biotin, thiamin, piridoxin…
1.4. Lịch sử nghiên cứu vấn đề
1.4.1. Trên thế giới
Ngành sản xuất nƣớc uống lên men đã có từ lâu đời và đang ngày càng
phát triển với tốc độ rất nhanh. Trong số các loại nƣớc giải khát thì đây đƣợc
coi là mặt hàng chiến lƣợc chủ yếu của thế kỷ XXI nên các quốc gia nhƣ Mỹ,
Hà Lan, Trung Quốc, Nhật, Đức…đã và đang tập trung nghiên cứu và sản
xuất các loại nƣớc uống lên men từ nhiều loại trái cây khác nhau nhƣ táo, dứa,
chanh leo, mơ, xoài… có chất lƣợng rất cao đáp ứng đƣợc nhu cầu ngày càng
cao của con ngƣời. Đối với những ngƣời tiêu dùng ở các nƣớc châu Âu và Mĩ
do có thói quen ăn thịt ít ăn rau đặc biệt là trẻ nhỏ nên nhu cầu sử dụng các
loại nƣớc trái cây và rau củ thơm ngon, bổ dƣỡng ngày càng tăng làm cho thị
trƣờng nƣớc trái cây ngày càng phát triển.
Ngày nay, khi điều kiện sống của con ngƣời ngày đƣợc nâng cao thì
nhu cầu sử dụng nƣớc giải khát ngày càng tăng và đang chuyển dần từ loại
nƣớc giải khát pha chế truyền thống sang sử dụng loại nƣớc giải khát có chứa
các loại chất dinh dƣỡng nhƣ các loại: axit amin, vitamin, muối khoáng…
đƣợc lên men từ dịch trái cây. Đây đƣợc coi là mặt hàng đóng vai trò chủ đạo
của thế kỉ 21, nên nhiều quốc gia nhƣ: Hà Lan, Mỹ, Đức, Úc, Nhật, Hàn
Quốc, Trung Quốc, Thái Lan… đã tập trung nghiên cứu và sản xuất đƣợc
nhiều loại nƣớc giải khát từ các loại trái cây khác nhau nhƣ: dâu, cam, dứa,
mơ, xoài,…có chất lƣợng tốt đã nhanh chóng chiếm lĩnh thị trƣờng tiêu thụ.

9


Theo dự đoán của các nhà chiến lƣợc, trong các loại nƣớc giải khát
đƣợc sản xuất từ trái cây thì loại nƣớc giải khát lên men đƣợc đánh giá là mặt
hàng “mạnh” trong tƣơng lai vì đây là sản phẩm đƣợc đánh giá có giá trị dinh
dƣỡng cao nhờ quá trình lên men của vi sinh vật và rất phù hợp với thế hệ trẻ.
1.4.2. Ở Việt Nam
Việt Nam có khí hậu nóng khô nên nhu cầu sử dụng nƣớc giải khát là
rất lớn. Mặc dù cho đến nay đã có một số công ty nƣớc ngoài đƣợc cấp giấy
phép đầu tƣ và sản xuất nƣớc giải khát từ trái cây tại Việt Nam, song mức tiêu
thụ bình quân của ngƣời Việt Nam mới chỉ đạt 0,16 lít/ ngƣời năm (là quá
thấp so với nhiều quốc gia trong khu vực), trong khi nguồn nguyên liệu để sản
xuất nƣớc trái cây ở Việt Nam lại vô cùng phong phú đa dạng hoàn toàn có
thể đáp ứng nhu cầu về nguyên liệu để sản xuất ổn định lâu dài lại đang có
nguy cơ bị dƣ thừa do thiếu công nghệ chế biến phù hợp.
Tại Việt Nam có những nghiên cứu về sản xuất nƣớc ép và rƣợu vang
từ trái cây nhƣ: dứa, nho, dâu tây… Việc nghiên cứu nƣớc trái cây lên men là
hoàn toàn phù hợp với xu thế phát triển chung của thế giới và khu vực.
Tuy nhiên việc lựa chọn nguyên liệu để có thể mang lại một loại nƣớc
giải khát lên men chất lƣợng cao, giá cả thích hợp cho ngƣời tiêu dùng không
phải là vấn đề đơn giản và nó cũng đang là vấn đề cấp thiết đối với nghành
nƣớc giải khát của Việt Nam. Bởi chọn nguyên liệu phải nghiên cứu nguyên
liệu có thỏa mãn về thành phần dinh dƣỡng, giá cả, mùa vụ, trữ lƣợng hay
không hoặc có phù hợp với công nghệ sản xuất hay không. Dù chƣa phổ biến
nhƣng những năm gần đây và trong tƣơng lai nƣớc giải khát lên men sẽ phổ
biến. Song để đạt đƣợc điều đó đòi hỏi Việt Nam phải tiếp tục nghiên cứu để
tận dụng các trái cây có sẵn tại Việt Nam để sản xuất nƣớc giải khát lên men
nhằm đa dạng hóa sản phẩm.

Hiện tại, một số chuyên gia thực phẩm Viện nghiên cứu Hà Nội đã
nghiên cứu thành công quy trình sản xuất nƣớc giải khát lên men từ nho, dâu,

10


dứa. Bên cạnh nƣớc quả lên men từ một loại quả thì hiện nay đã có nhiều
công trình nghiên cứu nƣớc quả lên men hỗn hợp. Ví dụ nhƣ quy trình nghiên
cứu nƣớc quả lên men hỗn hợp của Nguyễn Đỗ Hồng Hạnh – Khoa CNSTH
thực hiện với phƣơng trình dự kiến nhƣ sau:
Nguyên liệu 1

Nguyên liệu 2

Làm sạch

Làm sạch
Phối
trộn

Bổ sung đƣờng, phụ
gia

không bổ sung
Thanh trùng

Làm nguội

Bổ sung men

Lắng, lọc cặn, thêm CO2
Sản phẩm
Trong các loại quả hiện có ở Việt Nam, quả nhãn chiếm sản lƣợng lớn
và chất lƣợng cao nhƣng hiện nay nhãn vẫn chỉ đƣợc sử dụng làm thức ăn
tráng miệng. Để góp phần làm đa dạng hóa sản phẩm đồ uống lên men và sử
dụng có hiệu quả hơn nguồn đặc sản dồi dào là trái nhãn ở các địa phƣơng
chúng tôi đề xuất một hƣớng nghiên cứu sử dụng nhãn để chế biến nƣớc giải
khát lên men.

11


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
Cây nhãn (Dimocarpus longan)
Bộ phận sử dụng: cùi quả nhãn
Nơi thu mẫu: chợ Đồng Xuân, phƣờng Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên,
tỉnh Vĩnh Phúc.
2.1.2. Mẫu vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống từ dịch nhãn.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc khoa Sinh –
KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2
Thiết bị nghiên cứu:
- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)
- Nồi hấp Tommy (Nhật)
- Box vô trùng (Haraeus)
- Cân (Precisa XT 320M - Thụy Sĩ)
- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml
- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)
- Tủ lạnh
- Máy đo pH
- Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn và
nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.4. Hóa chất và các loại môi trường
2.1.4.1. Hóa chất
Hóa chất PTN Vi sinh vật khoa Sinh-KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2
cung cấp

12


- Nguồn cacbon: Glucose (C6H12O6), saccharose (C12H12O11), acid
axetic.
- Nguồn nitơ: Nấm men, pepton, (NH4)2SO4.
- Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4, NaCl, CaCO3.
- Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, tím gentian, phenolphtalein, ..
- H2SO4, thạch Agar, dịch nƣớc nhãn.
2.1.4.2. Các loại môi trường
- Môi trƣờng phân lập và giữ giống: (MT1)
Glucose

: 50g

Thạch aga: 20g

KH2SO4

: 3g

Pepton

: 10g

(NH4)2SO4

: 2g

Nước

: 1000ml

MgSO4.7H2O : 2g
- Môi trƣờng nhân giống cơ bản: (MT2)
Glucose: 50g

MgSO4.7H2O : 2g

KH2SO4: 3g

Pepton

(NH4)2SO4: 2g

Nước

: 10g
: 1000ml

- Môi trƣờng lên men: (MT3)
Saccarose: 100g

KH2SO4: 3g

Nước nhãn: 200 ml

(NH4)2SO4: 2g

Mg.7H2O: 2g
2.1.5. Phạm vi nghiên cứu
Chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống giải khát từ dịch
nhãn.
2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thời gian: tháng 9 năm 2018 đến tháng 4 năm 2019
Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật
13


Để chọn một tập hợp các tế bào nấm men ta sử dụng phƣơng pháp phân
lập trên đĩa petri. Môi trƣờng để tuyển chọn các chủng vsv là môi trƣờng
Hanxen.
Tiến hành phân lập: Sử dụng dịch giống có chứa vi sinh vật, cho dịch
giống vào ống nghiệm chứa nƣớc cất thanh trùng. Lắc đều bằng máy vonotex
trong 5 phút thu đƣợc dịch huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở
các nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-10. Dùng pipetman hút 50ml mẫu ở các

độ pha loãng 10-3 đến 10-10 nhỏ lên mặt môi trƣờng thạch vô trùng trong hộp
petri, dùng que chang chang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong
5 - 7 ngày. Dựa vào của hình thái khuẩn lạc chúng ta tiến hành tách một số
khuẩn lạc đặc trƣng ra khỏi môi trƣờng phân lập, cấy thuần sau đó chuyển
sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ lạnh.
2.2.1.2. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram, nhuộm đơn.
Nhuộm Gram: là phƣơng pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc
nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi sinh vật.
Các dung dịch thuốc nhuộm:
+ Thuốc nhuộm Fuchsin
+ Thuốc nhuộm Xanh methylene
Cách làm tiêu bản nhuộm bào tử nấm men
Cố định vết bôi: chuẩn bị vết bôi của nấm men trên lam kính, hơ nóng
nhẹ để cố định vết bôi (cố định bằng nhiệt).
Nhuộm Fuchsin: đặt phiến kính lên thanh đỡ ngang trên cốc đong có
chứa nƣớc đang sôi. Đậy lên vết bôi một mẫu giấy thấm có kích thƣớc vừa
với phiến kính. Phủ thuốc nhuộm Fuchsin lên phiến kính. Để yên 5 phút.
Lấy mẫu giấy ra, rửa thuốc nhuộm dƣ bằng nƣớc và khử màu vết bôi
bằng dung dịch cồn 330C hoặc H2SO4 1 % trong khoảng thời gian 1 phút sau
đó rửa lại bằng nƣớc trong 5 giây.
Nhuộm với Xanh methylene trong vòng 30 – 45 giây.

14


Rửa lại với nƣớc, thấm khô vết bôi nhẹ nhàng với giấy thấm rồi quan
sát dƣới vật kính dầu của kính hiển vi.
Bào tử sẽ bắt màu đỏ, còn tế bào sẽ bắt màu xanh [3].
2.2.1.3. Phương pháp đếm số lượng tế bào
Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa.

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi sinh vật, pha loãng theo phƣơng
pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang
đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 30oC sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc
(CFU) trong môi trƣờng đĩa petri, từ đó xác định số lƣợng tế bào nấm men
trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [7].
N = A.

.

Trong đó: N - Tổng số CFU trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu.
A - Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri
10 –n – Độ pha loãng dịch nuôi cấy.

Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm
Đây là phƣơng pháp đếm trực tiếp số lƣợng tế bào vi sinh vật có trong
mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật đến 10-n, nhỏ một giọt
dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa buồng đếm và đậy lá kính, di
chuyển nhẹ buồng đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm số lƣợng tế bào theo
các ô theo đƣờng chéo hoặc theo các góc ở trung tâm buồng đếm. Thƣờng
đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm buồng đếm để tính số lƣợng tế bào
trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml
ban đầu: [7]
N = A . 25 : V : N
Trong đó: N – Số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù
A – Số lượng tế bào trung bình trong một ô lớn
V – Thể tích của 1 ô lớn
n – Độ pha loãng của dung dịch huyền phù (10-n)
25 – Số ô đếm của toàn buồng đếm

15

2.2.1.4. Bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trƣờng giữ
giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 30oC. Sau đó giữ trong tủ
lạnh 4oC dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch
nghiêng định kì mỗi tháng một lần [7].
2.2.1.5. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử
dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật
cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trƣờng tiêu
chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút. Sau
đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng
vào nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [5], [7].
2.2.1.6. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men đã phân lập tuyển
chọn thông qua xác định hàm lƣợng CO2 thoát ra (g/l dịch lên men) bằng
phƣơng pháp cân trọng lƣợng bình hàm lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều thì
chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt.
Phƣơng pháp: dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250ml môi
trƣờng, có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h
lên men đem cân trọng lƣợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại [5],
[7].
2.2.1.7. Xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của chủng nấm men đƣợc xác định bằng tốc độ lắng
của sinh khối. Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành nhƣ sau: hòa sinh khối vsv
vào dung dịch đệm axetat đƣợc đựng trong ống nghiệm có hình dạng và kích
thƣớc nhƣ nhau. Lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 3
– 5 phút để lắng 15 phút. Lúc này toàn bộ khối đệm phân thành 2 lớp tiến
hành đo chiều cao lớp phía dƣới trong từng ống nghiệm để xác định khả năng

kết lắng của tế bào [5], [7].

16