Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng biocellulose trên môi trường dịch dưa chuột (cucumis sativus l 1753)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

KHUẤT THỊ MAI

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE
TRÊN MÔI TRƢỜNG DỊCH DƢA CHUỘT
(CUCUMS SATIVUS L.1753)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

KHUẤT THỊ MAI

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE
TRÊN MÔI TRƢỜNG DỊCH DƢA CHUỘT
(CUCUMS SATIVUS L.1753)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

ThS. NGUYỄN THỊ KIM NGOAN

HÀ NỘI, 2019


LỜI CẢM ƠN

ế
ạo mà
ột (Cucumis sativus.L.1753)”

dưa

Bo e

o e rê mô rường dịch

S.
ế
ế
2

-

khoa Sinh – KTNN, Trung tâm Thông tin th
2
.

n

ế
à ộ

à 15

Khuất Th Mai

m 2019


ỜI CAM ĐOAN

ế
ế

.
ế
ế

ế
15

5 ă

ê

Khuất Th Mai

2019

MỤC LỤC
MỞ ẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do ch

tài ........................................................................................... 1

2. M

u ..................................................................................... 2

3. N i dung nghiên c u ..................................................................................... 2
4
5 Ý
6

ng và ph m vi nghiên c u................................................................. 2
ĩ

ĩ

mm ic

c ti n.......................................................... 2

tài ...................................................................................... 3

....................................................................................................... 4
1

........................................................... 4

1.1. V trí phân lo

Gluconacetobacter ................. 4

1.1.1. Vị trí phân loại c a Gluconacetobacter trong sinh giới ......................... 4
m
12

a
-

o a e o a er ........................................... 4
Gluconacetobacter .................................. 5

1.3. Biocellulose ............................................................................................... 6
r

mà

Biocellulose ................................................................... 6

ộ

a mà
r

Biocellulose

a e

d
1.4

Biocellulose ................................................ 6

oe

ớ

o a e o a er ......... 7
o a e o a er .............. 8

a Biocellulose .................................................................... 8
t (Cucumis sativus) ............................................... 8

1.4.1. Vị trí phân loại ........................................................................................ 8
1.4.2. Thành phần dinh dưỡng .......................................................................... 8
1.4.3. ng d ng ................................................................................................. 9
1.5. Tình hình nghiên c u và s n xu t Biocellulose hi n nay .......................... 9
1.5.1. Trên thế giới .......................................................................................... 10
1.5.2. Ở Vi t Nam ............................................................................................ 10


2

ỨU ........................ 12

21

............................................................................... 12
ng ..................................................................................................... 12

2.1.2. Hóa ch t và thiết bị ............................................................................... 12
2.1.3. Các loạ mô rườ
22

.............................................................................. 13

g pháp nghiên c u.......................................................................... 15
ươ

............................................................................. 15

ươ g pháp hóa sinh .......................................................................... 17
ươ
ươ

m quan ........................................................................ 18
o

c .......................................................................... 18

3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 20
31

ă
Biocellulose
..................................................................................... 20

3.1.1. Lên men t nhiên ................................................................................... 21
3.1.2. Thu các ch ng vi khu n t màng mẫu và phân l p .............................. 21
32

ă
Biocellulose
..................................................................................... 24
ax ....................................... 24

3.2.1. Tuy n ch n các ch ng có kh

3.2.2. Tuy n ch n các ch ng có kh
n hóa glycerol thành
dihydroxyacetone ............................................................................................ 24
3.2.3. Tuy n ch n các ch ng có kh

ox

ae a o

à

ax .......... 24

3.2.4. Tuy n ch n các ch ng có kh

ox

a a e a e ............................ 25

3.2.5. Ki m tra hoạt tính catalase ................................................................... 25
3.2.6. Tuy n ch n các ch ng có kh
3.3. Nghiên c
ă ă
Gluconacetobacter M1 M2

ạo mà

rê mô rường lên men .. 26

Biocellulose
n ch n. ................................................... 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 33
TÀI LI U THAM KHẢO ............................................................................... 34
PHỤ LỤC


DANH MỤC VIẾT TẮT

MTPL

:M

ng phân l p

MT1

:M

ng gi gi ng

MT2

:M

ng nhân gi ng

MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, MT8, MT9

:M

ng lên men

PTN

: Phòng thí nghi m


DANH MỤC BẢNG

B ng 1.1

m sinh hóa c a vi khu n Gluconacetobacter theo
Frateur .............................................................................................. 5

B ng 3.1

m c a các ch ng phân l p ................................................... 22

B ng 3.2

m, th i gian hình thành màng trong các thí nghi m l p ..... 29


DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Vi khu n Gluconacetobacter ............................................................. 5
Hình 1.2

ng chuy n hóa cacbon c a vi khu n Gluconacetobacter ..... 8

Hình 3.1 Lên men t nhiên ............................................................................. 21
Hình 3.2 Vòng phân gi i c a vi khu n CaCO3 Gluconacetobacter ................ 24
Hình 3.3 Ch ng có ho

......................................... 26

Hình 3.4 Lên men t o màng ............................................................................ 26
Hình 3.5 Kết qu hình thành màng c a ch ng M1 ......................................... 27
Hình 3.6 Kết qu hình thành màng c a ch ng M2 ......................................... 27
Hình 3.7 Kết qu hình thành màng c a ch ng M3 ......................................... 27
Hình 3.8 Kết qu hình thành màng c a ch ng M4 ......................................... 27
Hình 3.9 Thí nghi m lên men t o màng ở
ng: MT3, MT4,
MT5, MT6, MT7, MT8, MT9 ........................................................ 28
Hình 3.10 Lên men t o màng theo quy mô PTN ........................................... 32

3.1 Quy trình phân l p vi khu n Gluconacetobacter trên môi

ng d
t ..................................................................... 20
Bi

3.1 Th i gian hình thành, thu màng Biocellulose ............................. 30

Biocellulose

ng d

t. ................................................ 30


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
ế
không g

ế

40
ở

ở

ế
ế

ế

Các nhà khoa h c luôn
nghiê
ĩ
ế
ế
M t trong nh ng ngu n
nguyên li
c quan tâm g
n hay
Biocellulose. Hi n nay màng Biocellulose
c xem là ngu n nguyên li u
m i có ti
ă
c ng d ng trong r t nhi ĩ
c khác nhau nh
nghi p th c ph m, công ngh gi y, công ngh s n xu t pin
ĩ... c bi
ĩ
c y h c, màng Biocellulose
cm ts
c
trên thế gi i nghiên c u ng d ng làm màng tr b ng, m t n
ng da, m ch
máu nhân t o [1].
Trên thế gi i vi c nghiên c u Gluconacetobacter và quá trình sinh t ng
h p Biocellulose
ng d ng c a Biocellulose b
u t r t s m.
Nh ng nghiên c
u tiên là c a Brown A.J và c ng s (1886). Tr

1 thế kỷ
ến nay Gluconacetobacter và màng Biocellulose v n
c s chú ý c a r t nhi u nhà khoa h c trên thế gi i.
Ở Vi t Nam, nghiên c u v Gluconacetobacter, màng Biocellulose và
ng d ng c a nó còn là v
khá m i m . Các nghiên c u và công b v
v
này còn r t khiêm t n, m i d ng ở nghiên c u quá trình t o màng
Biocellulose ng d ng trong s n xu t th ch d a, làm giá th g n kết tế bào vi
khu n và làm màng tr b ng
Trong nh
ă
m Vi sinh khoa Sinh KTNN, Tr
ih
m Hà N i 2 phân l p, tuy n ch
c ch ng
Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) có kh ă
o màng Biocellulose v i
ă
t và ch
ng t t trên các ngu n nguyên li
: ch t o,
c

1


ă
còn h n chế.

d
c vo g o. Tuy nhiên, các
Biocellulose trên ngu n
l a ch
tài: “
mà
Bo e
L.1753)”.

o e rê

mô

rường dị

dưa

, tôi
ạo

ột (Cucumis sativus

2. Mục đích nghiên cứu
ến hai
o màng Biocellulose

ă

Gluconacetobacter
t.

c nhóm
ng d ch

3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân l
B o e o e rê mô rường dị
3.2.
rườ dị dưa
3.3.

o a e o a er
dưa
ột.

ạo màng

ạo mà

Biocellulose trên mô

ộ

ê
à x
o a e o a er ã

d

r

ạo mà

Biocellulose

a

n ch n.

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
ư ng nghiên c u
ă
ng d

o màng Biocellulose phân l

c

t.

4.2. Phạm vi nghiên c u
Kh ă
t.

o màng Biocellulose phân l

ng d ch

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
Ý

ĩa

oa

c

ở khoa h :
ế c a quá trình lên men , chuy n hóa t
thành axit acetic nh vai trò c a vi khu n. Nghiên c
Gluconacetobacter
ă
Biocellulose

2

u


. Kết qu nghiên c u là d li u góp ph n b sung
cho các nghiên c u và ng d ng c a ch ng vi khu n G. xylinus
i
s ng.
5

Ý

ĩa

c tiễn

ă

Biocellulose tr
ĩ

:

6. Điểm mới của đề tài
p
Biocellulose dai, dày, nhẵn, có hình d ng nh
nh, th i gian hình thành
màng t ngày th 4, thu màng sau 7
chu t b sung glucose: 20(g), pepton: 5(g), (NH4)2SO4: 3(g), MgSO4. 7H2O:
2(g),KH2PO4: 2(g), pH 5 – 6.
ng d
≥ 60%
s m, gi
c tính dày, dai, nhẵn, có hình d ng nh
nh, th i gian
hình thành màng t ngày th 4, thu màng sau 7 ngày lên men. T
xây
d ng quy trình lên men t o màng Biocellulose c a hai ch
n ch n
ng d
t.

3


NỘI DUNG

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI IỆU
1.1. V trí phân loại và đ c điể

h nh th i của Gluconacetobacter

1.1.1. Vị trí phân loại c a Gluconacetobacter trong sinh giới
Trên thế gi i, có r t nhi u công trình tiến hành phân lo i vi khu n
acetic
: Rothenback 1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911,
Heneberg 1926, Fraterur 1950... Thu t ng
Gluconacetobacter”
c dùng
u tiên cho c
phân lo i gi ng ph trong gi ng Acetobacter.
Theo h th ng phân lo i c a nhà khoa h c Bergey: Gluconacetobacter
thu c h vi khu n Acetobacteraceae. H này g m 6 chi: Acetobacteria,
Acidomonas, Asaia, Gluconocetobacter, Gluconacetobacter và Kozakia [8].
Gluconacetobacter thu c chi Acetobacter, h Pseudomonasdaceae, b
Pseudomonasdales, l p Schizomycetes. Chúng thu c nhóm vi khu n axetic,
mỗi tế bào Gluconacetobacter có kh ă
n hóa 108 phân t glucose
thành cellulose trong 1 gi , là loài vi khu n t
c nhi u Biocellulose nh t
trong t nhiên.
Ngày nay, vi c phân lo i Gluconacetobacter còn t n t i nhi u quan
m, gây nhi u tranh cãi. Vì v y c n nhi
c công trình nghiên c u
tiếp theo v loài vi khu n này.
. . .

m

a

o a e o a er

Gluconacetobacter là vi khu n Gram âm d ng hình que, thẳng ho
ng ho
ng, chúng không sinh bào t . Khi nhu m
Gram có th
m do tế
u ki
ng thay
i. Gluconacetobacter có th
ng riêng ho c xếp thành chuỗi (hình 1.1).
Khi nuôi c
ng thiế
c y lâu chúng d sinh ra nh ng tế
c bi t (tế bào có th
phình to ho
i có d ng phân nhánh). Tế bào tìm th y nhi u
trong d ch hoa qu , gi m, d
… [1]

4


Hình 1.1 Vi khuẩn Gluconacetobacter
1.2. Đ c điể

sinh í - sinh h a của Gluconacetobacter

Gluconacetobacter
ởng t t ở
u ki n nhi
pH: 4-6. Vi khu n Gluconacetobacter
ởng, phát tri n
pH th p
ng b sung thêm axit ace
nh m h n chế s nhi m khu n l t
ng ngoài.

250C - 350C,
u ki n
ng nuôi c y

ă
m sinh hóa
: oxy hóa ethanol thành axit
acetic, CO2, H2O, ph n ng catalase
m
ở
ng
Hoyer, kh ă
n hóa glucose thành axit và chuy n hóa glycerol thành
dihydroxyaceton, không sinh s c t nâu và s t ng h p cellulose
nh danh
Gluconacetobacter (b ng 1.1).
Bảng 1.1 Đ c điểm sinh hóa của vi khuẩn Gluconacetobacter
theo Frateur (1950)

ST
T

Đ c điểm

Hiện tƣợng

Kết
quả

1

Chuy
ng ch a
Oxy hoá ethanol thành
Bromphenol Blue 0,04% t màu xanh
axit acetic
sang màu vàng

+

2

Ho t tính catalase

+

3

4

Hi

ng s i b t khí

ởng trên môi
Sinh kh i không phát tri n
ng Hoyer
Chuy n hoá glycerol T o kết t
thành dihydroxyaceton men

5

g ch trong d ch sau lên

_

+


5

Vòng sáng xu t hi n xung quanh
Chuy n hoá glucose
khu n l
ng ch a
thành xit
CaCO3

6

Ki m tra kh
sinh s c t nâu

7

Ki m tra kh
ă
t ng h p cellulose

ă

+

Không hình thành s c t nâu

_

Váng vi khu n xu t hi n màu lam

+

1.3. Biocellulose
. . .

r

mà

Biocellulose

Màng sinh h c (Bacterial cellulose; Biocellulose;
)
c t o ra do
vi khu n Gluconacetobacter, có c
ng nh t v i cellulose
c a th c v t. Tuy nhiên, Biocellulose
i cellulose c a th c v t
v
b n, d o, ch c [8] do c u trúc không ch a các h p ch t cao
phân t : peptin, ligin,
…
Biocellulose
ng kính b
1/100
ng kính c a cellulose th c
v t. Biocellulose c u t o bởi chuỗi β – 1,4 glucopynanose. Các chuỗi này hình
thành liên kết v i nhau t o thành s nh (subfibril)
c 1,5nm.
Subfibril kết tinh t o thành s i l
(s
ĩ
- microfibril) [13]. Các s i
ĩ
ết h p v i nhau t o thành bó và cu i cùng t o thành d i ribbon có
chi u dài kho ng 1-9nm [16] . Nh ng d i ribbon c a tế bào này liên kết v i
các d i ribbon c a tế bào khác b ng liên kết Van Der Waals t o thành c u trúc
m
i (l p màng m ng) trên b m
ng nuôi c y.

. . .

ộ

a mà

Biocellulose

Brown A.J (1886), nghiên c u l p màng do vi khu n
Gluconacetobacter t o ra. Kết lu n màng có b n ch t là Hemicellulose.
Hemicellulose là nh
c, tan trong dung
d ch ki m tính [9].

6


M t s tính ch t:
c: Biocellulose có kh
x

ă

c cao (99%), có tính

m cao.
b
ng th p,

có kh

1. . .

c: Biocellulose
nh v
c.

b n tinh th cao, s

tinh s ch: Biocellulose
tinh s ch t
ă
y sinh h c và tái chế, ph c h i.
r

ă

n, tr ng

ẳn so v i cellulose,
o a e o a er

Biocellulose
ng nuôi c

các ch
ng, vi khu n
i ch t b ng cách h p th ch t

Gluconacetobacter th
ng t

.

(1962)
i thích quá trình hình thành cellulose: Các tế bào
G.xylinus s ng ở
ng l ng th c hi
i ch t b ng cách
h p th
ng glucose. Chúng kết h
ng v
t o thành ti n
ch t n m ở màng tế bào. Ti n ch t
c tiết ra ngoài nh h th ng lỗ n m ở
trên màng tế bào cùng v i m
z
polymer hóa glucose thành
cellulose.
Quá trình sinh t ng h p Biocellulose g m nhi
u hòa
chuyên bi t, chính xác nh h th ng ch a nhi u enzyme, ph c h p xúc tác và
u hòa (hình1.2).

7


Hình 1.2 Con đƣờng chuyển h a cacbon của vi khuẩn Gluconacetobacter
. . .

a e

oe

ớ

o a e o a er

Màng Biocellulose n m trên b m
ng nuôi c y có tác d ng
b o v các tế bào vi khu n Gluconacetobacter kh i các nhân t có h i c a
ng. Các nghiên c u nh
nh cellulose bao quanh tế bào vi khu
b o v chúng kh i tia c c tím. Khi x lí tia c c tím trong 1 gi , 23% s tế bào
Gluconacetobacter
c bao b c Biocellulose s ng sót, tách Biocellulose
kh i tế bào kh ă
ng sót gi m còn 3% s tế bào [14].
Biocellulose là giá th ch
ng t
ng d dàng.
1. . .

d

cho các tế bào vi khu n, giúp l y ch t

a Biocellulose

Biocellulose là ngu n nguyên li u m i có ti
ă

c ng d ng
trong r t nhi
ĩ
p th c ph m, công ngh
gi y, công ngh s n xu
ĩ
c bi
ĩ
cy
h
cm ts
c trên thế gi i nghiên c u ng
d ng làm màng tr b ng, m t n
ng da, m ch máu nhân t o…
Trong ngành m ph m, màng Biocellulose
c s d ng làm m t n
ng da vi sinh Biocellulose mask. Biocellulose mask
c s n xu t t
ngu n nguyên li
cd
c b sung các ho t ch
ng da. Khác
v i các m t n hóa ch t tác d ng nhanh chóng, có h i cho da nếu dùng lâu dài

8


thì m t n vi sinh có tác d ng
[19].

ng tr ng da, c p m cho da t nhiên, an toàn

1.4. Tổng quan về dƣa chuột (Cucumis sativus)
1.4.1. Vị trí phân loại
(

)
n g c t Nam Châu Á: Nh t B n, Trung
Qu c,…
c tr ng ở r t nhi
t Nam.
chu t có
: Cucumis sativus, thu c h b u bí: Cucurbitaceae, b
Cucurbitales, ngành Ng c Lan (Magnoliophyta) [18].
1.4.2. Thành phầ d

dưỡng

100

t ch 95
ng 1,2g, 0,8g protit, 3g
07
m 0,6g, ch t béo 0,1g, có nhi u vitamin và mu i
khoáng : caroten , vitamin B1, vitamin B2, vitamin PP , can xi , photpho , s t,
kali vitamin B, C, ti
… [18].
1.4.3.

ng d ng

t là lo

nhi u b

ă

s c kh e. Trong qu
xúc tiế

ă
ng
c s d ng ph biến trong
c chế biến thành các món:
t mu i, kim
t chua ng t, n
t xào r t t t cho
a các enzym có ho t tính sinh h c cao
i ch
.

t ch a r t nhi
ng, ch
t
c n thiết: Canxi, ph t pho, s t, mangan, i t, kali, ch t nh y, các vitamin A,
1 2
t ch
ng
biotin và có hàm
ng vitamin C và Selenium cao là ch t b
ng cho da,

c s d ng nhi
ĩ
ẹp.
1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay
1.5.1. Trên thế giới
Trên thế gi i vi c nghiên c u Gluconacetobacter và quá trình sinh t ng
h p Biocellulose
ng d ng c a Biocellulose b
u t r t s m.

9


Nh ng nghiên c
1 thế kỷ

u tiên là c a Brown A.J và c ng s (1886). Tr
ến nay Gluconacetobacter và màng Biocellulose v n
c s chú ý c a r t nhi u nhà khoa h c trên thế gi i.

Tác gi Brown, 1999 cùng c ng s dùng màng Biocellulose làm môi
ng phân tách trong x
c, s d ng màng biế
nh t làm s i
truy
t sinh h c, th c ph m thay thế [9].
Ngoài ra Biocellulose dùng làm v i, s n xu t gi y ch
ng cao [12],
[13]. Trong y h c, cellulose kết h p v i chitosan t o thành v t li u composite
c s d ng thay thế da. Da thay thế

u tr b ng, làm m ch
…Màng Biocellulose
c s d ng trong ngành m ph
c ph m
làm m t n
ng da cho ph n . Czaia và c ng s (2006) s d ng màng
Biocellulose p lên các vế
ở, vết b ng, làm da nhân t o, m t n
u thu kết qu t t [10], [13].
Nh

ă

inh t ng h p cellulose t vi khu n trở
c nhi u nhà khoa h c quan tâm. Alexander Steinbuchel,
Sang Ki Rhee (2005) nghiên c u v
ng hình thành cellulose t vi
khu n, c u trúc s i cellulose, m i quan h gi a kh ă
và kh ă
u c a Czafa, Youn …v c u trúc
màng Biocellulose s d ng làm nanocomposit, kết qu có s
ng gi a
c u trúc màng Biocellulose v i collagen [13]. ă 2007 nghiên c u c a
Neelobon và c ng s v
ởng c
u ki n nuôi c
ến kh ă
thành màng. Nghiên c
c tính v t lí c a màng, c u trúc s i cellulose ng
d ng trong công nghi p gi y [10]. Nghiên c

c tính c u trúc màng
Biocellulose ng d ng làm da nhân t o c a Wojciech K [15].
1.5.2. Ở Việt Nam
Các công trình nghiên c u v Gluconacetobacter ở Vi t Nam còn m i,
d ng l i ở quá trình t
c tính, c u trúc c a màng Biocellulose.
Ứng d ng màng trong ngành th c ph m: s n xu t th ch d
ĩ
cy
h c: chế t o màng tr b ng. Các nghiên c u v
ng t
trình t o màng, s hình thành màng và ng d ng còn h n chế ă 1995 2000 công trình nghiên c u v vi khu n Gluconacetobacter và kh ă

10


axit axetic c a nhóm tác gi
Kim Nhung và c ng s [1] ă 2000
nhóm tác gi
Kim Nhung và c ng s nghiên c u
ởng c a
u ki n lên men cho vi khu n G.xylinus và ng d ng s n
xu t th ch d
ă 2003
u ch n l c dòng G.xylinus thích h p cho
ng dùng trong s n xu t cellulose c a Nguy
ng, Ph m
Thành H
ă 2008
Kim Nhung và c ng s

u, tuy n
ch
c ch ng vi khu n G.xylinus NH1 và kh o sát kh ă
o màng c a
ch ng này. Nhóm tác gi
ng khác nhau, nguyên
li
:
u, hoa qu
ng lên men [7].
Các ng d ng c a màng Biocellulose d
c quan tâm. ă 2006
nhóm tác gi c a Nguy
ă
ih
c h c Tp. HCM
ế t o màng tr b ng sinh h c d
m t.
Nhóm tác gi
Kim Nhung và c ng s (2010) nghiên c u thu nh n
màng cellulose t vi khu n Gluconacetobacter ng d ng tr b ng [2]. Màng
tr b ng sinh h c Biocellulose, cho kết qu t t do không ch
c t tr c
tiếp, không gây d ng, không lây lan, di t khu n gây nhi m trùng,
y
tái t o mô h t [4].

11

Chƣơng 2. ĐỐI TƢ NG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
. . .
ă
Biocellulose phân l

c

ng d

o màng

t.

2.1.2. Hóa ch t và thiết bị
Các d ng c trong phòng thí nghi m Vi Sinh thu c khoa Sinh – KTNN,
ih
m Hà N i 2.
2.1.2.1. Thiết bị nghiên c u
-T

(

m, t s

c)

- N i h p Tommy (Nh t)
- Box vô trùng (Haraeus)
ĩ)

- Cân (Precisa XT 320M - Th

- Máy l c Orbital Shakergallenkump (Anh)
- Máy li tâm Sorvall (M )
- Micropipet Jinson (Pháp) các lo i t 0.5μl – 10ml
- Kính hi n vi quang h

Z

(

c)

- T l nh
-M
-M

2

(

-Anh)

- H p l ng, ng nghi
nhi u d ng c hóa sinh thông d ng khác.

n và

2.1.2.2. Hóa ch t

-

- Ngu n cacbon: Glucose, fluctose, maltose, acid lactic...

12

2


- Ngu n nito: N m men, pepton, (NH4)2SO4, dd NH3..
- Ngu n mu i khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4...
- Thu c nhu
phenolphtalein, …

:

- H2SO4, CaCO3, th ch Agar…
2.1.3. Các loạ mô rườ
ô rườ
2

(MTPL)

: 500 ml

Glucose: 10(g)

(NH4)2SO4: 1,5(g)

Pepton: 2,5(g)

MgSO4.7H2O: 1(g)

: 10(g)

KH2PO4: 1(g)

CaCO3: 1(g)

pH: 5,5 - 6
ô rườ
2

(MT1)

: 500 ml

Glucose: 10(g)

(NH4)2SO4: 1,5(g)

Pepton: 2,5(g)

MgSO4.7H2O: 1(g)

: 10(g)

KH2PO4: 1(g)
pH: 5,5 - 6
2.1.3.3

ô rườ
: 500 ml

(MT2)
Glucose: 10(g)

(NH4)2SO4: 1,5(g)

Pepton: 2,5(g)

MgSO4.7H2O: 1(g)

Axit acetic: 2%

KH2PO4: 1(g)
pH: 5,5 - 6

13


ô rườ

ê me (MT3)

: 1000 ml

Glucose: 20(g)

(NH4)2SO4: 3(g)

Pepton: 5(g)

MgSO4.7H2O: 2(g)

G

: 10-20%

KH2PO4: 2(g)
pH: 5,5 - 6
2.1.3.5.

ô rường lên men (MT4)
: 800

Glucose: 20(g)
2

Pepton: 5(g)

N

(NH4)2SO4: 3(g)

G

MgSO4.7H2O: 2(g)

pH 5,5 - 6

: 200

: 10-20%

KH2PO4: 2(g)
2.1.3.6.

ô rường lên men (MT5)
: 600

Glucose: 20(g)

D

Pepton: 5(g)

N

2

(NH4)2SO4: 3(g)

G

: 10-20%

MgSO4.7H2O: 2(g)

pH: 5,5 - 6

: 400

KH2PO4: 2(g)
2.1.3.7.

ô rường lên men (MT6)
: 500

Glucose: 20(g)

D

Pepton: 5(g)

N

2

(NH4)2SO4: 3(g)

G

: 10-20%

MgSO4.7H2O: 2(g)

pH 5,5 - 6

KH2PO4: 2(g)

14

: 500


2.1.3.8.

ô rường lên men (MT7)
: 400

Glucose: 20(g)

D

Pepton: 5(g)

N

2

(NH4)2SO4: 3(g)

G

: 10-20%

MgSO4.7H2O: 2(g)

pH 5,5 - 6

: 600

KH2PO4: 2(g)
2.1.3.9.

ô rường lên men (MT8)
: 200

Glucose: 20(g)

D

Pepton: 5(g)

N

2

(NH4)2SO4: 3(g)

G

: 10-20%

MgSO4.7H2O: 2(g)

pH 5,5 - 6

: 800

KH2PO4: 2(g)
2.1.3.10.

ô rường lên men (MT9)

Glucose: 20(g)

N

2

: 1000

pepton: 5(g)

G

: 10-20%

(NH4)2SO4: 3(g)

pH 5,5 - 6

MgSO4.7H2O: 2(g)
KH2PO4: 2(g)

2.2. Phƣơng ph p nghiên cứu
2.2. .

ươ

2.2.1.1. Phân l p tuy n ch n ch ng Gluconacetobacter theo
truyền th
( ươ
V o rad
à Be jer
)

ươ

ng d
t, lên men men t nhiên t 12-15 ngày
ến khi xu t hi n m t l p màng m ng, màu tr ng n i trên b m t. T các
ỷ tinh vô trùng v t màng, l y m
ng nh

15


màng, r a qua b
c c t vô trùng, cho màng vào ng nghi
thu m u ch a ch ng vi sinh v t g c.
Chu n b các ng nghi
c thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Cho
vào 9 ng nghi
9
cc t2l
t trong b c c y vô trùng, chiế
tím 15 phút.

Tiến hành pha loãng d ch ch a các ch ng vi sinh v t g c có n
t
-9
10 ến 10 . Dùng pipet hút 1ml dung d ch ch a các ch ng vi khu n g c cho
vào ng nghi
1
3
c ng nghi m ch a d ch pha
loãng 10-1. Tiếp t c l y 1ml dung d ch t ng nghi m 1 cho vào ng nghi m
2
3
c ng nghi m ch a d ch pha loãng 10-2. Pha
loãng dung d
ến 10-9 thì d ng l i. D a vào s
ng vi sinh v t có trong
-5
m u, tôi l y các ng nghi
pha loãng t 10 ến 10-8 tiến hành các
thí nghi m tiếp theo.
-1

ĩ :
ng th
ĩ
ch p
kh
vào các h p l
t trong b c c y vô trùng, chiế
15
phút. Dùng pipet nh 10μ

a d ch pha loãng 10-5 vào h p l ng ch a môi
ng th ch.
u d ch pha loãng lên b m t th
c
0
n p h p l ng, bao gói c n th n, nuôi trong t m 30 C.
i v i các
-6
-8
pha loãng t 10 ến 10 . Sau 2 - 4 ngày l y ra quan sát khu n l c (màu
s c,
c,vi
)
Phân l

ng th

Chu n b các ng th ch nghiêng ch
ng th ch ( lo i b
CaCO3), kh trùng ở 1210C trong 15 phút. C y riêng rẽ các khu n l c vào các
ng th ch nghiêng trên, nuôi trong t m 300C. Sau 2 ngày l y ra quan sát và
làm tiêu b n tế bào, nhu
m Gram [5].
2.2

ươ

Dùng que c
vết bôi trên lam kính, c
Gram [5].

ê

m hình thái tế bào

trùng, l y khu n l c ra t
nh vết bôi, nhu m tế

ng th ch nghiêng làm
nhu m

Quan sát trên v t kính 10 - 40
t tiêu b
i v t kính d u có
i 1000 l n. Kết qu , vi khu n b t màu h ng c a thu c nhu m là
Gram âm, chính là Gluconacetobacter.
16