Tuyển chọn, nghiên cứu các chủng vi khuẩn lactobacillus có khả năng sinh gamma - aminobutyric acid (gaba) và một số đặc tính probiotic ứng dụng trong sản xuất các thực phẩm chức năng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Thị Anh Đào

TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG VI KHUẨN
LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH GAMMAAMINOBUTYRIC ACID(GABA) VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
PROBIOTIC ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
CÁC THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chuyên ngành: Động vật học (Vi sinh vật học)
Mã số: 8 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. DƯƠNG VĂN HỢP
Hà Nội – 2018


LỜI CẢM ƠN

Để hồn thành khóa học thạc sĩ của mình, tơi vơ cùng biết ơn các thầy
cơ giáo trong Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật- Viện Hàn lâm Khoa học
và Cơng nghệ Việt Nam đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu và tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình học tập.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo
PGS.TS.Dương Văn Hợp, người đã tận tình hướng dẫn và đóng góp nhiều
kinh nghiệm q báu cho tơi trong suốt q trình nghiên cứu đề tài và hồn
thành luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại Viện Vi sinh vật và

Công nghệ sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong
suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên,
khuyến khích tơi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 27 tháng 10 năm 2018

Nguyễn Thị Anh Đào


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, luâ ̣n văn này là kế t quả nghiên cứu và làm viê ̣c của
tơi, các nội dung nghiên cứu kế t quả trình bày trong luận văn là trung thực, rõ
ràng. Nếu có bất kỳ vấn đề gì xảy ra, tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Hà Nội, ngày 27 tháng 10 năm 2018
Tác giả luâ ̣n văn

Nguyễn Thị Anh Đào


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
LÕÌI CAM ÐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH ẢNH

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU ......................................................................................................... ..1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN….. ....................................................................... 2
1.1. Probiotic ………………………………………………….. ...................... 2
1.1.1.Định nghĩa…………………………………………………………….. . 2
1.1.2. Vai trò của probiotic...............................................................................2
1.2. Vi khuẩn lactictrong sản xuất probiotic………………… ......................... 7
1.2.1. Một số đối tượng vi sinh vật phổ biến trong sản xuất probiotic….... . 7
1.2.2.Vi khuẩn lactictrong sản xuất probiotic ................................................... 8
1.3. Tổng quan về Gamma - Aminobutyric Acid…………………………. . 10
1.3.1. Giới thiệu…………………………………………………………….. 10
1.3.2. Hình dạng và cấu trúc của GABA…………………………………… 10
1.3.3. Thụ thể GABA………………………………………………………..11
1.3.3.1.Thụ thể GABAA…………………………………………………… .. 12
1.3.3.2.Thụ thể GABAB……………………………………………………...13
1.3.4. Quá trình tổng hợp GABA trong não…………………………………14
1.3.5. Cơ chế hoạt động của GABA…………………………………………15
1.3.6. Chức năng của GABA………………………………………………...15
1.3.7. Các nguồn sinh tổng hợp GABA……………………………………...17
1.3.8. Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn…………………………………….18
1.3.9. Tình hình nghiên cứu về GABA…………………………………… ... 19


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……..23
2.1. Nguyên liệu…………………………………………………………......23
2.2. Hóa chất và thiết bị…………………………………………………......23
2.2.1. Hóa chất……………………………………………………………… 23
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ…………...………………………………………23
2.3. Các loại môi trường nghiên cứu……………………………………...... 24

2.4. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………. 26
2.4.1. Phương pháp định tính GABA bằng sắc ký bản mỏng (TLC)……………... 26
2.4.2. Phương pháp định lượng GABA………………………………………….. . 27

2.4.3.Phương pháp phân loại………………………………………………. . 29
2.4.3.1.Phân loại dựa trên phân tích trình tự rDNA……………………........ 29
2.4.3.2. Phân loại bằng phương pháp quan sát hình thái…………………… 32
2.4.4. Xác định các đặc tính probiotics của các chủng vi khuẩn lựa chọn… . 33
2.4.4.1. Phương pháp xác định khả năng chịu axit…………………………. 33
2.4.4.2.Phương pháp xác định khả năng chịu muối mật………………….... . 34
2.4.4.3. Phương pháp xác định khả năng sống trong môi trườngdịch dạ dày và
dịch ruột giả lập…………………………………………….. ........................ 34
2.4.4.4. Phương pháp xác định khả năng bám dínhinvitro ...………………35
2.4.4.5. Phương pháp xác định khả năng kháng kháng sinh .......................... 36
2.4.4.6. Kiểm tra khả năng ức chế một số chủng vi sinh vật gây bệnh …….. 36
2.4.4.7. Phương pháp xác định khả năng sinh axit lactic…………………. .. 37
2.4.5. Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho q trình tạo GABAvà
sinh khối cao của các chủng vi khuẩn lựa chọn…………………………...... 37
2.4.5.1. Lựa cho ̣n môi trường……………………………………………... .. 38
2.4.5.2. Lựa cho ̣n nhiê ̣t đô ̣ nuôi cấ y thích hơ ̣p……………………………. .. 38
2.4.5.3. Lựa cho ̣n pH môi trường nuôi cấ y thích hơ ̣p……………………..... 38


CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………….... 40
3.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA……………….... 40
3.2. Phân loại……………………………………………………………… .. 42
3.2.1. Phân loại dựa trên phân tích trình tự rDNA .........................................42
3.2.2. Hình thái của các chủng Lactobacillus nghiên cứu…………………...43
3.2.2.1. Chủng VTCC-B-421……………………………………………...... 43
3.2.2.2. Chủng VTCC-B-426……………………………………………...... 44

3.2.2.3. Chủng VTCC-B-431……………………………………………...... 45
3.2.2.4. Chủng VTCC-B-1450……………………………………………. ... 45
3.3. Xác định các đặc tính probiotics của các chủng vi khuẩn lactic………..46
3.3.1. Kết quả xác định khả năng chịu axit………………………………….47
3.3.2. Kết quả xác định khả năng chịu muối mật……………………………48
3.3.3. Khả năng sống sót trong dịch dạ dày và dịch ruột giả
lập……………………………………………………………………………49
3.3.4. Khả năng bám dính trên màng nhầy ruộtinvitro..................................51
3.3.5. Kết quả xác định khả năng kháng kháng sinh………………………...52
3.3.6. Kết quả kiểm tra khả năng ức chế một số chủng vi sinh vật gây bệnh . 54
3.3.7. Khả năng sinh axit lactic của 4 chủng vi khuẩn……………………… 55
3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho quá trình tạo
GABA và sinh khối cao của các chủng vi khuẩn lựa chọn……………….... 57
3.4.1.Kết quả lựa cho ̣n môi trường ………………………………………….57
3.4.2. Kết quả lựa cho ̣n nhiêṭ đô ̣ nuôi cấ y thích hơ ̣p…………………….......60
3.4.3. Kết quả lựa cho ̣n pH nuôi cấ y thích hơ ̣p………………………….......61
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………65

KẾT LUẬN…………………………………………………………………65
KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT…………………………………....................... 66


TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………............... ....................... 67

Tài liệu tiếng Việt………………………………………………………....... 67
Tài liệu tiếng Anh………………………………………………….……….. 68
PHỤ LỤC
CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃCƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Vi sinh vật phổ biến trong sản xuất probiotic………… ………..8
Bảng 1.2: Vai trò và chức năng sinh lý của GABA ………………………..16
Bảng 2: Mật độ quang phổ (OD 570nm) ở các nồng độ GABA khác nhau....29
Bảng 3.1.Kết quả sàng lọc khả năng sinh GABA của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus..................................................................................................40
Bảng 3.2: Khả năng sống sót trong dịch dạ dày và dịch ruột giả lập của 4
chủng vi khuẩn....................................................................................... ......... 50
Bảng 3.3: Khả năng bám dính trên màng nhầy ruột in vitrocủa 4 chủng vi
khuẩn................................................................................ ............................... 52
Bảng 3.4:Khả năng kháng kháng sinh của 4 chủng vi khuẩn ........................53
Bảng 3.5:Khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh của 4 chủng vi khuẩn.
......................................................................................................................... 54
Bảng 3.6 : Khả năng sinh axit lactic của 4 chủng vi khuẩn ............................55
Bảng 3.7: Khả năng sinh GABA và sinh trưởng của 4 chủng vi khuẩn trong 4
loại môi trường…………………………………………………… ............... 58
Bảng 3.8: khả năng sinh GABA và sinh trưởng của 4 chủng vi khuẩn khi nuôi
cấy ở các nhiệt độ khác nhau…………………………… .............................. 60
Bảng 3.9: Khả năng sinh GABA và sinh trưởng của 4 chủng vi khuẩnkhi nuôi
cấy ở các nhiệt độ khác nhau……………………………………… .............. 62


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Minh họa cơ chế tác động của probiotic………………………… . ..3
Hình 1.2: Hình ảnh bám dính của nấm men lên bề mặt của E.coli...................6
Hình 1.3: Cấutrúcphântử GABA………………………………………… .... 11
Hình 1.4: Mơhìnhcấutrúcthụthể GABAA………………………………....... 13
Hình 1.5:Mơ hình cấu trúc của thụ thể GABAB………………………….. . 13

Hình 1.6: Con đường tổng hợp GABA……………………………………. .. 14
Hình 3.1: Khả năng sinh GABA của các chủng vi khuẩn lactic…………..... 41
Hình 3.2: Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu với các lồicó mối quan
hệ họ hàng gần………………………………………………. ....................... 43
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-421…..44
Hình 3.4: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủng VTCC-B-26….. 44
Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-31…...45
Hình 3.6:Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-450….46
Hình 3.7: Khả năng chịu axit của 4 chủng vi khuẩn………………………. .. 48
Hình 3.8: Khả năng chịu muối mật của 4 chủng vi khuẩn………………… . 49
Hình 3.9: Khả năng chịu kháng sinh của chủng VTCC-B-421(A) và chủng
VTCC-B-431(B)………………………………... .......................................... 53
Hình 3.10: Khả năng ức chế Bacillus cereus (A) và Salmonella enterica (B)
của 4 chủng vi khuẩn……………………………… ...................................... 55
Hình 3.11: Con đường chuyển hóa glutamate thành ABA………………… . 64


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribo nucleic Acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

GABA

Gamma - aminobutyric acid

GAD

Glutamic acid decarboxylase

GRAS

Generally Recognized as Safe

HPLC

High performance liquid chromatography

LAB

Lactic acid bacteria

MSG

Monosodium glutamate

MRS

De Man, RoGoSa and Sharbe (Medium for LAB)

NA

Nutrient agar

NB

Nutrient broth

PBS

Phosphate-buffered saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

rDNA

Ribosomal Deoxyribonucleic acid

TLC

Thin layer chromatography

WHO

World Health Organization

OD

Optical Density



LỜI MỞ ĐẦU

Vi khuẩn lactic được coi là an toàn, từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực sản xuất và bảo quản thực phẩm đặc biệt trong sản xuất các sản
phẩm lên men truyền thống như lên men sữa, thịt, rau quả. Hiện nay, các hướng
nghiên cứu về vi khuẩn lactic ứng dụng cho sản xuất các loại sản phẩm chức năng
chứa các hợp chất có lợi cho sức khỏe đã và đang được quan tâm rộng rãi trên thế
giới. Đặc biệt một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng probiotic và sinh tổng

hợp gamma-amino butyric acid được nhiều nhà khoa học quan tâm. Gammaamino butyric acid (GABA) là một acid amin có chức năng quan trọng trong
hệ thống thần kinh. Do vậy các sản phẩm có chứa GABA có tác dụng bổ não và
bổ thần kinh, cải thiện giấc ngủ, điều chỉnh huyết áp, giảm mệt mỏi, tăng cường thể
trạng.

Trong nghiên cứu ứng dụng probiotic, điều quan trọng là phải sử dụng
các chủng vi sinh vật an tồn và mang những đặc tính probiotic quan trọng
vừa có tác dụng ức chế vi sinh vật có hại, vừa cung cấp các thành phần
vitamin, enzyme và các chất có hoạt tính sinh học q cho vật chủ như
bacteriocin, vitamin B12, gamma-aminobutyric acid, v.v...
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài:
“Tuyển chọn, nghiên cứu các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh
Gamma-aminobutyric acid (GABA) và một số đặc tính probiotic ứng dụng
trong sản xuất các sản phẩm chức năng” với mục tiêu:
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh tổng hợp
gamma-aminobutyric acid.
- Nghiên cứu một số đặc tính probiotic quan trọng của các chủng lựa chọn.
- Nghiên cứu khả năng sinh gamma-aminobutyric acid của các chủng lựa chọn.

1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Probiotic
1.1.1. Định nghĩa
Probiotic: theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”.
Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974
để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật đường
ruột” [21].
Từ đó đến nay, thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ
những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật
thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật
chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa
thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy
đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học:
(i) theo Fuller 1989[21], probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức
ăn giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi
cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi
sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ
đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” [20].
Prebiotic và synbiotic: nhằm giúp tăng hiệu quả của probiotic với vật
chủ, probiotic thường được bổ sung cùng chất mang. Prebiotic là các thành
phần hydratcacbon có tác dụng làm tăng sự phát triển của hệ vi sinh vật
đường ruột. Thường là các loại olygosaccharides như: fructooligosaccharides
(FOS), Xylooligosaccharide (XOS) và galactooligosaccharides (GOS).
Synbiotic hoặc Co-Biotic là sự kết hợp chung của probiotic và prebiotic.
1.1.2. Vai trị của probiotic
Việc duy trì ổn định hệ vi khuẩn đường ruột có vai trị quan trọng trong
bảo vệ sức khỏe, phòng ngừa bệnh tật. Vai trò chính của probiotic là giúp cho
2

hệ vi sinh vật đường ruột khỏe mạnh, ngăn cản sự thâm nhập và phát triển vi
sinh vật gây bệnh, tăng sức đề kháng tự nhiên với các bệnh truyền nhiễm của
đường tiêu hóa. Vai trị này được thể hiện ở một số các biểu hiện cụ thể sau:
➢ Tăng hiệu quả sử dụng đường lactose tránh bệnh tiêu chảy do dùng các sản
phẩm sữa:
Trong thành phần của sữa có đường lactose là một disaccharide. Những
thiếu hụt về khả năng sinh enzyme β-galactosidse thường dẫn đến bệnh tiêu
chảy. Phần lớn các vi khuẩn probiotic đặc biệt là vi khuẩn lactic
(Lactobacillus, Streptococcus và Bifidobacterium) có khả năng sinh enzyme
β-galactosidse có khả năng thủy phân đường lactose thành đường đơn là
galactose và glucose. Như vậy probiotic với các chủng vi khuẩn này không
chỉ là pháp điều trị bệnh tiêu chảy do dùng sữa mà còn tăng hiệu quả hấp thu
chất dinh dưỡng cho cơ thể con người và vật nuôi [40].
➢ Ức chế vi sinh vật gây bệnh cho vật chủ như E.coli. Salmonella,
Staphylococcus…

Hình 1.1: Minh họa cơ chế tác động của probiotic
3


Một trong những vai trị có lợi hơn cả của probiotic là khả năng ức chế
các mầm bệnh do vi rút và vi sinh vật gây ra đối với cơ thể. Probiotic có khả
năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh theo một số cơ chế sau:
+ Cơ chế sinh ra các chất bacteriocin (bao gồm cả lantibiotic) như nisin
enteriocin, subtilisin [8].
Bacteriocin lần đầu tiên được Gratia phát hiện (1925) cho đến nay có
hàng ngàn loại bacteriocins đã được nghiên cứu [12],[27]. Bacteriocin được
chia thành 4 nhóm :
- Nhóm 1: bao gồm các bacteriocin là các peptit kháng khuẩn như nisin,
enterocin và các chất kháng khuẩn là peptid dạng vịng (lantibiotic) như:

subtilin, epidermin, gallidermin.
- Nhóm 2: bao gồm các peptid bền nhiệt có trọng lượng phân tử <10 KD, các
peptid này có vai trị ức chế các vi sinh vật khác thơng qua hoạt tính hịa tan
thành tế bào và được chia thành 4 nhóm a,b,c,d với các đại diện đặc trưng là
Pediocin-PA1, lactococcin G, Enterocin AS-48 và aureocin A53.
- Nhóm 3: là các bacteriocin có kích thước >10KD có khả năng làm tan thành
tế bào như lysostaphin.
- Nhóm 4: là các bacteriocin có thành phần phức tạp gồm protein và phi
protein như lipid và hydratcarbon, ví dụ như glycocin F.
+ Probiotic có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh trong vật chủ thông quả
khả năng cạnh tranh vị trí bám trên nhu mơ ruột của vật chủ. Ví dụ vai trị của
L. rhamnosus GG và Bifidobacterium animalis trong việc cạnh tranh vị trí
bám (receptor) đối với rotavirus giúp rút ngắn thời gian tiêu chảy cho người
bệnh [41].
+ Probiotic có thể sinh ra các thành phần hữu cơ có tác dụng ức chế vi sinh
vật gây bệnh.
4


Các vi khuẩn probiotic đặc biệt là vi khuẩn lactic sinh ra các thành
phần axít hữu cơ như acid lactic, acid acetic, ethanol có tác dụng ức chế sự
phát triển của vi sinh vật gây bệnh [42].
+ Ngoài ra sự phát triển của vi khuẩn probiotic cịn có khả năng ức chế vi sinh
vật gây bệnh thông qua việc cạnh tranh nguồn thức ăn.
➢ Kích thích và tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ.
Các nghiên cứu cho thấy: sự có mặt của vi khuẩn probiotic tạo thành mơi
trường có pH thấp với các thành phần bacteriocin, các peptid và sinh các loại
acid béo liên kết thành các mạch ngắn hay việc bám của vi khuẩn vào nhu mơ
ruột sẽ kích thích hệ thống miễn dịch tập nhiễm (innate immune response).
Kết quả là kích thích sự hoạt động của đại thực bào tiết ra protein miễn dịch

IgA, thông qua tế bào T để sinh ra các loại cytokine khác nhau như Interferon
(IFN-γ), IL-10, IL-4 [42].
➢ Giảm pH của hệ tiêu hóa và tác dụng tích cực đến hệ vi sinh vật đường ruột
theo hướng có lợi cho vật chủ.
Trong hệ tiêu hóa của vật chủ có 1013-1014 tế bào vi sinh vật khác nhau.
Chúng được chia thành 3 nhóm chủ yếu: nhóm có lợi cho vật chủ như
Lactobacilii, Bifidobacterium, một số nấm men và Bacillii. Nhóm có hại cho
vật chủ: như Staphylococcus, Clostridium, E.coli và nhóm vừa có lợi vừa có
hại như Enterococii. Sự có mặt của vi khuẩn lactic làm giảm pH theo hướng
bất lợi cho nhóm vi sinh vật có hại do đó làm thay đổi cân bằng quần xã vi
sinh vật đường ruột có lợi cho vật chủ [45].
➢ Giảm cholesterol trong máu và hạn chế các bệnh liên quan đến tim mạch.
Vi khuẩn probiotic được biết có vai trị sinh ra acid hữu cơ, làm giảm acid
béo, thành phần cholesterol trong máu và ức chế quá trình phát triển của các
khối u, ung thư [36].Các nghiên cứu chỉ ra rằng các vi khuẩn Lactobacilii và
5


Bifidobacterium không chỉ sinh ra các acid hữu cơ mà còn trực tiếp sử dụng
lipit và các thành phần cholesterol trong máu [52].
➢ Phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột sau khi sử dụng chất kháng sinh.
Sau khi sử dụng kháng sinh, thông thường cơ thể dễ bị tiêu chảy do các
chất độc sinh ra từ sự phát triển của Clostridium. Việc xử lý với probiotic có
chứa Lactobacilii và Sacchromycess cerevisiae có tác dụng giải độc tố
ammonia và phenol cũng như ức chế sự phát triển của nhóm Clostridium [56].
➢ Bất hoạt hay ly giải độc tố vi sinh vật.
Một trong những hoạt tính quan trọng của probiotic là làm bất hoạt và
ly giải độc tố do vi sinh vật gây bệnh sinh ra. Một số độc tố được hấp phụ bởi
vi khuẩn probiotic và một số được phân giải do cơ chế enzyme.

Hình1.2 : Hình ảnh bám dính của nấm men lên bề mặt của E.coli.
Các nghiên cứu cho thấy là vai trò của nấm men Sacchromyces
boulardii không chỉ ức chế vi sinh vật với ethanol và hấp phụ vi sinh vật có
hại cũng như độc tố của chúng mà cịn sinh ra protease có hoạt tính phân giải
độc tố cao [60].
➢ Bổ sung các enzyme tiêu hóa và tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật chủ.

6


Các vi sinh vật đặc biệt là nhóm vi khuẩn có bào tử (Bacillii) khơng chỉ
đáp ứng được nhiều đặc tính quan trọng của probiotic mà cịn là nguồn
enzyme hỗ trợ tiêu hóa cho vật chủ như: protease, lipase, amylase,
cellulose….
➢ Bổ sung thêm các thành phần vitamin nhóm B và acid folic cũng như các hoạt
chất khác như GABA… có lợi cho vật chủ [63].
➢ Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn:
Quá trình trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột cung cấp nguồn năng
lượng quan trọng cho thành ruột, cung cấp đến 50% năng lượng hàng ngày
cho tế bào biểu mô ruột kết (colonocytes), bằng cách lên men carbohydrate
thành acid hữu cơ, chủ yếu là butyrate, trong trường hợp trẻ em bú mẹ là
lactate. Những ích lợi rõ ràng đối với sức khỏe do probiotic mang lại là giảm
các triệu chứng về suy hấp thụ lactose, kích thích tiêu hóa, kìm hãm chất gây
ung thư và giảm hàm lượng cholesterol trong máu [37].
Ngoài các tác dụng quan trọng trên, các nghiên cứu gần đây cho thấy
probiotic cịn có tác dụng cải thiện tình trạng sức khỏe của người bệnh liên
quan đến các bệnh thần kinh như: bệnh giảm trí nhớ (aizheimer) và bệnh tự
kỉ, trầm cảm.
1.2. Vi khuẩn lactic trong sản xuất probiotic
1.2.1. Một số đối tượng vi sinh vật phổ biến trong sản xuất probiotic

Cho đến nay có 3 nhóm vi sinh vật được dùng phổ biến cho sản xuất
probiotic là: (i) nhóm vi khuẩn lactic , (ii) nhóm vi sinh vật khơng thuộc nhóm
vi khuẩn lactic và (iii) nấm men như sau [63] :

7


Bảng 1.1: Vi sinh vật phổ biến trong sản xuất probiotic
Vi khuẩn lactic
Bifidobacterium/nhóm

Nhóm khơng thuộc vi

khác

khuẩn lactic

L.acidophilus

B.animalis

Bacillus coagulans

L.casei

B.bifidum

Bacillus subtilis

L.paracasei

B.longum

Bacillus clausii

L.plantarum

B.lactic/animalis

Bacillus licheniformis*

L.rhamnosus

subsp.lactic

Propionibacterium

L.fermentum

B.breve

freudenreichii

L.brevis

B.infantis

Saccharomyces

L.reuteri

Enterococus faecalis *

cerevisiae

L. delbrueckii

Enterococus faecium*

Saccharomyces boulardii

L. bulgaricus

Pediococus acidilactici

Lactobacillus

Streptococcus
thermophilus
*Dùng cho sản xuất thức ăn chăn nuôi.
1.2.2.Vi khuẩn lactic trong sản xuất probiotic
Đặc điểm chung
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, hình que hay hình cầu, khơng
sinh bào tử, khơng di động, chịu được acid, chuyển hóa đường thành acid
lactic. Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrate và sinh ra acid
lactic. Acid lactic sinh ra có thể ở dạng D(-), L(+) hay DL. Khác với một số vi
khuẩn khác như vi khuẩn đường ruột cũng sinh ra acid lactic thì tất cả các vi
8

khuẩn lactic đều là vi khuẩn lên men bắt buộc không chứa các cytochrome và
enzyme catalase. Chúng là các vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc. Khuẩn lạc của
vi khuẩn lactic thường trịn, nhỏ, bóng, có màu mơi trường, màu trắng đục
hoặc vàng kem. Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae.
Các chi chính bao gồm Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus, Lactococcus. Ngồi ra cịn có các chi khác như
Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus, Aerococcus, Alloiococcus,
Tetragenococcus, Atopobium… [65].
Đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic
Trong số các chủng vi sinh vật probiotic, các đối tượng thuộc
Lactobacillus chiếm một vị trí qua trọng, có thể nói hầu hết các sản phẩm
probiotic đều chứa đại diện của chi này. Một trong những ưu thế của
Lactobacillus là phần lớn chúng được phân lập từ thực phẩm lên men như sữa
chua các loại, dưa, phomat, cá, thịt lên men. Các đối tượng này được xem là
an toàn (GRAS) được sử dụng cho các sản phẩm lên men làm thực phẩm chức
năng cho con người. Ngoài ra các chủng thuộc Lactobacillus còn thỏa mãn
khá đầy đủ các tiêu chuẩn khác của probiotic như có khả năng sống trong điều
kiện khắc nghiệt: pH thấp (2-3), chịu nồng độ muối mật (0,1-0,3%) và các
enzym trong hệ tiêu hóa của vật chủ, sinh các bacteriocin kháng khuẩn (như
acidophilin, plartacin, pediocin, enteriocin …), sinh các acid hữu cơ như acid
lactic, acid acetic, propionic, ethanol làm thay đổi pH trong đường tiêu hóa
dẫn đến ức chế các vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, Clostridium, E.coli
(thích nghi pH trung tính). Mặt khác các chủng vi sinh vật này có khả năng
phân giải đường lactose làm tăng hiệu quả hấp thu thức ăn của vật chủ.
Lactobacillus là đại diện sinh trưởng hiếu khí tùy tiện (facultative), chúng có
khả năng bám dính tốt vào đường tiêu hóa và tồn tại, phát triển, phát huy khả
năng sinh acid hữu cơ, bacteriocin và kích thích miễn dịch tại các vị trí khác

9

nhau trong đường tiêu hóa với các điều kiện khác nhau về nồng độ oxy trong
hệ tiêu hóa.
1.3. Tổng quan về Gamma - Aminobutyric acid
1.3.1. Giới thiệu
GABA là một acid amin khá phổ biến trong tự nhiên. Nó có trong một
số loại thực phẩm như cà chua chín, thịt lợn nạc, gạo lức, gạo mầm, lúa mì và
ngũ cốc nguyên hạt, lòng đỏ trứng gà, cá ngừ, cá hồi, mực,…Trong cơ thể
người và một số động vật có vú, GABA đã được chứng minh là một chất dẫn
truyền thần kinh ức chế trong hệ thần kinh [19].
Năm 1883, GABA được tổng hợp lần đầu tiên, là sản phẩm chuyển hóa
thực vật và vi sinh vật. Đến năm 1950, GABA được tìm thấy là một phần của
hệ thần kinh trung ương động vật có vú.
1.3.2. Hình dạng và cấu trúc của GABA
Gama - aminobutyric acid, viết tắt là GABA, là một amino acid không tham
gia cấu tạo nên protein.
Tên IUPAC: acid 4-aminobutanoic
Công thức phân tử: C4H9NO2
Khối lượng phân tử: 103,12 g /mol
Điểm nóng chảy: 203,7 °C( 477 K, 399 ° F )
Gamma aminobutyric acid (GABA) là chất rắn, có khả năng hịa tan
trong nước với độ tan khoảng 1300mg/ml.
GABA có cấu trúc gồm 4C, bao gồm nhóm amino (

) nhận proton

và nhóm acid cacboxylic (COOH) cho proton, và gốc R, chủ yếu được tìm
thấy ở dạng lưỡng cực.

10

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử GABA.
Trong trạng thái khí, GABA có dạng cuộn xoắn cao do lực tĩnh điện
giữa hai nhóm chức năng. Trong trạng thái rắn, nó lại được tìm thấy ở dạng
cấu trúc thẳng, cấu hình trans ở nhóm amino và cấu trúc cis ở cuối nhóm
cacboxyl, đây là do tương tác với các phân tử lân cận. Ở trạng thái lỏng,
GABA tồn tại ở cả dạng gấp khúc và thẳng. Điều này giúp GABA có thể thực
hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng.
Ở động vật có xương sống, GABA hoạt động ở các khớp thần kinh ức
chế trong não bằng cách gắn kết với các thụ thể xuyên màng trong màng tế
bào của cả quá trình trước và sau synap. Có ba loại receptor của GABA được
biết đến là
receptor.

là các ion receptor, và

là metabotropic

giúp đóng mở kênh ion trên màng tế bào,

liên kết với protein G để mở các kênh ion qua trung gian [64].
1.3.3.Thụ thể GABA
Thụ thể GABA là một nhóm thụ thể phản ứng với chất dẫn truyền thần
kinh γ-Aminobutyric acid (GABA) bao gồm: thụ thể GABAA là phần phức hệ
mang kênh ion và vị trí gắn kết với phối tử; thụ thể GABAB thuộc họ thụ thể
11


protein G có nhiệm vụ mở kênh ion thơng qua truyền thông tin nội bào qua

protein G [64].
1.3.3.1.Thụ thể GABAA
Thụ thể GABAA thuộc về siêu họ thụ thể Cys-loop có liên quan đến
tiến hóa và các kênh ion có cấu trúc gắn kết tương tự, bao gồm các thụ thể
acetylcholin nicotinic, glyxin, và 5HT3 [14]. GABAA là một phân tử lớn có 5
tiểu đơn vị protein. Tất cả các tiểu đơn vị này đều có đoạn cuối là N ở phần
bên ngoài tế bào, tiếp đến là 4 đoạn xuyên màng, ở đoạn xuyên màng 3 và 4
có một đoạn loop lớn, cuối cùng là đoạn cuối C ngắn. Các tiểu đơn vị protein
này tổ hợp bằng những con đường khác nhau và được sắp xếp tạo ra một lõi
cho phép kênh ion mang điện tích âm Cl- đi qua (Hình1.4). GABAA có vai trị
cơ bản trong điều khiển các biểu hiện lo âu và ảnh hưởng tới trí nhớ ở não.
Các tế bào thần kinh sản xuất ra GABA được gọi là các thần kinh GABAergic
và hoạt động chính trong q trình ức chế ở các động vật có xương sống trong
giai đoạn trưởng thành. 17-20% neuron thần kinh là GABAergic và hầu hết
các hoạt tính sinh lý của GABA được tạo thành thông qua thụ thể GABA A.
Trong động vật có xương sống, GABA hoạt động ở các khe sinap trong não
bằng liên kết với thụ thể GABA xuyên màng tế bào thần kinh. Quá trình liên
kết này sẽ dẫn tới mở kênh ion để cho phép kênh ion mang điện tích âm Cl- đi
vào trong tế bào hoặc kênh ion mang điện tích dương ra ngồi tế bào. Quá
trình này sẽ tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn tới vị trí này thường
xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh, khoảng -75mV trong tế bào thần kinh.

12


Hình 1.4: Mơ hình cấu trúc thụ thể GABAA [65]
1.3.3.2.Thụ thể GABAB
Thụ thể GABAB có hai tiểu đơn vị là GABAB1 và GABAB2 (Hình 1.5 ).
GABAB1 có vai trị nhận dạng phối tử bên ngồi tế bào cịn GABAB2 có
nhiệm vụ ở trên màng tế bào và truyền tín hiệu. Thụ thể GABAB được ứng

dụng như là đích để tìm các loại thuốc trong điều trị dược học và liên quan
đến vai trị truyền tín hiệu về khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển,
tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm [29].

Hình 1.5: Mơ hình cấu trúc của thụ thể GABAB [66]

13


1.3.4. Quá trình tổng hợp GABA trong não
GABA được tổng hợp từ acid L-glutamic nhờ hoạt động của enzyme
glutamic acid decarboxylase (GAD) và pyridoxal phosphate (dạng hoạt động của
vitamin B6) thông qua một con đường trao đổi chất được gọi là GABA shunt.

Hình 1.6: Con đường tổng hợp GABA
GABA shunt là một nhánh tắt của chu trình Krebs. Các GABA shunt là
một q trình khép kín với hai mục đích sản xuất và bảo tồn nguồn cung cấp
GABA. Glucose là tiền chất chính để sản xuất GABA trong cơ thể, mặc dù
pyruvate và các acid amin cũng hoạt động như là tiền chất. Bước đầu tiên
trong GABA shunt là chuyển hóa amin của α-ketoglutarate (được hình thành
từ sự chuyển hóa glucose trong chu trình Krebs) nhờ GABA α-oxoglutarate
transaminase (GABA-T) thành acid L-glutamic. Tiếp theo GAD xúc tác
chuyển hóa acid L-glutamic thành GABA. GABA được chuyển hóa bởi
GABA-T để tạo thành semialdehyde succinic. Để bảo tồn nguồn cung cấp sẵn
của GABA, q trình chuyển hóa amin thường xảy ra khi hợp chất ban đầu αketoglutarate chấp nhận các nhóm amin tách ra từ GABA để hình thành lại
acid glutamic. Vì vậy, một phân tử GABA được hình thành chỉ khi một phân
tử tiền thân được hình thành. Succinic semialdehyde có thể bị oxy hóa bởi

14