Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trìnhtự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai bằng DNA thai tự do trong máu mẹ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

HOÀNG HẢI YẾN

CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC
LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

HOÀNG HẢI YẾN

CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC
LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Huy Thịnh

Cho đề tài:
Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trình tự gen
thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai
bằng DNA thai tự do trong máu mẹ
Chuyên ngành : Hóa sinh

Mã số
: 62720112

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2017


TỪ VIẾT TẮT

AFP

: Alpha fetoprotein

CffDNA

: cell free fetal DNA

CFTS

: Combined first trimester screening

CPM

: Confined Placental Mosaicism

CNV

: Copy number variant

CRL

: Crown–rump length

DANSR

: Digital Analysis of Selected Regions

HCG

: Human chorionic gonodotropin

MPS

: Massively parallel sequencing

NGS

: Next Generation Sequencing

NIPS

: Noninvasive prenatal screening

NST

: Nhiễm sắc thể

NT

: Nuchal Translucency

PAPA-A

: Prenancy Associated plasma protein – A

PCR

: Polymerase Chain Reaction

SCAs

: Sex chromosome abnormalities

uE3

: Unconjugated estriol

WGA

: Whole-Genome Approach


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
I. Tổng quan về các phương pháp sàng lọc lệch bội NST truyền thống.........2
1.1. Tính toán nguy cơ cho bệnh nhân......................................................2
1.2. Tuổi mẹ và tuổi thai............................................................................3
1.3. Ảnh hưởng của lần có thai trước đó...................................................6

1.4. Siêu âm hình thái................................................................................6
1.5. Sàng lọc trước sinh bằng xét nghiệm hóa sinh...................................7
1.5.1. βhCG...........................................................................................8
1.5.2. PAPP-A.......................................................................................8
1.5.3. AFP..............................................................................................8
1.5.4. uE3..............................................................................................9
1.5.5. Inhibin A......................................................................................9
1.6. Sàng lọc thai kỳ 1.............................................................................10
1.7. Sàng lọc thai kỳ 2.............................................................................11
II. Sàng lọc trước sinh không xâm lấn.........................................................14
2.1. Sàng lọc trước sinh bằng tế bào thai tự do trong máu mẹ................14
2.2. Sàng lọc trước sinh bằng DNA thai tự do (cffDNA) trong máu mẹ......16
2.2.1. Lịch sử phát hiện cffDNA.........................................................16
2.2.2. Các bước giải trình tự thế hệ mới sử dụng cffDNA phân tích
lệch bội NST.............................................................................18
2.2.3. Phương pháp sử dụng cffDNA để sàng lọc bất thường NST thai....20
2.2.4. Kết quả của NIPS......................................................................28
KẾT LUẬN.....................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Mô tả mối liên quan nguy cơ trisomy theo tuổi mẹ..........................3
Bảng 2: Ước tính nguy cơ trisomy 21 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối
liên quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai....................................................4
Bảng 3: Ước tính nguy cơ trisomy 18, 13 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối
liên quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai....................................................5
Bảng 4: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả của các xét nghiệm sàng lọc
trisomy 21 ......................................................................................12
Bảng 5: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả của các xét nghiệm sàng lọc

trisomy 21 ......................................................................................13


DANH MỤC HÌNH

Hình 1:

Nguồn gốc cffDNA.........................................................................17

Hình 2:

Sơ đồ tổng quát các bước giải trình tự cffDNA bằng NGS.............18

Hình 3:

Tóm tắt các bước phát hiện lệch bội NST bằng NGS.....................19

Hình 4:

Hai phương pháp được sử dụng trong NIPS...................................22


1

MỞ ĐẦU

Bất thường nhiễm sắc thể (NST) thai là một trong số những nguyên nhân
hàng đầu gây nên tỷ lệ tử vong và bệnh tật cho trẻ sơ sinh trên toàn thế giới
[1]. Các bất thường NST được sàng lọc và chẩn đoán trước sinh phần lớn là
bất thường lệch bội NST như trisomy 21, 18, 13 và NST giới tính gây ra hội

chứng Down, Edwards, Patau, Turner và phần còn lại là do bất thường các
NST hiếm gặp khác [2].
Đến nay, trên thế giới vẫn chưa có biện pháp nào phòng ngừa cũng như
điều trị triệt để tình trạng thai nhi mắc các hội chứng bất thường NST. Biện
pháp duy nhất là thực hiện các xét nghiệm sàng lọc và chẩn đoán trước sinh
giúp phát hiện sớm và tư vấn di truyền là việc làm hết sức cần thiết. Có rất
nhiều phương pháp sàng lọc lệch bội NST đang được áp dụng trên thế giới.
Hiệu quả của phương pháp được xác định bằng các thông số như độ nhạy, độ
đặc hiệu, và giá trị tiên đoán âm tính và dương tính. Các chương trình sàng lọc
nên dựa trên các phương pháp đạt tiêu chuẩn tối thiểu: đó là với độ nhạy > 75%
và độ đặc hiệu > 95%. Lựa chọn phương pháp sàng lọc phù hợp với từng thai
kỳ cũng là một yếu tố quan trọng nhằm phát hiện sớm thai lệch bội NST [3].
Mỗi phương pháp sàng lọc đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, kết
quả sàng lọc và độ chính xác dao động cũng khác nhau. Các phương pháp sàng
lọc trước sinh bất thường lệch bội NST bao gồm siêu âm hình thái và phân tích
huyết thanh từ máu mẹ trong thai kỳ 1 và 2. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu
không cao, tỷ lệ phát hiện dao động 30-97% với tỷ lệ dương tính giả dao động
trong khoảng 5% tùy thuộc vào từng phương pháp sàng lọc được sử dụng [4].
Việc phát hiện DNA thai tự do (cffDNA) có nguồn gốc từ rau thai lưu hành
trong huyết tương mẹ vào năm 1997 kết hợp với ứng dụng của công nghệ giải


2
trình tự gen thế hệ mới (NGS - Next Generation Sequencing) đã mở ra khả
năng thực hiện xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm lấn (Noninvasive
prenatal screening - NIPS), giúp các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc sớm thai
nhi trên nhiều phương diện khác nhau, đặc biệt là sàng lọc sớm lệch bội NST
[5]. Đây được xem là một phát hiện mang tính bước ngoặc, do việc lấy mẫu và
phân tích cffDNA không đòi hỏi tính can thiệp sâu, giảm thiểu nguy cơ cũng
như các biến chứng trên mẹ và thai. Hơn nữa, NIPS có tỷ lệ phát hiện cho

trisomy 21 trên 99% với tỷ lệ dương tính giả thấp dưới 1% [6].
Điều quan trọng là các bác sỹ sản khoa có thể chọn lựa phương pháp sàng
lọc phù hợp trong từng thai kỳ và giải thích những lợi ích, rủi ro và hạn chế của
từng phương pháp sàng lọc hiện có, giúp phát hiện sớm các bất thường NST.
Chuyên đề sau đây sẽ giới thiệu các phương pháp sàng lọc lệch bội NST
và giá trị của từng phương pháp.
I. Tổng quan về các phương pháp sàng lọc lệch bội NST truyền thống
Bất thường về NST là nguyên nhân chính gây tử vong chu sinh và tàn tật
ở trẻ em. Phát hiện các bất thường NST chủ yếu dựa chẩn đoán trước sinh
bằng thủ thuật xâm lấn. Tuy nhiên, xét nghiệm xâm lấn bằng chọc hút dịch ối,
sinh thiết gai rau có nguy cơ sảy thai khoảng 1%, do đó các xét nghiệm này
chỉ thực hiện trên những thai phụ có nguy cơ cao bất thường NST.
Các phương pháp sàng lọc truyền thống nguy cơ cao bất thường NST là
tuổi mẹ, siêu âm, xét nghiệm huyết thanh trong máu mẹ thai kỳ 1 và 2 như
double test và triple test….
1.1. Tính toán nguy cơ cho bệnh nhân
Mỗi thai phụ đều có nguy cơ thai nhi bị khuyết tật về NST. Trách nhiệm
của các nhà lâm sàng là đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến nguy cơ của thai


3
bằng cách sử dụng các phương pháp chính xác nhất giúp cho gia đình thai phụ
đưa ra quyết định đúng đắn khi thực hiện các xét nghiệm xâm lấn [7]. Để tính
toán nguy cơ cho thai phụ, cần phải tính nguy cơ mắc bệnh (phụ thuộc vào tuổi
mẹ và tuổi thai) kết hợp với một số kết quả của siêu âm và xét nghiệm hóa sinh
huyết thanh mẹ trong quá trình mang thai, từ đó tính toán được nguy cơ thực sự
của thai phụ, nguy cơ này sẽ trở thành nguy cơ mắc bệnh cho lần xét nghiệm
sàng lọc kế tiếp. Quá trình này được gọi là sàng lọc nối tiếp (sequential
screening) [8]. Trong tính toán nguy cơ cho thai phụ thường sử dụng phần mềm
FMF (UK) trong sàng lọc thai kỳ 1 và phần mềm Prisca (Immulite), T21

(Gamma) và Life cycle (Perkin Elmer) trong thai kỳ 2.
1.2. Tuổi mẹ và tuổi thai
Nguy cơ bất thường NST tăng theo tuổi mẹ (bảng 1), chủ yếu nguyên
nhân do các biến cố không kết nối trong quá trình giảm phân và kết quả là thai
mắc trisomy. Ngoài ra, thai có bất thường NST có nguy cơ tử vong trong tử
cung cao hơn so với thai bình thường, nguy cơ sẽ giảm theo tuần thai (bảng 2).
Bảng 1: Mô tả mối liên quan nguy cơ trisomy theo tuổi mẹ
Tuổi mẹ

Trisomy 21

Trisomy 18

Trisomy 13

15-19

1:1600

1:17000

1:33000

20-24

1:1400

1:14000

1:25000

25-29

1:1100

1:11000

1:20000

30-34

1:700

1:7100

1:14000

35-39

1:240

1:2400

1:4800

40-44

1:70

1:700

1:1600

45-49

1:20

1:650

1:1500


4
Ước tính rủi ro liên quan đến tuổi mẹ của trisomy 21 khi sinh dựa vào
nhiều khảo sát trên thai phụ mang thai trisomy 21. Dựa và xét nghiệm hóa sinh
từ huyết thanh mẹ và siêu âm hình thái thai nhi ở các giai đoạn khác nhau của
thai kỳ sẽ tính được nguy cơ bất thường NST cho thai nhi khi kết hợp với tuổi
mẹ và tuổi thai. Ước tính như vậy được so sánh với tần suất mắc trisomy 21 khi
sinh với tần suất mắc trisomy 21 thai nhi từ xét nghiệm chẩn đoán bằng chọc hút
dịch ối và sinh thiết gai rau trong thai kỳ 1 và thai kỳ 2 (bảng 3) [9].
Bảng 2: Ước tính nguy cơ trisomy 21 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối
liên quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai
Tuổi thai (tuần)
Tuổi mẹ (năm)
12
16
20
20
898
1053

1175
21
887
1040
1159
22
872
1022
1140
23
852
999
1114
24
827
969
1081
25
795
933
1040
26
756
887
989
27
710
832
928
28

655
768
856
29
593
695
776
30
526
617
688
31
457
536
597
32
388
455
507
33
322
378
421
34
262
307
343
35
210
246

274
36
165
193
216
37
128
150
168
38
98
115
129
39
75
88
98
40
57
67
74
41
43
50
56
42
32
38
42
Nguy cơ trisomy 18, 13 tăng theo tuổi mẹ và giảm theo tuổi

40
1527
1507
1482
1448
1406
1352
1286
1206
1113
1008
895
776
659
547
446
356
280
218
167
128
97
73
55
thai, tỷ lệ


5
thai chết trong tử cung giữa 12 và 40 tuần khoảng 80% (bảng 3) [10]. Hội

chứng Turner liên quan tới mất một NST X, do vậy bộ NST sẽ là 45,X, không
như trisomy, hội chứng này không liên quan tới tuổi mẹ. Tỷ lệ mắc khoảng
1:1500 tại thời điểm thai 12 tuần, 1:3000 tại 20 tuần và 1:4000 tại 40 tuần.
Đối với hội chứng bất thường NST giới tính khác (47,XXX, 47,XXY và
47,XYY), không có sự liên quan với tuổi mẹ và tỷ lệ chung thai chết trong tử
cung không cao hơn thai có bộ NST bình thường (1:500), không giảm theo
tuổi thai. Thai đa bội chiếm khoảng 2%, tỷ lệ thai chết trong tử cung cao do
đó rất hiếm khi quan sát được trên trẻ sinh sống. Tần suất gặp tại thời điểm 12
và 20 tuần vào khoảng 1:2000 và 1:250000 [10].
Đầu những năm 1970, có khoảng 5% thai phụ từ 35 tuổi và nhóm này
chiếm khoảng 30% thai phụ mang thai trisomy 21. Do vậy, sàng lọc trên cơ sở
tuổi mẹ với ngưỡng cut-off là 35 tuổi được xếp vào nhóm có nguy cơ cao, với
tỷ lệ dương tính giả là 5% và tỷ lệ phát hiện là 30%.Những năm sau đó, tại
các nước phát triển, phụ nữ có xu hướng mang thai muộn hơn, do đó hiện nay
khoảng 15% phụ nữ mang thai từ 35 tuổi và tỷ lệ thai trisomy 21 trong nhóm
này chiếm khoảng 50% [4].
Bảng 3: Ước tính nguy cơ trisomy 18, 13 (1/số đưa ra trong bảng) trong
mối liên quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai.
Tuổi mẹ (năm)
20
25
30
31
32
33
34
35
36
37
38

39

12
1886
1670
1105
959
814
676
550
440
346
269
207
158

Tuổi thai (tuần)
16
20
2709
4897
2399
4336
1587
2869
1377
2490
1169
2114
971

1755
790
1429
632
1142
497
899
386
698
297
537
226
409

40
18013
15951
10554
9160
7775
6458
5256
4202
3307
2569
1974
1505


6

40
119
171
41
90
129
42
68
97
1.3. Ảnh hưởng của lần có thai trước đó

310
233
175

1139
858
644

Nguy cơ mang thai trisomy trên những phụ nữ mang thai mắc trisomy
của lần mang thai trước đó có tỷ lệ cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ. Một nghiên
cứu trên 2054 thai phụ có tiền sử mang thai trisomy 21, nguy cơ tái mắc cho
lần mang thai sau là 0.75%, cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ ở cùng thời điểm
mang thai. Do vậy, một phụ nữ 35 tuổi có tiền sử mang thai trisomy 21 có
nguy cơ tăng từ 1:249 (0.40%) đến 1:87 (1.15%) tại 12 tuần thai, và trên phụ
nữ 25 tuổi nguy cơ tăng từ 1:946 (0.106%) đến 1:117 (0.856%). Nghiên cứu
trên 750 thai phụ có tiền sử mang thai trisomy 18, nguy cơ tái mắc cho lần
mang thai sau là 0.75%, cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ và tuổi thai liên quan
tới nguy cơ trisomy 18; nguy cơ trisomy 21 những phụ nữ này không tăng
thêm. Do vậy, nguy cơ tái mắc là đặc hiệu cho bất thường NST [4].

1.4. Siêu âm hình thái
Trong chẩn đoán trước sinh, siêu âm được sử dụng lần đầu tiên vào
những năm 1972. Sau đó siêu âm ngày càng được sử dụng rộng rãi và đã trở
thành một phương tiện chẩn đoán quan trọng và không thể thiếu trong chương
trình chăm sóc trước sinh. Đây là phương pháp không xâm phạm thai, tương
đối an toàn nên được xem là một trong những công cụ chủ yếu để sàng lọc và
phát hiện các dị tật của thai.
Trong sàng lọc trước sinh thường sử dụng nhiều nhất là độ mờ da gáy
(Nuchal Translucency: NT). NT là hình ảnh siêu âm sự tụ dịch dưới da sau cổ
thai nhi trong 3 tháng đầu thai kỳ, được tính là chiều dày tối đa của khoảng mờ
dưới da, là chiều dày từ mặt ngoài da gáy tới xương trên đốt sống cổ. NT tăng
theo tuổi thai tương ứng với chiều dài đầu mông CRL (crown–rump length).


7
Thai với CRL nhất định, mỗi phép đo NT đại diện cho một yếu tố nhân với
nguy cơ cơ bản để tính toán một nguy cơ mới. NT càng lớn thì hệ số nhân càng
cao thì nguy cơ mới càng cao. Ngược lại, phép đo NT nhỏ hơn, thì hệ số nhân
càng nhỏ và do đó làm giảm nguy cơ mới [11]. Sự tăng NT liên quan đến các
hội chứng bất thường NST như hội chứng Turner, hội chứng Down, các lệch
bội NST khác. Có rất nhiều nghiên cứu đo NT phát hiện trisomy 21. Mặc dù có
rất nhiều ngưỡng cutt-off khác nhau được sử dụng để nhận ra nhóm sàng lọc
nguy cơ, sự khác biết về tỷ lệ phát hiện và dương tính giả, tất cả các nghiên cứu
đều báo cáo tỷ lệ phát hiện cao. Kết quả kết hợp 14 nghiên cứu trên 174473
thai phụ, bao gồm 728 thai phụ mang thai trisomy 21, chứng minh tỷ lệ phát
hiện là 77% với tỷ lệ dương tính giả 4.7% [4]. Sàng lọc sử dụng kết hợp tuổi
mẹ, NT và các chỉ số hóa sinh Free βhCG và PAPP-A trong huyết thanh mẹ của
thai tuần 11-14 để tính nguy cơ của thai phụ mắc các hội chứng trisomy 21, 18,
13. Tất cả thai phụ có độ mờ da gáy của thai nhi ≥ 3,5mm cần được theo dõi
các bất thường của thai nhi bằng siêu âm trong quý II của thai kì đặc biệt là là

các bất thường tim bẩm sinh. Khoảng 80% thai trisomy 21 liên quan với tăng
NT ( ≥ 3mm).
Việc phân tích sự có mặt của xương mũi thai nhi bằng siêu âm cũng được
sử dụng trong thai kỳ 1 nhằm tăng tỷ lệ phát hiện hội chứng Down, từ 11-14
tuần thai, 60-70% thai trisomy 21 không thể siêu âm được xương mũi và dưới
1% trường hợp có số lượng NST bình thường không siêu âm được xương mũi
[12]. Nghiên cứu cho thấy sàng lọc trisomy 21 vào tuần 11-14 bằng cách phối
hợp siêu âm xương mũi, đo NT và phân tích free β-hCG/PAPP-A trong huyết
thanh mẹ tăng tỷ lệ phát hiện lên đến 97%, dương tính giả 5%, hoặc tỷ lệ phát
hiện 95% đối với tỷ lệ dương tính giả là 2% [13].
1.5. Sàng lọc trước sinh bằng xét nghiệm hóa sinh


8
Những sản phẩm của thai có trong huyết thanh mẹ thường được dùng để
phát hiện những thai có nguy cơ bị dị tật bẩm sinh phổ biến là: AFP (alpha
fetoprotein), HCG (human chorionic gonodotropin), uE3 (unconjugated
estriol), Inhibin A, PAPA-A (prenancy Associated plasma protein - A).
1.5.1. βhCG
βhCG là một thành phần trong cấu trúc của hormon hCG (human
chorionic gonadotropin). hCG đầu tiên được các tế bào lá nuôi của trứng sau
khi đã được thụ tinh tiết ra sau đó sẽ do rau thai bài tiết. hCG có mặt trong
huyết thanh của mẹ vào khoảng 6 đến 8 ngày sau khi trứng được thụ tinh và
đạt tới nồng độ cao nhất sau từ 50 đến 80 ngày tính từ lần kinh cuối. hCG
được cấu thành từ hai tiểu đơn vị là α (alpha) và β (beta). Nếu thai nhi mắc
hội chứng Down, nồng độ của tiểu đơn vị βhCG gia tăng đáng kể trong thai
kỳ 1 và thai kỳ 2.
1.5.2. PAPP-A
PAPP-A (Pregnancy Associated Plasma Protein A) là một loại
glycoprotein do rau thai bài tiết. Trong thai kỳ bình thường, nồng độ PAPP-A

tăng dần trong suốt thai kỳ. Trong thai kỳ 1, nếu thai nhi mắc hội chứng
Down sẽ thấy nồng độ PAPP-A trong máu mẹ giảm, trong khi đó ở thai kỳ 2
nồng độ PAPP-A vẫn giữ ở mức bình thường hoặc chỉ hơi giảm, do đó PAPPA chỉ được dùng trong thai kỳ 1 để sàng lọc thai nhi mắc hội chứng Down.
Hơn nữa, mức PAPP-A thấp trong thai kỳ 1 dự báo một thai không tốt như
thai nhẹ cân hay thai lưu. Trường hợp PAPP-A cao hơn bình thường là một
dấu hiệu dự báo thai lớn.
1.5.3. AFP (alpha fetoprotein)
Thai đang phát triển có 2 loại protein máu chính là Albumin và alpha
fetoprotein (AFP). Vì người trưởng thành chỉ có albumin trong máu, nên xét
nghiệm AFP được sử dụng để xác định gián tiếp lượng AFP trong máu thai


9
nhi. Nói chung chỉ có một lượng nhỏ AFP trong dịch ối có thể qua bánh rau
để đi vào máu người mẹ. Tuy nhiên khi có bất thường ống thần kinh, do một
phần ống thần kinh phôi thai không được đóng kín nên AFP sẽ thoát vào dịch
ối. Các bất thường ống thần kinh bao gồm thai vô não (do ống thần kinh phần
đầu không đóng được) và tật hở khe đốt sống (spina bifida: do phần đuôi ống
thần kinh không đóng được). Ở Mỹ, tỷ lệ mắc các loại bệnh này 1-2/1000
trường hợp sinh. Tương tự như vậy, trong tật hở thành bụng (gastroschisis)
hay thoát vị rốn (omphalocele) thì AFP từ thai sẽ đi vào trong máu mẹ với
một lượng lớn hơn bình thường.
Ðể xét nghiệm AFP có giá trị thì phải xác định chính xác tuổi thai vì AFP
tăng theo tuổi thai (tăng theo kích thước thai). AFP được tính theo bội số giá
trị trung bình (MoM). MoM tăng cao hơn bình thường thì càng có khả năng bị
dị tật bẩm sinh. AFP có độ nhạy lớn nhất trong tuổi thai 16-18 tuần nhưng
thường người ta sử dụng nó để tính nguy cơ trong giới hạn tuổi thai 15-22
tuần. Sự gia tăng của nồng độ AFP trong nước ối và trong máu mẹ liên quan
đến nhiều dị tật của thai nhi đặc biệt là dị tật của ống thần kinh. Trong thai kỳ
2, sự sụt giảm nồng độ AFP được thấy trong khoảng 30% trường hợp thai nhi

mắc hội chứng Down.
1.5.4. uE3 (Unconjugated estriol-estriol không liên hợp)
Estriol có nguồn gốc từ dehydroepiandrosterone (DHEA) được sản xuẩt
từ tuyến thượng thận sau đó được bánh rau chuyển hóa thành estriol. Estriol
đi vào máu mẹ và được bài xuất qua đường tiết niệu hoặc bài xuất qua gan
vào mật. Trong huyết thanh của mẹ, estriol được đo dưới dạng không kết hợp
uE3. Trong thai kỳ bình thường nồng độ của estriol tự do và estriol toàn phần
tăng dần trong suốt thai kỳ. Xét nghiệm liên tục estriol trong quí 3 thai kỳ để
theo dõi tình trạng của thai. Nếu estriol giảm báo hiệu thai đang có nguy cơ và


10
có thể có chỉ định kết thúc thai kỳ. Estriol cũng giảm trong thai bị hội chứng
Down hoặc thiểu sản tuyến thượng thận kèm theo vô não.
1.5.5. Inhibin A
Là một protein có nguồn gốc thai nhi do bánh rau và hoàng thể tiết ra.
Inhibin là một glycoprotein gồm 2 chuỗi α, β (gồm 2 loại βA, βB). Nếu chuỗi
α liên kết với βA thì gọi là Inhibin A, hoặc chuỗi α liên kết với βB gọi là
Inhibin B. Inhibin-A được định lượng trong huyết thanh mẹ. Qua nhiều
nghiên cứu phát hiện mức Inhibin A tăng là dấu hiệu nguy cơ của thai có hội
chứng Down hoặc báo hiệu nguy cơ sinh non và giảm trong trisomy 18.
1.6. Sàng lọc thai kỳ 1 (11-13 tuần 6 ngày)
Sàng lọc kết hợp thai kỳ 1 (CFTS: Combined first trimester screening)
thực hiện từ 11-13 tuần 6 ngày dựa trên tuổi mẹ, siêu âm đo độ mờ da gáy
(NT) và phân tích nồng độ FβhCG và PAPP-A trong huyết thanh mẹ, từ đó
dựa vào phần mềm tính toán yếu tố nguy cơ trisomy 21, 18, 13. Đây là
phương pháp sàng lọc chuẩn đang được sử dụng ở phần lớn các nước đang
phát triển. Phương pháp này có độ nhạy cao và có thể phát hiện sớm.
Thai phụ mang thai trisomy 21 ở thai kỳ 1, nồng độ β-hCG (khoảng 2
MoM) trong huyết thanh của mẹ cao hơn ở thai phụ mang thai có NST bình

thường, trong khi đó PAPP-A thấp hơn (khoảng 0,5MoM). Tỷ lệ phát hiện
trisomy 21 bằng sàng lọc sinh hóa thai kỳ 1 khoảng 60% với tỷ lệ dương tính
giả 5% [14].
Siêu âm đo NT tại 11-13 tuần 6 ngày kết hợp với tuổi mẹ đưa ra một
phương pháp sàng lọc hiệu quả trisomy 21, tỷ lệ phải thực hiện xét nghiệm
chẩn đoán là 5%, khoảng 75% thai phụ mang thai trisomy 21 được phát hiện


11
[15]. Khi sử dụng phương pháp sàng lọc kết hợp sẽ tăng được hiệu quả sàng
lọc hơn so với phương pháp riêng lẻ. Kết hợp NT với β-hCG và PAPP-A
trong huyết thanh mẹ, tỷ lệ phát hiện các loại bất thường NST 21, 18, 13
khoảng 90% với tỷ lệ dương tính giả 1% [16]. NT tăng cũng là một chỉ điểm
sàng lọc bất thường NST khác ngoài trisomy 21 [11]. Ngoài ra, còn một số
đặc tính đặc trưng khác của thai nhi cũng có thể nhận biết bất thường NST.
Đối với trisomy 18, thai kém phát triển trong buồng tử cung (IUGR), nhịp tim
chậm...[17]. Trisomy 13 có đặc điểm nhịp tim nhanh (quan sát thấy khoảng
2/3 trường hợp), IUGR sớm và dấu chứng não trước không phân chia
(holoprosencephaly) là khá đặc hiệu cho hội chứng trisomy 13 và gặp trong
30% trường hợp [18]. Hội chứng turner có đặc điểm nhịp tim nhanh, khoảng
50% các trường hợp, và IUGR sớm [19]. Thai đa bội, IUGR sớm, nhịp tim
chậm, holoprosencephaly... trong 40% trường hợp [20]. Trisomy 18 và 13,
free β-hCG và PAPP-A trong huyết thanh mẹ giảm [21],[22]. Trong trường
hợp bất thường NST giới tính, free β-hCG bình thường và PAPP-A thấp trong
huyết thanh mẹ [23]. Nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng kết hợp siêu âm
xương mũi với NT, β-hCG và PAPP-A tỷ lệ phát hiện đạt tới 95% [13].
1.7. Sàng lọc thai kỳ 2 (15-22 tuần)
Năm 1984, Merkatz và các cộng sự nghiên cứu sàng lọc bất thường NST
thai kỳ 2 cho thấy nồng độ AFP huyết thanh mẹ thấp trên thai phụ trisomy 21
[24]. Sau đó, rất nhiều nghiên cứu đã báo cáo sự thay đổi nồng độ free βhCG,

inhibin A và uE3 huyết thanh mẹ trong các trường hợp bất thường NST [25],
[26],[27]. Sàng lọc triple test dựa theo tuổi mẹ và kết hợp với các chỉ số sinh
hóa AFP, freeβ-hCG và uE3 huyết thanh mẹ liên quan đến tỷ lệ phát hiện
trisomy 21 là 60-70% với tỷ lệ dương tính giả là 5% [28]. Tuy nhiên, một yếu
tố quan trọng trong sàng lọc bằng chỉ số hóa sinh thai kỳ 2 là kết quả siêu âm
phải chính xác ngày dự kiến sinh, nếu không tỷ lệ phát hiện sẽ giảm 10%.


12
Sàng lọc quad test được thực hiện bằng cách định lượng các chất AFP, βhCG,
uE3, Inhibin A trong huyết thanh mẹ, kết hợp với tuổi mẹ, chiều cao, cân nặng
mẹ, và tuổi thai nhờ một phần mềm chuyên dụng để đánh giá nguy cơ các hội
chứng Down, Edward hoặc dị tật ống thần kinh của thai ở thai kỳ 2. Tỷ lệ
phát hiện quad test là 81% với tỷ lệ dương tính giả là 5% [29].
Bảng 4 là phân tích tổng hợp tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả
trisomy 21 của các xét nghiệm sàng lọc bất thường NST 21 của Nicolaides
năm 2003 [4].
Bảng 4: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả của các xét nghiệm sàng lọc
trisomy 21 [4]
Xét nghiệm sàng lọc
TM
TM + hCG và PAPP-A huyết thanh ở tuần
thai thứ 11-14
TM + NT ở tuần thai thứ 11 – 14
TM + NT + xương mũi ở tuần thai thứ 11 – 14
TM + NT + hCG và PAPP-A huyết thanh ở
tuần thai thứ 11 – 14
TM + NT + xương mũi + hCG và PAPP-A
huyết thanh ở tuần thai thứ 11 – 14
TM + Các chỉ số huyết thanh ở tuần thai thứ

15-18

DR (%)

FPR (%)

30 (hoặc 50)

5 (hoặc 15)

60

5

75 (hoặc 70)

5 (hoặc 2)

90

5

90 (hoặc 80)

5 (hoặc 2)

97 (hoặc 95)

5 (hoặc 2)

60 - 70

5

75

10 - 15

Siêu âm để phát hiện các bất thường và các
dấu ấn chỉ điểm (markers) ở thai nhi vào tuần
thai thứ 16 – 23


13
TM: Tuổi mẹ; NT: độ mờ da gáy; DR: Tỷ lệ phát hiện; FPR: tỷ lệ dương
tính giả
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phối hợp sàng lọc thai kỳ 1 và quad test
thai kỳ 2. Những phối hợp này còn gọi là sàng lọc intergrated, sequential hoặc
contingent thì hiệu quả sàng lọc tăng lên đáng kể [29].
Bảng 5: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả của các xét nghiệm sàng lọc
trisomy 21 [29]
XN sàng lọc
First trimester
Triple test
Quad test
Integrated
Sequential stepwise
Contingent
screening
Serum Integrated

NT
cffDNA

Tuổi thai (tuần)
11-14
15-22
15-22
11-14
sau đó 15-22

DR (%)
82-87
69
81

FPR (%)
5
5
5

Phương pháp
NT+PAPP-A và hCG, TM
hCG, AFP, uE3, TM
hCG, AFP, uE3, InhibinA, TM

96

5

NT+PAPP-A, sau đó Quad test

95

5

NT+hCG+PAPP-A, sau đó

11-14

Quad test

sau đó 15-22

NT+hCG+PAPP-A, sau đó

11-14
sau đó 15-22
11-14
>9

88-94

5

Quad test

88

5

PAPP-A+ Quad

64-70
99

5
0.5

Siêu âm
cffDNA trong máu mẹ

TM: tuổi mẹ, NT: độ mờ da gáy; DR: tỷ lệ phát hiện; FPR: tỷ lệ dương
tính giả.
Sàng lọc intergrated kết hợp đo NT và phân tích huyết thanh mẹ và quad
test, sau đó đưa ra chỉ một kết quả đánh giá nguy cơ lệch bội với tỷ lệ phát
hiện khoảng 96% với tỷ lệ dương tính giả là 5%. Tuy nhiên sàng lọc
intergrated phức tạp, yêu cầu đánh giá siêu âm thai kỳ 1 và 2 lần xét nghiệm
máu và kết quả cuối cùng đưa ra vào thai kỳ 2.
Giống như sàng lọc intergrated, cả 2 phương pháp sàng lọc sequential
stepwise và contingent đều dựa vào sàng lọc thai kỳ 1 và 2 để đưa ra kết quả
cuối cùng. Tuy nhiên kết quả sàng lọc thai kỳ 1 sẽ được trả lại cho bệnh nhân.
Sàng lọc sequential stepwise thực hiện sàng lọc thai kỳ 1 và quad test. Bệnh


14
nhân nguy cơ cao lệch bội sẽ được tư vấn và chẩn đoán sớm kết quả sàng lọc
thai kỳ 1. Sàng lọc contingent thực hiện sàng lọc thai kỳ 1 cho tất cả thai phụ,
sau đó phân loại nguy cơ cao, nguy cơ trung bình và nguy cơ thấp. Nhóm
nguy cơ cao sẽ được tư vấn xét nghiệm chẩn đoán. Nhóm nguy cơ thấp sẽ
không phải xét nghiệm thêm. Nhóm nguy cơ trung bình được tiếp tục xét

nghiệm quad test. Tỷ lệ phát hiện từ 88-95% với tỷ lệ dương tính giả là 5%.
Như vậy trong các phương pháp sàng lọc trước sinh bằng huyết thanh
mẹ kết hợp với siêu âm và một số yếu tố nguy cơ khác có thể tăng DR lên đến
96% nhưng FPR vẫn khá cao là 5% [29]. Do vậy vẫn cần một phương pháp
sàng lọc có tỷ lệ phát hiện cao hơn với tỷ lệ dương tính giả thấp hơn nữa để
có thể giảm bớt các xét nghiệm chẩn đoán xâm lấn gây ảnh hưởng tới thai phụ
và thai nhi [30].
II. Sàng lọc trước sinh không xâm lấn
2.1. Sàng lọc trước sinh bằng tế bào thai tự do trong máu mẹ
Từ năm 1893, người ta cho rằng tế bào của thai nhi có thể lưu hành trong
máu mẹ với sự kiện George Schmorl phát hiện được các nguyên bào nuôi
trong phổi của một thai phụ tử vong vì sản giật [31]. Nhưng phải đến năm
1969 khi Walknowska và cộng sự phát hiện được những tế bào lympho mang
NSTY trong máu của một thai phụ mang thai có giới tính nam, người ta mới
chắc chắn được rằng tế bào thai nhi thực sự có lưu hành trong máu mẹ [32].
Sau đó, một số nghiên cứu chứng minh đã tách chiết được tế bào thai lưu
hành trong máu phát hiện dị bội NST13, 18, 21, X và Y [33]. Về mặt lý
thuyết, các tế bào thai bào lưu hành trong máu mẹ là một nguồn mẫu lý tưởng
cho chẩn đoán trước sinh không xâm lấn vì toàn bộ bộ vật liệu di truyền và bộ
NSTcủa thai có thể được phân tích trực tiếp. Tuy nhiên, việc ứng dụng rộng
rãi chẩn đoán trước sinh không xâm lấn bằng phân tích tế bào thai lưu hành bị
hạn chế bởi số lượng tế bào và sự duy trì của nó trong vòng tuần hoàn của mẹ
sau khi sinh. Phân tích định lượng của các thành phần tế bào máu mẹ bằng
phương pháp PCR cho thấy rằng số lượng trung bình của tế bào thai trong


15
máu mẹ của thai phụ bình thường là 19 tế bào/16 ml máu (1.2 tế bào/ml)
trong thai kỳ 2 [34]. Bianchi và cộng sự đã phát hiện tế bào thai lưu hành
trong máu mẹ thậm chí 27 năm sau khi sinh [35], gây ra việc nhầm lẫn kết

quả do sự tồn tại của các tế bào của các lần mang thai trước đó.
* Một số tế bào thai xuất hiện trong máu mẹ.
- Tế bào hồng cầu: Sự hiện diện của tế bào hồng cầu thai nhi trong máu
người mẹ được chứng minh trong rất nhiều nghiên cứu. Tuy nhiên hồng cầu là
những tế bào không nhân nên không có tác dụng trong chẩn đoán di truyền học.
- Nguyên bào nuôi: việc sử dụng nguyên bào nuôi trong chẩn đoán trước
sinh có một số khó khăn nhất định. Thứ nhất, hiện tượng nguyên bào nuôi đi
vào tuần hoàn của người mẹ không phải xảy ra ở tất cả trường hợp mang thai.
Thứ hai, nếu hiện tượng này có xảy ra thì các nguyên bào nuôi cũng nhanh
chóng bị đào thải bởi tuần hoàn phổi. Ngoài ra, nguyên bào nuôi có nguồn
gốc ngoài phôi, tức là một phần của bánh rau, do vậy nguyên bào nuôi có khả
năng biểu hiện tình trạng khảm trong khoảng 1% trường hợp, do vậy nó
không phản ánh chân thực bộ gen của thai nhi.
- Tế bào bạch cầu: việc sử dụng tế bào bạch cầu thai nhi trong máu
người mẹ cũng gặp một số khó khăn nhất định. Bianchi và cộng sự đã phát
hiện rằng các tế bào gốc tạo máu, các tế bào tiền thân lympho tủy và tế bào
lympho T của thai nhi có thể tồn tại trong máu người mẹ nhiều năm. Do vậy,
nếu kỹ thuật này thực hiện ở các lần mang thai sau thì rất có thể sẽ thu nhận
những tế bào bạch cầu của thai nhi trong lần mang thai trước. Ngoài ra, việc
nhận diện các tế bào bạch cầu thai nhi cũng gặp bất lợi là hiện nay các loại
kháng thể đơn dòng để phát hiện bạch cầu tương ứng chưa có đầy đủ.


16
- Tế bào gốc và các tế bào gốc tạo máu: phương pháp này có lợi điểm là
tế bào gốc có thể nhân lên nhanh chóng trong in vitro, do vậy có thể cung cấp
đủ một lượng tế bào cần thiết cho các xét nghiệm di truyền học. Tuy nhiên các
tế bào này lại có khả năng tồn tại lâu trong máu người mẹ, do vậy, như trên đã
nói, nếu kỹ thuật này thực hiện ở các lần mang thai sau thì rất có thể sẽ thu
nhận những tế bào bạch cầu của thai nhi trong lần mang thai trước.

- Nguyên hồng cầu: các tế bào hồng cầu có nhân (nguyên hồng cầu) của
thai nhi là loại tế bào có thể đáp ứng tốt nhất các tiêu chí của kỹ thuật phát
hiện tế bào thai nhi trong máu người mẹ vì nó có đời sống tương đối ngắn, có
hình thái đặc trưng và hầu như luôn hiện diện trong máu người mẹ ở bất kỳ
trường hợp mang thai nào. Do vậy, hiện nay người ta thường tiến hành tách,
làm giàu các nguyên hồng cầu thai từ máu người mẹ để tiến hành phân tích,
xác định bệnh lý di truyền nói chung.
2.2. Sàng lọc trước sinh bằng DNA thai tự do (cffDNA) trong máu mẹ
2.2.1. Lịch sử phát hiện cffDNA
Năm 1948, Mandel và Metais phát hiện có một số lượng nhỏ DNA tự do
ngoài tế bào do quan sát có sự lưu hành của DNA và RNA trong huyết tương
của người khỏe mạnh và người bệnh [36]. Vào năm 1997, Lo và cộng sự sử
dụng kỹ thuật PCR thông thường khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu cho
NST Y rồi điện di trên thạch agarose đã phát hiện được DNA thai tự do
(cffDNA) trong hầu hết các mẫu huyết tương hoặc huyết thanh của những thai
phụ mang thai nam [37]. Đặc biệt hơn cả là trong phân tích định lượng bằng
realtime-PCR đã chỉ ra DNA trong huyết tương mẹ bao gồm số lượng lớn
cffDNA, nồng độ cffDNA tăng tương ứng với tuổi thai [38], nhóm nghiên cứu
chỉ ra DNA tự do trong huyết thanh mẹ chứa một lượng lớn DNA tự do có
nguồn gốc từ thai chiếm 3.4% - 6.2%. cffDNA có nồng độ cao hơn khoảng 20
đến 25 lần so với nồng độ tế bào thai trong máu mẹ ở cùng một giai đoạn
mang thai. cffDNA cũng có thể được phát hiện chỉ trong 10 μL huyết thanh


17
của mẹ, cao hơn đáng kể so với các tế bào thai tự do được lấy ra từ một thể
tích máu toàn phần tương tự. cffDNA tồn tại trong máu mẹ dưới dạng các
phân mảnh nhỏ DNA (150-200bp) có nguồn gốc từ tế bào lá nuôi phôi
(cytotrophoblast) do quá trình chết theo chương trình của tế bào (Apoptosis)
[39]. CffDNA chiếm 3-13% tổng số cfDNA trong máu mẹ, có thể phát hiện

sớm trong máu mẹ sau tuần thai thứ 7 và biến mất nhanh chóng 2 giờ sau
sinh [40]. Do vậy cffDNA được coi là nguồn mẫu lý tưởng cho xét nghiệm
sàng lọc trước sinh phát hiện lệch bội ở thai. Năm 1998, nhóm máu của thai
nhi Rhesus D (RhD) đã được xác định bằng phương pháp không xâm lấn
[41]. Năm 2008, việc phát hiện trisomy 21 bằng phương pháp giải trình tự
đồng thời khối lượng lớn các đoạn nucleotide (MPS) đã được mô tả lần đầu
tiên bởi 2 nhóm nghiên cứu là Chiu và Fan [42],[43]. So với việc phân tích tế
bào thai lưu hành trong máu mẹ thì việc khám phá ra cffDNA giúp việc phân
tích đơn giản hơn và ít tốn thời gian hơn [44]. Kể từ đó, đã có rất nhiều báo
cáo về việc sử dụng cffDNA cho việc sàng lọc không xâm lấn các lệch bội
NSTcủa thai nhi mà chủ yếu ở NSTsố 21.

Hình 1: Nguồn gốc cffDNA
Năm 2011, NIPS đã có mặt tại Hoa Kỳ và một vài nơi trên thế giới và
theo hướng dẫn của quốc tế [45],[46] NIPS đã được giới thiệu như là một thử
nghiệm trên thai phụ nguy cơ cao sinh con dị tật bẩm sinh. Chỉ vài năm sau,


18
NIPS được xem là thử nghiệm sàng lọc chính xác cho trisomy 21, 18 và 13 ở
cả thai kỳ có nguy cơ cao và nguy cơ thấp [47], với độ nhạy > 99% và tỷ lệ
phần trăm dương tính giả <0,1% [48],[49]. NIPS hiện đang được sử dụng
trong chẩn đoán tiền sản để chẩn đoán các bệnh di truyền liên kết với giới tính
X (như hội chứng hemophilia) và bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, và một
số bệnh di truyền đơn gen [49],[50].
2.2.2. Các bước giải trình tự thế hệ mới sử dụng cffDNA phân tích lệch bội NST
Bước đầu tiên trong giải trình tự thế hệ mới (NGS) là thu thập mẫu máu
mẹ, ly tâm tách huyết tương, tách chiết DNA từ huyết tương. Vì cfDNA là
phân mảnh DNA nên thực hiện ngay bước gắn kết adapter cho những phân
mảnh DNA, khuếch đại clonal của các mảnh DNA bằng các công nghệ khác

nhau như làm giàu bằng PCR (Polymerase chain reaction) trong môi trường
dung dịch (emulsion PCR) đối với công nghệ giải trình tự trên máy đọc trình
tự 454 của Roche và máy đọc trình tự SOLiD, Ion Torent của Life
Technologies hoặc PCR bắc cầu (bridge PCR) theo công nghệ của Illumina.
Cuối cùng, đọc trình tự các đoạn DNA đã được làm giàu bằng các công nghệ
tương ứng.


19
Hình 2: Sơ đồ tổng quát các bước giải trình tự cffDNA bằng NGS

Máu mẹ
DNA tự do
mẹ và thai
Giải trình tự
cfDNA
bằng MPS
Gióng hàng
Đếm
Hình 3: Tóm tắt các bước phát hiện lệch bội NST bằng NGS
Các kỹ thuật giải trình tự sâu được sử dụng để cho phép phân tích định
lượng DNA thai trong máu mẹ. Trình tự truyền thống có độ sâu hoặc độ bao
phủ (coverage) từ 5 đến 10 lần, có nghĩa là khoảng 5 đến 10 lần đọc độc lập
có sẵn cho mỗi chuỗi nucleotide hiện diện trong mẫu. Trong khi, trình tự sâu
ở NGS đề cập đến có độ bao phủ lớn 100 lần, cho phép hàng triệu tỷ lần đọc
đồng thời trong một lần chạy [51]. Lợi ích lớn nhất của trình tự sâu là nó cho
phép định lượng chính xác. Định lượng có thể bằng cách phân tích mức độ
thường xuyên của một dãy cụ thể được đọc so với tổng số lần đọc trong một
lần chạy nhất định.
NGS có thể được sử dụng để phát hiện lệch bội NST thai bằng cách sắp

xếp và phân tích tỷ số allele của locus đích. Các đoạn DNA có nguồn gốc từ
các biến thể allele của một gen có thể được phân biệt dựa trên SNPs. Thông
tin SNPs cho quá trình này xác định các gen đồng hợp tử ở mẹ và dị hợp tử ở
bào thai, có nghĩa là người mẹ có kiểu gen AA và thai có kiểu gen AB. Thông