Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài sóc chụm (Glochidion Glomerulatum) và loài sóc lông (Glochidion Hirsutum) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN VĂN THẮNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC
TẾ BÀO CỦA LOÀI SÓC CHỤM (GLOCHIDION GLOMERULATUM) VÀ
LOÀI SÓC LÔNG (GLOCHIDION HIRSUTUM) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số

: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2018


Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Phan Văn Kiệm
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Vũ Kim Thư

Phản biện 1:
Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học
viện, họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam vào hồi

giờ

, ngày

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Hà Nội

tháng

năm 2018.


1
MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của luận án
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, có khoảng 80% dân số sử dụng y học

cổ truyền, đặc biệt là dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu. Trong
quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc, kinh nghiệm sử dụng thuốc
trong dân gian là một trong những yếu tố quan trọng làm tăng tỷ lệ thành
công trong tìm kiếm các hợp chất dẫn đường để tổng hợp thuốc thông qua

việc giảm thời gian, tiết kiệm chi phí và ít độc hại với cơ thể sống. Do đó,
cây dược liệu vẫn là đối tượng thu hút mạnh mẽ sự quan tâm của các nhà
khoa học trên thế giới trong nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất mới.
Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam, chi Bọt ếch (Glochidion) ở
Việt Nam có nhiều loài được sử dụng làm thuốc và dược liệu chữa các
bệnh như: Sóc Dalton chữa lỵ trực trùng; Bòn bọt chữa viêm ruột và lỵ,
viêm da do tiếp xúc, ngứa, viêm da tróc vảy, mày đay, eczema; ở Viện
Dược liệu, lá cây Sóc mốc dùng làm thuốc mạnh gân xương và hàn vết
thương; cây Sóc lông thường dùng chữa ỉa chảy, ăn uống không tiêu, sôi
bụng, lá cây dùng trị rắn cắn,... Các nghiên cứu về thành phần hóa học
cho thấy chi Glochidion chứa nhiều lớp chất đáng quan tâm như
terpenoid, steroid, megastigmane, flavonoid, lignanoid và một số dạng
phenolic khác. Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch
chiết và các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi này có các hoạt tính
đáng quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, kháng nấm, kháng khuẩn,
chống oxi hóa,...
Do đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học
và hoạt tính gây độc tế bào của loài Sóc chụm (Glochidion
glomerulatum) và loài Sóc lông (Glochidion hirsutum) ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài G. glomerulatum và G.
hirsutum ở Việt Nam.


2

Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được để tìm
kiếm các hoạt chất tiềm năng.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:
1. Phân lập các hợp chất từ cành và lá hai loài G. glomerulatum và

G. hirsutum ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký;
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng
các phương pháp vật lý, hóa học;
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được.
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
Phần này trình bày tổng quan các nghiên cứu trong nước và quốc tế
về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học chi Glochidion.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Cành và lá loài Sóc chụm (Glochidion glomerulatum) thu tại Phúc
Yên, Vĩnh Phúc, Việt Nam vào tháng 9/2012.
Cành và lá loài Sóc lông (Glochidion hirsutum) thu tại Sơn Động,
Bắc Giang, Việt Nam vào tháng 12/2012.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
Phối hợp các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC),
sắc ký lớp mỏng điều chế và sắc ký cột (CC), sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC).
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là
kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao
gồm: phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), độ quay
cực ([]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được xác định theo
phương pháp MTT và SRB.


3

2.3. Phân lập các hợp chất
2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài G. glomerulatum
Phần này trình bày quá trình phân lập 10 hợp chất từ loài G.
glomerulatum.

Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. glomerulatum.


4

2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài G. hirsutum
Phần này trình bày quá trình phân lập 5 hợp chất từ loài G. hirsutum.

Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. hirsutum
2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất
2.4.1. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài
G. glomerulatum
Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 10 hợp chất
phân lập được từ loài G. glomerulatum.


5

2.4.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài
G. hirsutum
Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 5 hợp chất
phân lập được từ loài G. hirsutum.
2.5. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập đƣợc
2.5.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập từ loài G. glomerulatum

- 10 hợp chất (GG1-GG10) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
trên 4 dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, OVCAR, HT-29 theo phương
pháp thử hoạt tính gây độc tế bào MTT.
Bảng 2.1. % ức chế các dòng tế bào của các hợp chất GG1-GG10
tại nồng độ 100 µM
Hợp chất
GG1
GG2
GG3
GG4
GG5
GG6
GG7
GG8
GG9
GG10

A-549
97,54 ± 2,06
94,66 ± 1,22
71,24 ± 0,52
94,67 ± 1,62
96,21 ± 0,72
72,89 ± 0,56
97,43 ± 1,02
54,68 ± 0,21
69,54 ± 1,08
75,11 ± 0,96

MCF-7

82,28 ± 1,42
79,69 ± 1,30
83,25 ± 1,26
79,86 ± 2,34
80,34 ± 2,80
72,15 ± 0,38
74,38 ± 4,60
54,89 ± 0,30
71,02 ± 1,24
61,34 ± 4,20

OVCAR
90,64 ± 1,28
88,18 ± 0,84
97,12 ± 2,04
83,89 ± 2,06
91,56 ± 1,16
78,03 ± 1,86
92,08 ± 3,46
80,11 ± 2,82
82,13 ± 0,92
85,67 ± 1,04

HT-29
95,22 ± 2,38
93,12 ± 2,92
92,34 ± 0,20
91,98 ± 0,53
96,89 ± 3,20
77,21 ± 0,12

99,32 ± 4,44
81,11 ± 3,96
87,23 ± 1,36
79,52 ± 1,76

Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc 4 dòng tế bào theo nồng độ
của các hợp chất GG1-GG10
IC50 (µM)
A-549
MCF-7
OVCAR
9,3± 1,4
50,1± 3,2
8,9± 2,2
GG1
10,2± 2,3
56,1± 4,3
10,6± 3,3
GG2
41,0 ± 3,5
58,4 ± 3,7
6,6 ± 0,7
GG3
9,7 ± 1,2
60,7 ± 5,2
41,5 ± 3,1
GG4
7,9 ± 0,8
42,8 ± 5,2
9,8 ± 2,1

GG5
58,2 ± 2,4
69,3 ± 5,2
59,4 ± 6,8
GG6
8,2 ± 1,0
63,5 ± 3,6
8,6 ± 3,1
GG7
94,9 ± 4,1
86,3 ± 5,2
34,1 ± 3,4
GG8
58,1 ± 4,6
67,5 ± 4,8
45,8 ± 2,5
GG9
51,7 ± 3,1
77,2 ± 5,5
27,7 ± 4,6
GG10
7,2 ± 0,5
10,3 ± 1,2
8,4 ± 0,9
ĐC*
*ĐC: Mitoxantrone được sử dụng là chất đối chứng dương.

Hợp chất

HT-29

7,8± 1,2
9,5± 1,6
7,3 ± 1,4
7,5 ± 1,7
5,9 ± 0,5
49,3 ± 3,1
5,9 ± 0,7
45,0 ± 2,4
49,1 ± 4,1
58,7 ± 3,9
3,1 ± 0,3


6

2.5.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập từ loài G. hirsutum
- 5 hợp chất (GH1-GH5) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
trên 4 dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626, HepG2 theo phương
pháp thử hoạt tính gây độc tế bào SRB.
Bảng 2.3. % ức chế các dòng tế bào của các hợp chất GH1-GH5
tại nồng độ 100 µM
Hợp chất
GH1
GH2
GH3
GH4
GH5

A-549

90,10 ± 2,80
98,60 ± 1,64
97,44 ± 4,28
98,69 ± 2,32
96,06 ± 2,24

MCF-7
91,33 ± 1,12
98,28 ± 2,14
99,49 ± 0,98
96,86 ± 1,28
96,74 ± 3,12

SW-626
90,22 ± 3,14
98,21 ± 3,72
96,98 ± 3,34
94,14 ± 2,66
95,18 ± 1,80

HepG2
92,17 ± 1,38
99,09 ± 1,76
99,83 ± 2,38
99,39 ± 3,64
96,77 ± 4,90

Bảng 2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc 4 dòng tế bào theo nồng độ
của các hợp chất GH1-GH5
Hợp chất

GH1
GH2
GH3
GH4
GH5
ĐC*

A-549
9,3 ± 0,3
4,4 ± 0,7
49,3 ± 4,1
8,0 ± 2,2
8,6 ± 1,3
1,8 ± 0,3

IC50 (µM)
MCF-7
9,2 ± 0,5
4,7 ± 0,6
51,9 ± 3,7
8,8 ± 1,3
10,2 ± 2,4
2,0 ± 0,3

SW-626
8,5 ± 1,3
6,6 ± 1,0
54,4 ± 1,5
9,1 ± 1,1
10,1 ± 1,9

2,1 ± 0,3

HepG2
8,2 ± 1,3
3,4 ± 0,3
47,0 ± 5,6
7,6 ± 0,8
9,9 ± 3,1
1,4 ± 0,2

*ĐC: Ellipticine được sử dụng là chất đối chứng dương.

CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài G.
glomerulatum
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc
10 hợp chất mới được phân lập từ loài G. glomerulatum: Glomeruloside
I-II (GG1-GG2), Glomeruloside A-H (GG3-GG10). Mười hợp chất mới
đều là các hợp chất saponin khung olean-12-ene.


7

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của 10 hợp chất mới phân lập được
từ loài G. glomerulatum
Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một
hợp chất mới là GG1.
3.1.1. Hợp chất GG1 : Glomeruloside I
Hợp chất GG1 phân lập được dưới dạng chất rắn dạng bột vô
định hình màu trắng. Công thức phân tử của GG1 được xác định là

C55H84O20 bởi sự xuất hiện của pic ion giả phân tử [M + Cl]- tại m/z:
1099,5260 trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính toán lý
thuyết cho anion [C55H84O20Cl]- là 1099,5250 đvC).
Phổ 1H-NMR của hợp chất GG1 cho thấy tín hiệu proton của bảy
nhóm methyl dưới dạng singlet tại H 0,89 (3H, s), 0,93 (3H, s), 0,99 (3H,
s), 1,04 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,10 (3H, s) và 1,30 (3H, s); một proton


8

olefin tại H 5,35 (1H, br s); năm proton thơm tại H 8,05 (2H, d, J = 7,6
Hz), 7,49 (2H, t, J = 7,6 Hz) và 7,60 (1H, t, J = 7,6 Hz) gợi ý sự tồn tại
của một nhóm phenyl; 3 proton anome tại H 4,46 (1H, d, 8,0 Hz), 4,62
(1H, d, 7,6 Hz), 4,86 (1H) gợi ý hợp chất này có ba đơn vị đường. Các tín
hiệu proton của phần đường, tín hiệu proton dạng singlet của bảy nhóm
methyl thuộc phần aglycone và sự xuất hiện một số lượng lớn các tín hiệu
proton ở vùng trường cao (δH 0,81 ~ 2,46) cho phép dự đoán đây là một
hợp chất saponin khung oleane.

Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG1 và hợp chất tham khảo GG1A

Hình 3.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG1

Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG1

Phổ C-NMR của hợp chất GG1 xuất hiện tín hiệu của 55 carbon
và được phân loại bằng phổ DEPT thành: 1 carbon carbonyl (C 167,18),
13

9

8 carbon không liên kết với hydro (C), 27 nhóm methine (CH), 12 nhóm
methylene (CH2), 7 nhóm methyl (CH3). Trong đó, có 30 carbon thuộc
phần khung triterpene, 18 carbon của ba đơn vị phân tử đường hexose, 7
carbon còn lại của nhóm benzoyl. Các số liệu phổ proton được gán với
các số liệu carbon tương ứng thông qua phổ HSQC. Phân tích số liệu phổ
1
H- , 13C-NMR và phổ HSQC cho phép xác định sự tồn tại cấu trúc khung
olean-12-ene với các tín hiệu đặc trưng: 7 nhóm methyl tại C 16,12 (H
0,99, 3H, s), 16,80 (H 0,89, 3H, s), 17,29 (H 1,07, 3H, s), 27,49 (H 1,30,
3H, s), 27,49 (H 1,04, 3H, s), 28,32 (H 1,10, 3H, s) và 34,32 (H 0,93,
3H, s); hai carbon olefin tại C 124,23 (H 5,35, 1H, br s) và 143,40 cho
thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton. Ngoài ra, sự
tồn tại của 1 nhóm benzoyl được khẳng định bởi các tín hiệu cộng hưởng
tại C 132,10 (C-1), 130,43 (C-2 và C-6), 129,62 (C3 và C-5), 134,09
(C-4) và 167,33 (C-7).

Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG1

Hình 3.6. Phổ HSQC của hợp chất GG1

Nhận thấy các số liệu phổ NMR của hợp chất GG1 tương tự với
hợp chất GG1A (Glochierioside A [14]) ở phần aglycone, sự khác biệt
chỉ đến ở hợp phần các đơn vị đường (bảng 3.1). Vị trí các nhóm thế và
qui kết các giá trị phổ 1H-, 13C-NMR của hợp chất GG1 được thực hiện
bằng cách so sánh với số liệu phổ tương ứng của GG1A và được khẳng
định lại bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, HMBC và
COSY. Tương tác HMBC từ H-24 (δH 0,89) tới C-3 (δC 91,90)/ C-4 (δC
40.54)/ C-5 (δC 56,87)/ C-23 (δC 28,32) và giá trị độ chuyển dịch hóa học

của C-3 cho phép xác định một liên kết C-O tại C-3. Đồng thời các tương
tác trực tiếp HSQC gồm H-3/C-3, H-24/C-24, H-23/C-23 cho phép qui


10

kết các giá trị phổ 1H-, 13C- tại các vị trí này. Tương tác HMBC từ H-25
(δH 0,99) tới C-1 (δC 39,94)/ C-5 (56,87)/ C-9 (δC 48,10)/ C-10 (δC 37,66)
và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-1/C-1, H-25/C-25) cho phép qui
kết các giá trị phổ tại C-1, C-9, C-10 và C-25. Tương tác HMBC từ H-26
(δH 1,07) tới C-7 (δC 33,61)/ C-8 (δC 41,18)/ C-9 (48,10)/ C-14 (δC 44,20)
và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-7/C-7, H-26/C-26) cho phép qui
kết các giá trị phổ tại C-7, C-8, C-14 và C-26.

Hình 3.7. Phổ HMBC của hợp chất GG1

Hình 3.8. Phổ 1H– 1H COSY của hợp chất GG1

Tiếp tục, tương tác HMBC từ H-27 (δH 1,30) tới C-8/ C-13 (δC
143,40)/ C-14/ C-15 (δC 37,55) và tín hiệu carbon không liên kết với
hydro ở vùng Csp2 của C-13 cho thấy vị trí liên kết đôi C=C tại C-12/C13, kết hợp với tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-27/C-27, H-15/C15, H-12/C-12) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-12, C-13, C-15 và
C-27. Các tương tác HMBC từ H-29 (δH 0,93) và H-30 (δH 1,04) tới C-19
(δC 47,13), C-20 (30,98), C-21 (38,33) và các tương tác trực tiếp trên phổ
HSQC (H-29/C-29, H-30/C-30, H-19/C-19, H-21/C-21) cho phép quy kết
các giá trị phổ tại C-18, C-19, C-20, C-21, C-29 và C-30. Các tương tác
COSY giữa H-2/H-3, H-5/H-6, H-11/H-12, H-15/H-16, H-18/H-19, H21/H-22 cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-2, C-6, C-11, C-16, C-18
và C-22. Các tương tác HMBC từ H-28 (δH 3,68 và 4,02) tới C-16 (δC
69,44), C-18 (43,41), C-22 (72,04) và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC
(H-28/C-28) cho phép quy kết giá trị phổ tại C-28. Tín hiệu carbon δC
44,80 được qui kết cho giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-17 và được

11

khẳng định bằng các tương tác HMBC của H-16 (δH 4,32), H-18 (δH
2,46) và H-22 (δH 5,91) tới C-17.

Hình 3.1. Kết quả phân tích GC các đường chuẩn và hỗn hợp đường của hợp
chất GG1 sau khi thủy phân.
a) Kết quả phân tích GC của L – glucose
c) Kết quả phân tích GC của D – glucose
b) Kết quả phân tích GC của L – galactose d) Kết quả phân tích GC của D – galactose
e) Kết quả phân tích GC của hỗn hợp đường của hợp chất GG1 sau khi thủy phân

Tiếp đó, số liệu phổ của các đơn vị đường trong hợp chất GG1
cũng được qui kết dựa trên dữ liệu phổ 13C-NMR, phân tích phổ hai chiều
COSY, HSQC, HMBC và kết quả phân tích GC sau khi thủy phân đường
của GG1. Kết quả thủy phân đường và phân tích bằng GC cho thấy hợp
chất GG1 có chứa hai loại đơn vị đường với thời gian lưu lần lượt tR1 =
14,098 phút và tR2 = 18,713 phút (hình 3.9e). So sánh với kết quả phân
tích GC của các đường chuẩn, quan sát thấy thời gian lưu tR1 = 14,098
phút tương tự với thời gian lưu của đường D-glucose (tR = 14,106 phút,
hình 3.9b) và thời gian lưu tR2 = 18,713 phút tương tự với thời gian lưu
của đường D-galactose (tR = 18,706 phút, hình 3.9d), điều này khẳng định
phần đường của GG1 có đường D-glucose và đường D-galactose. Tương
tác HMBC giữa Gal H-1 (δH 4,46, d, J = 8,0 Hz) với aglyone C-3 (δC


12

91,90), chuỗi tương tác quan sát được trên phổ COSY gồm Gal H-1/ Gal
H-2/ Gal H-3/ Gal H-4/ Gal H-5 cùng với các tương tác trực tiếp trên
phổ HSQC của các proton này cho phép quy kết các giá trị phổ của đơn
vị đường galactose và liên kết O-glycoside của đường này với aglycone
tại C-3. Tương tác HMBC giữa Glc I H-1 (δH 4,86) và Gal C-2 (δC
76,40), cùng với chuỗi các tương tác COSY Glc I H-1/Glc I H-2/Glc I
H-3/ Glc I H-4/ Glc I H-5/ Glc I H-6 cho phép qui kết các giá trị
phổ của đơn vị đường Glc I và liên kết (1→2) giữa Glc I với Gal. Các số
liệu phổ carbon của Glc II (δC 105,24, 75,28, 77,32, 71,17, 78,07, 62,40)
và tương tác HMBC giữa Glc II H-1 (δH 4,62) với Gal C-3 (δC 85,25)
cho thấy Glc II cũng là một đơn vị đường glucose tự do gắn với Gal bởi
liên kết (1→3) O-glycoside. Những phân tích trên cho phép xác nhận cấu
trúc chuỗi mạch trisaccharide liên kết với C-3 là O-β-D-glucopyranosyl
(1→3)-[β-D-glucopyranosyl (1→2)]-β-D-galactopyranoside.

Hình 3.2. Các tương tác COSY, HMBC và ROESY chính của hợp chất GG1

Hóa lập thể khung aglycone của hợp chất GG1 tiếp đó được
minh chứng dựa trên phân tích phổ tương tác không gian ROESY. Các
tương tác ROESY giữa H-25/H-26, H-18/H-30 cho thấy các proton này
gần nhau trong không gian và cùng định hướng beta như sinh tổng hợp
của các hợp chất thứ cấp khung oleane. Tương tự như vậy, tương tác
ROESY giữa H-5/H-9/H-27 cũng minh chứng cho sự định hướng alpha
của các proton này. Trên phổ ROESY của GG1 quan sát thấy tương tác


13

giữa H-3 (δH 3,22) và H-5 (δH 0,81) cho phép xác định proton H-3 định
hướng alpha giống H-5, hay nhóm oxygen thế ở C-3 định hướng beta.

Ngoài ra, quan sát thấy tương tác ROESY giữa H-22 (δH 5,91)/H-16 (δH
4,32) nhưng không quan sát thấy tương tác ROESY giữa H-18 (δH 2,46)
với H-22 (δH 5,91)/H-16 (δH 4,32), điều đó cho phép xác định proton H16 và H-22 cùng định hướng alpha, hay nhóm oxygen thế ở C-22 định
hướng beta. Từ các phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học của hợp chất
GG1 được xác định là 22β-benzoyloxy-3β,16β,28-trihydroxyolean-12ene 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-[β-D-glucopyranosyl (1→2)]-β-Dgalactopyranoside. Đây là một hợp chất mới theo cơ sở dữ liệu Scifinder
2015, hợp chất GG1 được đặt tên là Glomeruloside I. Số liệu phổ 1H- và
13

C-NMR của GG1 được tổng hợp tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG1 và hợp chất tham khảo
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

20
21
22

Ca,b
40,08
27,20
90,50
40,40
57,08
19,44
33,77
41,36
48,31
37,87
24,83
124,41
143,61
44,38
37,72
69,60
44,97
43,59
47,31
31,15
38,49
72,20

#

Ca,c
39,94
27,09
91,90
40,54
56,87
19,28
33,61
41,18
48,10
37,66
24,67
124,23
143,40
44,20
37,55
69,44
44,80
43,41
47,13
30,98
38,33
72,04

DEPT
CH2
CH2
CH
C
CH

CH2
CH2
C
CH
C
CH2
CH
C
C
CH2
CH
C
CH
CH2
C
CH2
CH

Ha,d (độ bội, J, Hz)
1,02 (m)/1,65 (m)
1,76 (m)/1,96 (m)
3,22 (br d, 11,2)
0,81 (d, 11,2)
1,47 (m)/1,62 (m)
1,41 (m)/1,63 (m)
1,60 (m)
1,95 (m)
5,35 (br s)
1,52 (m)/1,98 (m)
4,32 (br d, 10,0)

2,46 (d, 12,4)
1,22 (m)/1,90 (m)
1,78 (m)
5,91 (br s)


14
C
23
24
25
26
27
28

#

Ca,b
28,64
17,14
16,31
17,44
28,08
64,86

Ca,c
28,32
16,80
16,12
17,29

27,49
64,69

DEPT
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH2

29
30
22-O-Bz
1
2, 6
3, 5
4
7
3-O1
2
3
4
5
6
2-O-Glc
1
2
3
4

5
6
3-O-Glc
1
2
3
4
5
6

34,48
27,65

34,32
27,49

CH3
CH3

Ha,d (độ bội, J, Hz)
1,10 (s)
0,89 (s)
0,99 (s)
1,07 (s)
1,30 (s)
3,68 (d, 10,8)/
4,02 (d 10,8)
0,93 (s)
1,04 (s)

132,31
130,61
129,79
134,24
167,33
Ara
107,25
72,24
84,00
69,66
66,81

132,10
130,43
129,62
134,09
167,18
Glc
105,83
76,40
85,25
69,97
75,92
63,76

C
CH
CH
CH
C

8,05 (d, 7,6)
7,49 (t, 7,6)
7,60 (t, 7,6)
-

CH
CH
CH
CH
CH
CH2

4,46 (d, 8,0)
4,00 (m)
3,81 (m)
4,12 (br s)
3,55 (m)
3,54 (m)/3,83 (m)

103,51
76,05
78,32
72,53
77,86
62,34

CH
CH
CH

CH
CH
CH2

4,86(m)
3,14 (t, 8,0)
3,33 (m)
3,08 (t, 8,0)
3,32 (m)
3,70 (m)/3,84 (m)

105,24
75,28
78,32
71,17
78,07
62,40

CH
CH
CH
CH
CH
CH2

4,62 (d, 7,6)
3,32 (m)
3,32 (m)
3,30 (m)
3,33 (m)

3,73 (m)/3,84 (m)

105,53
75,47
77,80
71,33
78,04
62,52

a

CD3OD, b tại 200 MHz, c tại 100 MHz, d tại 400 MHz

#

C của GG1A (Glochierioside A [14])


15

Hình 3.11. Phổ ROESY của hợp chất GG1

3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài G. hirsutum
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc
5 hợp chất mới được phân lập từ loài G. hirsutum: Hirsutoside A-E
(GH1-GH5). Năm hợp chất mới này đều là các hợp chất saponin khung
olean-12-ene.

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của 5 hợp chất phân lập được từ loài G. hirsutum

Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một
hợp chất là GH1.


16

3.2.1. Hợp chất GH1 : Hirsutoside A
Hợp chất GH1 được phân lập dưới dạng chất bột, vô định hình
màu trắng. Công thức phân tử của GH1 được xác định là C43H64O11 bởi
sự xuất hiện của pic ion giả phân tử [M + Na]+ tại m/z: 779,4370 trên phổ
khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức
[C43H64O11Na]+: 779,4346 đvC). Phổ 1H-NMR của hợp chất GH1 cho
thấy tín hiệu proton của sáu nhóm methyl dưới dạng singlet tại H 0,75
(3H, s), 0,96 (3H, s), 1,04 (3H, s), 1,06 (3H, s), 1,17 (3H, s) và 1,34 (3H,
s); một proton olefin tại H 5,37 (1H, t, J = 3,0 Hz); năm proton thơm tại
H 8,04 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,51 (2H, dd, J = 8,0 và 8,0 Hz) và 7,62 (1H,
t, J = 8,0 Hz) gợi ý sự có mặt một nhóm phenyl; một proton anome tại H
4,43 (1H, d, J = 8,0 Hz) gợi ý hợp chất này có một đơn vị đường.

Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất GH1 và hợp chất tham khảo GH1B

Hình 3.14. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GH1

Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của hợp chất GH1

Phổ 13C-NMR của hợp chất GH1 xuất hiện tín hiệu của 43 carbon
và được phân loại bằng phổ DEPT thành: 1 nhóm carboxyl (C 167,85), 8
carbon không liên kết với hydro (C), 17 nhóm methine (CH), 11 nhóm
methylene (CH2), 6 nhóm methyl (CH3). Các tín hiệu giúp gợi ý cấu trúc
khung olean-12-ene: sáu nhóm methyl tại C 13,39 (H 0,75, 3H, s), 16,60

17

(H 1,04, 3H, s), 17,45 (H 1,06, 3H, s), 18,85 (H 1,17, 3H, s), 27,41 (H
1,34, 3H, s) và 29,43 (H 0,96, 3H, s); hai carbon olefin tại C 124,93 (H
5,37, 1H, t, 3,0 Hz) và 142,99. Ngoài ra, các tín hiệu cộng hưởng tại C
129,63; 130,43; 131,87; 134,23 và 167,85 xác nhận sự có mặt của 1
nhóm benzoyl.
Phân tích các số liệu 1H- và 13C-NMR của GH1 nhận thấy khá
tương đồng với hợp chất tham khảo 21β-benzoyloxy-3β,16β,23,28tetrahydroxyolean-12-ene (GH1B) đã công bố ở phần aglycone và nhóm
benzoyl [9], khác nhau ở chỗ hợp chất GH1 có sự xuất hiện thêm các tín
hiệu của phần đường. Vị trí các nhóm thế và quy kết các giá trị phổ 1Hvà 13C-NMR của hợp chất GH1 được khẳng định lại bằng phổ cộng
hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, HMBC, COSY.

Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của hợp chất GH1

Hình 3.17. Phổ HSQC của hợp chất GH1

Các tương tác HMBC từ H-2 (δH 8,04)/ H-6 (δH 8,04) tới C-7
(δC 167,85), C-1 (δC 134,23) và các tương tác COSY giữa H-2/H-3, H3/H-4, H-4/H-5, H-5/H-6 cùng với các tương tác trực tiếp trên phổ
HSQC (H-2/C-2, H-3/C-3, H-4/C-4, H-5/C-5, H-6/C-6) cho phép
quy kết các giá trị phổ tại C-1, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6, C-7 của
nhóm benzoyl. Các tương tác HMBC giữa H-29 (δH 0,96)/H-30 (δH 1,17)
với C-19 (δC 47,95)/C-20 (δC 36,61)/C-21 (δC 78,17) cùng với tương tác
HMBC giữa H-21 (δH 5,16) với C-7 (δC 167,85) chỉ ra rằng nhóm
benzoyloxy liên kết với aglycone tại C-21. Ngoài ra, tương tác HMBC từ
H-24 (δH 0,75) tới C-3 (δC 83,33)/ C-4 (δC 43,89)/ C-5 (δC 48,11)/ C-23
(δC 64,82) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-3 và C-23 cho phép
xác định một liên kết C-O tại C-3 và một nhóm hydroxy tự do tại C-23.

18

Hình 3.18. Phổ HMBC của hợp chất GH1

Hình 3.19. Phổ COSY của hợp chất GH1

Các số liệu phổ carbon của phần đường (δC 105,72, 75,63, 77,72,
71,56, 78,32, 62,73) cùng với tín hiệu proton anome tại H 4,43 (1H, d, J
= 8,0 Hz, H-1) và kết quả thủy phân đường, phân tích bằng GC cho thấy
đây là một đơn vị đường D-glucose. Tương tác HMBC giữa H-1 (δH
4,43) với aglycone C-3 (δC 83,33), chuỗi tương tác quan sát được trên
phổ COSY gồm H-1/ H-2/ H-3/ H-4/ H-5/ H-6 cùng với các tương
tác trực tiếp trên phổ HSQC của các proton này cho phép qui kết các giá
trị phổ của đơn vị đường glucose và liên kết O-glycoside của đường này
với aglycone tại C-3.
Trên phổ NOESY của GH1 quan sát thấy tương tác giữa H-3 (δH
3,67), H-5 (δH 1,66) và H-23 (δH 3,31 và 3,67) cho phép xác định proton
H-3, H-5 và nhóm CH2OH cùng định hướng alpha, hay nhóm oxygen thế
ở C-3 định hướng beta. Ngoài ra, quan sát thấy tương tác NOESY giữa
H-21 (δH 5,16)/Hα-19 (δH 2,10)/H-29 (δH 0,96) cùng với tương tác
NOESY giữa H-16 (δH 4,36) với H-27 (δH 1,34)/Hα-19 (δH 2,10) cho phép
xác định H-16, H-21 cùng định hướng alpha, suy ra nhóm oxygen thế ở
C-16, C-21 định hướng beta. Từ các phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học
của hợp chất GH1 được xác định là 21β-benzoyloxy-3,16,23,28tetrahydroxyolean-12-ene 3-O- -D-glucopyranoside. Đây là một hợp
chất mới theo cơ sở dữ liệu Scifinder, hợp chất GH1 được đặt tên là


19

Hirsutoside A. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của GH1 được tổng hợp tại
bảng 3.2.

Hình 3.20. Các tương tác COSY, HMBC và NOESY chính của hợp chất GH1

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất GH1 và hợp chất tham khảo
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

#

C
39,4
28,2
73,6
43,4
48,9
19,0
33,2
40,6
47,7
37,5
24,4
124,1
143,1
44,2
37,2
67,2
44,7
43,5
47,7
36,4
77,7
31,0

Ca,b
39,62
26,31

83,33
43,89
48,11
18,81
33,29
41,06
48,14
37,51
24,72
124,93
142,99
44,55
36,48
67,88
44,74
43,64
47,95
36,61
78,17
30,21

DEPT
CH2
CH2
CH
C
CH
CH2
CH2
C

CH
C
CH2
CH
C
C
CH2
CH
C
CH
CH2
C
CH
CH2

23

68,1

64,82

CH2

Ha,c (độ bội, J, Hz)
1,00 (m)/1,66 (m)
1,73 (m)/1,98 (m)
3,67 (dd, 3,5, 13,0)
1,66 (m)
1,44 (m)/1,57 (m)
1,36 (m)/1,74 (m)

1,27 (m)
1,96 (m)
5,37 (t, 3,0)
1,44 (m)/1,82 (m)
4,36 (dd, 5,0, 12,0)
2,51 (dd, 4,5, 14,0)
1,33 (m)/2,10 (m)
5,16 (dd, 5,0, 12,0)
1,73 (dd, 12,0, 13,5)
2,39 (dd, 5,0, 13,5)
3,67 (d, 13,0)/


20
C

#

C

Ca,b

DEPT

24
25
26
27
28

13,7
16,7
17,5
27,4
66,9

13,39
16,60
17,45
27,41
66,58

CH3
CH3
CH3
CH3
CH2

29
30
21-O-Bz
1
2, 6
3, 5
4
7
3-O-Glc
1
2
3

4
5
6

29,6
19,3

29,43
18,85

CH3
CH3

Ha,c (độ bội, J, Hz)
3,31 (d, 13,0)
0,75 (s)
1,04 (s)
1,06 (s)
1,34 (s)
3,42 (d, 11,0)/
3,73 (d, 11,0)
0,96 (s)
1,17 (s)

132,0
130,4
129,4
133,7
166,7

134,23
130,43
129,63
131,87
167,85

C
CH
CH
CH
C

8,04 (d, 8,0)
7,51 (dd, 8,0, 8,0)
7,62 (t, 8,0)
-

105,72
75,63
77,72
71,56
78,32
62,73

CH
CH
CH
CH
CH
CH2

4,43 (d, 8,0)
3,20 (t, 8,0)
3,36 (m)
3,31 (m)
3,30 (m)
3,67 (dd, 4,5, 12,0)
1,86 (dd, 2,0, 12,0)
a
đo trong CD3OD, b tại 125MHz, c tại 500 MHz, # C của GH1B (21β-benzoyloxy 3β,16β,23,28-tetrahydroxyolean-12-ene) đo trong pyridine-D5, tại 100MHz [9]

Hình 3.21. Phổ NOESY của hợp chất GH1

3.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc
3.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài G.
glomerulatum
Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của mười hợp chất GG1GG10 trên các dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, OVCAR, HT-29


21

(bảng 2.2.) cho thấy các hợp chất GG1, GG2, GG5 và GG7 có nhóm thế
benzoyloxy ở C-22 thể hiện hoạt tính gây độc mạnh với dòng tế bào ung
thư A-549, HT-29 và OVCAR với giá trị IC50 dao động từ 5,9 µM đến
10,6 µM (tương đương với chất đối chứng dương mitoxantrone, IC50 dao
động trong khoảng 3,1 µM đến 10,3 µM). Hợp chất GG3 thể hiện độc
tính trên dòng tế bào HT-29 và OVCAR với giá trị IC50 tương ứng 7,3
µM và 6,6 µM. Hợp chất GG8-GG10 không có nhóm thế benzoyloxy ở
C-22 thể hiện hoạt tính gây độc yếu với giá trị IC50 từ 27,7 µM đến 94,9
µM. Hợp chất GG4 không có nhóm thế nào tại C-16 và C-22 biểu hiện

độc tính mạnh với giá trị IC50 là 9,7 µM và 7,5 µM đối với dòng tế bào
ung thư A-549 và HT-29. Tất cả mười hợp chất đều có hoạt tính gây độc
yếu trên dòng tế bào ung thư MCF-7.
Các kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã báo cáo về
hoạt tính gây độc của các hợp chất saponin khung oleanane với nhóm thế
acyl ở C-21 và C-22 đối với các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm
A-549, HL-60 và HCT-116 của các nhóm nghiên cứu đã công bố [43, 46,
84-86]. Nghiên cứu hiện tại cho thấy hoạt tính gây độc tế bào của các hợp
chất GG1, GG2, GG5 và GG7 đối với các dòng tế bào A-549, HT-29 và
OVCAR tương đương với mitoxantrone.
3.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài G.
hirsutum
Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của năm hợp chất
GH1-GH5 trên bốn dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626,
HepG2 (bảng 2.4.) cho thấy các hợp chất GH1, GH2, GH4 và GH5 có
nhóm thế benzoyloxy ở C-21 thể hiện hoạt tính gây độc mạnh với cả bốn
dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626 và HepG2 với giá trị IC50
dao động từ 3,4 µM đến 10,2 µM (chất đối chứng dương ellipticine, IC50
dao động trong khoảng 1,4 µM đến 2,1 µM). Điều này một lần nữa cho
thấy các hợp chất saponin khung oleanane có chứa nhóm acyl ở C-21 có
tiềm năng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư [43, 46, 8486]. Hợp chất GH3 có chứa nhóm acetyloxy tại glc C-6" có hoạt tính gây
độc tế bào yếu với các giá trị IC50 dao động từ 47,0 µM đến 54,4 µM.


22

Trong mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các hợp
chất GH1-GH3: khi hợp chất có thêm một đơn vị đường tại glc C-3"
(hợp chất GH2) thì hoạt tính gây độc tế bào biểu hiện mạnh hơn, tuy
nhiên, khi xuất hiện một nhóm acetyloxy tại glc C-6" (hợp chất GH3) thì

hoạt tính gây độc tế bào thể hiện yếu đi. Nghiên cứu hiện tại đã chứng tỏ
rằng hoạt tính gây độc tế bào của GH2 thể hiện trên cả bốn dòng tế bào
ung thư người thử nghiệm A-549, MCF-7, SW-626, HepG2, tương đương
với hoạt tính gây độc tế bào ung thư của chất sử dụng làm đối chứng
dương ellipticine.
KẾT LUẬN
Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của hai loài Glochidion glomerulatum (Sóc chụm) và
Glochidion hirsutum (Sóc lông) ở Việt Nam.
1. Nghiên cứu về thành phần hóa học
Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký, các phương pháp phổ
hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 15 hợp chất mới từ hai loài G.
glomerulatum và G. hirsutum, các hợp chất này đều là các saponin khung
olean-12-ene:
- Từ loài G. glomerulatum đã phân lập và xác định cấu trúc 10
hợp chất mới: Glomeruloside I (GG1), Glomeruloside II (GG2),
Glomeruloside A (GG3), Glomeruloside B (GG4), Glomeruloside C
(GG5),

Glomeruloside

D

(GG6),

Glomeruloside

E

(GG7),

Glomeruloside F (GG8), Glomeruloside G (GG9), Glomeruloside H
(GG10).
- Từ loài G. hirsutum đã phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp
chất mới: Hirsutoside A (GH1), Hirsutoside B (GH2), Hirsutoside C
(GH3), Hirsutoside D (GH4), Hirsutoside E (GH5).
2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
- Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 10
hợp chất phân lập từ loài G. glomerulatum trên 4 dòng tế bào ung thư


23

người là: A-529, HT-29, OVCAR, MCF-7. Kết quả cho thấy, các hợp
chất Glomeruloside I, II, Glomeruloside C, E thể hiện hoạt tính gây độc
mạnh với dòng tế bào ung thư A-549, HT-29 và OVCAR với giá trị IC50
dao động từ 5,9 µM đến 10,6 µM. Hợp chất Glomeruloside A thể hiện
hoạt tính gây độc mạnh trên dòng tế bào HT-29 và OVCAR với giá trị
IC50 tương ứng 7,3 µM và 6,6 µM; Glomeruloside F-H thể hiện hoạt tính
gây độc yếu với cả bốn dòng tế bào thử nghiệm; Glomeruloside B biểu
hiện độc tính mạnh với giá trị IC50 là 9,7 µM và 7,5 µM đối với dòng tế
bào ung thư A-549 và HT-29. Tất cả mười hợp chất đều có hoạt tính gây
độc yếu trên dòng tế bào ung thư MCF-7.
- Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 5
hợp chất phân lập từ loài G.hirsutum trên 4 dòng tế bào ung thư người là:
A-529, MCF-7, HepG2, SW-626. Kết quả cho thấy, hợp chất Hirsutoside
A, B, D, E thể hiện hoạt tính gây độc mạnh với cả bốn dòng tế bào ung
thư A-549, MCF-7, SW-626 và HepG2 với giá trị IC50 dao động từ 3,4
µM đến 10,2 µM. Hợp chất Hirsutoside C có hoạt tính gây độc tế bào yếu
trên cả bốn dòng tế bào thử nghiệm với các giá trị IC 50 dao động từ 47,0

µM đến 54,4 µM.
KIẾN NGHỊ
Hợp chất Glomeruloside B biểu hiện độc tính mạnh với giá trị IC50 là
9,7 µM và 7,5 µM đối với dòng tế bào ung thư A-549 và HT-29; các hợp
chất Glomeruloside I, II và Glomeruloside C, E thể hiện hoạt tính gây độc
mạnh với dòng tế bào ung thư A-549, HT-29 và OVCAR với giá trị IC50
dao động từ 5,9 µM đến 10,6 µM; các hợp chất Hirsutoside A, B, D, E
thể hiện hoạt tính gây độc mạnh với cả bốn dòng tế bào ung thư A-549,
MCF-7, SW-626 và HepG2 với giá trị IC50 dao động từ 3,4 µM đến 10,2
µM. Vì vậy, cần thêm các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây độc tế bào, tác
dụng dược lý của các hợp chất này