Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ

i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG 

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, 
GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI 
LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY 
THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC 
NHỜ AGROBACTERIUM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

i


ii

HÀ NỘI – 2018 

ii


iii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG 

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, 
GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI 
LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY 
THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC 
NHỜ AGROBACTERIUM

Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã số: 94 20 116

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:  

1. TS. Nguyễn Trung Nam 

Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
Viện Công nghệ sinh học

iii


iv

HÀ NỘI – 2018 

iv


v

LỜI CẢM ƠN
Luận án được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, 
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ 
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ  Việt Nam và Trung tâm Chẩn 
đoán Thú y Trung ương. Với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên  
cứu thường xuyên của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công 
nghệ sinh học. 
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn  
nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ  hướng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà 
khoa học, các anh chị  em đồng nghiệp và quý cơ  quan, phòng ban. Tôi xin chân 
thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng  
của Viện Công nghệ  sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành 
luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy, PGS.TS. Chu Hoàng Hà và 
TS. Nguyễn Trung Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi  
điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận  
án.
Tôi xin chân thành cảm  ơn GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Phạm Bích 
Ngọc, PGS.TS. Đinh Duy Kháng, PGS.TS. Tô Long Thành, TS. Nguyễn Tường 
Vân, ThS. Hồ Thị Thương và tập thể cán bộ  Phòng Công nghệ  tế  bào thực vật, 
Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ  gen đã luôn giúp đỡ, chia sẻ  những 
kiến thức quý báu và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình 
thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm  ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp,  
Ban Lãnh đạo, cùng toàn thể cán bộ  của Viện Công nghệ  sinh học Lâm nghiệp  
đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để cho tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án.
Cuối cùng, tôi xin cảm  ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn  
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này.
       Hà Nội, ngày    tháng    năm 2018

v


vi
Nghiên cứu sinh
    
                                                      
                            Nguyễn Thị Minh Hằng

vi


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự  hướng dẫn khoa học của 
PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Trung Nam và một số  kết quả  cùng cộng  
tác với các cộng sự khác.
Các số  liệu và kết quả  trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã 
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép 
của các đồng tác giả.
Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai công bố  trong bất kỳ  công 
trình nào khác. 
Hà Nội, ngày    tháng    năm 2018
              Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hằng

i

ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH 
 MỞ ĐẦU    1
  
 Chương 1   6 
 TỔNG QUAN TÀI LIỆU                                                                                              
 
.............................................................................................
   
 6
 Chương 2   43 
 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU                                                   
 
..................................................
    
 43
 Chương 3   61 
 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU                                                                                          
 
.........................................................................................
    
 61
 Chương 4   108 

 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU                                                                  
 
.................................................................
    
 108
 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ                                                                                   
 
..................................................................................
    
 132
 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN                   
 
..................
    
 132
 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH                                                           
 
..........................................................
    
 133
 TÀI LIỆU THAM KHẢO                                                                                         
 
........................................................................................
    
 140

ii


iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AS
aa
2b CMV

Acetosyringone
Amino acid  (axit amin)
Cucumber mosaic virus (CMV) 2b protein (Protein 2b của virus 

bp
BSA
CaMV
Cs
DNA
ER
ELISA
ELP
et al
Fc
GFP
GP5
GP5ecto
HC­Pro
HP­PRRSV

khảm dưa chuột)
Base pair (Cặp base)
Bovine serum albumin
Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ)

Cộng sự
Deoxyribonucleic acid
Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất)
Enzyme linked immunosorbent assay
Elastin­like polypeptide
And co­workers  (và các cộng sự)
Fragment crystallizable
Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh)
Glycoprotein 5
Ectodomain of glycoprotein (Vùng ngoại bào của protein GP5)
Helper component protease (Protein hỗ trợ)
Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome 
virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thể độc 

HRP
IPMA

lực cao)
Horseradish peroxidase
Immunoperoxidase monolayer assay (Xét nghiệm miễn dịch đơn 

IgG
kb
kDa
LB 

lớp cộng hợp enzyme peroxidase)
Immunoglobulin G
Kilobase
Kilodalton

Luria­Bertani (Môi trường nuôi khuẩn Luria­Bertani) 

iii


iv

LV
M
MES
mg
MLV

Lelystad virus
Matrix/ Membrance protein
2­(N­ Morpholino)ethanesulfonic acid
Milligram
Modified­live virus (Virus sống đã làm biến đổi = virus nhược 

mITC

độc)
Membrane­based  Inverse transition cycling (Chu trình chuyển pha 

nptII

nghịch đảo qua màng)
Gene mã hoá  Neomycin phosphotransferase (Gen kháng 

Nos

nsp
OD

kanamycin)
Nopaline synthase terminator
Non­structural protein
Optical density (Mật độ quang)

ORF

Open reading frame (Khung đọc mở)

PBS

Phosphate­buffered saline

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Fc

Stabilizing domain ­ "Fragment of crystallizable chain of IgG" 

PRRSV

(Vùng hằng định của kháng thể IgG)
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (Virus gây 

RNA

hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn)
Ribonucleic acid

ScFv

Single chain variable fragment

SDS­PAGE

Sodium dodecyl sulphate­polyacrylamide gel electrophoresis

TSP

Total soluble protein (Protein tổng hợp)

35S Ter

35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã)

VLP

Virus­like particle

WT

Wild type (Cây không chuyển gen)

DANH MỤC BẢNG

iv


v
Bảng 1.1

Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016 
………………...

Bảng 2.1
Bảng 2.2
Bảng 2.3

8

Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen gp5opt, gp5ecto­ 4
m và m ………………………………………………………..

4

Thành phần phản ứng ghép nối gen m, gp5opt với vector 

4

pRTRA 35S­Histag­Cmyc­100xELP ………………………..

7

Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gp5ecto với gen m và 

4

với vector pRTRA 35S­Histag­Cmyc­100xEL ……………… 7
Bảng 2.4

Thành phần phản ứng ghép nối các cassette gen với vector 

4

pCB301 ………………………………………………………. 8
Bảng 3.1

So sánh mức độ biểu hiện tạm thời gen mã hoá các kháng 
nguyên tái tổ hợp (M­ELP, GP5­ELP, GP5ectoM­ELP) trong 

Bảng 3.2

lá thuốc lá N. benthamiana 

8

…………………………………...

2

Hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch của các protein M­

9

ELP, GP5­ELP, GP5ectoM­ELP …………………………….. 1

v


vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

vi


Hình 1.1

Đặc điểm hình thái của virus PRRS 

Hình 1.2

………………………….
Ảnh hiển vi điện tử của các h
viiạt Arterivirus 

Hình 1.3

………………….
9
Mô hình cấu trúc hạt virus PRRS và các khung đọc mở trên 

Hình 1.4

hệ gen PRRS ………………………………………………… 12

Đặc điểm của GP5 

Hình 1.5
Hình 1.6

…………………………………................
13
Cấu trúc Arterivirus …………………………………………. 14
Sơ đồ mô tả sự biểu hiện gen tạm thời sử dụng các vector 

9

pEAQ bằng phương pháp thẩm lọc A. tumefaciens 
34

Hình 1.7

………….
Thẩm lọc nhờ A. tumefaciens vào lá N. benthamiana 

34

Hình 1.8

………..
Sơ đồ của chu kỳ chuyển pha nghịch đảo qua màng 

Hình 2.1

………...

41
Chuyển gen tạm thời vào lá cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens 
bằng phương pháp hút chân không 
50

Hình 2.2

…………………………..
Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột 

55

Hình 2.3

………………….
Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên lợn 

56

Hình 3.1

…………………….
Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S­m­Histag­Cmyc­

Hình 3.2

100xELP ……………………………………………………... 61
Sơ đồ cấu trúc cassette gen m mã hoá protein M dung hợp 

Hình 3.3

ELP............................................................................................ 62
Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S­m­Histag­

Hình 3.4

Cmyc­100xELP ……………………………………………… 63
Phân tích sản phẩm Colony­PCR kiểm tra A. tumefaciens 

Hình 3.5

mang vector pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP ………..
Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S­gp5opt­Histag­

Hình 3.6

Cmyc­100xELP ……………………………...
66
Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5opt mã hoá protein GP5 dung 

Hình 3.7

hợp ELP ……………………………………………………... 67
Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S­gp5opt­

Hình 3.8

Histag­Cmyc­100xELP ……………………………………… 68
Sản phẩm Colony­PCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector 

Hình 3.9

pCB301 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP ……………….. 69
Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S­gp5ecto­m­Histag­
70

Cmyc­100xELP ………………..…………
Hình 3.10  Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5ecto­m mã hoá protein  

65

vii


viii

viii


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hội chứng rối loạn sinh s ản và hô hấp  ở  lợn (Porcine reproductive and  
respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hi ểm trên lợn do 
virus gây ra.  Ở  Việt Nam, b ệnh còn đượ c gọi là “Bệnh lợ n tai xanh” (theo  
ngôn ngữ  đại chúng) do lợn mắc bệnh thường b ị xung huy ết  ở tai, lúc đầu đỏ 
sẫm, sau tím xanh. PRRS gây thiệt hại kinh tế rất lớn  ở nh ững n ước có bệnh. 
PRRS đượ c  phát  hiện  ở   Mỹ   vào  năm 1987.  Hàng năm  nước   Mỹ   phải chịu 
những thiệt hại do b ệnh này ướ c tính khoảng 664 triệu USD cho vi ệc tiêu huỷ  

lợ n chêt, l
́ ợn ôm, chi phi chông dich va x
́
́ ́
̣
̀ ử ly môi tr
́
ươ ̀ng.
Ở Việt Nam, dich PRRS do virus th
̣
ể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên  
vào năm 2007. Từ  đo đên nay, dich 
́ ́
̣ đã xuât hi
́ ện  ở  hâu hêt cac đia ph
̀
́ ́ ̣
ươ ng  
trong ca n
̉ ươ c. Theo th
́
ống kê của Cục Thú y, từ  cuối tháng 4/2016 đến tháng  
11/2016, đã xuất hiện 14  ổ  dịch PRRS tại 8 huy ện c ủa 4 t ỉnh là Quảng Trị,  
Hậu Giang, Nghệ  An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong  đó có 
1.242 con lợn b ị tiêu huỷ. PRRS đã anh hu
̉
̛ở ng nặng nê t
̀ ới nganh chan nuoi l
̀
̆

̂ ợn  
trong nước. Bệnh vẫn xuất hi ện  ở m ột s ố địa phươ ng và có tính chất 2­3 năm  
một lần. Điều này cũng cho thấy nguy c ơ xu ất hi ện tr ở l ại c ủa d ịch b ệnh này  
trong thời gian t ới.
Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và nhược 
độc. Cac vaccine vô ho
́
ạt thươ ̀ng an toan nh
̀
ưng kh ả  năng bao h
̉ ộ  thâp. Cac
́
́ 
vaccine nhượ c độc bao h
̉ ộ  tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về  tính an toàn 
của các loaị  vaccine này. Vaccine nhược độc có thể  giam dân m
̉
̀ ức bao h
̉ ộ  do 
giam m
̉
ức tương đông v
̀
ới chung m
̉
ới (nếu có) va ban thân virus vaccine sau
̀ ̉
 
nhiêu lân truyên nhi
̀ ̀

̀
ễm cũng co thê đ
́ ̉ ột biên tr
́ ở  thanh c
̀ ươ ̀ng độc. Mặc dù vậy,  
phòng chống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao. Hiện nay, d ịch ch ỉ xu ất  
hiện lẻ tẻ, trong những năm gần đây hầu như không có dịch, một phần là nhờ 
biện pháp chủ động tiêm phòng cho lợn.


2
Virus gây Hội chứng rối loạn sinh s ản và hô hấp  ở  lợn  ở  nướ c ta hiện  
nay đượ c xác định là thể  độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng 
chống dịch chủ  yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y 
(Tiêu độc khử  trùng, vệ  sinh truồng tr ại, cách ly và tiêu huỷ  lợn bệnh ...). Để 
phòng chống virus th ể  độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có 
thêm vaccine phù hợp. Nhu cầu về các loại vaccine PRRS th ế h ệ m ới trong đó  
có vaccine tiểu đơn vị, an toàn và hiệu quả là vấn đề cấp thiết. 
Protein   GP5   và   M   là   những   protein   cấu   trúc   chính   của   virus   PRRS  
(PRRSV) đượ c lựa chọn là những  ứng viên tiềm năng để  sản xuất vaccine  
tiểu đơn vị chống PRRSV. Các kháng thể  kháng GP5 và M  ở  lợn là các kháng  
thể  có khả  năng trung hoà PRRSV. Sự  kết hợp đoạn peptit miền ngoài của  
kháng nguyên GP5 (Ectodomain, GP5ecto) được cho là chứa các epitope trung hoà  
của   GP5   với   protein   M   với   mong   muốn   sẽ   tạo   được   protein   tái   tổ   hợp 
heterodimer GP5ectoM có khả  năng kích thích tạo đáp  ứng miễn dịch mạnh và 
trở thành một trong những ứng viên tiềm năng làm nguyên liệu để phát triển sản 
xuất vaccine chống PRRSV.
Kháng nguyên của  virus PRRS có  thể  đượ c  sản xuất trong hệ  th ống  
thực vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị  phòng PRRS thông qua phươ ng 
pháp biểu hiện gen tạm thời. H ệ  th ống bi ểu hi ện gen t ạm th ời  ở  th ực v ật  

bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên 
có nhiều  ưu điểm như: Mức độ  biểu hiện kháng nguyên cao, có thể  sản xuất  
protein với số  lượng l ớn, ph ương pháp thực hiện đơn giản, thời gian nhanh,  
không bị   ảnh hưởng bởi vị  trí gắn gen đích trong tế  bào thực vật và có thể 
tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá, cung cấp kháng  
nguyên cho mục đích sản xuất vaccine chống ch ủng virus m ới xu ất hi ện m ột  
cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra.
Căn cứ  vào các luận cứ  khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án  
được thực hiện với  đề  tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, 
GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong 


3
cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium” với mục đích 
tạo cơ  sở  khoa học và thực nghiệm để  biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên  
của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu 
hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục 
vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung
Nghiên cứu cơ  sở  khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng 
nguyên tái tổ  hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây 
bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc 
lá phục vụ cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới.
Mục tiêu cụ thể
Thiết   kế  được   3  cấu  trúc  vector   chuyển   gen  mang  gen  m,  gp5optimize 
(gp5opt) và gp5ecto­m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối 
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter  
CaMV 35S. 
Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên  

M, GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc 
lá và tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá 
thuốc lá.
Đánh   giá   được   tính   sinh   miễn   dịch   của   protein   tái   tổ   hợp   M,   GP5   và 
GP5ectoM trên động vật thí nghiệm.  
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m, 
gp5opt   và  gp5ecto­m  mã   hoá   kháng   nguyên   tái   tổ   hợp   M­ELP,   GP5­ELP,  
GP5ectoM­ELP và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng.
Nội dung 2: Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen  m,  gp5opt và 
gp5ecto­m  ở  lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Biểu hiện tạm thời và tinh 
sạch các kháng nguyên tái tổ hợp.


4
Nội dung 3: Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể  của kháng nguyên M­
ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.
4. Đong gop m
́
́ ới cua lu
̉
ận án
Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ  việc 
thiết kế  vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS 
gây bệnh lợn tai xanh, tối  ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực  
vật, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của  
kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. 
Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về việc 
thiết kế  vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m 
mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của chủng 

virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc  
lá N. benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. 
Kết quả  của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ 
hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP có khả  năng kích thích sinh kháng thể 
đặc hiệu kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó, kháng nguyên  
GP5ecto (vùng ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM­
ELP) kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên M­ELP, GP5­
ELP riêng lẻ. Kháng nguyên GP5ectoM­ELP và GP5­ELP là hai  ứng viên tiềm  
năng để  sản xuất vaccine tiểu đơn vị  chống PRRSV thể  độc lực cao đang gây 
bệnh ở Việt Nam.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 
Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp cơ  sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu 
trúc   vector   chuyển   gen   mang   gen   m/gp5opt/gp5ecto­m  mã   hóa   cho   các   kháng 
nguyên  tái  tổ  hợp  M,  GP5  và  GP5ectoM  của  PRRSV  dung  hợp Elastin  ­  like 
polypeptide (ELP); biểu hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá  
bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá 
khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp 
này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về 


5
tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị  phòng PRRS trong  
thực vật. 
Ý nghĩa thực tiễn
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen  m/ gp5opt/ gp5ecto­m 
mã hóa các kháng nguyên tái tổ  hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của 
chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng A. tumefaciens mang 
các vector này có thể  được sử  dụng để  nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát 
triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS.

Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp  
thẩm lọc nhờ  A. tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể 
ứng   dụng   để   sản   xuất   các   kháng   nguyên   tái   tổ   hợp   M­ELP,   GP5­ELP,  
GP5ectoM­ELP hoặc các protein tái tổ hợp khác.
Kháng nguyên tái tổ hợp GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được tạo ra trong đề 
tài luận án là hai  ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị  phòng  
bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam.


6

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
1.1.1. Sơ lược tình hình dịch bệnh
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp  ở  lợn (Porcine Reproductive and  
Respiratory Syndrome ­ PRRS) còn được gọi là Bệnh lợn tai xanh (theo ngôn ngữ 
đại chúng), lần đầu tiên được phát hiện  ở  Mỹ  vào năm 1987, với các biểu hiện 
bệnh ở cơ quan sinh sản và hô hấp. Lợn nái mắc hội chứng này bị sảy thai ở thai  
kỳ cuối, thai lưu, đẻ non, lợn con sinh ra yếu hoặc bị chết, tỷ lệ đẻ  thấp, chậm 
động dục trở lại. Lợn con đang bú sữa hoặc lợn con đã cai sữa có biểu hiện rối  
loạn hô hấp nghiêm trọng. Sau đó, dịch PRRS đã lây lan nhanh sang nhiều quốc 
gia khác bao gồm: Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh  
(1991) và  ở  Pháp (1992) (Rossow, 1998). Đến năm 1991, nguyên nhân gây bệnh 
“bí hiểm” được xác định là do một loại virus RNA gây ra. Ngay sau đó, virus này  
cũng   đã   được   phân   lập   ở   Mỹ   (Collins  et   al.,   1992),   Canada   (Dea  et   al., 
1992a,1992b) và nhiều nước trên thế  giới. Năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh 
này được tổ  chức tại St. Paul, Minnesota đã thống nhất tên gọi là hội chứng rối 
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRS và được tổ chức Thú y thế giới (OIE) công 
nhận. Từ đó, virus gây bệnh cũng được gọi là PRRSV. 

Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt 
lợn bệnh. Năm 2006, PRRS lại bùng phát trong vòng ba tháng, làm trên 2 triệu lợn  
mắc bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỷ lệ chết khoảng 20%. Bệnh có tốc độ 
lây lan nhanh, chỉ sau 3 ­ 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao  
40 ­ 420C, vì vậy năm 2006 bệnh này còn có tên là “bệnh sốt cao”. Năm 2007, 
dịch lại tiếp tục bùng phát, xảy ra  ở  26/33 tỉnh với 257.000 con mắc, làm chết 
hơn 68.000 con, tiêu huỷ 175.000 con. Các chủng PRRSV thể độc lực thấp và thể 
độc lực cao thuộc dòng Bắc Mỹ  đều đã được phân lập từ  các mẫu bệnh phẩm 
của lợn mắc bệnh. Từ đó đến nay, bệnh vẫn diễn biến phức tạp. Ở Philippines,  


7
PRRS xuất hiện từ năm 2006, trong năm 2007 có 18 ổ dịch, 13.542 con mắc, làm  
chết 1.743 con. Sau đó PRRS lan ra cả nước, gây  ốm và chết lợn nái và lợn con 
theo mẹ (Cục Thú y, 2008). Tại  Thái  Lan,  PRRS  xuất  hiện  vào  năm  1989  bao 
gồm  hai  chủng thuộc dòng châu Âu và Bắc Mỹ. Các báo cáo cho thấy, từ  năm 
2005  trở  lại đây,  25  nước  và vùng  lãnh  thổ thuộc  tất  cả  các Châu  lục  trên thế 
giới đều có PRRSV lưu hành (ngoại trừ châu Úc và  Newzeland) đã gây ra những 
thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi ở nhiều quốc gia trên khắp thế giới  
(Han et al., 2006). Ở Mỹ, hàng năm PRRS gây tổn thất ước tính thiệt hại lên đến 
664 triệu USD/năm (Holtkamp et al., 2012). 
Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn  
lợn giống 51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Từ cuối 1996 đến đầu năm 
2007,  không có  các  thông báo về  bệnh lâm sàng  hoặc  thiệt  hại trực   tiếp do  
PRRSV gây ra mà chỉ có thống kê về trường hợp dương tính với PRRSV của một  
số mẫu khi kiểm tra 478 mẫu huyết thanh của lợn tại Cần Thơ (Tô Long Thành, 
2007). Cuối tháng 2/2007, bệnh xảy ra trên các đàn lợn tại Hải Dương được xác 
định do nhiễm PRRSV thể  độc lực cao, là virus PRRS type II tương đồng 99% 
với các chủng của Trung Quốc (Feng   et al.,  2008). Cũng trong nam 2007, cac
̆

́ 
trương h
̀ ợp lợn măc PRRS v
́
ơi ty l
́ ̉ ệ măc va ty l
́ ̀ ̉ ệ chêt cao lân đâu tien đu
́
̀ ̀ ̂
̛ợc ghi  
nhạn xay ra tai Vi
̂ ̉
̣
ẹt Nam (C
̂
ục Thú y, 2007). Dich co xu hu
̣
́
̛ơng trâm trong hon do
́
̀
̣
̛
 
thương phat hi
̀
́ ẹn vi khuân kê phat (Tiêu Quang An 
̂
̉
́ ́

et al., 2011). Trong giai đoaṇ  
2007­2012, dich PRRS lien tuc xay ra tren di
̣
̂ ̣
̉
̂ ẹn r
̂ ọng tai nhiêu đia phuong, đ
̂
̣
̀ ̣
̛ ̛
ặc biệt  
trong cac nam 2008, 2010 va 2012, đa gay thi
́ ̆
̀
̃ ̂
ẹt hai nghiem trong cho ngu
̂ ̣
̂
̣
̛ơi chan
̀
̆ 
nuoi l
̂ ợn, anh hu
̉
̛ơng tieu c
̉
̂ ực đên an sinh xa h
́

̃ ọi va gay o nhiêm moi tru
̂ ̀ ̂ ̂
̃
̂ ̛ờng do phaỉ  
tieu huy hang tram ngan con l
̂ ̉
̀
̆
̀
ợn măc b
́ ệnh va chêt. 
̀ ́
Tháng 3/2008, bệnh tiếp tục bùng phát ở Thanh Hoá và Hà Tĩnh, đến tháng  
7/2008 bệnh lây lan trên 17 tỉnh/thành phố, trong đó có các tỉnh đồng bằng sông 
Cửu Long gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong nước (Đậu Ngọc 
Hào et al., 2008). Dich co tinh chât chu ky 2­3 năm m
̣
́ ́
́
̀
ột lân (C
̀ ục Thú y, 2011). 
Theo thống kê của Cục Thú y năm 2016 (Bảng 1.1), từ  cuối tháng 4/2016  
đến tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng  


8
Trị, Hậu Giang, Nghệ  An và Hà Tĩnh làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có  
1.242 con lợn tiêu huỷ. So với năm 2015, diện dịch có giảm nhẹ, nhưng số lợn  
mắc bệnh phải tiêu hủy là tăng cao hơn. Bệnh vẫn còn diễn biến phức tạp do sự 

biến chủng nhanh chóng của virus PRRS và sự tồn tại của virus này trong các đàn 
lợn lành bệnh. Điều này cũng cho thấy nguy cơ bùng phát trở  lại của dịch bệnh  
trong thời gian tới (Cục Thú y, 2016).
Bảng 1.1: Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016
Nội dung so sánh
Số xã có dịch
Số huyện có dịch
Số tỉnh có dịch
Số gia súc mắc bệnh, chết, tiêu hủy

Năm 2015

Năm 2016

19
11
06
1.288

14
08
04
3.433

(Nguồn: Cục Thú y, 2016)

1.1.2. Bệnh tích của PRRS
Trong cơ thể lợn bệnh, virus phá hủy đại thực bào làm giảm về số lượng  
và chức năng, dẫn đến suy giảm miễn dịch.   Lợn bị  mắc PRRS thường đi kèm 
nhiễm trùng các loại mầm bệnh kế phát khác như Dịch tả, tụ huyết trùng .v.v. 

Đối với PRRS, bệnh tích đặc trưng nhất là  ở  phổi. Phổi có hiện tượng 
viêm hoại tử, đặc trưng bởi những đám chắc, đặc. Trên các thuỳ phổi bị bệnh có 
màu xám đỏ, có mủ, chắc đặc. Mặt cắt ngang của các thuỳ phổi bệnh lồi ra, khô. 
Lợn bị viêm phế  quản, phổi hóa mủ. Bệnh tích vi thể  thấy phổi có hiện tượng  
dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm bạch cầu, trong phế  nang chứa đầy 
dịch viêm, đại thực bào. Một số  trường hợp hình thành tế  bào khổng lồ  nhiều  
nhân. Một bệnh tích khá đặc trưng  ở  phổi là hiện tượng phế  nang bị  nhăn và 
thấy có hiện tượng đại thực bào bị  phân huỷ.  Ở  các bộ  phận khác cũng có các 
dấu hiệu như xuất huyết trên da, thâm tím do chảy máu trong mô, lách nhồi máu, 
hóa gỗ  và nhiều bọt khí. Thận  có  nhiều  đốm  máu,  tim  có  nhiều  dịch  ở  màng 
bao,  gan  hoại  tử,  chảy dịch màu trắng ngà. Các mạch máu não mềm và mỏng, 
hạch não rỉ máu. Hạch bạch huyết có những đốm xuất huyết. Ngoài bệnh tích ở 
phổi, một số bệnh tích khác thường gặp tùy theo tình trạng bội nhiễm như viêm  


9
màng bao tim, viêm màng phổi, viêm phúc mạc, viêm màng não khi ghép với 
Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis (Mateu và Diaz, 2007).
1.1.3. Virus PRRS
1.1.3.1. Đăc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại PRRSV
Virus PRRS  (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, virus 
gây Hội trứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn  – PRRSV) thuôc chi 
̣
Arterivirus, 
họ  Arteriviridae, thuộc bộ  Nidovirales, là virus RNA sợi đơn, dương có vỏ  bao  
bọc  (Lunney  et al., 2016).  PRRSV  có hình dạng thay đổi từ  hình oval đến hình  
cầu (Hình 1.1). PRRSV có vỏ bọc ngoài với đường kính của hạt virus từ 50 – 65  
nm (trung bình là 55 nm). Phần lõi nucleocapsid có đường kính khoảng 40 nm, có 
cấu trúc đối xứng 20 mặt, được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc.

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của virus PRRS
(Nguồn: và )

Mặt   ngoài   virus   nhẵn   với   vài   điểm   lồi   lõm   do   các   vùng   ngoại   bào  
(ectodomain) của các glycoprotein vỏ tạo thành, cách biệt với vỏ bọc khoảng 2 ­  
3 nm. Bên trong hạt virus là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39 
nm (Hình 1.2).  Lớp lipit kép và phần lõi nucleocapsid cách nhau khoảng 3 nm.  
Lớp lõi nuclecapsid sắp xếp dạng xoắn, không đối xứng (Eric et al., 2013).


10

Hình 1.2. Ảnh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus
(Nguồn: A: Snijder et al., 1998; B, C: Spilman et al., 2009)
(A): Hình ảnh hiển vi điện tử của các hạt PRRSV; (B): Các hạt PRRSV tinh khiết; (C): Hạt PRRSV
điển hình với kích thước xác định.

1.1.3.2. Hệ gen và protein cấu trúc của virus PRRS
Hệ  gen của PRRSV đã được giải mã thành công và được ghi nhận vào 
năm 1993. Dựa vào kiểu gen (genotype), PRRSV được chia làm hai loại: kiểu gen 
Châu Âu (type I), đại diện tương  ứng là chủng Lelystad (LV) và kiểu gen Bắc  
Mỹ  (type II), đại diện tương  ứng là chủng VR2332. Genome của chủng virus  
VR2332 phân lập tại Mỹ  (số  đăng ký: AY150564) thuộc type II, đại diện dòng  
Bắc Mỹ  có độ  dài là 15451 bp (Nielsen   et al.,  2003). Genome của virus PRRS 
chủng GD (Quảng Đông, Trung Quốc) (số   đăng ký: EU109503) đại diện cho 
nhóm độc lực cao phân lập ở Trung Quốc cũng thuộc type II, có độ  dài là 15353  
bp (Zhou et al., 2009).  
Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 RNA thông tin (mRNA) 
được tổng hợp. Tất cả 6 mRNA đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận được từ 
đầu 5' của hệ  gen RNA và tất cả  chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA. Độ  dài 

các gen hoàn toàn khác nhau giữa PRRSV dòng châu Âu và Bắc Mỹ phản ánh sai 
khác di truyền và mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng thuộc 2 dòng 
này. Trong cùng một dòng Bắc Mỹ, các gen mã hoá cho các protein chức năng  
(ORF 2­7) có độ  dài gần như  nhau, nhưng có độ  khác nhau về  kích thước và 
thành phần gen mã hoá cho RNA­polymerase (ORF1a và ORF1b). Đặc điểm gen 
và hệ gen này là yếu tố  ảnh hưởng đến độc lực của virus PRRS mới xuất hiện  
gần đây  ở  Trung Quốc từ  cuối năm 2006 (Tian, 2007) và có lẽ  xâm nhập vào  
Việt Nam đầu năm 2007 với đặc tính hoàn toàn đồng nhất về đặc điểm di truyền  
và tính gây bệnh (Lê Thanh Hòa et al., 2009). Sự xuất hiện và lây lan của PRRSV  
độc lực cao  ở Trung Quốc, Việt Nam và Nam Á, sự đa nhiễm trộn lẫn các dòng  


11
PRRSV trên thế  giới sẽ  làm phức tạp hoá dịch tễ  học và vaccine phòng chống 
PRRSV.
Cấu trúc nucleocapsid của Arterivirus bao gồm genome RNA có chiều dài 
13 ­ 15 kb và protein nucleocapsid (N). Màng lipid kép bao quanh nucleocapsid 
chứa 7 protein vỏ  (Hình 1.3). Genome RNA đơn, chuỗi dương của virus chứa 9 
khung  đọc mở  (ORF ­ open reading frame) 1a, 1b, 2a, 2b và 3 – 7 (Hình 1.4). 
Trong đó, ORF 1a và 1b mã hóa cho protein phi cấu trúc replicase và polymerase  
tham gia vào quá trình nhân bản của virus, ORF 2 ­ 7 mã hóa các protein cấu trúc. 
ORF   1a   và   ORF   1b   chiếm   xấp   xỉ   khoảng   80%   genome   virus,   mã   hoá   hai 
polyprotein lớn là protein sao chép pp1a và pp1b. Những protein này được cắt 
đồng thời hoặc  sau  khi dịch  mã  bởi 4 protease  thành  14  protein  phi cấu  trúc  
(NSPs), NSP1α, NSP1β  và NSP2 đến NSP12. Một vùng đặc biệt thuộc protein  
NSP11 đóng vai trò quan trọng chu trình sao chép của tất cả  các virus thuộc chi  
Arterivirus. Chức năng sinh học của từng NSPs  ở virus PRRS đến nay cũng chưa 
được hiểu đầy đủ, ngoại trừ  chúng có hoạt tính sao chép, protease và polymer  
hóa (Fang và Snijder, 2010). 
ORFs 2a, 2b và 3­7 nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus, sau dịch mã được phân 

cắt thành các protein cấu trúc của virus PRRS (Wu et al., 2009). Các protein cấu 
trúc được mã hoá bởi các đoạn mRNA nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus và có cùng 
promoter nằm  ở  đầu 5’ (Meulenberg, 2000). Glycoprotein 5 (GP5), protein màng 
(M) và nucleoprotein (N) được mã hóa bởi các ORF 5­7, là các thành phần chính 
của hạt virus (Dea et al., 2000). ORF 2a, 3 và 4 mã hóa cho các protein khác thuộc 
hạt virus bao gồm GP2a, GP3 và GP4. Các protein này tương tác với nhau và tập  
hợp thành virion như một phức hệ đa thành phần và cũng tham gia vào quá trình  
lây nhiễm virus (Wissink  et al.,  2005). ORF 2b mã hóa cho protein vỏ  (E).  Khi 
phân  tích  hệ  gen của  PRRSV  thấy  rằng  các  khung  đọc  mở  (ORFs)  lồng 
vào  nhau  từ  1 ­ 253  bp.  Ví  dụ:  khung  đọc  mở  4  (ORF4)  và  5 (ORF5)  lồng 
vào  nhau  bởi  1  bp,  ORF3  và  ORF4  lồng  vào  nhau  bởi  253  bp. Như  vậy, các 
gen sau sử  dụng một phần cuối chu ỗi nucleotide của gen trước làm promoter