Tóm tắt Luận án tiến sĩ Vật lý kỹ thuật: Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ nhạy cao sử dụng điện cực in các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỖ THỊ NGỌC TRÂM

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN
HÓA ĐỘ NHẠY CAO SỬ DỤNG ĐIỆN CỰC IN CÁC BON
ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM

Ngành: Vật lý kỹ thuật
Mã số: 9520401

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ KỸ THUẬT

Hà Nội – 2018


Cơng trình được hồn thành tại:
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:
Hướng dẫn 1: PGS.TS. Trương Thị Ngọc Liên
Hướng dẫn 2: GS.TS. Patrick Wagner
Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Văn Hiếu
Phản biện 2: GS. TS. Nguyễn Năng Định
Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Thế Toàn

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp
tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Vào hồi ….. giờ, ngày.….. tháng…….năm….

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội
2. Thư viện Quốc gia Việt Nam


MỞ ĐẦU
Ung thư là bệnh có tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao đứng thứ hai trên thế giới
với hơn 200 loại ung thư khác nhau [60]. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp
Việt Nam ở vị trí 78 trên 172 quốc gia, vùng lãnh thổ được khảo sát với tỉ lệ
tử vong 110/100.000 người, nằm trong 50 nước thuộc nhóm 2 của bản đồ ung
thư thế giới [1]. Tuy nhiên, phần lớn bệnh nhân mắc bệnh ung thư tại Việt
Nam đến khám và điều trị ở giai đoạn khối u đã chuyển thành ác tính và di căn
nên tỷ lệ chữa khỏi bệnh là thấp, chi phí điều trị tốn kém. Hiện nay, việc khám
và chữa bệnh ung thư tại các bệnh viện chủ yếu dựa vào các phương pháp
truyền thống như siêu âm, chụp cộng hưởng từ và sinh thiết. Kết quả của các
phương pháp này phụ thuộc vào kích thước và đặc tính của khối u nên thường
phát hiện khi bệnh ở giai đoạn đã phát triển và không hiệu quả trong phát hiện
ung thư giai đoạn sớm [17]. Các chỉ dấu khối u thường được sinh ra từ tế bào
ung thư và biểu mô và có nồng độ cao hơn mức ở người bình thường. Các chất
này có thể xác định được bằng các kỹ thuật như ELISA [247], PCR [108],
miễn dịch phóng xạ (RIA) [131], phổ huỳnh quang [59], phổ khối [285] và sắc
kí [217]. Các kỹ thuật này cho phép phát hiện chỉ dấu khối u với độ chính xác
và độ chọn lọc cao; tuy nhiên yêu cầu thời gian phân tích lâu, chi phí hóa chất
cao, phân tích đơn lẻ từng chất chỉ dấu. Cảm biến sinh học điện hóa với ưu
điểm độ nhạy và độ chọn lọc cao, thời gian phân tích ngắn, cho phép phát hiện
chất cần phân tích ở nồng độ thấp, đơn giản và rẻ tiền, khả năng tích hợp trong
các thiết bị đo cầm tay ứng dụng phép phân tích tại chỗ đang là phương pháp
được ưu tiên lựa chọn để phát hiện chỉ dấu khối u. Chính vì vậy, tác giả quyết
định chọn đề tài “Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ nhạy

cao sử dụng điện cực in các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm”.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án:
(1) Phát triển cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa sử dụng điện cực in lưới
thương mại với chi phí thấp hướng đến ứng dụng thực tế trong các thiết bị cầm
tay.
(2) Cải tiến và phát triển các kỹ thuật biến tính bề mặt điện mực in các bon
nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học cũng như tăng cường đáp
ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa.
(3) Chế tạo cảm biến sinh hóa điện hóa có độ nhạy và độ chọn lọc cao phát
hiện chỉ dấu khối u (bao gồm các kháng nguyên α-hCG, PSA, AFP) ứng dụng
trong chẩn đoán sớm một số bệnh ung thư và cảm biến điện hóa enzyme xác
định glucose trong máu.
Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu của luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm.
1


Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
- Về lý luận khoa học: các kết quả thu được của luận án đã góp phần làm sáng
tỏ cơ chế hoạt động cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở sử dụng đầu thu
sinh học tự nhiên (kháng thể) và đầu thu sinh học bán tổng hợp aptamer.
- Về thực tiễn: kết quả nghiên cứu của luận án hướng tới phát triển cảm biến
sinh học có cấu trúc đơn giản, giá thành thấp, thời gian phân tích ngắn, độ nhạy
và độ chọn lọc cao, cho phép phát hiện chỉ dấu khối u trong giai đoạn sớm của
bệnh. Cảm biến sinh học đã chế tạo có định hướng ứng dụng trong các thiết bị
cầm tay đáp ứng yêu cầu xét nghiệm tại chỗ.
Những đóng góp mới của luận án:
1. Luận án đã đóng góp các kết quả mới về cơng nghệ chế tạo hạt nano vàng
phân tán đều trên bề mặt điện cực in lưới mực in các bon nhằm thay thế
điện cực in lưới mực in vàng. Hơn thế nữa giải pháp công nghệ này giúp

phân tán đều đầu thu sinh học trên bề mặt điện cực, nhờ đó nâng cao hiệu
suất bắt cặp giữa đầu thu và chỉ dấu sinh học cần phân tích.
2. Luận án đóng góp ba giải pháp biến tính bề mặt điện cực in lưới mực in các
bon bằng hệ vật liệu mới nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học
và đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa. Hệ vật liệu bao
gồm: (i) Polyme dẫn đồng trùng hợp polypyrrole-polypyrrole cacboxyl
(PPy-PPa); (ii) Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng
hợp PPy-PPa và ơxít graphene dạng khử điện hóa (erGO); (iii) Vật liệu lai
giữa poly(para-aminothiophenol) và hạt nano vàng.
3. Ứng dụng thành công đầu thu sinh học bán tổng hợp aptamer trong chế tạo
cảm biến phổ tổng trở điện hóa xác định chỉ dấu ung thư tiền liệt tuyến. Kết
quả nghiên cứu này là tiền đề cho định hướng nghiên cứu về cảm biến phổ
tổng trở điện hóa phát hiện chỉ dấu sinh học với chi phí thấp, khơng u
cầu điều kiện bảo quản nghiêm ngặt.
4. Ứng dụng thành công cấu trúc đa lớp giữa vật liệu polyme ơxy hóa-khử
Osmium và enzyme trong cảm biến cảm biến điện hóa enzyme thế hệ thứ
2. Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho định hướng nghiên cứu về cảm
biến điện hóa đo dịng phát hiện chỉ dấu sinh học trên cơ sở tác nhân sinh
học enzyme.
5. Xây dựng quy trình chế tạo quy mơ phịng thí nghiệm 06 cảm biến điện hóa
sử dụng điện cực in lưới mực in các bon cho phép xác định nồng độ chỉ dấu
khối u trong ngưỡng phát hiện sớm các bệnh ung thư (ung thư u tế bào mầm
tinh, ung thư tiền liệt tuyến và ung thư gan). Các cảm biến đã chế tạo có độ
nhạy và độ chọn lọc cao, yêu cầu lượng mẫu phân tích nhỏ (cỡ 3µL), thời
gian phân tích nhanh (khoảng 30 phút), thao tác đơn giản, có khả năng tích
hợp với thiết bị cầm tay.
2


Bố cục của luận án:

Chương 1. Cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng chẩn đốn bệnh sớm
Chương 2. Thực nghiệm và các phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu α-hCG ứng dụng chẩn đoán
u tế bào mầm tinh
Chương 4. Cảm biến aptamer phát hiện chỉ dấu PSA ứng dụng chẩn đóa ung
thư tiền liệt tuyến
Chương 5. Cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu AFP ứng dụng chẩn đoán
ung thư gan
Chương 6. Cảm biến điện hóa glucose
CHƯƠNG 1. CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HĨA ỨNG DỤNG CHẨN
ĐỐN BỆNH SỚM
1.1 Cảm biến sinh học
Theo Hiệp hội Quốc tế về Hóa học và Hóa học ứng dụng (IUPAC –
Internatonal Union of Pure and Applied Chemistry), cảm biến sinh học
(biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thơng tin, phân tích
định lượng hoặc bán định lượng của chất cần phân tích thơng qua việc sử dụng
đầu thu sinh học được cố định lên bộ phận chuyển đổi tín hiệu [101, 168]. Cấu
tạo của một cảm biến sinh học bao gồm ba phần chính: đầu thu sinh học, bộ
phận chuyển đổi và bộ phận xử lý đọc tín hiệu.
1.2 Cảm biến sinh học điện hóa
Cảm biến sinh học điện hóa là cảm biến hoạt động dựa trên nguyên tắc
chuyển đổi tín hiệu do tương tác sinh học thành tín hiệu điện của hệ điện hóa
(tín hiệu dịng, tín hiệu điện áp, tín hiệu độ dẫn, tín hiệu tổng trở) [104, 220].
Cảm biến loại này có ưu điểm như thời gian đáp ứng nhanh, độ nhạy và độ
chọn lọc cao. và được ứng dụng trong các phép phân tích y sinh trong y tế,
trong cơng nghệ sinh học thực phẩm hoặc kiểm sốt các thông số môi trường
[21, 155, 171].
Cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa dựa trên nguyên tắc nhận biết
tương tác sinh học xảy ra trên bề mặt điện cực và làm thay đổi trở kháng phức
của hệ điện hóa. Phép đo phổ tổng trở được khảo sát trong dung dịch điện ly

có cặp chất ơxy hóa-khử được gọi là phổ tổng trở Faradaic (EIS faradaic);
trong dung dịch điện ly khơng có cặp chất ơxy hóa-khử được gọi là phổ tổng
trở khơng Faradaic (EIS nonfaradaic) [25]. Mơ hình mạch tương đương
Randles được áp dụng đối với hệ điện hóa khảo sát trong dung dịch điện ly có
cặp chất ơxy hóa-khử, bao gồm 3 thành phần là Rs là điện trở của dung dịch
điện ly, Rct điện trở truyền điện tích, Cdl là điện dung lớp kép, trở kháng
Warburg ZW.
1.2.1 Điện cực điện hóa
3


4 mm

(a)

(b)

Tiếp xúc
thiết bị

Điện cực
làm việc cácbon
(2,64 mm2)

Vùng mặt
nạ không
thấm nước

Điện cực đối

12,5 mm

Điện so sánh
Ag/AgCl

Điện cực
làm việc vàng
(3,67 mm2)

Hình 1.18. Điện cực in lưới màng dày của hãng BioDevice Technology (Nhật Bản)
(a) điện cực làm việc mực in các bon; (b) điện cực làm việc mực in vàng.

Điện cực in lưới màng dày có nhiều ưu điểm như: giá thành thấp, cho phép
sản xuất hàng loạt, thiết kế linh hoạt, độ lặp lại cao, nguồn nguyên liệu phong
phú. Điện cực làm việc sử dụng mực in cácbon hay kim loại (vàng hoặc platin),
điện cực so sánh sử dụng mực in Ag/AgCl. Mực in cácbon với ưu điểm dịng
phơng nền thấp và giá thành rẻ và khả năng tương thích sinh học cao nên được
lựa chọn trong cảm biến sinh học [234].
1.2.2 Phân loại cảm biến sinh học điện hóa
1.2.2.1 Cảm biến đo dòng
1.2.2.2 Cảm biến đo điện thế
1.2.2.3 Cảm biến đo độ dẫn
1.2.2.4 Cảm biến đo phổ tổng trở
1.3 Ung thư và một số chỉ điểm khối u
1.3.1 Chỉ dấu hCG và ung thư tế bào mầm tinh
hCG (Human chorionic gonadotropin) thuộc họ nội tiết glycoprotein được
sản sinh từ các cộng bào nuôi của nhau thai và tế bào mầm của khối u [202].
Nồng độ hCG đối với người bình thường ở cả nam và nữ khơng mang thai nằm
trong khoảng 0 ÷ 5 mIU/mL; đối với phụ nữ tiền mãn kinh là thấp hơn 9,5
mIU/mL. Khi nồng độ chỉ dấu hCG tăng thì có thể bệnh nhân mắc các bệnh lý

liên quan đến u lá ni thời kì thai nghén đối với nữ, u tế bào mầm xuất hiện
trong cơ quan sinh dục của cả nam và nữ [31].
1.3.2 Ung thư tiền liệt tuyến và kháng nguyên PSA
PSA là một glycoprotein được mã hóa bởi gen KLK3 (Kallikrein-3) được
tiết ra bởi các tế bào biểu mô của tuyến tiền liệt bình thường và mơ bướu [129].
Nồng độ PSA trong huyết thanh thường thấp hơn 4 ng/mL và gia tăng trong
ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) cũng như một số bệnh lý khác như phì đại
tuyến tiền liệt, viêm tuyến tiền liệt. Giá trị nồng độ PSA nằm trong “vùng xám”
có giá trị từ 4 đến 10 ng/mL có nguy cơ mắc UTTLT.
1.3.3 Chỉ dấu sinh học AFP và ung thư gan nguyên phát
AFP là chỉ dấu sinh học ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư gan
ngun phát. Người bình thường có AFP thấp hơn 10 ng/mL [9]. AFP tăng
4


cao trong phần lớn bệnh nhân ung thư gan nguyên phát và bệnh viêm gan siêu
vi. Ở người có khối u bướu gan mà khơng có bệnh lý ở gan trước đó, ngưỡng
AFP tăng cao hơn 100 ng/mL có giá trị chẩn đoán ung thư gan nguyên phát.
1.4. Nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát hiện chỉ dấu
khối u
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phương pháp điện hóa
2.1.1 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS)
Phổ tổng trở điện hóa là một công cụ hiệu quả cho phép nghiên cứu các
hiện tượng hóa lý xảy ra trên bề mặt phân chia rắn-lỏng. Nguyên lý của EIS
dựa trên việc phân tích trở kháng phức thu nhận được khi đặt điện áp xoay
chiều lên hệ điện hóa với tần số được thay đổi liên tục từ giá trị cao đến thấp.
Ưu điểm của cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở là điện áp đặt trên điện
cực rất nhỏ nên không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của các thành phần sinh
học. Phổ trở kháng phức thực nghiệm được mô phỏng bằng mơ hình mạch

tương đương Randles.
2.1.2 Phương pháp qt thế tuần hoàn (CV)
Nguyên lý cơ bản của phương pháp CV là áp đặt một điện thế biến đổi tuần
hoàn lên điện cực làm việc và ghi lại dòng tuân theo định luật Nernst. Phương
pháp này cho phép điều khiển quá trình phản ứng điện hóa thơng qua các thơng
số điện áp, tốc độ quét thế. Trong nội dung luận án, tác giả sử dụng phương
pháp CV để tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE, tổng hợp vật liệu
polyme, khử điện hóa graphene oxít trên điện cực SPCE. Ngồi ra, phương
pháp CV cịn giúp cho việc phân tính tính chất lớp vật liệu polyme biến tính
trên bề mặt điện cực và đánh giá tương tác kháng nguyên – kháng thể thông
qua việc xác định các thông số đặc trưng Epa, Epc, Ipa, Ipc.
2.2 Phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu
2.3 Cơng nghệ vi lưu ly tâm
2.3.1 Giới thiệu
2.3.2 Thiết kế và quy trình chế tạo chíp vi lưu ly tâm
Chíp vi lưu ly tâm kiểu cấu trúc van xi phông bằng phương pháp khuôn
đúc sử dụng vật liệu polydimethylsiloxane (PDMS) ứng dụng kết hợp với điện
cực thương mại của hãng DropSens mã DRP-110 và DRP-AUTR10. Việc thu
nhỏ kích thước buồng phản ứng sẽ giảm đáng kể lượng dung dịch hóa chất và
thể tích mẫu phân tích tiêu hao giảm từ 100 µL (trong phương pháp nhỏ giọt
trực tiếp trên bề mặt điện cực) xuống còn 5 µL.

5


Tấm cố định

Chip vi lưu

Điện cực

Giá đỡ

Hình 2.8. Thiết kế giá đỡ gắn với trục quay của máy ly tâm: a) Thứ tự lắp ghép chíp vi lưu
và điện cực; b) Vị trí bốn hệ chíp vi lưu-điện cực được cố định đồng thời trên giá đỡ.

2.4 Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến
2.4.1 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực làm việc SPCE
Tiến hành tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE bằng phương pháp
quét thế tuần hồn. Tiến hành nhỏ 35 µL dung dịch HAuCl4 100 µM pha trong
dung dịch đệm PBS 100 mM lên trên bề mặt SPCE sao cho bao phủ cả 3 điện
cực (bao gồm cả Ag/AgCl, điện cực đối và điện cực làm việc). Tiến hành quét
thế tuần hoàn từ -0,6 V ÷ +0,5 V vs. Ag/AgCl, tốc độ quét 50 mV/s và bước
nhảy 10 mV.
2.4.2 Màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) alkanethiol
- Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (MHDA): Axít 16-mercaptohexadecanoic
(MHDA) là axít hữu cơ chuỗi mạch dài gồm 16 nguyên tử các bon, có một đầu
là nhóm cacboxyl (-COOH) và đầu cịn lại là nhóm thiol (-SH). Ngâm toàn bộ
phần điện cực làm việc của cảm biến trong 100 µL dung dịch MHDA nồng độ
1 mM phân tán trong dung môi ethanol và giữa tại nhiệt độ phòng trong 12
giờ. Sau bước này trên bề mặt điện cực hình thành màng SAM có nhóm chức
cacboxyl hướng lên trên bề mặt.
- Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (p-ATP): Phân tử p-ATP có cấu trúc mạch
vịng benzen có gắn nhóm chức thiol (-SH) và nhóm chức amin (-NH2) tại vị
trí para. Điện cực làm việc của cảm biến được ngâm trong 100 µL dung dịch
của p-ATP nồng độ 25 mM phân tán trong dung môi ethanol và được ủ tại
nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 6 đến 24 giờ. Như vậy, sau bước này
bề mặt điện cực cảm biến hình thành màng SAM có nhóm amin hướng lên
trên bề mặt.
2.4.3 Tổng hợp vật liệu polyme bằng phương pháp trùng hợp điện hóa
2.4.3.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa

2.4.3.2 Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPyPPa và erGO
2.4.3.3 Vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng
2.4.4 Cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị
6


2.4.4.1 Liên kết cộng hóa trị thơng qua nhóm amin của đầu thu sinh học

Hình 2.11. Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm amin (NH2) của đầu thu sinh học và nhóm
cacboxyl (-COOH) trên bề mặt điện cực sử dụng hợp chất NHS và EDC [219].

2.4.4.2 Liên kết cộng hóa trị thơng qua nhóm cacboxyl của đầu thu sinh học

Hình 2.12. Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm cacboxyl (-COOH) của kháng thể và
nhóm amin (NH2) trên bề mặt điện cực sử dụng EDC [219].

2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến phổ tổng trở điện hóa
Bước 1. Chuẩn bị mẫu chỉ dấu sinh học cần phân tích
Bước 2. Phản ứng đặc hiệu giữa đầu thu sinh học và chỉ dấu sinh học phân tích
Bước 3. Khảo sát phổ tổng trở điện hóa
Vật liệu biến
tính điện cực
SPCE
Màng đơn
lớp tự lắp
ghép SAM

Vật liệu
polyme

Mơ hình

Mạch điện tương đương

Rs , Rct , Z C =

Cdl

C và
Warburg

dl

Rs
Rct

ZW

CPE và
Warburg

Phẩn tử trong
mạch điện

Rct
ZW

2.6 Quy hoạch số liệu thực nghiệm
7

ZW =

j Cdl

,

1

( j )1/ 2 .W

Rs , Rct , Z CPE =

CPE

Rs

ZW =

1

1
( j ) .Q

1

( j )1/ 2 .W

n

,

CHƯƠNG 3. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG
ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH
3.1 Mở đầu
3.2 Thực nghiệm

(a)

(b)

Hình 3.1. (a) Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM 5 MHz được ghép nối với bộ tạo dao
động QCM25 của hãng Stanford Research Systems, (b) Hệ thiết bị khảo sát hoạt động của
QCM ở chế độ đo động.

(b)

(a)

(c)

Hình 3.2. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in vàng, (b) Điện cực mực in vàng
SPAuE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa AutoLab PGSTAT 12.

3.2.3 Quy trình cố định mAb α-hCG trên điện cực vàng
OH

OH
O

S

S

OH
O

S

SPAuE

S

O

S

O N
O

OH

OH
O

OO N
O
O

O

(EDC)
R1-N=C=N-R2
(NHS)

S

S

OO N
O
O

S

SPAuE

OO N OO N
O
O
O

S

O

S

O

O N
O

NH
O

O

-NH2
(Kháng thể)
Cố định
kháng thể

S

S

O
NH
O

S

SPAuE

O N
O

O

S

O
NH
O

S

NH
O

(Ethanolamine)
Loại bỏ các liên kết
khơng đặc hiệu

NH

O

S

S

NH
O

S

NH

O

S

NH
O

O

S

SPAuE

Hình 3.3. Quy trình cơng nghệ cố định mAb α-hCG lên điện cực vàng thông qua màng SAM.

3.2.4 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA)/QCM
Cảm biến dựa trên linh kiện QCM được khảo sát ở chế độ đo trong pha
lỏng động, độ dòng chảy của dung dịch là 3 mL/giờ, độ pH của dung dịch đo
là 7,4 [102]. Sự suy giảm tín hiệu tần số cộng hưởng của linh kiện QCM được
ghi nhận ngay trong quá trình bơm dung dịch. Thời gian cho mỗi phép phân
tích khảo sát tương tác kháng nguyên-kháng thể là 80 phút.
8


3.2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA) /SPAuE
Cảm biến được tiến hành đo phổ trở kháng phức trong dung dịch gồm có 0,1
M KCl và 5 mM [Fe(CN)6]3-/4- trong dải tần số từ 100 kHz đến 50 mHz tại thế
một chiều 0,16V và thế xoay chiều 10
-Z (Ω)
mV. Sử dụng phần mềm khớp (fit) phổ

tổng trở với mơ hình mạch tương
đương Randles và xác định giá trị của
phần tử trong mạch. Xây dựng đồ thị
phụ thuộc của giá trị Rct vào nồng độ
kháng nguyên α-hCG. Khi phản ứng
miễn dịch xảy ra giữa kháng nguyên và
kháng thể trên bề mặt điện cực sẽ hình
R
∆R
Z (Ω)
thành khối điện mơi cản trở quá trình Hình 3.5. Nguyên lý hoạt động của cảm
truyền điện tích đến điện cực, Rct tăng biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa.
theo lượng kháng nguyên bắt cặp với
kháng thể.
3.3 Kết quả và thảo luận
3.3.1 Cảm biến miễn dịch nhạy khối lượng mAb α- hCG/SAM(MHDA)/QCM
3.3.1.1 Hiệu sut c nh khỏng th
Cdl

im

RS

W
ZW

RCT

[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

e-

e-

e-

S

CT

re

0
Linh kiện QCM

-100

-100

Độ dịch tần số f (Hz)

Độ dịch tần số f (Hz)

0

-200
-300

SAM (MHDA)/QCM

-400
NHS-EDC/SAM (MHDA)/QCM

-500

-200
-300
-400
-500
-600

mAb hCG/NHS-EDC/SAM (MHDA)/QCM

-600

-700
0

10

20
30
Thời gian (phút)

40

0

50

5

10

15

20

25

30

Nồng độ kháng nguyên -hCG (ng/mL)

Hỡnh 3.6 dịch tần sau mỗi bước chế tạo của
cảm biến nhạy khối lượng sử dụng QCM 5 MHz.

Hình 3.8 Đường đặc trưng chuẩn
của cảm biến nhạy khối lượng.

Hiệu suất cố định kháng thể đánh giá theo công thức (Nkháng thể/NNHS) x 100%;
kết quả thu được là 2,88% cao hơn so với nghiên cứu của Wang chỉ là 0,14%
[299]. Như vậy có thể thấy quy trình cố định kháng thể chúng tơi nghiên cứu
là hoàn toàn phù hợp.

3.3.1.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến
Khảo sát thống kê với 03 cảm biến độc lập với cùng quy trình chế tạo, tần
số suy giảm mạnh trong khoảng nồng độ kháng nguyên từ 100 pg/mL đến 7,0
9


ng/mL và suy giảm không đáng kể khi nồng độ kháng nguyên tăng trong
khoảng từ 12 đến 27 ng/mL.
3.3.2 Cảm bin min dch in húa mAb -hCG/SAM(MHDA) /SPAuE
60

30
Nồng độ kháng nguyªn -hCG
0
100 pg/mL
4 ng/mL
10 ng/mL

25

20 ng/mL
30 ng/mL
70 ng/mL
100 ng/mL

Mạch tương đương Randles
Cdl

50

Rs
Rct
ZW

(k)

40

ct

15

30

R

-Z" (k)

20

R (k) = 16,65 + 0,22*C (ng/mL)
ct
LOD = 9,35 ng/ml

10

20

5

10

0
0

10

20

30

40

50

0

60

Z' (k)

Hình 3.10. Phổ trở kháng phức đáp ứng
của cảm biến với kháng ngun α-hCG có
nồng độ 0÷100 ng/mL

0

20
40
60

80
100
Nång độ kháng nguyên -hCG (ng/mL)

Hỡnh 3.11. ng c trng chun của
cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA) /SPAuE.

Khảo sát với 5 mẫu trắng và 3 mẫu cảm biến độc lập ứng với mỗi điểm
nồng độ. Kết quả cho thấy Rct thay đổi tuyến tính trong khoảng nồng độ kháng
nguyên từ 4 đến 100 ng/mL, giới hạn phát hiện của cảm biến là 9,35 ng/mL
với diện tích điện cực làm việc là 3,67 mm2.
3.4 Kết luận
Tối ưu qui trình cơng nghệ cố định màng kháng thể bằng màng SAM dựa
trên linh kiện QCM. Cảm biến nhạy khối lượng hoạt động tốt trong dải nồng
độ thấp và sai số nhỏ hơn 5%.
Cảm biến miễn dịch điện hóa khơng đánh dấu sử dụng điện cực mực in
vàng (SPAuE) có giá thành rẻ hơn nhiều so với QCM, yêu cầu một lượng nhỏ
dung dịch mẫu, dễ tích hợp với các thiết bị cầm tay là cơ sở cho việc chế tạo
cảm biến sinh học sử dụng một lần. Kết quả cho thấy cảm biến mAb
hCG/MHDA/SPAuE đáp ứng yêu cầu đối với xét nghiệm đối với các bệnh
liên quan đến chỉ dấu α-hCG.
CHƯƠNG 4. CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG
DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN
4.1 Mở đầu
4.2 Thực nghiệm

10


(b)

(a)

(c)

Hình 4.2. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in các bon, (b) Điện cực mực in
các bon SPCE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa Vertex Invium.

4.3 Kết quả và thảo luận
4.3.1 Cảm biến aptamer phổ tổng trở điện hóa
Do DNA aptamer có kích thước nhỏ hơn kháng thể và mang điện tích âm
nên tín hiệu của cảm biến có thể được giải thích liên quan đến hai cơ chế xảy
ra đồng thời. Đối với cảm biến aptamer sự tăng hay giảm của giá trị Rct phụ
thuộc vào cơ chế nào chiếm ưu thế hơn.
[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4-

e-

OH
S

S

AuNP

PSA

S

OH
S
S

S

AuNP
AuNP

SPCE

[Fe(CN)6]3-/43-/4-

[Fe(CN)6]

[Fe(CN)6]

OH
S

S

S

S

S

S

S

[Fe(CN)6]

[Fe(CN)6]

S

S

S

S

AuNP

S

S

OH

OH

S

S

S

OH
S

S

S

S

[Fe(CN)6]3-/4e-

e-

PSA
S

[Fe(CN)6]3-/4[Fe(CN)6]3-/4-

[Fe(CN)6]3-/4-

3-/4-

3-/4-

OH

S

S

SPCE

(b)
3-/4-

S

S

S

S

S

S

S

S

OH

S

AuNP

OH S
S

S

OH S
S

S

OH

S

OH
S

OH
S

e-

S

(a)

OH
S

S

SPAuE

S

S

S

S

S

S

S

OH

OH

S

S

S

S

S

SPAuE
COOH

PSA

Kháng nguyên PSA;

Aptamer;

Ethanolamine;

S

SAM Axit 16-Mercaptohexadecanoic

Hình 4.5. Mơ hình q trình động học xảy ra trên bề mặt điện cực trong phép đo trở kháng
phức Faradaic sử dụng cặp chất dò [Fe(CN)6] 3-/4-: (a) trên điện cực SPAuE, (b) trên điện cực
AuNPs-SPCE.

Cơ chế về hàng rào tĩnh điện: Aptamer là chuỗi oligonucleotide có các liên
kết thiếu phosphate mang điện tích âm [77]. Aptamer được cố định trên bề mặt
điện cực sẽ hình thành hàng rào điện thế âm cản trở điện tử truyền đến bề mặt
điện cực. Nếu kháng nguyên mang điện tích dương khi tương tác với aptamer
sẽ làm giảm hàng rào tĩnh điện giúp cho sự chuyển điện tử đến điện cực dễ
dàng và điện trở Rct giảm [176].
Cơ chế về hiệu ứng không gian: Khi kháng nguyên liên kết đặc hiệu với
aptamer sẽ tạo thành khối điện môi trên bề mặt điện cực, tạo thành vùng không
11

gian cản trở q trình truyền điện tích đến điện cực dẫn tới Rct tăng [56, 88].
4.3.2 Cảm biến PSA-Aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE
4.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước cơng nghệ
10

10

PSA-Aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE

6
(b)

4
(d)

§iƯn cùc SPCE
AuNPs-SPCE
SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE
Aptamer (5 g/mL)/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE
PSA (10 ng/mL)/Aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE

8

-Z''(k)

-Z''(k)

PSA/aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE

§iƯn cùc SPAuE
SAM (MHDA)/SPAuE
Aptamer (5 g/mL)/SAM (MHDA)/SPAuE
PSA (10 ng/mL)/Aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE

8

6

4

(c)
(b)

2

2

(d)

(e)

(a)

(c)

(a)

0

0
8

10

12

14

16

18

20

22

Z'(k)

2

4

6

8

10

12

Z'(k)

Hình 4.6. Phổ EIS sau mỗi bước cơng nghệ
chế tạo của cảm biến
PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE.

Hình 4.11. Phổ EIS sau mỗi bước công
nghệ chế tạo của cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE.

Kết quả phép đo phổ tổng trở đã cho thấy aptamer được cố định thành công
trên bề mặt điện cực thông qua màng SAM của MHDA cũng như đã xảy ra
tương tác đặc hiệu giữa aptamer và kháng nguyên PSA trên bề mặt điện cực
cảm biến. Với điện cực AuNPs-SPCE, hiệu suất cố định aptamer là 56% trong
khi điện cực SPAuE là 72%. Tuy nhiên, độ nhạy của cảm biến cảm biến sử
dụng AuNPs-SPCE đạt 73% trong khi giá trị này chỉ đạt 18% đối với cảm biến
sử dụng điện cực planar SPAuE. Việc sử dụng điện cực AuNPs-SPCE giúp
phân tán aptamer và tăng hiệu suất bắt cặp giữa aptamer và kháng nguyên PSA.
4.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ aptamer lên tín hiệu cảm biến trên điện cực
SPAuE
Trên điện cực SPAuE xác suất cố định aptamer trên điện cực vàng lớn nên
hiệu ứng màn chắn tĩnh điện sẽ chiếm ưu thế. Tín hiệu cảm biến thăng giáng và
khơng theo quy luận nhất định. Đường chuẩn của cảm biến khơng đáp ứng được
u cầu tuyến tính trong dải nồng độ thuộc “vùng xám” trong xét nghiệm chẩn
đoán UTTLT.

12

5

PSA-aptamer/SAM/SPAuE

PSA-aptamer/SAM/SPAuE

0

-1

RCT (k)

RCT (k)

0

-2

-5

-3

Nồng độ aptamer cố định

-10

100 g/mL
50 g/mL
5 g/mL

Nồng ®é aptamer cè ®Þnh

-4

-15

50 g/mL
5 g/mL

-5
0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

2

4

Nång ®é PSA (ng/mL)

6

8

10

12

14

16

Nång ®é PSA (ng/mL)

Hình 4.7. Khảo sát sự phụ thuộc của ∆Rct như một hàm của nồng độ PSA của cảm biến
PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE với nồng độ aptamer 5, 10, 100 µg/mL.

4.3.3 Cảm biến PSA-Aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE
4.3.3.1 Phân tán aptamer
AuNP – 5 CVs

AuNP – 10 CVs

AuNP – 15 CVs

AuNP – 20 CVs

Hình 4.8. Ảnh SEM bề mặt điện cực SPCE sau khi tổng hợp hạt nano vàng bằng phương pháp
quét thế vòng với số vòng qt: 5, 10, 15, 20 vịng.

Hình 4.9. Phổ EDS của điện cực AuNPs-SPCE với cac hạt nano vàng được tổng hợp bằng
phương pháp quét điện thế tuần hoàn 20 chu kỳ.

4.3.3.2 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước cơng nghệ
13


4.3.3.3 c trng ca cm bin
4.0

PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE

3.0

-Z" (k)

2.5

Nồng độ kháng nguyên PSA
0 ng/mL,
8 ng/mL
2 ng/mL,
10 ng/mL
4 ng/mL,

12 ng/mL
6 ng/mL,
14 ng/mL

0.6

Mạch tương đương Randles
Cdl

Rct

(b) PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE

0.5

Rs
ZW

0.4
Rct (k)

3.5

2.0
1.5

0.3
0.2
Rct(k)=0,0275+0,0518*PSA(ng/mL)

1.0

2

0.1

R =0,9845

0.5

0.0
0.0
2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

0

Z' (k)

2

4

6
8
10
Nång ®é PSA (ng/mL)

12

14

Hình 4.12. a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến tại các nồng độ kháng nguyên PSA từ 0
ng/mL đến 14 ng/mL; b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến PSAaptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE.

Rct (k)

Các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ hạt vàng cũng như nồng độ
aptamer cố định cho thấy tín hiệu của cảm biến đạt kết quả tốt nhất với 10
vòng quét tổng hợp hạt nano vàng
0.6
−hCG
và nồng độ của aptamer là 5

Protein TAU
amylin
µg/mL. Đường kính của bán cung
0.5
PSA
trong phổ EIS tăng khi nồng độ
0.4
kháng nguyên PSA tăng, hiệu ứng
khơng gian chiếm ưu thế. Cảm
0.3
biến có tính chọn lọc và độ tuyến
0.2
tính cao trong dải nồng độ PSA từ
0 đến 10 ng/mL, giới hạn phát hiện
0.1
LOD= 1,95 ng/mL. đáp ứng được
0.0
yêu cầu phát hiện chỉ dấu PSA ứng
2
4
6
8
10
12
14
Nång ®é (ng/mL)
dụng trong chẩn đốn sớm ung thư
Hình 4.14. Độ chọn lọc của cảm biến PSAtiền liệt tuyến.
Aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE.
4.4 Kết luận

Hạt nano vàng tổng hợp trên điện cực SPCE cho phép phát triển màng SAM
alkanethiol giống như trên điện cực SPAuE. Kết quả này rất có ý nghĩa, điện
cực SPCE với giá thành thấp khi được biến tính bởi hạt nano vàng trên bề mặt
sẽ cho phép sử dụng như điện cực vàng. Bên cạnh đó, các hạt nano vàng giúp
phân tán đều đầu thu sinh học được cố định trên bề mặt điện cực.
Các kết quả đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của hai loại cảm biến trên điện
cực SPAuE và AuNPs-SPCE được giải thích một cách khoa học và đầy đủ bởi
hiệu ứng không gian và hiệu ứng màn chắn tĩnh điện. Các lý giải này cũng giải
thích được những mâu thuẫn trong kết quả cơng bố của nhóm tác giả Be Liu
(2012) và Jolly Pawan (2015).
14


CHƯƠNG 5. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP
ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ GAN
5.1 Mở đầu
5.2 Thực nghiệm
5.2.2 Cố định mAb AFP lên điện cực PPy-PPa/SPCE và PPy-PPa/erGO-SPCE
O

Pyrrole-2-carboxylic axit (Pa)

OH

N

N
H

Pyrrole (Py)

N
H

n

SPCE

Polyme

O

O
O

NH
O

(EDC)
R1-N=C=N-R2

(a)

N
H

N
H

O

-NH2

n

N
H

SPCE

N
H

n

SPCE

Cố định
kháng thể

(NHS)

SPCE
O

N

N
H

Polyme

SPCE

N
H

N
H

n

SPCE

Graphene oxit (GO)

NH
O

O

erGO

O

O

OH

(b)

N
H

SPCE

n

O

-NH2
Cố định
kháng thể

Pyrrole-2-carboxylic axit (Pa)
(NHS)

N
H

N
H

n

SPCE

Pyrrole (Py)

Hình 5.1. Quy trình cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin của

kháng thể và nhóm cacboxyl của polyme PPy-PPa: (a) trên điện cực SPCE; (b) trên điện cực
erGO-SPCE.

5.2.3 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi màng SAM(p-ATP)
NH2
S

SPCE

SPCE

SPCE
Tạo màng SAM

Tạo hạt nano vàng

O
(EDC)
R1-N=C=N-R2 + R3-C-OH
(Ab)

Xử lý EDC
Cố định kháng thể

Kháng thể AFP

Kháng nguyên AFP
NH

NH

NH

NH

AuNP
S

S

SPCE

SPCE

Ethanolamine
NH2

Phản ứng miễn dịch
kháng nguyên - kháng thể

4-Aminothiolphenol (p-ATP)
SH

Hình 5.2. Quy trình cơng nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm
cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của SAM (p-ATP) trên điện cực AuNPs-SPCE.

5.2.4 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi vật liệu lai poly(pATP) và hạt nano vàng

15

NH2
S

SPCE

SPCE

SPCE

Tạo hạt nano vàng

Tạo màng SAM
Tạo màng polymer

N

S

AuNP

S

S

H
N

H
AuNP

AuNP

N

H
S

AuNP

AuNP

S

AuNP

S

S

AuNP

AuNP

AuNP

S

S

NH2

NH2
N H

N

N H

H

H

N

SPCE

N H

H

H

N

Xử lý EDC
Cố định kháng thể

SPCE

H

H

SPCE

O
(EDC)
R1-N=C=N-R2 + R3-C-OH
(Ab)

Phản ứng miễn dịch
kháng nguyên - kháng thể

NH2

Kháng thể AFP

Kháng nguyên AFP

Ethanolamine

AuNP

4-Aminothiolphenol (p-ATP)
SH

Hình 5.3. Quy trình cơng nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm
cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của vật liệu lai polyme (p-ATP) và hạt nano vàng trên
điện cực AuNPs-SPCE.

5.3. Kết quả và thảo luận
5.3.1 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/SPCE
5.3.1.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa trên điện cực SPCE
5.3.1.2 Tối ưu hóa tỷ số hợp phần của monome Pa với Py
40

I / A

20
10

-

COO

SPCE
Tû sè Pa / Py
0 mM : 160 mM
40 mM : 120 mM
80 mM : 80 mM
120 mM : 40 mM
160 mM : 0 mM

Dao động đặc tr-ng của Py

PPy-PPa/SPCE
tại các vị trí khác nhau
(1)

C-ờng độ (a.u.)

30

0

-10

(2)

(3)

-20

G-band

(4)

D-band

-30

điện cực SPCE trÇn

-40

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

300

0.6

600

900

1200

1500

1800

2100

2400

-1

Sè sãng (cm )

E / V vs. Ag/AgCl

Hình 5.6. Đáp ứng dòng-thế của điện cực
được tổng hợp màng PPy-PPa/SPCE với tỷ lệ
Pa so với Py thay đổi từ 0 đến 100% mol.

Hình 5.5. Phổ Raman của màng polyme đồng
trùng hợp PPy-PPa trên điện cực SPCE.
(b)

Tỷ lệ hợp phần của Pa với Py là 1:3
(40mM:120 mM) cho màng polyme có
đáp ứng điện hóa tốt nhất (Hình 5.6).
Màng polyme có dạng bông súp lơ và
phát triển đa tầng trên bề mặt điện cực
(Hình 5.4b). Phép đo quang phổ Raman
được thực hiện tại bước sóng kích thích
là 632,8 nm, vạch phổ tại số sóng 1398
đến 1400 cm-1 khẳng định sự có mặt của
16

Hình 5.4b. Ảnh SEM bề mặt màng
polyme PPy-PPa trên điện cực SPCE.


nhóm cacboxyl trong cấu trúc màng polyme đồng trùng hợp.
5.3.1.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến
4.0

4.0

a)

3.5

2.5
2.0

b)

CPE

Rs
Rct

2.5
2.0
1.5

1.0

1.0

0.5

0.5

0.0

0.0
3

4

5

6

7

LOD = 2,46 ng/mL

3.0
ZW

1.5

2

mAb AFP/PPy-PPa/SPCE

3.5

Mạch tương đương

Rct(k)

3.0

-Z"(k)

mAb AFP/PPa-PPy/SPCE
Nång ®é AFP

0 ng/mL ;
5 ng/mL
10 ng/mL;
20 ng/mL
30 ng/mL;
40 ng/mL
50 ng/mL;
60 ng/mL
70 ng/mL;
80 ng/mL
90 ng/mL;
100 ng/mL

8

9

R2 = 0,984
Rct (k) = 0,312 + 0,04*AFP (ng/mL)

n sè mÉu = 3
0

10

20

40

60

80

100

Nång ®é AFP(ng/mL)

Z'(k)

Hình 5.7. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng
n samples = 3
độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.
40

a)

mAb AFP/PPa-PPy/SPCE

14

b)

30

mAb AFP/PPy-PPa/SPCE

12
20

Ipc(A)

I / A

10
10
0

-10

Nång ®é AFP
0 ng/mL;

-20
-30

8
6
4

5 ng/mL

10 ng/mL;

20 ng/mL

40 ng/mL;

60 ng/mL

80 ng/mL;

100 ng/mL

Ipc() = 0,37 + 0,158*AFP (ng/mL)

2

R2 = 0,99

0

-40
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0

E / V vs. Ag/AgCl

20

40

60

80

100

Nång ®é AFP (ng/mL)

Hình 5.8. Đáp ứng dòng thế của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng độ kháng
R = 0,984
nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.
2

5.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE
5.3.2.1 Khử điện hóa GO trên SPCE
20

SPCE
GO-SPCE
erGO-SPCE 30CVs

a)

18
16
-Z" (k)

14

40
2.0

1.0

SPCE
GO-SPCE
erGO-SPCE

-0.4

-0.2

20

0.5

12

3

4

5

6

10

7

I / A

0.0

10
8

0

-10

6

-20

4
2
0

b)

30

1.5

-30

0

5

10

15

20

25 30
Z' (k)

35

40

45

-40

50

0.0
0.2
0.4
E / V vs. Ag/AgCl

0.6

Hình 5.10. Đặc trưng điện hóa của điện cực erGO-SPCE khảo sát trong dung dịch đo gồm 5

mM [Fe(CN)6] 3-/4- và KCl 0,1 M. a) Đáp ứng phổ EIS, b) Đáp ứng dòng-thế tại tốc độ quét
50 mV/s.

17


Điện cực sau khi phủ GO có độ dẫn
kém, sau khử điện hóa erGO-SPCE với
30 vịng qt cho đáp ứng dòng thế cao
hơn so với điện cực SPCE ban đầu. Độ
dẫn và tốc độ truyền điện tử được cải
thiện khi sử dụng điện cực erGO-SPCE.
Tỷ số IG/ID giảm khi số vòng quét
tăng, Tỷ số này khá cách biệt giữa 10 và
20 vòng quét CV nhưng sai khác khá nhỏ
tại số vòng quét là 20 và 30. Điều kiện tối
ưu khử điện hóa GO là 30 vịng qt.

G-band

D-band

C-êng ®é a.u.

ID/IG = 1,02

800

(a) GO

ID/IG = 2,21

(b) erGO 10CVs

ID/IG = 2,67

(c) erGO 20CVs

ID/IG = 2,70

(d) erGO 30CVs

1000

1200

1400

1600

1800

Sè sãng (cm-1)

Hình 5.11. Phổ Raman của màng GO và
erGO trên điện cực SPCE.

5.3.2.2 Hình thái học bề mặt điện cực
a)

SPCE

b)

c)

erGO/SPCE

d)

GO/SPCE

PPa-PPy/erGO/SPCE

Hình 5.12. Ảnh SEM của a) bề mặt điện cực SPCE trần, b) có nhỏ phủ GO, c) điện cực
SPCE biến tính bởi erGO và d) điện cực được tổng hợp vật liệu lai cấu trúc nano hai
chiều giữa PPy-PPa và erGO.

Hình thái bề mặt erGO-SPCE khác biệt hẳn so với điện cực ban đầu với
các nếp gấp giúp tăng diện tích bề mặt riêng của điện cực. Màng PPy-PPa được
tổng hợp trên điện cực erGO/SPCE nhiều nếp nhăn tựa như cấu trúc của vỏ
não người; hình thái này hoàn toàn khác biệt so với cấu trúc dạng bông súp lơ
của polyme PPy-PPa trên điện cực SPCE.
5.3.2.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến
18


7

5

a) mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE 1.2

-Z''(k)

4
3

b)

mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE

6

0.9
0.6

LOD=0,34 ng/mL

5

0.3

Rct(k)

Nång ®é AFP
0 ng/mL ;
0,1 ng/mL
1 ng/mL;
5 ng/mL
10 ng/mL;

20 ng/mL
30 ng/mL;
40 ng/mL
50 ng/mL;
60 ng/mL
70 ng/mL;
80 ng/mL
90 ng/mL;
100 ng/mL

0.0
3

4

5

6

2

4
3
R2 = 0,996

2

1

Rct (k) = 0,375 + 0,057*AFP (ng/mL)

1
n sè mÉu = 3

0

0

2

4

6

8
10
Z'(k)

12

14

0

20

40
60
80
Nång ®é AFP (ng/mL)

100

Hình 5.13. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/erGO-SPCE với
nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.

Rct()

Vùng đáp ứng tuyến tính cua cảm biến mở rộng từ 0,1 ng/mL đến 100 ng/mL.
Độ nhạy của cảm biến đạt 57 /ng.mL-1 cao hơn 1,4 lần so với cảm biến sử
dụng polyme PPy-PPa (40 /ng.mL-1).
5.3.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/SAM(p-ATP)/ AuNPs-SPCE
5.3.3.1 Ảnh hưởng của mật độ hạt nano vàng
5.3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian tạo màng SAM
Thời gian tạo màng đơn lớp
quyết định đến tính ổn định
3000
6 giê
12 giê
và độ bền của màng SAM.
18 giê
2500
24 giê
Với thời gian tạo màng SAM
2000
là 18 và 24 giờ đáp ứng tín
hiệu Rct khơng ổn định do
1500
điện cực SPCE ngâm quá lâu
1000

trong môi trường ethanol sẽ
ảnh hưởng đến chất lượng của
500
điện cực. Chúng tôi chọn điều
0
kiện tối ưu để tổng hợp màng
10
50
100
Nång ®é AFP (ng/mL)
SAM trên điện cực 20 CVs
Hình 5.18. Đáp ứng tín hiêu Rct của cảm biến với
AuNPs-SPCE là 12 giờ.
thời gian tổng hợp màng SAM là 6, 12, 18, 24 giờ.
5.3.3.3 Đặc trưng điện hóa sau mỗi bước công nghệ

19


4.0

mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
3.5

SPCE
AuNPs-SPCE

3.0

poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE

mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
antigen AFP (5 ng/mL)

-Z" (k)

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2

4

6

8

10

12

14

Z' (k)

Hình 5.19. Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ
chế tạo của cảm biến mAb AFP/SAM(pATP)/AuNPs-SPCE.

Hình 5.24. Phổ EIS sau mỗi bước cơng
nghệ chế tạo của cảm biến mAb
AFP/poly(p-APT)/AuNPs-SPCE.

5.3.3.4 Đặc trưng chuẩn của cảm biến
4.0

3.5

mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE
Mạch tương đương Randles
Nång ®é AFP (ng/mL)
Cdl
0 ng/mL,
1 ng/mL
Rs
10 ng/mL,
20 ng/mL
R
ct
30 ng/mL,
40 ng/mL
ZW
50 ng/mL,
60 ng/mL
70 ng/mL,
80 ng/mL
90 ng/mL,
100 ng/mL

3.0

-Z" (k)

2.5
2.0

3.0

b)

mAb AFP/SAM p-ATP/AuNPs-SPCE
LOD = 1,41 (ng/mL)

2.5

Rct (k)

a)
3.5

2.0
1.5

R2 = 0,987

1.0

1.5

RCT (k) = 0,19 + 0,035*AFP (ng/mL)

0.5

1.0
0.5

0.0

0.0

-0.5

n samples = 3
2

3

4

5

6

7

8

Z' (k)

0

20

40

60
AFP (ng/mL)

80

100

Hình 5.20. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/SAM(p-ATP)/SPCE với
nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.

Đáp ứng tính hiệu tốt hơn so với PPy-PPa/SPCE, tuy nhiên vẫn thấp hơn
so với cấu trúc vật liệu lai hai chiều PPy-PPa/erGO-SPCE.
5.3.4 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
5.3.4.1 Poly(p-ATP) kết hợp hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE
5.3.4.2 Phổ Raman của màng poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
b)

Hình 5.21b. SEM bề mặt màng polyme
(p-ATP).

Hình 5.23. Phổ Raman của màng
poly(p-ATP) trên điện cực SPCE.
20

Phức chất nano vàng và monome p-ATP cho mạng polyme phát triển theo
cấu trúc 3D. Trên đặc trưng quang phổ Raman xuất hiện hai píc tương ứng với
vạch phổ G band (tại số sóng 1350 cm-1) và vạch D band (tại số sóng 1580 cm1
) của vật liệu các bon trên điện SPCE. Các píc tại số sóng 1081 cm-1, 1143
cm-1, 1181 cm-1, 1403 cm-1 lần lượt tương ứng với dao động các liên kết đặc
trưng của poly(p-ATP) [98, 178, 316].
5.3.4.3 Đặc trưng điện hóa sau các bước cơng nghệ
5.3.4.4 Đường trưng chuẩn của cảm biến
90

60

50

40

-Z" (k)

mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
Nång ®é AFP (ng/mL)
0 ng/mL,
1 ng/mL
10 ng/mL,
20 ng/mL
30 ng/mL,
40 ng/mL
50 ng/mL,
60 ng/mL
70 ng/mL,

80 ng/mL
90 ng/mL,
100 ng/mL

30

80

Mạch tương đương
CPE

Rs
Rct

b)

mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE

LOD = 0,13 (ng/mL)

70
ZW

60
RCT (k)

a)

50
40

30

20

R2 = 0,985

20
10

RCT (k) = 3,27 + 0,73*AFP (ng/mL)

10

n samples = 3

0
0
0

20

40

60

0

80

Z' (k)

20

40
60
AFP (ng/mL)

80

100

Hình 5.25. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE
với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL.

Cảm biến mAb AFP/poly(p-ATP)/SPCE có LOD=0,13 ng/mL và độ nhạy
730 /ng.mL-1. Độ nhạy của cảm biến lớn hơn 21 lần so với cảm biến sử dụng
màng SAM (p-ATP) và lớn hơn 13 lần so với cảm biến sử dụng vật liệu lai
cấu trúc nano hai chiều giữa polyme PPy-PPA/erGO-SPCE.
5.4 Kết luận
Quy trình khử điện hóa graphene oxít tạo erGO trên SPCE khơng sử dụng
hóa chất độc hại và thời gian được rút ngắn rất nhiều so với phương pháp hóa
học đã được xây dựng thành công. Lớp erGO trên SPCE giúp cải thiện độ dẫn
cũng như làm tăng diện tích bề mặt riêng của điện cực, qua đó cải thiện đặc
tính nhạy của cảm biến. Cấu trúc lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng đóng vai
trị liên kết chéo trong mạng polyme giúp tăng tốc độ truyền điện tử đến điện
cực cũng như tăng độ nhạy của cảm biến.
CHƯƠNG 6. CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE
6.1 Glucose và đường huyết
6.2 Cảm biến điện hóa enzyme GOx
6.3 Polyme ơxy hóa khử Osmium và cảm biến GOx

Polyme Ossmium (Os(dmbpy)2PVI) là một dạng phức chất của Tris đóng
vai trò như chất trung gian giúp vận chuyển điện tử từ vùng hoạt động FAD của
enzyme GOx đến bề mặt điện cực cảm biến theo chuỗi phản ứng.
21


Glucose

Gluconolactone

Polymer oxy hóa khử Osmium

Glu cos e + GOx ( FAD) → Gluconolactone + GOx ( FADH 2 ) (6.11)

GOx ( FADH 2 ) + 2Os

3+

2Os

2+

→ GOx( FAD) + 2Os + 2 H
2+

→ 2Os 3+ + 2e−

+

(6.12)

OsIII

OsII

OsII

OsIII

(6.13)
[Os(4,4′-dimethyl-2,2′bipyridine)2(polyvinylimidazole)10Cl]+/2+

e-

Hình 6.3. Nguyên lý hoạt động của cảm biến điện hóa Glucose/(GOx/Osmium)n/AuNPs-SPCE.

6.4 Thực nghiệm
6.5 Kết quả và thảo luận
6.5.1 Khảo sát hình thái bề mặt cấu trúc đa lớp (GOx/Osmium)
AuNPs-SPCE

Osmium/AuNPs-SPCE

a)

b)

(GOx-Osmium)/AuNPs-SPCE

(GOx-Osmium)4/AuNPs-SPCE

c)

d)

Hình 6.5. Ảnh hiển vi điện tử quét SEM.
(a) bề mặt điện cực AuNPs-SPCE, (b) Osmium/AuNPs-SPCE
(c) (GOx/Osmium)/AuNPs-SPCE, (d) (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE

6.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của số lớp (GOx/Osmium)
Số lớp (GOx/Osmium) tăng sẽ làm tăng số lượng enzyme trên bề mặt điện
cực cảm biến do đó làm tăng tín hiệu của cảm biến. Khi số lớp lớn hơn 4, màng
đa lớp cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực, tín hiệu dịng của cảm
biến có xu hướng giảm.

22


500

Số lớp (GOx/Osmium)
1
2
3
4
5
6

150

100

Mật độ dòng (A/cm2)

Mật độ dòng (A/cm2)

200

50

400

Số lớp (GOx/Osmium)
1
2
3
4
5
6

300

200

100

0

Điện áp -0,02 V (vs. Ag/AgCl)
0

-50
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0

0.6

20

40

60

80

100

Nồng độ glucose (mM)

Điện áp vs. Ag/AgCl (V)

Hình 6.6. (a) Đáp ứng dịng-thế của cảm biến với số lớp (GOx/Osmium) từ 1 đến 6 trong
môi trường dung dịch glucose nồng độ 10 mM pha trong đệm PBS pH 7,4; (b) Đường đặc
trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng độ glucose của cảm biến với số lớp (GOx/Osmium)
khác nhau tại điện áp -0,02V (vs. Ag/AgCl).

6.5.3 Đáp ứng dịng-thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE
C¶m biÕn (GOx-Os)4/AuNPs/SPCE

160

Glucose (mM)
0

120

1
2

80

4
6

40

8
10

C¶m biến (GOx-Os)4/AuNPs/SPCE

500

Glucose (mM)

Mật độ dòng (A/cm2)

Mật độ dòng (A/cm2)

200

400

20
30

300

40
50
60

200

70
80
90
100

100

0
0

-40
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

Điện áp vs. Ag/AgCl (V)

Điện áp vs. Ag/AgCl (V)

Hỡnh 6.7. c trng dòng - thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE khảo sát
trong dung dịch glucose nồng độ 0 - 100 mM với tốc độ quét là 5 mV/s.

Trên đường đặc trưng dòng thế xuất hiện rõ rệt píc ơxy hóa tại điện áp -0,02
V vs. Ag/AgCl. Trong dải nồng độ từ 0 đến 10 mM, mối quan hệ giữa đáp ứng
dòng và nồng độ là một đường tuyến tính với phương trình J(µA/cm2) = 20,83
+ 16,47*C (mM), trong đó C là nồng độ glucose trong dung dch, vi R2 = 0,99.
500

Mật độ dòng (A/cm2)

6.6 Kết luận
Cảm biến điện hóa phát
hiện glucose trên cơ sở cấu
trúc đa lớp giữa polyme oxy
hóa - khử Osmium và enzyme
GOx có độ nhạy đạt 18,72
µA/mM.cm2 với diện tích điện
cực là 2,64 mm2, cho phép
cảm biến hoạt động ở điện áp
thấp (-0,02 V vs. Ag/AgCl).

400

300
250

J (A/cm2) = 20,83 + 16,47* Glucose(mM)

R2=0,9964

200

200

150
100

100
50
0

0
0

20

40

0

2

4

60

6

80

8

10

12

100

Nång ®é glucose (mM)

Hình 6.8. Đặc trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng
độ glucose của cảm biến (GOx-Os)4/AuNPs-SPCE
làm việc tại điện áp -0,02V (vs. Ag/AgCl).
23