Tóm tắt Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ Sphingomonas paucimobilis
ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm
TS. Trần Thị Mai

Phản biện 1: PGS. TS. Trần Đình Mấn
Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn La Anh
Phản biện 3: PGS. TS. Dương Văn Hợp

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường
họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Vào hồi ….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1.Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội
2.Thư viện Quốc gia Việt Nam


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Gellan là một polysaccharit ngoại bào, được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn hiếu khí
Sphingomonas sp. Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và
các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm dày và chất tạo gel.
So với các polysaccharit khác, gellan có nhiều lợi thế như có thể duy trì độ bền ở nhiệt độ cao
(trên 90oC), ổn định trong khoảng pH rộng (3 - 8) nên được ứng dụng nhiều trong sản xuất nước giải
khát. Trong sản xuất bánh, kẹo dẻo, khi thêm gellan giúp tạo gel mềm, mọng nước và tăng được nhiệt
độ nóng chảy, ngăn cản sự tan chảy và biến dạng sản phẩm. Gellan thường cho ra gel mềm, đàn hồi,
trong và với tính chất tạo vi màng, có khả năng ngăn oxy nên cũng rất thích hợp cho sử dụng tạo màng
bao bảo quản quả.
Sản phẩm khử acyl của gellan là tác nhân làm đông vượt trội do gel có độ trong suốt cao, tạo gel
giòn ở nồng độ thấp (dưới 0,4 %), có khả năng hồi phục nhiệt khi đun nóng và làm lạnh, được ứng
dụng nhiều trong sản xuất thạch.
Sở hữu những đặc tính quí báu trên, nên hiện nay gellan được ứng dụng rộng rãi trong chế biến
và bảo quản thực phẩm, nhu cầu về thị trường ngày một tăng. Các công bố về quá trình sinh tổng hợp,
thu nhận gellan trên thế giới cũng luôn được cập nhật, bổ sung nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng
cho chế phẩm.
Ở Việt Nam, hiện chưa có cơ sở nào sản xuất được gellan, gellan nhập ngoại đã được sử dụng để
bổ sung vào nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau, nhưng giá nhập khẩu vẫn còn cao (khoảng 20-50
usd/kg, tùy loại). Trong giai đoạn 2013-2015, nhóm nghiên cứu của đề tài chúng tôi đã phân lập được
một số chủng có khả năng sinh tổng hợp gellan khá cao (18-20 g/lít dịch nuôi) và bước đầu khảo sát
được các điều kiện lên men, thu hồi gellan, tuy nhiên công nghệ chưa sẵn sàng, cần phải có các nghiên
cứu cải tiến hơn nữa nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận
gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” đã
được lựa chọn trong khuôn khổ của luận án này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S.
paucimobilis lựa chọn; Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan
của chủng S. paucimobilis lựa chọn; Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo
quản, chế biến thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu
1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao: Đánh giá khả năng sinh tổng hợp
gellan của chủng S. paucimobilis GL4; So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng
S. paucimobilis GL4 và S. paucimobilis GL12.
2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn: Tối ưu hóa điều kiện sinh
tổng hợp gellan trên bình tam giác; Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên
men 10 lít; Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột; Nghiên

1


cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm; Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng
S. paucimobilis lựa chọn.
3. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men của chủng S. paucimobilis: Xác định
điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl; Xác định điều kiện tách chiết
và sấy kết tủa gellan khử acyl; Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl; Đề
xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl.
4. Đánh giá chất lượng các chế phẩm: Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S.
paucimobilis; Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl.
5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl: Ứng dụng chế phẩm gellan
trong tạo màng bao bảo quản chuối; Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất
thạch.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1. Về khoa học: Luận án là một nghiên cứu có hệ thống từ lựa chọn chủng giống, đến sinh
tổng hợp, thu hồi và khai thác khả năng ứng dụng gellan, cũng như chuyển hóa gellan thành

gellan khử acyl. Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể dùng làm tài liệu tham khảo cho
các nghiên cứu thu nhận và ứng dụng gellan hoặc các polisaccharit ngoại bào khác đi từ nguồn
vi sinh vật.
2. Về thực tiễn: Xây dựng được qui trình công nghệ thu nhận gellan và gellan khử acyl góp
phần chủ động tạo nguồn phụ gia thực phẩm sở hữu các đặc tính phù hợp cho ứng dụng trong
bảo quản và chế biến thực phẩm.
Kết quả mới
- Đã xây dựng được quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 phân lập
tại Việt Nam đạt 32,8 g/lít. Giải pháp sử dụng nguồn bột đậu tương giàu tryptophan thay thế
nguồn trypton, kết hợp cải thiện phương thức cấp ôxi bằng việc bổ sung H2O2 theo bậc nhằm
khắc phục độ nhớt của dịch lên men đã nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp gellan.
- Đã xây dựng được quy trình chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl có độ deacyl đạt
86% đáp ứng yêu cầu cho việc tạo ra gel có độ giòn và độ trong cao.
- Đã đánh giá được một số đặc tính của chế phẩm gellan và gellan khử acyl từ S.
paucimobilis GL12 làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong chế biến, bảo quản thực phẩm.
- Đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng gellan trong tạo màng bao bán thấm có
khả năng ngăn khí và giữ nước để kéo dài thời gian bảo quản chuối (18 ngày so với 9 ngày ở
mẫu đối chứng). Gel tạo ra từ chế phẩm gellan khử acyl của đề tài khá bền và ổn định trong
môi trường pH thấp (pH<4) nên thích hợp cho việc sản xuất các sản phẩm có độ axit cao như
thạch dứa.
Bố cục luận án: Luận án được trình bày trong 114 trang: mở đầu (3 trang), tổng quan
tài liệu (25 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (21 trang), kết quả và thảo luận (52

2


trang với 29 bảng, 28 hình), kết luận (1 trang), kiến nghị (1 trang), danh mục các công trình
đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (10 trang với 8 tài liệu tiếng Việt và 93 tài liệu tiếng Anh).

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Thông tin chung về gellan và gellan khử acyl bao gồm 04 tiểu mục: 1.1.1. Cấu tạo;
1.1.2. Tính chất; 1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel và mục
1.1.4. Sphingomonas paucimobilis: giới thiệu chung về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa,
cơ chế sinh tổng hợp gellan và động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan.
1.2. Tình hình nghiên cứu thu nhận gellan và gellan khử acyl bao gồm 03 tiểu mục:
1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp gellan, phần này đề cập đến các vấn đề về
giống, tuổi giống, tỷ lệ giống, thành phần môi trường, nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí cho
quá trình lên men; 1.2.2. Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men; 1.2.3. Chuyển hóa
gellan thành gellan khử acyl.
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng gellan và gellan khử acyl bao gồm 03 tiểu mục:
1.3.1. Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây; 1.3.2. Ứng dụng trong chế biến thực
phẩm; 1.3.3. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác.
1.4. Vấn đề cần nghiên cứu của luận án mục này điểm qua những kết quả nghiên cứu đã
có trước để đưa ra những định hướng và nội dung nghiên cứu cụ thể cho luận án.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Hai chủng S. paucimobilis GL4 và GL12 nhận được từ bộ sưu tập giống của Bộ môn
Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch-Viện Cơ điện NN và Công nghệ STH. Chủng
S. paucimobilis GL12 đã được kiểm nghiệm về độ an toàn chung và khả năng gây tan huyết
đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho ứng dụng trong chế biến thực phẩm.
- Chuối tiêu được trồng tại Đông tảo, Khoái Châu, Hưng Yên vụ 2017.
2.2. Phƣơng pháp phân tích
Xác định hàm lượng gellan và gellan khử acyl theo (Horace G., 1993). Phân tích cấu
trúc gellan và gellan khử acyl theo phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân MNR (Fialho
A. M., 1999). Xác định khối lượng phân tử của gellan theo Gong Y., (2009) và Masuelli A.
M., (2014) thông qua việc xác định độ nhớt thực của dung dịch. Xác định mức độ deacyl hóa
của gellan khử acyl qua phân tích phổ IR theo BaxterA., (1992). Xác định độ bền gel của
gellan khử acyl bằng máy phân tích cấu trúc Texture Analyzer TA.XT2 (Anh) theo Mao R.,
(2000). Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của gellan như khả năng tạo gel (Bajaj B.I.,

2007), độ ẩm (AOAC 920.05), độ tro (AOAC 930.30), hàm lượng chì (AOAC 999.11), hàm
lượng asen (AOAC 986.15), E. Coli (TCVN 7924-2:2008), Salmonella (TCVN
4829:2005), Coliform (TCVN 6848:2007), tổng số vi khuẩn hiếu khí (TCVN 4884:2005),
tổng số bào tử nấm men, nấm mốc (TCVN 8275-2:2010).
3


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao: chủng S. paucimobilis GL12 và
GL4 được thử nghiệm với 150 ml dịch với glucose 3,2%; trypton 0,6 %; tỷ lệ tiếp giống 8 %;
nhiệt độ lên men 30oC, pH 7, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau 72h dịch lên men được nâng
nhiệt lên 95oC trong 15 phút, làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch
nổi và đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan (Nguyễn Thị Hồng Hà, 2015).
- Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng STH gellan từ S. paucimobilis GL12: tiến
hành tương tự như trên, khảo sát với các nồng độ bột đậu tương, axit amin khác nhau và 6
chế độ cấp H2O2 theo bậc vào quá trình lên men (Guilan Z., 2014).
- Tối ƣu hóa môi trƣờng sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12 trên bình tam giác
bằng quy hoạch thực nghiệm bậc hai theo Box–Behnken.
- Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít: các thí nghiệm được
tiến hành lên men trên bình lên men sục khí 10 lít với các thông số về thành phần môi trường
lên men theo điều kiện tối ưu tìm được khi lên men trên bình tam giác. Thiết bị lên men được
cài đặt chế độ nhiệt độ 30oC, tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph, khảo sát với các tốc độ khuấy dao
động từ 200 đến 300 vòng/phút.
- Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men với các khảo sát về điều kiện tiền xử lý dịch
lên men, lựa chọn dung môi kết tủa, tỷ lệ dịch lên men và dung môi theo Fialho A. M., (1999).
- Xác định điều kiện sấy: kỹ thuật sấy đối lưu được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ
của tác nhân sấy, thời gian sấy, độ dày lớp vật liệu sấy. Các thí nghiệm đều được thực hiện với
tốc độ thổi khí 1 m/s, khi bề mặt khối sấy khô se, dùng que sắt nhọn kẻ thành các ô vuông có
cạnh 1,5 cm,tiến hành đảo để khối ô vuông gellan rời ra, rồi dàn đều, sau đó cứ 2 giờ lặp lại
01 lần. Khi mẫu khô đem đi nghiền thành bột và bảo quản trong bao bì kín.

- Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl: xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan
khử acyl theo Nampoothiri M. K., (2003); xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử
acyl; xác định điều kiện sấy và bảo quản chế phẩm gellan khử acyl.
Mức độ deacyl hóa của mẫu được tính theo công thức sau:
ĐĐA = 100 -

xa

Trong đó: h1720 và h3400 là chiều cao các đỉnh phổ tại bước sóng 1720 và 3400 cm-1 đặc trưng
cho các nhóm carbonyl và nhóm - OH trong phân tử gellan và a là hệ số thực nghiệm.

4


- Nghiên cứu ứng dụng gellan tạo màng bao trong bảo quản chuối: xác định công thức
dung dịch tạo màng gellan theo Rojas G. M. A., (2007); xác định một số đặc tính của dung
dịch tạo màng gellan như xác định hàm lượng chất khô, thời gian khô của màng, thời hạn sử
dụng dung dịch tạo màng, độ bám dính của màng, tính thẩm thấu hơi nước của màng, mức độ
ngăn cản trao đổi khí được tiến hành theo Nguyễn Duy Lâm (2011).
- Nghiên cứu ứng dụng gellan khử acyl trong chế biến thạch dứa: xác định hàm lượng
gellan khử acyl thích hợp cho công thức thạch; đánh giá cảm quan và độ ổn định của sản phẩm).

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao

Từ kết quả ở bảng 3.1. rút ra, trong điều kiện khảo sát chủng S. paucimobilis GL12 có
khả năng sinh tổng hợp gellan cao hơn chủng S. paucimobilis GL4. Hơn thế chủng
S.paucimobilis GL12 đã được đánh giá là chủng an toàn, bước đầu đảm bảo cho các sản
phẩm của chúng được ứng dụng trong chế biến thực phẩm (Nguyễn Thị Hồng Hà., 2015).
Do vậy, chủng S. paucimobilis GL12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo của luận án.

Bảng 3.1. So sánh khả năng STH gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và S. paucimobilis GL12

Thí nghiệm

Hàm lƣợng gellan (g/l)
S. paucimobilis GL4

S. paucimobilis GL12

1

23,9

28,6

2

23,6

28,4

3

24,2

29,0

Trung bình

23,9

28,7

3.2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12
3.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan
3.2.1.1. Ảnh hưởng của nitơ
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy khi bổ sung nguồn nitơ là trypton, hàm lượng gellan đạt
cao nhất là 22,7 g/l. Tuy nhiên, với nguồn nitơ là bột đậu tương cũng cho sản lượng sinh tổng
hợp gellan khá cao đạt 21,9 g/l. Điều này có thể do bột đậu tương có hàm lượng protein cao
(khoảng 40%) và chứa nhiều tryptophan là một axit amin cũng được chứng minh như một
tiền tố làm tăng khả năng sinh tổng hợp gellan (Hyuck J., 2003). Bajaj B. I., (2006) khi bổ
sung tryptophan ở nồng độ 0,05% vào môi trường lên men đã tăng được sản lượng gellan lên
tới 39,5 g/l.

5


Bảng 3.2. Ảnh hưởng các nguồn nit đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12

Nguồn nitơ (%)

Hàm lƣợng gellan (g/l)

Pepton (0,6)

19,6b ± 0,61

Trypton (0,6)

22,7a± 0,40

Bột đậu tƣơng * (1,5)

21,9ab± 0,95

* Hàm lượng bột đậu tư ng được tính lấy để tư ng tư ng với 0,6% protein trong dịch lên men

Kết quả ở hình 3.1. cho thấy khi bổ sung tăng dần bột đậu tương vào môi trường lên
men, sản lượng gellan cũng tăng theo và tăng chậm lại khi bổ sung bột đậu tương 2%. Kết
quả này cũng phù hợp với Hyuck J., (2003), tác giả cũng đã tìm ra dịch chiết đậu tương 2%
bổ sung vào môi trường lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis NK2000 đã
cho khả năng sinh tổng hợp gellan tăng 44%.

Hàm lƣợng gellan (g/L)

30
25

21.5

22.7

24

24.2

2.00

2.25

20
15
10
5
0
1.50

1.75

Nồng độ bột đậu tƣơng (%)

Hình 3.1. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tư ng đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12

3.2.1.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin
Các thí nghiệm được thử nghiệm với 4 loại axit amin với tỷ lệ bổ sung 0,05 %. Kết quả
thử nghiệm đã xác định được L-threonine là axit amin thích hợp nhất cho sinh tổng hợp gellan
(đạt 24,3 g/l với liều bổ sung 0,05%). Việc bổ sung L-threonine được cho là làm tăng sự biểu
hiện của một số enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp gellan do vậy dẫn đến làm
tăng sản lượng gellan (Nampoothiri M. K., 2003).
Nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan thu
được ở hình 3.2. đã khẳng định lại khả năng sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất khi môi
trường được bổ sung L-threonine 0,05%.

6


Axit amin

Hàm lƣợng gellan
30

Hàm lƣợng gellan (g/l)

(g/l)
Đối chứng
(Không axit amin)

19,4 ± 0,36

Glycine

21,4 ± 0,39

L-valine

22,1 ± 0,89

L-glutamine

23,2 ± 0,47

L-threonine

24,3 ± 0,52

25

20.8

22.5

24.3

24.5

0.05

0.07

20
15
10
5
0
0.01

0.03

Tỷ lệ L- threonine (%)

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các axit amin

Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine

3.2.1.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2
Động học phát triển của chủng S. paucimobilis GL12 cho thấy chủng sinh trưởng mạnh
nhất từ giờ thứ 6 đến 24 giờ. Theo thời gian lên men, với việc tăng sinh khối, đồng thời
lượng gellan được tích lũy quanh tế bào cũng tăng lên, kéo theo giảm hiệu quả cấp oxy cho
tế bào. Để khắc phục hiệu ứng này, tiến hành các thử nghiệm bổ sung thêm H2O2 vào dịch
lên men dựa trên sự chuyển hóa H2O2 thành O2. Tuy nhiên, nồng độ H2O2 quá mức lại là một
trong những tác nhân gây tổn thương tế bào vi sinh vật, dẫn đến việc ức chế sự phát triển của

tế bào cũng như sinh tổng hợp gellan. Do vậy, trong phần này tiến hành các thử nghiệm bổ
sung dần H2O2 vào các mốc thời gian tương ứng 6, 12, 18, 24, 28 giờ với các liều lượng khác
nhau theo từng chế độ thử nghiệm. Sau 72 giờ lên men, các mẫu được lấy đi đánh giá lượng
sinh khối và gellan tạo thành
Kết quả phân tích ở bảng 3.4 cho thấy, việc bổ sung H2O2 theo CĐ1 và CĐ2 hầu như
không làm tăng được lượng sinh khối cũng như không cải thiện được khả năng sinh tổng hợp
gellan cho chủng nghiên cứu. Điều này có thể lý giải do ở những giờ nuôi đầu (6, 12 giờ) lớp
gellan bảo vệ bên ngoài vi khuẩn chưa nhiều nên việc sử dụng hàm lượng H2O2 ở những
nồng độ 4 và 3 mM là không phù hợp sẽ gây sốc tế bào, ức chế quá trình tăng sinh. Đổi lại,
với CĐ3 lượng H2O2 bổ sung ban đầu được duy trì ở mức thấp hơn (2 mM) sau mới tăng dần
lên tới 3 và 4 mM ở những giờ cuối đã kích thích tăng sinh khối tế bào và kéo theo tăng hàm
lượng gellan. Kết quả nhận được ở các CĐ4, CĐ5 và CĐ6 cho hàm lượng gellan thấp hơn
hoặc tương tự với CĐ3. Thử nghiệm cũng cho thấy, kéo dài việc cung cấp H2O2 ở giờ thứ 28
(CĐ6) là không cần thiết bởi lẽ lúc đó vi khuẩn bắt đầu vào pha cân bằng, nhu cầu oxy đã
giảm, khi đó chế độ sục khí hay lắc của hệ thống lên men cũng đủ để đảm bảo duy trì sự
sống cho vi khuẩn. Guilan Z., (2014) cũng đã công bố sự sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất
khi bổ sung H2O2 trong những giờ đầu lên men. Như vậy, bổ sung H2O2 theo CĐ3 sẽ được
lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

7


Bảng 3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 tới khả năng tích lũy sinh khối và gellan

Lƣợng H2O2 bổ sung (mM)
tƣơng ứng ở các mốc 6, 12,
18, 24, (28) giờ

Lƣợng sinh khối
tế bào (g/l)

Hàm lƣợng gellan
(g/l)

ĐC

0, 0, 0, 0

3,95 ± 0,36bc

20,1 ± 0,96b

CĐ1

4, 3, 2, 2

3,97 ± 0,26c

20,1 ± 0,148b

CĐ2

3, 4, 2, 2

4,12 ± 0,18ab

21,7 ± 0,84b

CĐ3

2, 2, 3, 4

4,74 ± 0,36a

26,2 ± 0,88a

CĐ4

2, 2, 4,3

4,38 ± 0,29ab

25,3 ± 0,47a

CĐ5

2, 2, 3, 5

4,76 ± 0,18a

26,2 ± 1.19a

CĐ6

2, 2, 3, 4 và (4)

4,74 ± 0,38a

26,2 ± 0,98a

Chế độ

4

35

2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

3

30

2

25
20
15

1

10
5
0
6

OD 600 nm

Hàm lƣợng gellan (g/l)

3.2.1.4. Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan
Để xác định được thời gian lên men thích hợp cho hàm lượng gellan cao nhất, trong
phần này các thí nghiệm được thiết kế theo các điều kiện lựa chọn ở trên (Bột đậu tương
2,0%, L-threonine 0,05 %, bổ sung H2O2 theo CĐ3, các điều kiện khác giữ nguyên).
Kết quả trình bày ở hình 3.3. cho thấy, quá trình sinh tổng hợp gellan diễn ra sau 6 giờ
nuôi cấy. Pha logarit của chủng kéo dài từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 30. Cùng với sự tăng sinh
khối trong pha này, lượng gellan tích lũy trong dịch lên men cũng tăng theo từ 0,44 đến
10,20 g/l nhưng đạt giá trị cực đại (31,40 g/l) ở giờ thứ 66. Như vậy, hàm lượng gellan của
chủng S. paucimobilis GL12 được sinh tổng hợp trong suốt pha logarit và cả ở pha cân bằng.
Tác giả Nampoothiri M. K., (2003) cũng cho thấy chủng S. paucimobilis ATCC 31461 đạt
hàm lượng gellan cao nhất tại 48 giờ. Trong khi đó, với chủng S. paucimobilis E2, Lobas D.,
(1992) lại tìm thấy từ 60-68 giờ là khoảng thời gian thích hợp cho thu nhận gellan. Như vậy,
thời gian lên men tạo gellan phụ thuộc nhiều vào chủng sản xuất và điều kiện tiến hành. Dựa
vào các kết quả thí nghiệm thu được, lựa chọn thời gian 66 giờ là thời điểm kết thúc quá
trình lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis GL12.

12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78

Hàm lượng gellan (g/l)

OD 600 nm

Thời gian (giờ)

Hình 3.3. Động học quá trình sinh trưởng và tích lũy gellan của chủng S. paucimobilis GL12
(Mũi tên chỉ các thời điểm bổ sung H2O2 tương ứng với nồng độ 2, 2, 3, 4 mM)

8


3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác
Dựa trên cơ sở đã khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp
gellan từ S. paucimobilis GL12, đã xác định được mức độ tác động đơn lẻ của các yếu tố tới
sự sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12. Tuy nhiên, trong môi trường lên men các vi
sinh vật sẽ phải chịu tác động đồng thời của các yếu tố đó, đặc biệt ba yếu tố có giá trị ảnh
hưởng dương và lớn là glucose, bột đậu tương và L-threonine. Nhằm xác định được giá trị tối
ưu của các yếu tố này, phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box–Behnken đã được sử dụng
và đưa ra được phương trình hồi qui biểu diễn ảnh hưởng của ba yếu tố trên tới khả năng sinh
tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12 như sau:
Hàm lượng gellan (Y) = + 32,2 + 2,02X1 + 0,71X2 + 1,18X3 + 1,5X1X2 – 0,89X1X3 +
1,39X2X3 – 3,05X12 – 3,05 X22 – 1,12X32
với X1, X2 và X3 là các yếu tố glucose, bột đậu tương và L-threonine tương ứng
Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng
S. paucimobilis GL12. Kết quả tìm được giá trị hàm lượng gellan cao nhất theo lý thuyết đạt
từ 31,0 đến 32,96 g/l khi tổ hợp 3 yếu tố là nồng độ glucose: 3,6 %; bột đậu tương: 2,1 %; Lthreonine 0,06 %.
Tiến hành lên men thực nghiệm với các điều kiện vừa tìm được ở trên, kết quả hàm
lượng gellan thu được đạt (32,80 ± 0.85 g/l) nằm trong khoảng tin cậy trung bình 95% của
khoảng giá trị dự đoán theo lý thuyết. Những kết quả này xác nhận, kết quả lý thuyết và thực
nghiệm chênh trong giới hạn cho phép.
Dưới điều kiện tối ưu, chủng S. paucimobilis ATCC 31.461 sinh tổng hợp gellan với
hàm lượng 32,7 g/l sau 48 giờ lên men (Nampoothiri M. K., 2003). Cũng với chủng trên,

Bajaj B. I., (2007) lại thu được 35,9 g/l, trong khi đó, Jun Zhang (2015) báo cáo chỉ tổng hợp
được gellan từ S. paucimobilis QHZJUJW CGMCC2428 với hàm lượng 19.90 ± 0.68 g/l trên
môi trường có 4% sucrose, 3% peptone, ở pH 7.0, 30oC sau 72 giờ lên men.
3.2.3. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít
* Xác định tốc độ khuấy: Trong phần này 5 tốc độ khuấy 200; 225, 250, 275 và 300
vòng/phút được thử nghiệm. Kết quả hình 3.10 cho thấy, ở tốc độ khuấy 200 vòng/phút, khả
năng tạo gellan thu được khá thấp chỉ đạt 28,3 g/l sau 66 giờ lên men. Sản lượng gellan đạt
tối đa là 32,5 g/l ở tốc độ khuấy 275 vòng/phút. Tuy nhiên, khi tăng tốc độ khuấy lên 300
vòng/phút sản lượng gellan giảm nhẹ. Kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, tốc độ khuấy trộn
ảnh hưởng nhiều tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL12. Trong
nuôi cấy vi sinh vật ở quy mô lớn thì độ nhớt của môi trường cao và nhu cầu oxy lớn do
vậy nếu tốc độ khuấy thấp sẽ không thích hợp. Nhưng tốc độ khuấy quá lớn sẽ tạo ra lực cắt
làm ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như sự phát triển của tế bào, điều đó đồng nghĩa với việc
các sản phẩm thứ cấp tạo thành cũng bị ảnh hưởng (Banik R. M., 2006). Do vậy, tốc độ khấy
275 vòng/phút được chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

9


29.1

30.7

32.3

31.8

25
20
15

10
5
225

250

275

2

23

1.5

1

1
0.5
0

300

Thời gian (giờ)

Tốc độ khuấy(vòng/phút)

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy

4

0 12 24 36 48 52 56 58 60 62 64 66
pH
Hàm lượng gellan

0
200

35
30
25
20
15
10
5
0

OD 600nm

30

28.3

Hàm lƣợng gellan (g/l)

Hàm lƣợng gellan (g/L)

35

Hình 3.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan trên
bình lên men 10 lít (khấy 275 v/ph)

* Xác định thời gian thu hồi gellan: Đồ thị biểu thị sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp
gellan của chủng vi khuẩn S. paucimobilis GL12 trong quá trình sinh tổng hợp gellan trên
bình lên men sục khí 10 lít với tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph và tốc độ khuấy 275 vòng/phút
được thể hiện ở hình 3.5. Kết quả phân tích cho thấy, đường cong sinh trường của chủng
nghiên cứu ở qui mô này cũng tương tự như ở qui mô bình tam giác, lượng sinh khối đạt cực
đại sau khoảng 30 giờ lên men. Gellan cũng được tích lũy ngay từ pha logarit, tăng dần theo
thời gian và đạt cực đại ở pha cân bằng (33,1 g/l ở 58 giờ). Mặc dù hàm lượng gellan thu
nhận ở quy mô bình sục khí không khác nhiều so với quy mô phòng thí nghiệm (32,8 g/l ở
66 giờ), nhưng thời gian thu nhận gellan đã rút ngắn được tới 8 giờ. Điều này có thể là do ở
hệ thống bình lên men việc kiểm soát tốc độ cấp khí tốt hơn cho quá trình tăng trưởng và duy
trì của vi khuẩn. Hơn nữa, lượng H2O2 bổ sung theo bậc vào môi trường lúc này có thế lại
đóng vai trò như một tác nhân gây sốc nhẹ để cảm ứng cho vi khuẩn tăng tiết nhanh gellan ra
bên ngoài bề mặt để bảo vệ chúng.
3.2.4. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men
3.2.4.1. Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối
Do đặc tính của chủng S. paucimobilis khi sinh trưởng phát triển sẽ tiết ra gellan bám
xung quanh tế bào để bảo vệ chúng khỏi các tác động bên ngoài. Do vậy, để tách gellan khỏi
sinh khối, dịch lên men cần được xử lý trước khi ly tâm.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào vi khuẩn

Nhiệt độ dịch lên men
(oC)
Không xử lý nhiệt (ĐC)
75
85
90
95
100

Hàm lƣợng gellan
(g/l)
---31,9
32,8
32,6

Hàm lƣợng sinh khối tế bào
(g/l)
---3,51
4,62
4,74
4,75

Chú thích: --- : Không tách pha, không thu hồi được gellan;
-- : Có dấu hiệu tách pha, khi ly tâm không phân tách được sinh khối tế bào và gellan;
- : Có tách pha, khi ly tâm dịch nổi chứa gellan còn lẫn sinh khối tế bào;

10


Kết quả của bảng 3.5. cho thấy, khi xử lý dịch lên men ở nhiệt độ dưới 85oC không thể
tách hết gellan ra khỏi sinh khối. Tuy nhiên ở các mốc nhiệt xử lý 90, 95, 100 oC trong 15
phút, làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút cho hiệu quả tách vi khuẩn khỏi
dịch lên men là như nhau. Hiện tượng này có thể do khi nâng nhiệt tế bào vi khuẩn ở nhiệt
độ cao sẽ biến tính co cụm lại và nhả khối dịch gellan bám xung quanh tế bào. Bên cạnh đó
ở khoảng nhiệt độ này cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan ở dạng sợi đơn, độ nhớt
giảm kéo theo giảm độ kết dính với bề mặt vi khuẩn. Do vậy, khi tiến hành ly tâm sẽ dễ dàng
tách được gellan khỏi tế bào vi khuẩn.
3.2.4.2. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ
* Lựa chọn dung môi thích hợp: Dịch lên men thu được qua bước tiền xử lý ở trên được cho

thử nghiệm kết tủa gellan với các dung môi ethanol, acetone và isopropyl alcohol theo tỉ lệ
dịch:dung môi là 1:3 (v/v). Kết quả ở hình 3.6A. cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan từ các
dung môi thử nghiệm là khá cao (trên 91%) và khác nhau không đáng kể, có lẽ vì gellan là
một polyme anion nên chúng kết tủa tốt với các dung môi phân cực. Tuy nhiên xét về hiệu
quả kinh tế và tính an toàn, ethanol sẽ là dung môi được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp
của luận án. West T. P., (2003) cũng đã chọn ethanol là dung môi để thu hồi gellan và nhận

30.9

30.6

30

80
60

25
91.5

94.2

20

93.3

15

40

10

20

5

0

0
Aceton

Hiệu suất thu hồi gellan
Hàm lượng Gellan (g/l)

Ethanol

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

93.6

35
30

76.2

25

62.5
30.7
25

30.9

20
15

20.5

10
5
2/1

Isopropyl
alcohol

94.2

1/1

Hàm lƣợng gellan (g/l)

30

Hiệu suất thu hồi gellan (%)

100

Hàm lƣợng gellan (g/l)

Hiệu suất thu hồi gellan (%)

thấy khi sử dụng ethanol hiệu suất thu hồi gellan đạt cao hơn so với khi sử dụng dung môi
isopropyl alcohol và methanol.

0
1/2
1/3
Tỷ lệ dịch lên men/ethanol

Hàm lượng gellan (g/l)
Hiệu suất thu hồi gellan (%)

Dung môi

A. Ảnh hưởng của các loại dung môi
B. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol
Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất thu hồi gellan

* Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol đến hiệu suất thu hồi gellan: Để hiệu suất thu hồi
gellan cao nhất và tiết kiệm chi phí sản xuất, nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men
gellan/ethanol đến khả năng thu hồi gellan được tiến hành khảo sát với 4 tỷ lệ khác nhau: 2/1,
1/1, 1/2 và 1/3. Kết quả nghiên cứu ở hình 3.6B cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan cao nhất ở

tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/3 cho hiệu suất thu hồi đạt 94,2%. Ở tỷ lệ 1/2, hiệu suất thu
hồi gellan có thấp hơn nhưng không nhiều so với tỉ lệ 1/3 (hiệu suất đạt 93,6%). Khi giảm
lượng cồn xuống (ở các tỷ lệ 1/1 và 2/2) hiệu suất thu hồi gellan cũng bị giảm xuống nhiều
(tương đương 76,2% và 62,5%).

11


Từ các nhận xét trên, tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/2 sẽ được lựa chọn nhằm giúp tiết
kiệm đáng kể lượng ethanol tiêu hao mà vẫn đảm bảo được hiệu suất thu hồi gellan khá cao.
3.2.4.3. Loại màu khỏi kết tủa gellan
Do đặc tính của các chủng Sphingomonas sp trong quá trình sinh trưởng và phát triển
cũng thường tiết ra môi trường các sắc tố carotenoid màu vàng nên kéo theo các kết tủa gellan
cũng bị sậm màu nếu các sắc tố này không được loại ra trước đó (Xuechang W., 2011).
Dựa trên khả năng hòa tan của các carotenoid vào các dung môi hữu cơ, lặp lại các lần
kết tủa gellan với các dung môi này sẽ làm tăng được độ sáng màu cho kết tủa.
Trong phần này, tiến hành thí nghiệm với 500 ml dịch lên men sau khi đã tách sinh khối.
Ethanol 95o được sử dụng làm dung môi để kết tủa gellan với 4 lần kết tủa lặp lại. Kết quả
đánh giá hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu qua các lần kết tủa được cho ở bảng
3.6. Từ kết quả phân tích này và quan sát sự cải thiện độ trắng của kết tủa gellan (hình 3.7),
kết tủa lặp lại 3 lần sẽ được lựa chọn.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu

Số lần kết tủa

Lƣợng gellan

Hiệu suất thu Lƣợng carotenoid

Khả năng loại

tổng (g)

hồi gellan (%) tổng bị loại ra (g)

carotenoid (%)

Dịch gellan thô

16,40

-

0,0930

-

1

15,35

93,6

0,0776

83,4

2

15,04

91,7

0,0846

91,0

3

14,70

89,6

0,0867

93,2

4

14,61

89,1

0,0868

93,3

Dịch gellan sau lên men

Kết tủa lần 1

Kết tủa lần 2

Kết tủa lần 3

Hình 3.7. Sự cải thiện màu sắc của kết tủa gellan qua các lần kết tủa lặp lại

3.2.5. Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột
Để sản phẩm gellan dễ sử dụng, dễ bảo quản thì cần tạo chế phẩm gellan dạng bột.
Dịch gellan đậm đặc có đặc tính là một khối keo nhớt nên không dễ dàng để tiến hành sấy
phun, sấy đông khô… nếu không bổ sung chất trợ sấy. Tuy nhiên, khi bổ sung chất trợ sấy
có thể sẽ ảnh hưởng đến cấu trúc tạo gel của chế phẩm. Phương pháp sấy đối lưu đã khắc
phục được các nhược điểm trên và được sử dụng để thử nghiệm cho nội dung nghiên cứu này.
12


Qua khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của tác nhân sấy, thời gian sấy, độ dày vật liệu sấy đã
tìm được thông số sấy thích hợp với độ dày khối sấy 5cm, nhiệt độ của tác nhân sấy là 80oC
và thời gian sấy là 24 giờ, hiệu suất thu hồi sản phẩm đạt 85,9 % với độ ẩm sản phẩm là 6,50 %.
Tóm tắt các bước trên tính được hiệu suất tổng của quá trình thu hồi chế phẩm gellan từ
dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12 là 76,9 % (bảng 3.7)
Bảng 3.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12

Hiệu suất (%)

Các công đoạn
Dịch nổi

100

Kết tủa gellan + loại màu

89,6

Sấy

85,9

Toàn bộ quá trình

76,9

3.2.5. Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan
Trong quá trình sản xuất và phân phối hàng hóa, bao bì có chức năng bảo vệ sản phẩm
trong môi trường kín, ngăn cản độ ẩm không khí, tránh ánh sáng, tránh tác động của các lực
bên ngoài, giữ cho tính chất của sản phẩm được ổn định trong một thời gian nhất định. Vì
chế phẩm gellan có đặc tính hòa tan được trong nước, dễ bị hút ẩm nên việc lựa chọn loại bao
bì thích hợp để bảo quản chế phẩm là rất cần thiết. Sau khi khảo sát đặc tính của một số loại bao
bì 1 lớp và nhiều lớp (màng kép), độ ẩm của gellan bảo quản trong các loại màng này hầu như
không thay đổi so với khi mới đóng gói. Ở loại màng ghép thì màng có lá nhôm tránh ẩm tốt
nhất, điều đó đã chứng minh vai trò của lớp lá nhôm mỏng trong vật liệu tạo màng, có được
kết quả này là do ngoài các tính chất về độ bền hóa học, bền nhiệt độ, bền cơ học, màng
nhôm còn có một số tính chất mà các vật liệu khác không có được là tính chống khí, độ ẩm
và ánh sáng rất tốt. Xét về mặt kinh tế thì các loại màng ghép càng nhiều lớp giá càng đắt.
Do vậy, để phù hợp cho việc đóng gói sản phẩm được an toàn, đồng thời có hiệu quả kinh tế,
màng Al/PE được lựa chọn cho bảo quản sản phẩm gellan. Sau 06 tháng bảo quản gellan
đựng trong màng này vẫn có độ ẩm 6,51%.

13

3.2.7. Đề xuất quy trình thu nhận S. paucimobilis GL12

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu, quy trình công nghệ sản xuất bột gellan được đề xuất:
Chủng vi khuẩn S.paucimobilis GL12

Nhân giống
(30oC ± 2; pH 7 ± 0,2; 20 giờ; 200 vòng/phút)

Lên men sinh tổng hợp gellan
(giống 8%; 30oC, pH 7; H2O2 ở 6, 12, 18 và 24 h
bổ sung 2, 2, 3 và 4 mM; 275 vòng/ phút; tốc độ thổi
khí 1 lít/lít/phút; 58 giờ)

Tiền xử lý dịch lên men tách vi khuẩn
(95 – 100 oC/ 15 phút)

Ly tâm thu dịch nổi chứa gellan
(7000v/ph trong 15 phút)
Ethanol 95o
Kết tủa gellan
(dịch nổi/Ethanol: 1/2; kết tủa 10 giờ)

Ly tâm thu tủa
(ly tâm 4500 v/ph, trong 15 phút)

Sấy tủa
(Độ dày lớp sấy 5cm; 80 - 85 oC; thổi khí: 1m/s;
sấy 24 giờ)

Nghiền và bao gói

Chế phẩm gellan

Hình 3.8. Qui trình công nghệ thu nhận gellan từ S. paucimobilis GL12 trên hệ thống bình lên men 10 lít

3.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl
3.3.1. Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl
3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan
Để khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl của gellan, các thí nghiệm được tiến
hành trong môi trường kiềm ở một số giá trị pH khác nhau 8, 9, 10, và 11 với thời gian xử lý 8

14


phút. Các mẫu gellan khử acyl sẽ được đưa đi phân tích đánh giá mức độ deacyl bằng phương
pháp phổ hồng ngoại IR.
Trên các phổ hồng ngoại nhận được ở hình 3.9 đều xuất hiện các pic ở vùng 3400 và
1726 cm-1. Trong đó, pic ở khoảng 3400 cm-1 là dao động hóa trị đặc trưng cho các nhóm chức
OH- của chuỗi polysaccharide. Và pic xuất hiện ở khoảng 1726 cm-1 là dao động hóa trị đặc
trưng của các nhóm chức acyl, cường độ của các pic phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít của
các nhóm này.
Với các mẫu gellan chuẩn và gellan thu được từ S. paucimobilis GL12, phổ IR của chúng
xuất hiện đầy đủ hai pic hấp thụ ở 3400 và 1726 cm-1 với cường độ khá mạnh (hình 3.9a và
3.9b). Với phổ IR của các mẫu gellan khử acyl, cũng xuất hiện pic ở hai băng sóng này, tuy
nhiên cường độ pic ở khoảng 1726 cm-1 đều bị giảm và có sự khác nhau theo mỗi điều kiện
khử acyl (hình 3.9c và 3.9d). Khi tăng độ kiềm của phản ứng đồng nghĩa với việc tăng mức độ
deacyl, do đó khi xử lý ở pH 10 nhận thấy độ lớn của pic ở vùng 1726 cm-1 có giá trị nhỏ hơn
so với khi xử lý ở pH 9.
100

98
96
94

814.29
607.48cm-1

895.57

%T

92
90

1229.75

88

2934.45cm-1

86
1291.52cm-1

84
82
80
79
4000

1415.02cm-1

1725.63cm-1

1616.93cm-1

3421.13cm-1

3500

3000

1027.02cm-1

2500

2000

1750

1500

1250

1000

750

500450

cm-1

B. Phổ IR của gellan từ S. paucimobilis GL12

A. Phổ IR của gellan (chuẩn)
100
98
96
94

894.71

%T

92

611.64cm-1

812.75
1725.18cm-1

90

1293.19cm-1

88

1412.87cm-1

2932.13cm-1

86
1611.42cm-1

1231.53

84
82
3399.48cm-1

80
79
4000

3500

3000

1032.28cm-1

2500

2000

1500

1000

500450

cm-1

C. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở điều kiện
phản ứng pH = 9 trong 8 phút (tư ng ứng độ
deacyl 65%)

D. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở điều kiện phản
ứng pH = 10 trong 8 phút (tư ng ứng độ deacyl 82%)

Hình 3.9. Phổ IR của các gellan

15


Từ kết quả xác định chiều cao các đỉnh phổ thu được và dựa vào công thức tính mức độ
deacyl của các mẫu thử nghiệm ở các pH khác nhau được cho ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH xử lý tới mức độ deacyl của gellan

pH

Mức độ deacyl-ĐĐA (%)

8

KXĐ

9

65

Gel mềm, yếu

10

82

Gel chắc, giòn

11

84

Gel chắc, giòn

Đặc tính gel
Gel mềm

Thực nghiệm cho thấy, khả năng deacyl phụ thuộc nhiều vào pH xử lý. Khi xử lý ở pH
8 (nhiệt độ 80°C, trong 8 phút), mức độ deacyl gần như không đáng kể, sản phẩm thu được
từ phản ứng này cho gel có các tính chất gần với gellan (gel mềm, đàn hồi). Khi tăng mức độ
kiềm lên đạt pH 9, thu được sản phẩm có độ deacyl ở khoảng 65%, tạo gel nhão, yếu. Xử lý
ở pH 10, sản phẩm nhận được có độ deacyl 82%, cho gel chắc, giòn. Khi tăng đến pH 11
mức độ deacyl cải thiện không đáng kể (đạt 84%). Như vậy, việc thay đổi pH có thể nhận
được các sản phẩm có độ deacyl khác nhau và với mỗi sản phẩm nhận được có thể sử dụng
để tạo gel có tính chất khác nhau từ mềm, đàn hồi tới cứng và giòn. Đặc tính khác nhau của
gel nhận được từ các sản phẩm gellan khử acyl có thể được giải thích do sự thay thế nhóm
acyl đã làm giảm liên kết hydro nội phân tử, làm giảm cấu trúc xoắn cuộn của gellan dẫn đến
khả năng hút ẩm giảm, tăng độ cứng và độ giòn cho gel.
3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl
Nhằm tìm ra thời gian thích hợp cho phản ứng deacyl, tiến hành khảo sát thời gian
deacyl ở điều kiện môi trường kiềm có pH 10, ở nhiệt độ 80 oC, độ deacyl hóa của sản phẩm

được xác định sau các mốc 4, 6, 8, 10 và 12 phút phản ứng (hình 3.10).
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian deacyl hóa cho thấy, tốc độ deacyl xảy ra
khá nhanh trong 8 phút và mạnh mẽ nhất ở khoảng 4 phút đầu của phản ứng (độ deacyl đạt
60%). Thời điểm 8 và 10 phút sau phản ứng, tốc độ deacyl xảy ra chậm dần (độ deacyl tăng
từ 82% - 86%). Sau 10 phút, độ deacyl của gellan ít bị thay đổi. Điều này có thể được giải
thích do giai đoạn đầu quá trình deacyl xảy ra đối với các nhóm acyl trên bề mặt của gellan,
chúng tiếp xúc trực tiếp với các ion OH- nên tốc độ deacyl xảy ra khá nhanh. Sau đó, phản
ứng deacyl xảy ra đối với các nhóm acyl bên trong khó tiếp xúc hơn, đòi hỏi thời gian
khuếch tán lâu hơn của ion OH- vào lớp bên trong. Vì vậy, tốc độ phản ứng deacyl hóa diễn
ra chậm dần. Ngoài ra, do gellan có mạch polyme dài, đan xen, cuộn xoắn che lấp các nhóm
chức nên rất khó loại bỏ hoàn toàn nhóm acyl. Điều này cũng nhận được tương tự khi tiến
hành deacetyl hóa chitin để được sản phẩm chitosan. Theo tác giả Đặng Xuân Dự (2015) sử

16


dụng nồng độ NaOH 50%, đun nóng ở 80°C sau khoảng 3 giờ phản ứng đã thu được
chitosan có độ đề acyl khoảng 83%.
100

82

86

86

98

72

80

96
816.43

60

94

897.53
611.80cm-1

60

92
1723.50

%T

Độ deacyl-ĐĐA (%)

100

40

90

1297.00

2926.72cm-1

88
1414.72cm-1

1236.93

86

20

1612.22cm-1

84

0

82

4

6

8

10

12

80
79

4000

Thời gian phản ứng (phút)

1155.83

3388.20cm-1

3500

3000

1038.89cm-1

2500

2000

1750

1500

1250

1000

750

500450

cm-1

Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian deacyl đến độ
deacyl của gellan

Hình 3.11. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở
điều ki1n phản ứng pH = 10 trong 10 phút (tư ng
ứng độ deacyl 86%)

Từ các kết quả trên, lựa chọn được các điều kiện thích hợp cho thu nhận gellan khử acyl từ
dịch nổi chứa gellan của chủng S. paucimobilis GL12 như sau: điều chỉnh dịch tới pH 10, giữ ở
80°C trong 10 phút, hạ nhiệt dịch khử, trung hòa về pH 7 bằng HCl. Phổ IR của sản phẩm ở
điều kiện xử lý này được cho trên hình 3.11 tương ứng với mức độ deacetyl 86%.
3.3.2. Kết tủa gellan khử acyl bằng ethanol
Ethanol được lựa chọn để kết tủa gellan khử acyl trong dịch lên men. Nhằm thu hồi
hiệu suất gellan khử acyl cao nhất và tiết kiệm chi phí sản xuất, nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ
lệ dịch lên men gellan khử acyl/ethanol đến khả năng thu hồi gellan khử acyl. Sau khi kết thúc

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

89.3

89.9

35
30

71.9
25

58.2
29.3
23.58

29.48

20
15

19.09
10
5
2/1

1/1

Hàm lượng gellan khử acyl (g/l)
Hiệu suất thu hồi gellan khử acyl (%)

Hàm lƣợng gellan khử acyl (g/l)

Hiệu suất thu hồi gellan khử acyl
(%)

quá trình khử acyl và trung hòa về pH 7, ethanol 95o được bổ sung vào khối dịch theo các tỷ lệ
dịch/ethanol: 2/1, 1/1, 1/2 và 1/3 để kết tủa trong 10 giờ, sau đó đánh giá lượng gellan khử
acyl thu được cho mỗi thí nghiệm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan khử acyl tăng dần khi tăng lượng
ethanol trong dịch và đạt ổn định khi tỷ lệ dịch khử acyl/ethanol là ½ , hiệu suất thu hồi đạt
89,3% (hình 3.12).

0
1/2
1/3
Tỷ lệ dịch gellan khử acyl/ethanol

Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch gellan khử acyl/ethanol
đến hiệu suất thu hồi

17

Hình 3.13. Kết tủa gellan khử acyl sau 1 lần
kết tủa cồn


Một điều khác cũng được nhận thấy khi bổ sung kiềm vào để thực hiện phản ứng
deacyl, màu vàng của khối dịch lên men sẽ bị nhạt dần và dịch có màu trắng khi ở pH 10. Do
đó, trong trường hợp này chỉ cần tiến hành kết tủa 1 lần thay vì 3 lần như trong trường hợp
của gellan trên đây. Sự đối màu này có thể là do song song với trong quá trình khử acyl đã
xảy ra phản ứng oxy hóa làm khối dịch chuyển từ màu vàng sang màu trắng.

3.3.3. Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl
Kế thừa các kết quả nghiên cứu về phương pháp sấy đối lưu cho gellan ở phần trên,
trong phần này, kết tủa gellan khử acyl cũng được sấy theo phương pháp này với chế độ sấy
như sau: sấy ở nhiệt độ 80oC, tốc độ thổi khí 1 m/s, độ dày khối sấy là 5cm. Sau 24 giờ thu
được sản phẩm đem đi nghiền thành bột, đóng gói kín. Kết quả phân tích ở bảng 3.9. cho
thấy, hiệu suất thu hồi của quá trình sấy đạt 85,6 % cho sản phẩm có độ ẩm 6,45%, chế phẩm
phẩm có dạng bột mịn, màu trắng sáng, mùi thơm nhẹ.
Từ những kết quả trên, có thể tóm tắt hiệu suất quá trình thu hồi chế phẩm gellan khử
acyl dạng bột từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12, khi đó hiệu suất tổng đạt
76%, chế phẩm có độ ẩm đạt 6,5%, độ deacyl 86% (Bảng 3.10).
Bảng 3.9. Xác định hiệu xuất sấy thu hồi gellan khử acyl

Lần sấy

Lƣợng gellan

Hiệu suất

Độ ẩm

khử acyl (g)

thu hồi (%)

(%)

Ban đầu

200,0

-

-

Lần 1

171,4

85,7

6,48

Lần 2

171,2

85,6

6,45

Lần 3

171,2

85,6

6,42

Trung bình

171,2

85,6

6,45

Bảng 3.10. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan khử acyl từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12

Hiệu suất (%)

Các công đoạn
Dịch nổi

100

Khử acyl + kết tủa

89,3

Sấy

85,6

Toàn bộ quá trình

76,0

Từ những kết quả thu được ở này, qui trình khử acyl được đề xuất theo hình 3.14:

18

Dịch nổi chứa gellan

Deacyl hóa
(pH=10 bằng NaOH 2M ; 80oC; 10

Hạ nhiệt, trung hòa
(Nhiệt độ môi trường; pH =7 bằng

phút)

HCl)
Ethanol 950

Kết tủa gellan khử acyl
(Dịch nổi / Ethanol:1/2; kết tủa 10 giờ)

Ly tâm thu tủa
(Ly tâm 4500 v/ph, trong 15 phút)

Sấy
(Độ dày 5cm, 80 -85 oC, 1m/s, 24 giờ)

Nghiền và bao gói

Gellan

Hình 3.14. Qui trình công nghệ chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl

3.4. Đánh giá chất lƣợng thuộc tính chế phẩm
3.4.1. Đánh giá chất lƣợng gellan
3.4.1.1. Xác định cấu trúc gellan của chủng S. paucimobilis GL12
Cấu trúc phân tử gellan được xác định theo phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân
NMR. Theo đó, phổ một chiều NMR của mẫu gellan chuẩn được xác định sau đó làm cơ sở
để so sánh với số liệu phổ NMR của mẫu thí nghiệm.
Kết quả so sánh phổ một chiều - 1H của gellan chuẩn (TN0) và gellan thu được từ
chủng S. paucimobilis GL12 (TN2) trên hình 3.15. cho thấy sự tương đồng về các tín hiệu
cộng hưởng từ proton ở tất cả các vị trí như vị trí nhóm metyl (CH 3) của đường rhamnose,
gốc acetate, các proton anomer của các đơn vị đường. Trong đó, quan sát dễ dàng nhất là tín
hiệu của các nhóm methyl trong gốc acetate và trong đơn vị đường rhamnose. Sự tương
đồng về tỷ lệ tích phân giữa tín hiệu của nhóm methyl trong gốc acetate và nhóm methyl
trong đơn vị đường rhamnose (tỉ lệ khoảng 1:2.1) cũng cho phép dự đoán hàm lượng acetate
của gellan nhận được từ chủng S. paucimobilis GL12 là giống với gellan chuẩn.
19


A. Phổ 1H – NMR của gellan chuẩn

B. Phổ 1H – NMR của gellan từ S. paucimobilis GL12

Hình 3.15. So sánh phổ proton của gellan chuẩn (TN0) và gellan từ S. paucimobilis GL12 (TN2)

3.4.1.2. Xác định khối lượng phân tử gellan
Theo phương pháp của Gong Y., (2009) và Masuelli A. M., (2014), muốn xác định
được khối lượng phân tử gellan thì cần tính độ nhớt rút gọn của gellan, từ đó xây dựng được
mối tương quan giữa độ nhớt rút gọn và nồng độ của dung dịch mẫu, từ đây đưa giá trị x = 0
sẽ tìm được độ nhớt đặc trưng của gellan. Thông qua phương trình Mark-Howink sẽ tính ra
được khối lượng phân tử gellan.
Từ thực nghiệm ở hình 3.16. cho thấy, chế phẩm gellan được sinh tổng hợp từ

Độ nhớt rút gọn (ηr/C)

S.paucimobilis GL12 có độ nhớt đặc trưng là 28,26 dl/g và đã xác định được trọng lượng
phân tử trung bình nhớt của gellan là 1,3 x 106Da. Kết quả này cũng phù hợp với Eric và
Iurciuc công bố, gellan có khối lượng phân tử khoảng 105 đến 106Da (Dreveton E., 1996;
Iurciuc S. A., 2015). KangD., (2017) lại tìm ra gellan có khối lượng phân tử 0,4 – 1,0 x 106
Da. Theo Vasiliki và cộng sự năm 2017 cho thấy khối lượng phân tử gellan thu được dao
động khoảng 1 - 2 x 106 Da (Vasiliki E., 2017).

y = 54.3x + 28.261
R² = 0.9532

31.5
30.5
29.5
28.5
27.5
26.5
0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

Nồng độ dung dịch gellan (C %)

Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn mối tư ng quan giữa độ nhớt rút gọn và nồng độ gellan

20


3.4.1.3. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan
Để đánh giá chất lượng chế phẩm, tiến hành đánh giá chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và
vi sinh vật, theo kết quả phân tích sản phẩm tại khoa Hóa Học - Trường đại học Khoa Học
Tự Nhiên, Bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm và Bộ môn
Nghiên cứu Công nghệ sinh học STH - Viện cơ điện NN và CNSTH thu được, chế phẩm bột
gellan được đóng trong túi Al/PE với trọng lượng 50g/túi. Chế phẩm có thể bảo quản tại nhiệt
độ phòng, tránh ánh sáng trực tiếp. Chế phẩm gellan có độ ẩm 6,64 %; Độ nhớt của dung dịch
1% ở 25oC là 2837 Cp. Nhiệt độ bắt đầu tạo gel ≥ 750C, gel mềm và đàn hồi, khả năng tạo gel
với ion Ca+2 và ion Na+ là 100% hạt gel tạo ra bền vững. So sánh kết quả chỉ tiêu lý hóa,
phân tích kim loại nặng và vi sinh vật thì chế phẩm gellan thu nhận từ S. paucimobilis GL12
đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép của gellan thương mại công bố (Bajaj B.I., 2007).
Từ những kết quả phân tích trên cho thấy, sản phẩm gellan thu từ S. paucimobilis GL12
có cấu trúc, khối lượng phân tử và các đặc tính hóa lý gần tương tự với các chế phẩm gellan
công bố trên thị trường. Kết quả này cũng cho thấy, mặc dù có một số thay đổi về thành
phần môi trường lên men và điều kiện cấp oxi so với những điều kiện tìm ra trước của đề tài
(Nguyễn Thị Hồng Hà., 2005) nhưng chế phẩm gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 vẫn
mang những đặc tính tương tự.
3.4.2. Đánh giá chất lƣợng gellan khử acyl
3.4.2.1. Xác định cấu trúc gellan khử acyl
Cấu trúc của gellan khử acyl được thu nhận từ chủng S. paucimobilis GL12 được xác đinh

bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân tương tự như của mẫu gellan trên.
Kết quả ở hình 3.17 đã chỉ ra, phổ proton của gellan khử acyl chuẩn (TN.KhuAcyl –D2O1H) và phổ proton của gellan khử acyl do chủng S. paucimobilis GL12 tạo ra (TM2-D2O-1H) là
đồng nhất.

a. Phổ 1H – NMR của gellan khử acyl chuẩn

b. Phổ 1H -NMR gellan khử acyl 86% từ S. paucimobilis GL12

Hình 3.17. So sánh phổ proton của gellan khử acyl chuẩn (TN.KhuAcyl –D2O-1H) và
gellan khử acyl từ S. paucimobilis GL12 (TM2)

3.4.2.2. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan khử acyl
Tương tự như gellan, chế phẩm gellan khử acyl cũng cần đánh giá các chỉ tiêu như: chỉ
tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật để làm cơ sở trước khi ứng dụng sản phẩm. Chế
21


phẩm bột gellan khử acyl được đóng trong túi Al/PE với trọng lượng 50g/túi. Chế phẩm được
bảo quản tại nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trực tiếp. Sản phẩm gellan khử acyl có độ ẩm 6,58;
độ bền gel 437 g/cm2; nhiệt độ bắt đầu tạo gel khoảng ≥ 350C; gel cứng và giòn. Các chỉ tiêu vi
sinh vật và kim loại nặng của chế phẩm đều đạt yêu cầu về ATTP cho phép trong thực phẩm và
trong khoảng giới hạn cho phép của gellan khử acyl thương mại công bố (Bajaj B.I., 2007).
Sản phẩm đủ điều kiện ứng dụng thử nghiệm trong phòng thí nghiệm.
3.5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl
3.5.1. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối
Các thí nghiệm trong phần này đã xác định được công thức thích hợp cho dung dịch để
tạo màng bao cho bảo quản chuối với các thành phần như sau: gellan 0,3%, glycerol 0,5%,
axit oleic 0,2% và dầu hướng dương 0,025%. Dịch có pH 8,0 - 8,2, độ nhớt đạt 400 - 434 Cp
ở 20oC, thời gian khô của màng là 25 - 30 phút. Thời gian bền nhũ tương ≥ 06 tháng.
Chuối được phủ màng gellan, ở nhiệt độ phòng (20 ± 2oC) có thời gian bảo quản là 18

ngày, tăng gấp 2 lần so với đối chứng. Tỷ lệ hao hụt của chuối sau 18 ngày bảo quản là 5,34
%; độ cứng của quả đạt 2,84 kg/ cm2; độ sáng vỏ quả là 56,22. Chuối được bảo quản bằng
màng bao gellan có màu vàng đẹp, vỏ bóng tươi, ruột quả cứng, vị ngọt, thơm ngon. Phiếu
đánh giá cảm quan đều kết luận chuối bảo quản có hình thức quả đẹp, vị ngon, đạt yêu cầu bán
ra thị trường đạt 100%.

A. Chuối được phủ màng
gellan

CT1 CT2 CT3 CT4
CT3
CT4
B. Theo dõi chuối thí
nghiệm

C. Mẫu đối chứng
(Sau 9 ngày)

D. Mẫu chuối được bảo
quản màng gellan theo
CT3(sau 18 ngày)

Hình 3.18. Một số hình ảnh bảo quản chuối từ màng bao gellan (nhiệt độ bảo quản 22oC)

3.5.2. Ứng dụng gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa
Do có khả năng tạo được dạng gel cứng, giòn và bền trong môi trường có pH thấp (dưới 4)
nên trong phần này chế phẩm gellan khử acyl được sử dụng để bổ sung vào công thức thạch dứa
thay thế cho chất tạo gel agar. Thử nghiệm đã tìm được tỷ lệ bổ sung gellan khử acyl thích hợp là
0,6%, thời gian tạo gel diễn ra nhanh chóng, thạch thu được có độ trong suốt, độ giòn cao, khối
thạch chắc, không chảy nước, giữ được mùi vị đặc trưng. Sau 03 tháng bảo quản, thạch vẫn giữ được

các tính chất cảm quan đặc trưng về mùi vị và cấu trúc.

22


Bảng 3.11. Xác định tỉ lệ gellan khử acyl bổ sung thích hợp trong thành phần thạch

Nồng độ gellan
khử acyl (%)

Điểm cảm
quan

Nhận xét

0,50

11.5

Gel lỏng, thạch không tạo hình được, có mùi vị đặc trưng

0,55

16,4

Thời gian tạo gel chậm, gel lỏng lẻo, chảy nước, thạch trong
suốt, có mùi vị đặc trưng

0,60

17.8

Thời gian tạo gel nhanh, tạo khối chắc, không chảy nƣớc,
thạch trong suốt, giữ đƣợc mùi vị đặc trƣng

0,65

15.7

Tạo gel nhanh, thạch hơi đục, giòn, có mùi vị đặc trưng

0,70

10,6

Tạo gel nhanh chóng, thạch đục, cứng, nhưng vẫn giữ được
mùi vị đặc trưng

A.Thạch dứa bổ sung 1,4% agar

B. Thạch dứa bổ sung 0,6% gellan

Hình 3.19. Hình ảnh mẫu thạch dứa thu được khi sử dụng agar (A) và khi sử dụng gellan (B)

23