Luận văn: Xác định thành phần môi trường nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp enzyme pectinase
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.17 MB, 82 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & DẦU KHÍ
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
---------------o0o---------------
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC SINH
TỔNG HP ENZYME PECTINASE
GVHD : TS. Lê Văn Việt
Mẫn
SVTH : Vũ Thò Hồng Vân
MSSV : 60103229
Tp HCM, tháng 12/2005
Luận văn tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, con xin chân thành cảm ơn Bố, Mẹ và
gia đình đã giúp đỡ con về mọi mặt từ vật chất đến tinh
thần để con có thể hoàn thành tốt bài luận văn tốt
nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường ĐHBK
– TpHCM, cảm ơn quý thầy cô, cán bộ phòng thí nghiệm
đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt
những năm học vừa qua.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến
thầy Lê Văn Việt Mẫn là giáo viên hướng dẫn và tập
thể thầy cô bộ môn Công nghệ thực phẩm trường ĐH
Bách Khoa đã chỉ dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian
thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Mình cũng cảm ơn các bạn trong nhóm Châu, Tùng,
Song, Đức, các bạn phòng 101 và các em đã luôn giúp đỡ
và động viên mình.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn và chúc mọi
người nhiều sức khỏe và thành công.
Tp.HCM, tháng 1/2006
VŨ THỊ HỒNG VÂN
-ii-
Luận văn tốt nghiệp
TÓM TẮT LUẬN VĂN
Tên đề tài “Xác đònh thành phần môi trường nuôi
cấy nấm mốc sinh tổng hợp enzyme pectinase”
Pectinase là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy
phân pectin. Chế phẩm pectinase được ứng dụng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, nhất là trong
công nghiệp sản xuất các loại nước ép trái cây. Hiện
nay, các chế phẩm enzyme được sản xuất chủ yếu từ vi
sinh vật, trong đó phương pháp nuôi cấy bề sâu có nhiều
ưu điểm hơn các phương pháp khác. Phương pháp bề sâu
cho phép điều khiển chính xác các thông số kỹ thuật của
quá trình lên men và thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp
enzyme ở vi sinh vật.
Trong luận văn tốt nghiệp này, nội dung nghiên cứu
của chúng tôi gồm có những phần sau:
Nuôi cấy 3 loài nấm mốc thuộc giống Aspergillus có
khả năng tổng hợp enzyme pectinase bằng phương pháp
nuôi cấy bề sâu: từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng
tôi tuyển chọn loài A. awamori có khả năng tổng hợp
pectinase cao nhất để nghiên cứu tiếp.
Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ
lên quá trình sinh tổng hợp pectinase của nấm mốc.
Tối ưu hóa hàm lượng cơ chất carbon và nitơ trong môi
trường nuôi cấy bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
Thử ứng dụng chế phẩm enzyme pectinase thô thu
được để làm giảm độ nhớt nước ổi ép.
-iii-
Luận văn tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên hoạt tính
enzyme pectinase.
Bảng 2.2: Nồng độ các chất khoáng cần thiết cho vi
sinh vật phát triển.
Bảng 2.3: Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật
theo phương pháp nuôi cấy bề sâu.
Bảng 3.1: Thực hiện phản ứng giữa pectinase và cơ
chất.
Bảng 3.2: Dựng đường chuẩn monogalacturonic acid.
Bảng 3.3: Xây dựng đường chuẩn Tyrosin.
Bảng 4.1: Sự thay đổi hoạt tính endo-polygalacturonase trong
canh trường nuôi cấy nấm mốc theo thời gian.
Bảng 4.2: Sự thay đổi hoạt tính exo-polygalacturonase trong
canh trường nuôi cấy nấm mốc theo thời gian.
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt
tính endo-polygalacturonase trong môi trường nuôi cấy A.
awamori.
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính endopolygalacturonase trong môi trường nuôi cấy A. awamori.
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của hàm lượng NH 4Cl trong môi
trường nuôi cấy đến hoạt tính endo-polygalacturonase.
Bảng 4.6: Thành phần môi trường của các mẫu thí
nghiệm quy hoạch thực nghiệm.
Bảng 4.7: Hoạt tính của endo-polygalacturonase trong các
mẫu trong thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp trực giao
bậc hai.
Bảng 4.8: Các hệ số của phương trình hồi quy.
Bảng 4.9: Thể tích dòch ổi ép và dòch enzyme sử dụng.
Bảng 4.10: Thời gian chảy của dòch ổi ép khi bổ sung
enzyme và khi không bổ sung enzyme.
-iv-
Luaän vaên toát nghieäp
-v-
Luận văn tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Phân tử pectin.
Hình 2.2: Cơ chế tác dụng của exo-polygalacturonase .
Hình 2.3: Cơ chế tác dụng của endo-polygalacturonase .
Hình 2.4: Cơ chế tác dụng của enzyme pectinesterase.
Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của enzyme pectate lyase.
Hình 2.6: Cơ chế tác dụng của enzyme pectin lyase.
Hình 2.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi
trường ban đầu đến hoạt tính enzyme polygalacturonase.
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu.
Hình 4.1: Sự thay đổi hoạt tính endo-polygalacturonase trong
canh trường nuôi cấy nấm mốc theo thời gian.
Hình 4.2: Sự thay đổi hoạt tính exo-polygalacturonase trong
canh trường nuôi cấy nấm mốc theo thời gian.
Hình 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt tính
endo-polygalacturonase.
Hình 4.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính endopolygalacturonase trong môi trường nuôi cấy A. awamori.
Hình 4.5: Ảnh hưởng của hàm lượng NH 4Cl trong môi
trường nuôi cấy đến hoạt tính endo-polygalacturonase.
Hình 4.6: Đồ thò biểu diễn phương trình hồi quy.
-vi-
Luận văn tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU:
............................................................................................................................
2
Lời mở đầu
................................................................................................................................
2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
...........................................................................
5
Pectin:[7,8]
......................................................................................................................................
5
1.1.1. Nguồn gốc:
........................................................................................................................................
5
1.1.2. Cấu tạo của pectin:
...........................................................................................................................
5
1.1.3. Một số tính chất của pectin:
...........................................................................................................
6
1.1.4. Phân loại pectin:
.................................................................................................................................
7
1.2. Enzyme pectinase:[2,3,5,8,9]
....................................................................................................
7
1.2.1. Phân loại enzyme pectinase:
..............................................................................................................
7
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase ở vi sinh vật:
12
......
1.2.3. Phương pháp thu nhận enzyme pectinase:[2, 4]
..............................................................................
17
1.2.4. Ứng dụng của chế phẩm enzyme pectinase:[2]
........................................................................
22
1.3. Đặc điểm của một số loài nấm mốc trong sinh tổng hợp enzyme pectinase:[7]
24
1.3.1. Aspergillus niger:
................................................................................................................................
25
1.3.2. Aspergillus oryzae:
.............................................................................................................................
25
1.3.3. Aspergillus awamori:
..........................................................................................................................
25
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
...............
28
Nguyên liệu:
...............................................................................................................................
28
1.3.4. Vi sinh vật sử dụng để thu nhận enzyme pectinase:
...................................................................
28
1.3.5. Hóa chất:
.........................................................................................................................................
28
1.3.6. Môi trường để giữ giống:
...................................................................................................
28
1.3.7. Môi trường cơ bản để nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp enzyme pectinase:
....................
29
1.4. Phương pháp nghiên cứu:
.................................................................................................
30
Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm:
...........................................................................................................
30
Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu:
............................................................................................................
31
1.5. Phương pháp phân tích:
.....................................................................................................
35
1.5.1. Cách xác đònh hoạt tính enzyme pectinase:
..................................................................................
35
2. Chương 4: Kết quả và bàn luận:
...............................................................................
44
2.1. Khảo sát chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp pectinase có hoạt tính cao nhất: . 44
2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt tính pectinase:
....................................
48
2.3. Chọn nguồn Nitơ vô cơ cho môi trường nuôi cấy:
....................................................
51
2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ lên hoạt tính pectinase:
.........................................
54
2.5. Quy hoạch thực nghiệm:
.....................................................................................................
57
2.5.1. Thực hiện:
........................................................................................................................................
57
2.5.2. Kết quả:
..........................................................................................................................................
59
2.6. Thử ứng dụng chế phẩm pectinase thô thu được để làm giảm độ nhớt của
dòch quả:
.....................................................................................................................................
64
3. Kết luận và đề nghò:
....................................................................................................
67
-vii-
Luận văn tốt nghiệp
3.1. Kết luận:
..............................................................................................................................
67
3.2. Đề nghò:
.................................................................................................................................
67
4. TÀI LIỆU THAM KHẢO
...........................................................................................
69
5. PHỤ LỤC
..........................................................................................................................
71
-viii-
Luận văn tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
-1-
Luận văn tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
MỞ ĐẦU:
Lời mở đầu
Trong vòng vài chục năm gần đây, công nghiệp sản
xuất chế phẩm enzyme đã có những bước tiến khổng lồ
với tốc độ phát triển khá mạnh mẽ. Các chế phẩm
enzyme được sản xuất ngày càng nhiều về số lượng, đa
dạng về chủng loại. Vì enzyme là những chất không thể
tổng hợp bằng con đường hóa học nên người ta chỉ thu
chúng từ các nguồn sinh học. Ta có thể thu nhận enzyme
từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, hầu hết
các nguồn nguyên liệu động vật, thực vật không thể
dùng làm nguyên liệu để sản xuất chế phẩm enzyme với
quy mô công nghiệp lớn. Như vậy, trong các nguồn nguyên
liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào
và đầy hứa hẹn vì enzyme từ vi sinh vật có tốc độ sinh
trưởng nhanh và có hoạt lực xúc tác mạnh mẽ. Nguyên
liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật lại dễ kiếm và
rẻ tiền, do đó dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme sẽ
đem lại hiệu quả kinh tế lớn.
Một trong các chế phẩm enzyme được ứng dụng nhiều
nhất là pectinase. Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, y dược và nông
nghiệp.
Trong công nghiệp sản xuất nước rau quả, một hiện
tượng gây ảnh hưởng không tốt đến chất lượng sản
phẩm trong quá trình tồn trữ là nước rau quả bò hoá đục.
Nguyên nhân chủ yếu là do trong các loại rau quả chứa
một lượng lớn hợp chất pectin. Có nhiều giải pháp để
giải quyết vấn đề trên, trong đó giải pháp sử dụng các
chế phẩm enzyme thủy phân pectin là cho hiệu quả và tốt
hơn cả.
Hiện nay trong sản xuất công nghiệp, các chế phẩm
pectinase được thu nhận từ các nguồn vi sinh vật như nấm
mốc hoặc vi khuẩn… chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy
bề mặt hay bề sâu. Để đáp ứng cho yêu cầu tự động
hóa, cơ giới hóa trong công nghiệp, phương pháp nuôi cấy
-2-
Luận văn tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
bề sâu ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất
các chế phẩm enzyme. Trên cơ sở đó, chúng tôi bước
đầu khảo sát quá trình sinh tổng hợp pectinase từ nấm
mốc bằng phương pháp nuôi cấy bề sâu, từ đó tối ưu
hóa thành phần môi trường nuôi cấy nhằm thu nhận
pectinase có hoạt tính cao.
-3-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
-4-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Pectin:[7,8]
1.1.1. Nguồn gốc:
Pectin có mặt trong quả và củ. Pectin có chức năng
duy trì hình dáng và sự vững chắc của trái cây. Người ta
thấy có 2 dạng tồn tại của pectin là protopectin không tan
(là phức chất giữa pectin và các thành phần khác như
cellulose và hemicellulose làm nên cấu trúc vách tế bào)
và pectin tan là chất có trong thành phần dòch bào của
thực vật.
Từ thời tiền sử, chất pectin đã là thành phần trong
khẩu phần ăn của con người. Nhưng chỉ mới trong nửa thế
kỷ trước, ngành công nghiệp thực phẩm mới nhận biết
được vai trò quan trọng của phụ gia pectin trong việc đa dạng
hóa các sản phẩm thực phẩm.
Trong công nghiệp, pectin được thu nhận từ dòch chiết
của các nguyên liệu thực vật, thường là táo hay các quả
có múi.
Đối với việc sản xuất nước quả, sự có mặt của
pectin là điều không mong muốn và không có lợi. Do nó
có tính chất keo nên làm cho dòch quả có độ nhớt cao, vì
thế sẽ làm cản trở các quá trình như ép, lọc, trích ly dòch
chiết từ quả. Ngoài ra, pectin còn làm giảm độ bền keo
của nước quả.
1.1.2. Cấu tạo của pectin:
Pectin là một polysaccharide dò thể, mạch thẳng, cấu tạo
từ acid polygalacturonic đã được ester hóa 1 phần hay toàn
bộ với rượu methylic.
Acid polygalacturonic là 1 polymer của acid Dmonogalacturonic liên kết với nhau bằng liên kết
1,4glucoside.
Tùy thuộc nguồn gốc pectin mà mạch acid
polygalacturonic dài hay ngắn, do đó khối lượng phân tử
của chúng cũng khác nhau, dao động trong khoảng 20.000-
-5-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
200.000 đơn vò. Ví dụ như: phân tử lượng của pectin từ táo,
mận là 25.000-35.000, từ nguồn cam là 50.000.
Ở thực vật, có sự biến đổi giữa thành phần
protopectin và pectin trong quá trình chín của quả. Khi quả
xanh, hàm lượng protopectin trong quả rất cao, phân tán chủ
yếu ở thành tế bào và có tác dụng làm cho quả cứng.
Đến khi quả chín, dưới tác dụng của các acid hữu cơ và vai
trò xúc tác của enzyme protopectinase có trong quả,
protopectin không tan sẽ chuyển dần sang dạng protopectin
tan và pectin làm quả mềm ra.
Phân tử pectin
1.1.3. Một số tính chất của pectin:
Pectin thương phẩm là chất bột màu trắng xám hay
vàng nhạt, tan trong nước, dung dòch đường, kiềm, carbonat
natri và trong glycerin nóng. Pectin không tan trong rượu và
các dung môi hữu cơ khác. Pectin dễ dàng bò kết tủa bởi
ethanol, isopropanol, sulfat amon, clorua nhôm, muối đồng,
muối canxi và bởi acid.
Ở trạng thái dung dòch, pectin có những đặc tính công
nghệ quan trọng như: là chất làm đặc, chất ổn đònh cấu
trúc, chất tạo gel, trong đó khả năng tạo gel là quan trọng
nhất.
Pectin hòa tan khi bò tác dụng của các chất kiềm loãng
hoặc enzyme pectinesterase sẽ giải phóng rượu methylic và
acid polygalacturonic tự do. Acid polygalacturonic kết hợp với ion
canxi sẽ cho ra canxi polygalacturonate kết tủa. Tính chất này
được ứng dụng để đònh lượng pectin.
-6-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
1.1.4. Phân loại pectin:
1.1.4.1. Theo tỉ lệ % nhóm methylen trong phân tử pectin:
HMP: High Methoxyl Pectin: DE >50%.
LMP: Low Methoxyl Pectin: DE
50%.
Với DE (degree of esterification): là phần trăm về số
lượng của các gốc acid galacturonic được ester hóa trên
tổng số lượng gốc acid galacturonic có trong phân tử.
1.1.4.2. Theo khả năng hòa tan trong nước:
Pectin hòa tan: methoxyl polygalacturonic.
Pectin không hòa tan: protopectin là dạng kết hợp giữa
pectin với các polysaccharid khác.
1.2. Enzyme pectinase: [2,3,5,8,9]
Enzyme pectinase là nhóm enzyme thủy phân pectin, sản
phẩm tạo thành là acid galacturonic, oligogalacturonic,
polygalacturonic mạch ngắn, methanol...
Enzyme pectinase rất phổ biến trong thế giới sinh vật.
Nó có nhiều trong lá và củ khoai tây, trong chanh, cà chua
và trong các loại quả khác. Ngoài ra, nó cũng được tạo
thành từ các vi sinh vật như: nấm mốc, vi khuẩn, nấm men.
1.2.1. Phân loại enzyme pectinase:
Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng và kiểu phản
ứng của enzyme, năm 1966 Koller và Newkom đã chia
pectinase thành 2 nhóm chính:
Nhóm enzyme
polygalacturonase
Nhóm
pectatelyase
enzyme
hydrolase:
gồm
trans-eliminase:
pectinesterase
gồm
pectinlyase
và
và
1.2.1.1. Nhóm enzyme hydrolase:
Là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân pectin.
Gồm có các enzyme sau:
-7-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
Polygalacturonase
Pectinesterase
a) Enzyme polygalacturonase (viết tắt PG):
Là enzyme xúc tác thủy phân liên kết
-1,4-Dgalacturosiduronic giữa các gốc acid galacturonic trong pectin
và acid polygalacturonic, tách các gốc D-galacturonic thành
các phân tử D-galacturonic tự do. Có 2 loại polygalacturonase
là endo-polygalacturonase và exo-polygalacturonase:
Endo-polygalacturonase: là enzyme có tác dụng cắt
giữa mạch các phân tử pectin hoặc các phân tử acid
polygalacturonic, tạo thành các mạch ngắn hơn làm cho độ
nhớt của dung dòch pectin giảm đi nhiều. Thông thường,
endo-polygalacturonase chỉ xúc tác thủy phân liên kết 1,4-D-galacturosiduronic giữa 2 nhóm acid galacturonic không bò
methyl hóa [13].
Exo-polygalacturonsase: là enzyme có khả năng phân
cắt dần dần từng gốc acid galacturonic bắt đầu từ đầu
không khử của mạch. Enzyme này không làm giảm rõ rệt
độ nhớt của dung dòch pectin, nhưng làm tăng hàm lượng
các chất chiết có phân tử lượng thấp trong quá trình trích
ly dòch quả.
Không những thế, một số endo và exo-polygalacturonase
có thể tác dụng được trên pectin đã methyl hóa. Do đó có
tên là endo hay exo-polymethylgalacturonase. Một số khác
chỉ có khả năng phân cắt những cơ chất pectin đã mất
hết nhóm methyl, nghóa là chỉ tác dụng trên acid
polygalacturonic. [12]
Endo-polygalacturonase
còn
có
tên
nữa
là
polygalacturonase “dòch hóa”. Còn exo-polygalacturonase còn
có tên là polygalacturonase “đường hóa”. Đó là do cơ chế
thủy phân của chúng tương tự như
-amylase và
glucoamylase trên cơ chất amylo của tinh bột.
Các sản phẩm của quá trình thủy phân bởi
polygalacturonase có thể là các acid polygalacturonic mạch
-8-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
ngắn, tetra-galacturonic, tri-galacturonic, di-galacturonic, monogalacturonic...
pH tối ưu của các polygalacturonase khá khác nhau và
phụ thuộc vào nguồn thu nhận enzyme. Và chúng hoạt
động tốt chủ yếu trong vùng pH từ 4 đến 6.
Nhiệt độ tối thích của đa số polygalacturonase chủ yếu
nằm trong vùng từ 40-450C, enzyme bò vô hoạt ở 55-65 0C.
Các polygalacturonase được hoạt hóa bởi các cation của kim
loại kiềm và NH4+.[2]
COOH
COOH
O
O
H
OH
H
H
H
O
O
OH
H
OH H
H
H
H
H
OH
OH
COOH
O
H
H
O
OH H
COOH
O
H
H
O
OH H
H
H
OH
COOH
O
OH
H
H
OH H
H
OH
OH
H
COOH
COOH
COOH
O
O
O
H
H
OH
H
H
H
H
O
O
OH
H
OH H
OH H
H
H
H
+
OH
H
H
OH
H
OH
O
OH
exo-polygalacturonase
Cơ chế tác dụng của exo-polygalacturonase
COOH
COOH
O
O
H
H
H
O
OH H
O
OH H
H
H
H
OH
H
OH
O
COOH
O
H
OH H
H
OH
O
COOH
O
H
H
O
OH H
H
O
H
OH
COOH
O
H
OH H
H
endo-polygalacturonase
+
COOH
O
H
H
O
OH H
H
OH
H
OH
COOH
O
OH
H
OH
H
H
OH
O
OH
COOH
O
H
OH H
H
O
OH
Cơ chế tác dụng của endo-polygalacturonase.
b) Enzyme pectinesterase (viết tắt là PE):
Đây là enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết ester
trong phân tử pectin để tạo thành methanol và acid
polygalacturonic.
Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất
là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do.
Và enzyme sẽ thủy phân lần lượt các liên kết ester dọc
theo phân tử pectin. Người ta cũng thấy rằng PE của nấm
mốc thủy phân pectin sâu sắc hơn PE của thực vật. Hoạt
độ của PE phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của
pectin và tỷ lệ thuận với mức độ ester hóa. Ví dụ như PE
-9-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
từ nấm mốc A. niger, chỉ xúc tác cơ chất pectin ester hóa ở
mức độ cao (DE không nhỏ hơn 70%).
pH tối ưu của PE từ nấm mốc dao động từ 4,5 đến 5,5.
Trái lại, pH tối ưu của PE từ thực vật thường nằm trong
khoảng từ 6 đến 8.
Nhiệt độ tối ưu của PE từ nấm mốc thay đổi từ 40
đến 450C. Khi tăng nhiệt độ đến 55-62 0C thì enzyme bò vô
hoạt. Trong khi đó, PE thu nhận từ thực vật lại có nhiệt độ
tối ưu cao hơn, từ 55-600C.
Các ion Na+, Ca2+, K+ có tác dụng hoạt hóa enzyme PE từ
nấm mốc, còn các ion: Hg2+, Pb2+, Fe3+, Al3+ sẽ có tác dụng
kiềm hãm hoạt tính của PE.
pectinestearase
COOCH3
COOH
O
O
H
H
H
H
O
O
OH H
O OH H
H
H
H
OH
H
OH
COOH
O
H
H
O
OH H
COOH
O
H
H
O
OH H
H
H
OH
COOH
COOH
O
O
H
H
H
H
O
O
OH H
O OH H
H
H
H
OH
H
OH
COOH
O
H
H
O
OH H
COOH
O
H
H
O
OH H
H
H
OH
OH
+
OH
CH3OH
Cơ chế tác dụng của enzyme pectinesterase
1.2.1.2. Nhóm enzyme transeliminase:
Là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất
pectin bằng con đường khác con đường thủy phân, kết quả
là tạo ra các sản phẩm có chứa gốc galacturonic có chứa
nối đôi (4-dezoxy-5-cetogalacturonic).
Các enzyme trans-eliminase thường gặp gồm có:
Pectinlyase (poly-[1,4- -D methoxygalacturonide] lyase): là
enzyme phân cắt hợp chất pectin.
Pectatelyase (poly-[1,4- -D galacturonide] lyase): là enzyme
phân cắt hợp chất polygalacturonate (hay pectate).
Trans-eliminase từ những nguồn khác nhau thì có các
tính chất khác nhau. Ví dụ như trans-eliminase từ nấm mốc
hoạt động tối ưu ở pH 5.2, trái lại trans-eliminase từ vi khuẩn
hoạt động tối ưu ở pH từ 7 đến 8.5.
-10-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
Cơ chế tác dụng của enzyme pectatelyase
-11-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
Cơ chế tác dụng của enzyme pectinlyase.
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme
pectinase ở vi sinh vật:
Hiện nay trong sản xuất công nghiệp, các chế phẩm
pectinase chỉ được thu nhận từ vi sinh vật. Do đó trong luận
văn tốt nghiệp này, chúng tôi chỉ đề cập đến công
nghệ sản xuất chế phẩm pectinase theo phương pháp vi sinh.
1.2.2.1. Vi sinh vật sử dụng để sinh tổng hợp pectinase:
Người ta thường thu nhận pectinase từ canh trường bề
mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc. Các vi
khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzyme này:
Nấm mốc: Nhiều loài nấm mốc có thể sản xuất ra
enzyme pectinase. Loài nấm mốc Aspergillus niger là được sử
dụng nhiều nhất. Ngoài ra, người ta còn sử dụng các loài
nấm mốc khác như Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Thermoascus
aurantiacus và Penicillium expansum.... Các loài nấm mốc khác
nhau thường sinh tổng hợp các kiểu enzyme khác nhau. Ví dụ
như: A. niger chủ yếu là tổng hợp ra pectinesterase. Pen.citrimin
tạo ra chủ yếu là polygalacturonase.
Vi khuẩn: một số loài vi khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp enzyme pectinase như: Erwinia caralovora, Bacillus polymyxa,
các loài thuộc giống Streptomyces...
-12-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
Nấm men: một số loài nấm men cũng có thể tạo ra
enzyme pectinase. Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces fragilis có
khả năng tạo ra endo-polygalacturonase [12]
Tóm lại, tùy vào vi sinh vật sử dụng mà ta có thể thu
nhận được hỗn hợp enzyme pectinase có những đặc tính
khác nhau.
1.2.2.2. Ảnh hưởng của các cấu tử trong môi trường dinh
dưỡng:[2]
Thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt
động sống của vi sinh vật và quá trình sinh tổng hợp
enzyme pectinase. Vi sinh vật muốn phát triển cần phải có
các nguồn dinh dưỡng cung cấp các hợp chất chứa C, N, H
và O. Trong thành phần môi trường cũng phải có chứa
các chất khoáng như Mg, Ca, P, S, Fe, K,..
a) Ảnh hưởng của nguồn Carbon:
Enzyme pectinase cũng thuộc nhóm enzyme cảm ứng như
các enzyme thủy phân khác. Do đó, việc chọn đúng cơ
chất cho vi sinh vật sử dụng là rất quan trọng. Nguồn carbon
thường sử dụng nhất là các polysaccharide, disaccharide,
monosaccharide…
Đặc biệt, sự có mặt của pectin trong môi trường là
không thể thiếu, vì pectin vừa có vai trò là chất cảm ứng
lại vừa là nguồn cung cấp carbon cho cho vi sinh vật phát
triển. Ta có thể bổ sung pectin vào môi trường bằng cách
thêm vào môi trường pectin hoặc những nguyên liệu giàu
pectin như bột táo, bã củ cải đường, bã mía hay vỏ của
các loại quả có múi…
Đối với một số loài vi sinh vật, khi trong môi trường
có sử dụng phối hợp giữa pectin với các loại đường như
glucose, saccharose, fructose thì đường có thể gây ức chế
quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase. Ví dụ như khi ta nuôi
cấy A. niger, nếu môi trường chỉ có nguồn carbon là pectin
thì hoạt tính của PE là 0,127 UI/ml và của PG là 0,055UI/ml
sau 48 giờ nuôi cấy. Nhưng khi thêm glucose vào môi trường
-13-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
với hàm lượng là 5g/l thì hoạt tính của PE chỉ còn khoảng
0,08 UI/ml và của PG là 0,03 UI/ml [16].
b) Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Nguồn thức ăn nitơ cũng có vai trò rất quan trọng trong
quá sinh tổng hợp enzyme pectinase. Nguồn nitơ sử dụng có
thể là nước chiết ngô, bột đậu nành, bột mì, dòch thủy
phân casein, pepton… hay là các hợp chất nitơ vô cơ. Nguồn
nitơ vô cơ sử dụng có thể ở dạng muối amon hay muối
nitrat như (NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)2HPO4, NaNO3… Việc sử dụng
các loại muối amon có thể làm giảm pH của môi trường
trong quá trình nuôi cấy do quá trình vận chuyển ion NH 4+ từ
môi trường vào bên trong tế bào chất của vi sinh vật xảy
ra kèm theo với quá trình vận chuyển ngược ion H + từ bên
trong tế bào chất ra môi trường bên ngoài. Tỉ lệ thích hợp
giữa carbon và nitơ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy
theo loài vi sinh vật sử dụng, thông thường tỉ lệ này là
7:1 [4].
Các muối amon và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ được
vi sinh vật hấp thu dễ dàng và nhanh chóng sử dụng
chúng, còn nitơ của nitrate sẽ được khử thành dạng nitrite
rồi mới được vi sinh vật hấp thu [2].
Người ta nhận thấy nguồn nitơ sử dụng cũng ảnh
hưởng khá nhiều lên hoạt tính của vi sinh vật. Ví dụ như: khi
khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau lên
hoạt tính pectinase của Streptomyces sp, sau 24 giờ nuôi cấy,
người ta thu được kết quả sau: [17]
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên hoạt tính
enzyme pectinase của Streptomyces sp.
Nguồn Nitơ (hàm lượng: Hoạt
0,5%w/v)
(UI/l)
tính
Peptone
66
Tryptone
65
Chiết xuất nấm
men
57
NH4NO3
-14-
50
pectinase
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
(NH4)2HPO4
48
NaNO3
60
KNO3
54
(NH4)2SO4
62
Việc lựa chọn nguồn nitơ và hàm lượng sử dụng cho
mỗi loài vi sinh vật sẽ được xác đònh bằng phương pháp
thực nghiệm.
c) Ảnh hưởng của các nguyên tố khác:
Sự có mặt của các chất khoáng đa lượng và vi lượng
cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme
của vi sinh vật. Do chúng là thành phần cấu tạo nên một
số hợp chất và cơ quan trong tế bào.
Ví dụ như phosphor, lưu huỳnh rất cần cho vi sinh vật, vì
chúng tham gia vào thành phần của những chất quan trọng
của tế bào (a. nucleic, protein). Ngoài ra, phosphor còn tham
gia vào rất nhiều phản ứng trao đổi chất của tế bào.
Các nguyên tố như sắt, kẽm, đồng, coban… rất cần thiết
cho vi sinh vật để cấu tạo nên một số loại enzyme dù
rằng hàm lượng của các nguyên tố ấy rất nhỏ.
Các nguyên tố đa lượng được đưa vào thành phần môi
trường ở dạng muối vô cơ, còn các nguyên tố vi lượng
được đưa vào từ nguồn nước máy, nước giếng hoặc
nguyên liệu hữu cơ.
Người ta nhận thấy nồng độ cần thiết của các muối
khoáng đối với vi khuẩn, nấm mốc thường thay đổi trong
phạm vi sau đây:
Bảng 2.2: Nồng độ các chất khoáng cần thiết cho vi
sinh vật phát triển [7]
Muối khoáng
Nồng độ cần thiết (g/l)
Đối với vi khuẩn
Đối với nấm mốc
K2HPO4
0,2-0,5
1-2
KH2PO4
0,2-0,5
1-2
MgSO4.7H2O
0,1-0,2
0,2-0,5
-15-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
MnSO4.4H2O
0,005-0,01
0,02-0,1
FeSO4.7H2O
0,005-0,01
0,05-0,2
ZnSO4.7H2O
0,001-0,005
0,02-0,1
CaCl2
0,01-0,03
0,01-0,1
CaSO4.5H2O
0,001-0,005
0,01-0,05
Thành phần tham khảo của một số môi trường nuôi
cấy vi sinh vật theo phương pháp bề sâu với mục đích sinh
tổng hợp enzyme pectinase được trình bày trong bảng 2.3.
-16-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn tốt nghiệp
Bảng 2.3: Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật
theo phương pháp nuôi cấy bề sâu [11,12,14,18]
A. niger
A. oryzae
Bacillus sp
Streptomyces sp
Pectin: 15g/l
(NH4)2SO4: 2g/l
Bột mì: 40g/l
Petin: 2,5g/l
Glucose: 5g/l
KH2PO4: 4g/l
FeSO4: 0,1g/l
Chất
nấm
0,5g/l
CaCl2: 0,01g/l
(NH4)2SO4: 5g/l
MnSO4:
37,8mg/l
KH2PO4: 2,5g/l
H3BO3: 10mg/l
FeSO4.7H2O:6x1
0-5 g/l
NaHPO4: 0,2g/l
pH: 4,5
Petin: 10g/l
Chất
chiết
men:
chiết nấm
men: 10g/l
CaCl2: 0,05g/l
pH: 7,2
Chất
chiết
nấm men: 5g/l
KH2PO4: 1g/l
MgSO4.7H2O:
0,1g/l
pH: 8
MgSO4: 0,5g/l
ZnSO4:
g/l
6x10-5
MnSO4: 10-6 g/l
pH: 4
Ngoài ra, các yếu tố khác như pH của môi trường dinh
dưỡng, phương pháp nuôi cấy, nhiệt độ và điều kiện nuôi
cấy... đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme
pectinase.
1.2.3. Phương pháp thu nhận enzyme pectinase: [2, 4]
Để thu được enzyme pectinase từ vi sinh vật, ta có 2
phương pháp nuôi cấy:
Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề sâu
1.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt:
Trong phương pháp này, người ta thường sử dụng vi sinh
vật là nấm mốc hoặc xạ khuẩn. Vi sinh vật phát triển và
bao phủ trên bề mặt các hạt chất dinh dưỡng rắn đã
được làm ẩm. Vi sinh vật sẽ lấy thức ăn từ những chất
-17-
